JPH04182469A - 新規なチオエステル化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、新規なチオエステル化合物、それからなる酵
素基質、チオエステル化合物を用いた加水分解酵素の測
定方法、測定材料および測定器具に関する。

［従来の技術］ 尿中に出現する白血球の量は、腎臓や泌尿生殖器の疾病
の診断の指針となる。また腹膜透析液中の白血球のモニ
タリングにより腹膜炎が早期に発見できることも知られ
ている。従来、それら液中の白血球の検出は、顕微鏡で
液中の白血球数を数えることにより行われていたが、こ
の方法は高価な機器、長い測定時間、複雑な操作、熟練
等を要し、更に崩壊していない完全な白血球しか測定で
きないという欠点を存していた。

ところで、上記従来法の欠点を解決するために、白血球
中のエステラーゼやプロテアー七等の加水分解酵素を検
出し、それによって白血球量を測定する検出法が近年試
みられており、この方法は鏡検により白血球数を数える
上記従来法に比べて操作が容易であって短時間で結果が
得られ、そして崩壊した白血球でも検出できるという利
点を有している。このような方法としては、（Ａ）フェ
ノキシアミノ酸エステルからなる酵素基質を用いる方法
（特公昭６１−４５９８２号公報）　、（Ｂ）インドキ
シル−アミノ酸エステルまたはインドキシルーペプチト
エステルを色原体として用いる方法（特公昭５９〜３４
７５号公報）および（Ｃ）５−フェニルビロールエステ
ルを用いる方法（特公昭６２−４１７１０号公報）か知
られている。

しかしながら、これらの方法は酵素基質や色原体を酵素
で加水分解させ、その生成物をジアゾニウム塩と反応さ
せてアブ染料として発色させる、または酸化により発色
させるという発色機構を採るために高価な試薬か必要で
あり、また呈色安定性に欠け、感度か悪いという欠点を
有している。

［発明か解決しようとする課題１ したがって、本発明の目的は、直値な機器を使用するこ
となく、簡単な操作で迅速に、しかも高精度で安定性よ
く白血球や加水分解酵素を検出するための方法、材料お
よび機器を提供することである。

［発明の内容］ 上記目的を達成すべく本発明者らは研究を続けてきた。

その結果、新規なチオエステル化合物を得ることができ
、しかもこのチオエステル化合物のチオエステル結合が
加水分解酵素により選択的に加水分解されること、そし
て加水分解により生成した８−メルカプトキノリン（別
称チオオキシン）が金属イオンとキレートを形成して鮮
明で安定に呈色すること、したかつてこの千オニステル
化合物を酵素基質として使用すると加水分解酵素や白血
球が容易に検出できることを見出して本発明を完成した
。

したがって、本発明は、下記の一般式（１）（式中、Ａ
はアミノ酸残基またはペプチド残基、Ｂは窒素保護基で
あり、Ｒ１−Ｒ６は各々独立して水素原子、ハロゲン原
子、アルキル基、アルコキシル基、アリール基、アルア
ルキル基およびアルアルコキシル基から選ばれる基、或
はＲ１−Ｒ６のうちの隣接する２つの基が結合して縮合
環を形成していてもよい基を示す） で表されるチオエステル化合物である。

さらに、本発明は上記−数式（１）で表されるチオエス
テル化合物からなる酵素基質、該チオエステル化合物お
よび金属イオンを使用する加水分解酵素の測定方法、該
チオエステル化合物および金属塩を有効成分とする加水
分解酵素測定材料、ならびに該加水分解酵素測定材料を
備えた測定器具を包含する。

本発明のチオエステル化合物（１）は、元々白色−淡黄
色の色を有する化合物であるが、これにエステラーゼ、
プロテアー七等の加水分解酵素か作用すると、硫黄原子
Ｓとアミノ酸残基またはペプチド残基Ａとの間のチオエ
ステル結合、ｔ　すｈ　チー　Ｓ　−Ｃ（０）−が加水
分解されて、下記の一般式（ｎ） （式中、Ｒ１−Ｒ６は上記と同し基を表す）で示される
８−メルカプトキノリン（チオオキシン）を生成する。

そして、このチオオキシンは金属イオンとキレート化合
物を形成して鮮明な呈色を示す。キレ−１・化合物の吸
収波長は金属の種類により異なるか、通常４００〜５０
０ｎｍ付近の極大吸収波長をもつ場合か多い。上記一般
式（Ｕ）で示されるチオオキシンの生成量は被測定物質
中の加水分解酵素の量に相関し、したがってキレート形
成による呈色も酵素量に相関するため、呈色の度合を見
ることにより被測定物中の酵素量を定量することができ
る。呈色の度合は、目視で読み取ることも可能であり、
また分光光度計等の機器を使用して測定するとより正確
な測定結果を得ることかできる。

上記一般式（Ｉ）において、アミノ酸残基Ａとしては、
加水分解酵素によって加水分解可能なチオエステル結合
を形成するものであればいずれでもよいが、Ｌ型、Ｄ型
およびラセミ体、特にＬ型のアラニン、バリン、ロイシ
ン、イソロイシン、フェニルアラニンからのアミノ酸残
基がよい。またＡがペプチド残基である場合は、それら
のアミノ酸の２〜５個よりなるものがよい。その場合に
、加水分解酵素の種類によってアミノ酸残基およびペプ
チド残基に対する特異性か多少異なるので、アミノ酸残
基およびペプチド残基の種類を選択することによって、
特定の酵素の量を選択的に測定できる。

また、窒素保護基Ｂとしては、アミノ酸およびペプチド
における常用の窒素保護基であればよく、例えばアシル
基、オキシカルバモイル基、ホスホリル基、カルパルモ
イル基、チオカルバモイル基、スルホニル基、スルフェ
ニル基、ヒニル基、クロロへキセニル基等を挙げること
かできる。

そして基Ｒ６〜Ｒ６としては、水素原子、フッ素、塩素
、臭素およびヨウ素、特に塩素および臭素、炭素原子数
１〜５個のアルキル基、炭素原子数１〜５個のアルコキ
シル基、フェニル基、ナフチル基、ベンジル基、ペンシ
ルオキシ基等を挙げることができ、またＲ１〜Ｒ０のう
ちの隣接する２つの基か結合して炭素原子数５〜６個の
飽和または不飽和縮合環を形成していてもよい。

上記一般式（１）で示されるチオエステル化合物の具体
例を挙げると以下のとおりであるか、勿論それに限定さ
れない。

■　８−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニル
チオ）キノリン■　５−クロロ−８−（Ｎ−ｐ−４−ル
エンスルホニルーし一アラニルチオ）キノリン■　４−
メチル−８−（Ｎ−叶トルエンスルホニルーし一アラニ
ルチオ）キノリン■　５−メトキシ−８−（Ｎ−ｐ−ト
ルエンスルホニル−し−アラニルチオ）キノリン■　８
−（Ｎ−カルボベンジルオキシ−Ｌ−アラニルチオ）キ
ノリン■　８−（Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−し−ア
ラニルチオ）キノリン一般式（１）で示される新規なチ
オエステル化合物は、上記一般式（ＩＩ）で示したチオ
オキシンと、下記の一般式（Ｉ［＋） ＨＯ−Ａ−Ｂ　　　　　　　（Ｉ［［）（式中、Ａおよ
びＢは上記と同じ基を表す）で表されるアミノ酸または
ペプチド、あるいはそれらの適当な反応性誘導体（例え
ばアミノ酸またはペプチドの酸クロライドや酸無水物等
）とを反応させて千オニステルを形成することにより製
造できる。

一般式（ＩＦ）で示されるチオオキシンは公知化合物で
あり、例えば＾ｎａ１．ｃｈｅｍ、　３５．１４２４（
１９６３）Ａ、　Ｃｏｒｉｓｉｎｉ　ｅｔａｌ、　Ｚｈ
ｕｒ、Ａｎａｌｉｈｉｍ、　１８．６６８（１９６３）
　Ｙｕ、Ａ、　Ｂａｎｋｏｖｓｋｙ　ｅｔａｌ、等に記
載されている。また一般式（ＤＩ）で示される窒素原子
の保護されたアミノ酸およびペプチドはよく知られてい
る。

更に、本発明は、一般式（１）で示されるチオエステル
化合物を酵素基質として使用すること、そしてそれを金
属塩と併用して該チオエステル化合物の加水分解により
生成した一般式（ＩＩ）のチオオキシンと金属イオンと
でキレートを形成させて加水分解酵素の検出や定量等を
行う測定法、そのための測定材料や機器をも包含するこ
とは上記したとおりであるが、その場合の金属塩として
は、酵素を阻害する作用を有しておらず、また金属イオ
ンとチオオキシンとにより形成されたキレートが鮮明に
呈色するものであればいずれでもよく、例えば銅、亜鉛
、ニッケル、コバルト、鉄等の金属の塩を挙げることか
でき、特にそれらの金属のハロケン化物か好ましい。

その場合に、金属塩は１種類のみを使用しても２種以上
を組み合わせて使用してもよい。

チオエステル化合物、金属塩の使用割合は、キレート形
成という点から、通常、約１０．３〜１のモル比で使用
するのがよい。

また、加水分解酵素の検出に際しては、被検８液１１当
たり、チオエステル化合物を約　０．５〜２．０ミリモ
ル使用するのがよい。

本発明の方法により加水分解酵素を検出する場合は、チ
オエステル化合物と金属塩の両方を最初から存在させて
おいてそれに被検出物を作用させて検出を行っても、ま
たは初めはチオエステル化合物のみを被検出物に加え、
その後に金属塩を加えて検出を行ってもよい。

そして、本発明の加水分解酵素測定材料の形態としては
、チオエステル化合物および金属塩を吸着性担体に保持
せたちのを挙げることができる。その場合の吸着性担体
としては、チオエステル化合物および金属塩を均一に吸
着保持するとともに被検査液をよく吸収し、しかも加水
分解酵素の働きやキレート形成反応を阻害しないもので
あればいずれも使用でき、例えば濾紙、天然繊維や合成
繊維からなる繊維フリースや布帛、天然や合成の無機お
よび有機発泡体や多孔体等を挙げることかできる。吸着
性担体は、シート状、塊状、粒状等いずれの形状であっ
てもよい。吸着性担体に保持させるに際しては、チオエ
ステル化合物および金属塩、並びにその他試験材料の製
造において通常使用されている成分を適当な溶媒（例え
ば水、メタノール、エタノール、アセトン等）に溶解さ
せ、それを担体に含浸後、乾燥させるとよい。その場合
にチオエステル化合物および金属塩は同し溶液にして同
時に含浸させても、または一方を含浸させた後もう一方
を含浸させる方法によって行ってもよい。特に、吸着性
担体か濾紙や布帛等からなる場合は、本発明の酵素基質
と金属塩を担持した試験紙および試験片か製造できる。

吸着性担体に保持させるというかかる方法を採用した場
合は、担体に被検査液を含浸後、その呈色変化を読み取
るという簡単な操作で被検査液中の加水分解酵素を検出
することができる。

また、チオエステル化合物および金属塩を、粉末、顆粒
、錠剤、ベレット状の薬剤の製造に通常使用されて成分
を使用して、粉末、顆粒、錠剤、ベレット等の形態から
なる加水分解酵素検出材料とすることもできる。更に、
天然または合成高分子材料からなる膜形成性材料中に直
接、またはそれらの溶液や分散液中にチオエステル化合
物および金属塩を他の成分とともに加えたものから高分
子膜を形成して、チオエステル化合物および金属塩を含
有する膜を直接製造することもでき、この場合は、この
膜から直接試験片を得ることができる。

更に、チオエステル化合物および金属塩を直接被検査液
に加えて反応させて加水分解酵素の検出を行うこともで
きる。この場合に、反応終了後に、液にクロロホルム、
酢酸エステル等の有機溶媒を加えて生成したキレート化
合物を有機溶媒層に移した後、その有機溶媒層の透過吸
光度を測定する方法を採用すると、呈色か鮮明になり加
水分解酵素の検出および定量をより精密に行うことかで
きる。

上記いずれの場合も、加水分解酵素試験材料のｐＨを酵
素の作用し易いｐＨ領域である約５〜９、特に約６〜７
に緩衝剤等を使用して調節しておくのがよく、その場合
の緩衝剤としては、例えばホウ酸緩衝剤、リン酸緩衝剤
、トリス緩衝剤、クエン酸緩衝剤等を使用することかで
きる。

更に、界面活性剤および／または湿潤剤をチオエステル
化合物および金属塩とともに併用すると、被検査液の試
験材料への浸透が促進されて酵素による反応時間の短縮
を図ることかでき、且つ生成したキレート化合物による
呈色か一層鮮明になり好ましい。この場合の界面活性剤
および湿潤剤としては、トライトン６、アルキル硫酸ナ
トリウム、スパン３、トウィーン１、ポリエチシングリ
コール、高級アルコール類、エーテルアルコール類等を
挙げることができ、炭素数８〜１２の直鎖アルコールお
よび炭素数８〜１５のエーテル結合を有する直鎖アルコ
ールが好ましい。そして、吸着性担体にチオエステル化
合物および金属塩を含む液を含浸保持させて測定材料を
形成する場合は、界面活性剤および／または湿潤剤を含
浸液に約０．１〜４．０重量％の割合で使用するのかよ
い。

そして、上記した本発明の加水分解酵素試験材料は、直
接そのまま試験に使用することもできるが、適当なシー
トやフィルム等の支持体に取り付けた試験機器として使
用することもでき、またカラムやチューブ等の適当な容
器に充填した形態にして使用することもできる。

本発明によるときは、エステラーゼ、プロテアーゼ類の
加水分解酵素群、特にキモトリプシン、エラスターセ、
カテプシン、プラスミン、メダラシン等を特異的に直接
検出、定量できるため、加水分解酵素を含有する白血球
の検出、消化液や血奨中のプロテアーセ活性等の検査、
定量が可能となる。その結果、尿中の白血球の量か診断
の指針となる腎、尿路感染症の診断、腹膜透析液中の白
血球のモニタリング、消化機能の診断、血液凝固系の機
能のモニタリング等に本発明を広く利用することかでき
る。

次に本発明を実施例により具体的に説明するか本発明は
それにより限定されない。

実施例　１ ［８−（Ｎ　−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニル
チ　オ）キノリンの製造］ ８−メルカプトキノリン１．０ｇ　（５，０６ｇａｏｌ
）およびＮ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニン１
．２９ｇ（５，３０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン１
５ｍ１に溶解し、０℃で撹拌しながらテトラヒドロフラ
ン５＊１に溶解した１、３−ジシクロヘキシルカルボシ
イミド１．１３ｇ　（５，５０ｍｍｏｌ）を加えた。０
℃で１時間撹拌後、室温でさらに２時間撹拌を続けた。

反応混合物を減圧乾固した後、残渣に酢酸エチルを加え
、吸引濾過して生成した尿素を除去した後、濾液を再び
減圧濃縮し粗生成物を得た。これを酢酸エチル３　／　
ｎ−ヘキサン７混合液を溶出溶媒とするシリカゲルフラ
ッシュクロマトグラフで精製して目的物１５６ｇを得た
。

’Ｈ−■（ＣＤＣｈ）δｐｓｍ　１．４５（ｄ、ａｌａ
＜Ｕｓ）、　２．３０（ｓ、Φ（Ｈ３）、　４．３０（
ａ　ＣＢ）。

７、１０−９．００（ａｒｏｍ−［１１ｏ）ＴＲ（Ｃｔ
ｌＣＩ、）　　ｖ　ｃｙａ−’　３３５０（ＮＩＩ）、
　３０５０（ａｒｏａ）、　１７００（Ｓ＝０）実施例
　２ ［５−クロロ−８−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ
−アラニルチオ）キノリンの製造］５−クロロー８−メ
ルカプトキノリン　１．０ｇ（４，３１ｍｗｏｌ）およ
びＮ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニン１．０９
ｇ（４，５０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン１５＋１
に溶解し、０℃で撹拌しながらテトラヒドロフラン５鵬
１に溶解した　１．３−ジシクロヘキシルカルボシイミ
ド０．９８　ｇ　（４，７５ｍｍｏｌ）を加えた。０℃
で１時間撹拌後、室温でさらに２時間撹拌を続けた。反
応混合物を減圧乾固した後、残渣に酢酸エチルを加え、
吸引濾過して生成した尿素を除去した後、濾液を再び減
圧濃縮し粗生成物を得た。これを酢酸エチル３　／　ｎ
−ヘキサン７からなる混合液を溶出溶媒とするシリカゲ
ルフラッシュクロマトグラフで精製して目的物１３９ｇ
を得た。

’Ｅｌ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）δｐｐｍ　１．４５（ｄ
、ａｌａ−ＣＬ）、　２．３０（ｓ、φ−Ｃ■３）、　
４．３０（ｍ、ＣＢ）。

７．３０−９．００（ａｒｏｆｆｉ−Ｈｅ）ＩＲ（Ｃｔ
ｌＣＩ、）　　ｖ　ｃｍ−’　３３５０（ＮＵ）、　３
０５０（ａｒｏｍ）、　１７００（Ｓ＝ｏ）実施例　３ ［４−メチル−８−（Ｎ−ｐｌ−ルエンスルホニルーＬ
−アラニルチオ）キノリンの製造］４−メチルー８−メ
ルカプトキノリン　１．０ｇ（４，７２ｍ■ｏｌ）およ
びＮ−ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニン１．２０
ｇ（４，９５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン１５■１
に溶解し、０℃で撹拌しながらテトラヒドロフラン５ｍ
ｌに溶解した１、３−ジシクロヘキシルカルボシイミド た。０℃で１時間撹拌後、室温でさらに２時間撹拌を続
けた。反応混合物を減圧乾固した後、残渣に酢酸エチル
を加え、吸引濾過して生成した尿素を除去した後、濾液
を再び減圧濃縮し粗生成物を得た。これを酢酸エチル３
　／　ｎ−ヘキサン７からなる混合液を溶出溶媒とする
シリカゲルフラッシュクロマトグラフで精製して目的物
１゜５９ｇを得た。

実施例　４ ［５−メトキシ−８−（Ｎ−ｐ−１ルエンスルホニルー
Ｌ−アラニルチオ）キノリンの製造］５−メトキシー８
−メルカプトキノリン１．０ｇ（４，３９■蓋ｏ１）　
ＩよびＮ−ｐ−ト／レニンスルホニル−Ｌ−アラニン１
．１２ｇ（４，６０■■ｏｌ）をテトラヒドロフラン１
５璽ｌに溶解し、０℃で撹拌しながらテトラヒドロフラ
ン５ｍ＋１に溶解した１、３−ジシクロヘキシルカルボ
ジイミド１．０ｇ　（４，８５ｍ＋ｎｏｌ）を加えた。

０℃で１時間撹拌後、室温でさらに２時間撹拌を続けた
。反応混合物を減圧乾固した後、残渣に酢酸エチルを加
え、吸引濾過して生成した尿素を除去した後、濾液を再
び減圧濃縮し粗生成物を得た。これを酢酸エチル３　／
　ｎ−へキサン７からなる混合液を溶出溶媒とするシリ
カゲルフラッシュクロマトグラフで精製して目的物１．
２６ｇを得た。

’［１−ＮＭＲ（ＣＤＣＩｓ）δｐｐｌ＋　１．４５（
ｄ、ａｌａ−Ｃｔｌｇ）、　２．３０（ｓ、Φ−Ｃ■３
）、　３．８（１（ｓ、（Ｉｌｓ）。

４、３０（Ｌ　Ｃ１１）、　７．００−９．００（ａｒ
ｏｍ−ｔｌｑ）ＩＲ（ＣＢＣＩ３）　　ｙ　ｃｔｒ−’
　３３５０（ＮＴＩ）、　３０５０（ａｒｏｎ）、　１
７００（Ｓ＝０）実施例　５ ［８−（Ｎ−カルボペンシルオキシ−し−アラニルチオ
）キノリンの製造］ ８−メルカプトキノリン１．０ｇ　（５，０６釦目０１
）およびＮ−カルボペンシルオキシ−し−アラニン１．
１８ｇ（５，３０ｍ＠ａｌ）をテトラヒドロフラン１５
幻１に溶解し、０℃で撹拌しなからテトラヒドロフラン
５ｍｌに溶解した１、３−ジシクロヘキシルカルボシイ
ミド１．１６ｇ　（５，６０ｍｆｆ１ａｌ）を加えた。

０℃で１時間撹拌後、室温でさらに２時間撹拌を続けた
。反応混合物を減圧乾固した後、残渣に酢酸エチルを加
え、吸引濾過して生成した尿素を除去した後、濾液を再
び減圧濃縮し粗生成物を得た。これを酢酸エチル３　／
　ｎ−ヘキサン７混合液を溶出溶媒とするシリカゲルフ
ラッシュクロマトグラフで精製して目的物１．５３　ｇ
を得た。

実施例　６ ［８−（Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル−し−アラニルチ
オ）キノリンの製造コ ８−メルカプトキノリン１．０ｇ　（５，０６■ｅｏｌ
）およびＮ−ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−アラニン１
．　ＯＯｇ（５，３０■■ｏｌ）をテトラヒドロフラン
１５閲ｌに溶解し、０℃で撹拌しながらテトラヒドロフ
ラン５朧ｌに溶解した１、３−ジシクロへキシルカルボ
ジイミド１．１６ｇ　（５，６０ｍｍｏｌ）を加えた。

０℃で１時間撹拌後、室温でさらに２時間撹拌を続けた
。反応混合物を減圧乾固した後、残渣に酢酸エチルを加
え、吸引濾過して生成した尿素を除去した後、濾液を再
び減圧濃縮し粗生成物を得た。これを酢酸エチル３　／
　ｎ−ヘキサン７混合液を溶出溶媒とするシリカゲルフ
ラッシュクロマトグラフで精製して目的物１．３３　ｇ
を得た。

ＩＲ（ＣＢＣＩり　　ｖ　ｃ＋＋＋−’　３３５０（１
１？＋）、　３０５０（ａｒｏｌｌ）、　１７１０（Ｃ
＝０）、　１７００（Ｓ−０）実施例　７［加水分解酵
素の測定］ ２００ＩＩＩＭボラックスー塩酸緩衝液（ｐ［＋＝８．
０）　１　ｍｌ中に、上記実施例１〜６で製造した酵素
基質の各々の１５　ｍＭ酵素基質−エタノール溶液０．
２＋１゜１０　ｍＭ　ＮｉＣｌ２水溶液０２目１を加え
た後、２　Ｘ　１Ｏ−２ｕｎｉｔ／ｆｆ１ｌキモトリプ
シンＰＢＳ溶ｇＬ０．１ｍｌを加え、室温で２分間撹拌
反応させた。これに酢酸エチル２ｍｌを加えてよ（混和
し、静置後、酢酸エチル層の透過吸光度を測定した。

対照として、キモトリプシンを含有しないＰＢＳを用い
て上記と同様に実験を行った。

５４５ｎｍの波長の透過吸光度を分光光変針（日立製作
新製Ｕ　−２０００）を用いて測定した。

各酵素基質についての結果を下記の表１に示す。

表　　　　１ 透過吸光度 酵素基質　　　　　　　　キモトリプシン　対　照し一
アラニルチオ）キノリン　　　　　　　　　　１．５７
８　　　　０．３４８実施例３４−メチルー８−（Ｎ−
ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−アラニルチオ）キノリン
　　　　　　　　　　１．４３１　　　　０．２９９チ
オ）キノリン　　　　　　　　　　　　　　　０．７３
９　　　　０．２０４実施例６　８−（Ｎ−ｔ−ブトキ
シカルボニル−し−アラニルチオ）キノリン　　　　　
　　　　　　　　　　０．４９５　　　　０゜１４７実
施例　８［加水分解酵素の測定］ ２００■蓋ボラックスー塩酸緩衝液（ｐ■＝８．０）　
１　ｍｌ中に、１５ｍＭ　８’−（Ｎ−トシル−し−ア
ラニルチオ）キノリンのエタノール溶ｅ　Ｏ，２ｍｌ、
下記の表２に示した金属塩化物の各々の１０閣麗水溶液
０．２膳ｌを加えた後、２　Ｘ　１Ｏ−２ｕｎｉｔ／　
＠ｌキモトリプシンＰＢＳ溶液０．　ｌｅｌを加えて室
温で２分間撹拌反応させた。これに酢酸エチル２ｍｌを
加えてよく混和し、静置後、酢酸エチル層の透過吸光度
を測定した。

対照として、キモトリプシンを含有しないＰＢＳを用い
て上記と同様に実験を行った。

実施例７で使用したのと同し分光光度計を使用して、そ
の極大吸収波長における透過吸光度を測定した。

その結果を下記の表２に示す。

表　　　　　２ 透過吸光度 ＣｕＣ１ｚ　　　　４３９　　　　　　０．８２９　　
　０．１７１ＦｅＣ１ｚ　　　　　４６４　　　　　　
　　　０．７２０　　　　　０．１６３ＣｏＣ１２４６
９０，６７５０，１２０ＺｎＣ１２４０４１，１３１０
，２４３ＮｊＣ１ｚ　　　　　５４５　　　　　　　　
　１．５３７　　　　０．３３２実施例　９［加水分解
酵素の測定］ 濾紙（アトハツチツク社製　Ｎｏ、５１４＾）を１ｅＭ
ＮｉＣ１２を含有する２００ｍＭボラックスー塩酸緩衝
液（ｐ■−８，０）に含浸し、６０℃で５０分間通風乾
燥した。この濾紙を更に２ｍＭの各酵素基質及び２％エ
チレングリコールモノヘキシルエーテルを含有するアセ
トン溶液に含浸し、４０°Ｃで２０分間通風乾燥した。

これを５Ｘ５＋＋目角に切断し、両面テープを用いて０
．２ｍ＋ａ厚のポリスチレンンートに固定した。これに
２　Ｘ　１０−”ｕｎｉｔ／　ｌ１ｌｌキモトリプシン
ＰＢＳ水溶液を滴下し、２分後の試験紙の呈色変化を大
塚電子社製のＭＣＰＤ−２００を用いて波長５４５ｎｍ
における反射吸光度として測定した。

対照として、キモトリプシンを含有しないＰＢＳを用い
て上記と同様に実験を行った。

各酵素基質についての結果を下記の表３に示す。

表　　　　　３ 反射吸光度 アラニルチオ）キノリン　　　　　　　　０．８２３　
　　　　　０．１５８実施例２５−クロロー８−（Ｎ−
ｐ−トルエンスルホニル−し−アラニルチオ）キノリン
　　　　０．７２２　　　　　　０．１４２実施例３４
−メチルー８−（Ｎ−ｐ−トルエンスルホニル−Ｌ−ア
ラニルチオ）キノリン　　　　０．８５３　　　　　　
０．１８１実施例４５−メトキシー８−（Ｎ−ｐ−トル
エンスルホニル−Ｌ−アラニルチオ）キノリン　　　　
０．７９７　　　　　　０．１５４実施例５　８−（Ｎ
−カルボペンシルオキシ−し−アラニルチオ）キノリン
　　　　　　　　　　０．４４５　　　　　　０．１０
２［発明の効果］ 本発明による場合は、加水分解酵素、それを含有する白
血球、リンパ球等の検出や定量を高価な機器、長い測定
時間、複雑な操作、熟練等を要することなく極めて簡単
な操作で迅速に打つことができ、しかも完全な細胞だけ
でなく、崩壊した細胞の検出、定量ができる。

更に、本発明は、上記一般式（Ｉ）で示されるチオエス
テル化合物の酵素による加水分解物によって生成した上
記一般式（ＩＩ）で示されるチオオキシンと金属イオン
とのキレート形成反応のよって呈色を行うものである点
で、（Ａ）フェノキシアミノ酸エステル、（Ｂ）インド
キシル−アミノ酸エステルまたはインドキシルーペブチ
トエステルおよび（Ｃ）５−フェニルピロールエステル
等の酵素基質を用いてンアゾニウム塩との反応または酸
化反応により発色させる従来法と呈色機構が全く異なっ
ている。そして、キレート形成による呈色を利用する結
果、本発明では呈色のための高価な試薬が不要であり、
呈色安定性が良好で、しかも感度よい。

特許出願人　　テ　ル　モ　株式会社 代理人　弁理士　辻　長子−゛。

・−ニュ゛

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ａはアミノ酸残基またはペプチド残基、Ｂは窒
   素保護基であり、そしてＲ＿１〜Ｒ＿６は各々独立して
   水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシル基
   、アリール基、アルアルキル基およびアルアルコキル基
   から選ばれる基、或はＲ＿１〜Ｒ＿６のうちの隣接する
   ２つの基が結合して縮合環を形成していてもよい基を示
   す） で表されるチオエステル化合物。 ２）請求項１のチオエステル化合物からなる酵素基質。 ３）請求項１のチオエステル化合物および金属イオンを
   使用する加水分解酵素の測定方法。 ４）請求項１のチオエステル化合物および金属塩を有効
   成分とする加水分解酵素測定材料。 ５）請求項４の加水分解酵素測定材料を備えた測定器具
   。