JPS61199800A - エステル分解―及び／又は蛋白分解酵素の検出剤 - Google Patents
エステル分解―及び／又は蛋白分解酵素の検出剤Info
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- JPS61199800A JPS61199800A JP60225022A JP22502285A JPS61199800A JP S61199800 A JPS61199800 A JP S61199800A JP 60225022 A JP60225022 A JP 60225022A JP 22502285 A JP22502285 A JP 22502285A JP S61199800 A JPS61199800 A JP S61199800A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
腎蔵及び泌尿生殖器の疾病の診断において、尿中の白血
球の検出は非常に重要である。従来、この検出は顕微鏡
で行なわれており、この際特定の量の尿中に存在する白
血球の数を顕微鏡で数えていた。しかしながらこの方法
は時間がかかり、労多く、煩雑であり、更に熟練した人
材を必要とする。
球の検出は非常に重要である。従来、この検出は顕微鏡
で行なわれており、この際特定の量の尿中に存在する白
血球の数を顕微鏡で数えていた。しかしながらこの方法
は時間がかかり、労多く、煩雑であり、更に熟練した人
材を必要とする。
最近、種々の体液中の白血球の検出原理として、酵素反
応が採用され℃いる。それというのも白血球は広い酵素
スペクトルを有するからである。
応が採用され℃いる。それというのも白血球は広い酵素
スペクトルを有するからである。
白血球中に存在するエステル分解及び／又は蛋白分解作
用が分析の目的に利用される体液中の白血球の検出手段
は、西Ｖイツ特許出顯公開第２８２６９６５号及び同第
２８３６６４４号明細書から公知である。この場合には
、スルホンフタレインエステルもしくはアゾー色素エス
テルが白血球−エステラーゼ及び／又は−プロテアーゼ
に対する基質として使用される。酵素反応時に遊離する
色素は一般に公知の方法で評価される。これらの明細書
中に記載の検出剤はなお敏感すぎる。これらは、検出下
限値に対して反応時間が長すぎるから、実用にはなお特
定の欠点を有し、特に試験の実施の際に長すぎる待期時
間を伴なっている。
用が分析の目的に利用される体液中の白血球の検出手段
は、西Ｖイツ特許出顯公開第２８２６９６５号及び同第
２８３６６４４号明細書から公知である。この場合には
、スルホンフタレインエステルもしくはアゾー色素エス
テルが白血球−エステラーゼ及び／又は−プロテアーゼ
に対する基質として使用される。酵素反応時に遊離する
色素は一般に公知の方法で評価される。これらの明細書
中に記載の検出剤はなお敏感すぎる。これらは、検出下
限値に対して反応時間が長すぎるから、実用にはなお特
定の欠点を有し、特に試験の実施の際に長すぎる待期時
間を伴なっている。
プロテアーゼ及びエステラーゼを検出する種種の方法が
組織化学及び細胞化学的酵素学からも公知である（例え
ば、Ａ、Ｇ、ＩＣ，ピア 、ｃ （Ｐｅａｒａｅ）のＨ
ｌｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、 Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａ
ｌ ａＭ Ａｐｐｌｉｅｄ第３版０ｈｕｒｃｈｉｌｌ
Ｌｉｖｉｎｇａｔｏｎｅ 、 ｌｄｉｎｂｕｒｇｈ −
Ｌｏｎａｏｎ −Ｎｅｗ −Ｙｏｒｋ １９６８年）。
組織化学及び細胞化学的酵素学からも公知である（例え
ば、Ａ、Ｇ、ＩＣ，ピア 、ｃ （Ｐｅａｒａｅ）のＨ
ｌｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、 Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａ
ｌ ａＭ Ａｐｐｌｉｅｄ第３版０ｈｕｒｃｈｉｌｌ
Ｌｉｖｉｎｇａｔｏｎｅ 、 ｌｄｉｎｂｕｒｇｈ −
Ｌｏｎａｏｎ −Ｎｅｗ −Ｙｏｒｋ １９６８年）。
この場合、原理的には、同様に無色又は僅かに着色した
エステルが使用され、こねは、酵素分解により少なくと
も無色の酸及び同様に無色のアルコール−（フェノール
）−成分に分解する。次いで後者は、酵素鹸化に引続く
反応で例えば、ジアゾニウム塩との結合又は酸化反応に
より、着色した物質に変えられる。
エステルが使用され、こねは、酵素分解により少なくと
も無色の酸及び同様に無色のアルコール−（フェノール
）−成分に分解する。次いで後者は、酵素鹸化に引続く
反応で例えば、ジアゾニウム塩との結合又は酸化反応に
より、着色した物質に変えられる。
？、 シｓ−マＡ／ツｈ （８ｃｈｍａｌｔｌ ）及び
Ｈ，ブラウンスタイナー（Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎｅｒ
）は、例えばＫ１１ｎ 、 Ｗａｃｈｒ 、 ４６巻６
４２頁（１９６８年）Ｋ１基質としてナフトール−ＡＳ
−Ｄ−クロルアセテート及び着色アゾ化合物形成のた
めのジ、アゾニウム＃Ａｔ用いる特異な細胞化学的白血
球エステラーゼ検出に関して記載している。
Ｈ，ブラウンスタイナー（Ｂｒａｕｎｓｔｅｉｎｅｒ
）は、例えばＫ１１ｎ 、 Ｗａｃｈｒ 、 ４６巻６
４２頁（１９６８年）Ｋ１基質としてナフトール−ＡＳ
−Ｄ−クロルアセテート及び着色アゾ化合物形成のた
めのジ、アゾニウム＃Ａｔ用いる特異な細胞化学的白血
球エステラーゼ検出に関して記載している。
体液例えば尿中の白血球を迅速かつ簡単に検出するため
の検出剤を得るためには、この種の２成分系は好適でな
いことが判明した。これらはあまりに鈍感に反応する。
の検出剤を得るためには、この種の２成分系は好適でな
いことが判明した。これらはあまりに鈍感に反応する。
例えば白血球５０００／μｌ’に有する試料は反応を示
さない。
さない。
尿中に存在する多くの化合物例えばウロビリノーゲン、
ステルコビリノーｒン、ビリルビン等はジアゾニウム塩
と反応することは公知である。
ステルコビリノーｒン、ビリルビン等はジアゾニウム塩
と反応することは公知である。
このことは尿中のウロビリノーゲン又はピリルぎンを検
出するための市販の試験片（これは検出反応のためにシ
アψニウム塩七使用する）が最良であることを立証して
いる。エステラーゼ検出のために文献中で使用さねてい
るジアゾニウム塩は、他の尿成分との副反応管示し、一
部は、その個有の色にも基づき白血球試験には使用でき
ない。
出するための市販の試験片（これは検出反応のためにシ
アψニウム塩七使用する）が最良であることを立証して
いる。エステラーゼ検出のために文献中で使用さねてい
るジアゾニウム塩は、他の尿成分との副反応管示し、一
部は、その個有の色にも基づき白血球試験には使用でき
ない。
ところで、本発明の課題は、酵素に対する反応成分とし
てエステル及びジアゾニウム塩の組成物を有するエステ
ル分解及び／又は蛋白分解酵素の検出剤を調製すること
であり、これを用いると、酵素は簡単かつ容易に取扱い
可能な方法で短時間に検出でき、被検試料の他の成分と
の障害性副反応は認められない。
てエステル及びジアゾニウム塩の組成物を有するエステ
ル分解及び／又は蛋白分解酵素の検出剤を調製すること
であり、これを用いると、酵素は簡単かつ容易に取扱い
可能な方法で短時間に検出でき、被検試料の他の成分と
の障害性副反応は認められない。
この課題は好適なエステルと特別に置換されたジアゾニ
ウム塩との特定の組成物を使用することにより解決さ≦
１１ この際意外にも、使用ジアゾニウム塩は、他の尿
成分例えばビリルビン及びウロぎりノーデンと反応せず
、特異的にかつ迅速に使用したエステルの分解時に生じ
るフェノール成分と結合して着色化合物を形成する。
ウム塩との特定の組成物を使用することにより解決さ≦
１１ この際意外にも、使用ジアゾニウム塩は、他の尿
成分例えばビリルビン及びウロぎりノーデンと反応せず
、特異的にかつ迅速に使用したエステルの分解時に生じ
るフェノール成分と結合して着色化合物を形成する。
好適なエステルは、エステル分解及び／又は蛋白分解酵
素に対して充分忙反応性であるはずであり、従って、こ
れらはできるだけ迅速に分解されて酸及びアルコール成
分（これＫはフェノールも入り得る）になる。エステル
は、遊離したアルコール成分が良好Ｋかつ完全に使用ジ
アゾニウム塩と結合するように選択すべきでもある。ジ
アゾニウム塩の反応性は置換分を適当に選択するととＫ
より、本発明により使用されているエステルかノら遊離
されたアルコール成分と充分に迅速に反応するが、試験
溶液のその他の成分とは反応しないように調節すべきで
ある。
素に対して充分忙反応性であるはずであり、従って、こ
れらはできるだけ迅速に分解されて酸及びアルコール成
分（これＫはフェノールも入り得る）になる。エステル
は、遊離したアルコール成分が良好Ｋかつ完全に使用ジ
アゾニウム塩と結合するように選択すべきでもある。ジ
アゾニウム塩の反応性は置換分を適当に選択するととＫ
より、本発明により使用されているエステルかノら遊離
されたアルコール成分と充分に迅速に反応するが、試験
溶液のその他の成分とは反応しないように調節すべきで
ある。
従って、本発明の目的物は、エステル分解及び／又は蛋
白分解酵素殊に白血球中に存在するエステラーゼ及び／
又はプロテアーゼを検出するための検出剤であり、こわ
は、適当なエステラーゼ−もしくはプロテアーゼ検出系
、緩衝剤並びに場合によっては他の慣用の添加物を含有
する吸着性担体、膜層、粉末混合物、凍結乾燥物、溶液
又は試薬錠剤よりなり、その特徴は、エステラーゼ−も
しくはプロテアーゼ検出系として、置換分の適当な選択
により、エステルから遊離されたアルコール成分と充分
に迅速に反応するが試験溶液の他の成分とは反応しない
ようにその反応性が―節されている、特別に置換された
ジアゾニウム塩と適当なエステルとの組成物上使用する
ことよりなる。
白分解酵素殊に白血球中に存在するエステラーゼ及び／
又はプロテアーゼを検出するための検出剤であり、こわ
は、適当なエステラーゼ−もしくはプロテアーゼ検出系
、緩衝剤並びに場合によっては他の慣用の添加物を含有
する吸着性担体、膜層、粉末混合物、凍結乾燥物、溶液
又は試薬錠剤よりなり、その特徴は、エステラーゼ−も
しくはプロテアーゼ検出系として、置換分の適当な選択
により、エステルから遊離されたアルコール成分と充分
に迅速に反応するが試験溶液の他の成分とは反応しない
ようにその反応性が―節されている、特別に置換された
ジアゾニウム塩と適当なエステルとの組成物上使用する
ことよりなる。
本発明における適当な置換されたジアゾニウム塩は、例
えば、一般式■： 〔式中Ｂ１は低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級
アル中ルメルカゾト基、Ｎ−モルホリ／Ｍ、１１−ｆオ
ーモルホリノ基、Ｎ−ピロリジノ基 Ｎ／−フルキル化
さｉていてもよいＮ−ピペラジノ基、Ｎ−ピペリジノ基
、ハロゲン又は水素を表わし、Ｒ３は低級アルキル基、
低級アルコキシ基、アリールオキシ基、低級プルキルメ
ルカプト基、アルキルアミノ基、ジアルキル了ミノ基、
ヒＦロキシ基、Ｎ−モルホリノ基、Ｎ−チオ−モルホリ
ノ基、Ｎ−ピロリジノ基、Ｎ／ −フルキル化さｔ１″
′ＣいてもよいＮ−ピペラジノ基、Ｎ−ｆベリジノ基、
フェニルアミノ基、低級アルキル又は低級アルコキシ基
で置換されていてもよいフェニル基、ハロゲン又は水素
を表わし、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５は同−又は異なるものであ
つ℃よく、それぞれ、低級アルキル基、低級アルコキシ
基、低級フルキルメルカプト基、ハロゲン又は水素を表
わし、Ｘは安定化性アニオンを表わす〕の化合物である
。
えば、一般式■： 〔式中Ｂ１は低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級
アル中ルメルカゾト基、Ｎ−モルホリ／Ｍ、１１−ｆオ
ーモルホリノ基、Ｎ−ピロリジノ基 Ｎ／−フルキル化
さｉていてもよいＮ−ピペラジノ基、Ｎ−ピペリジノ基
、ハロゲン又は水素を表わし、Ｒ３は低級アルキル基、
低級アルコキシ基、アリールオキシ基、低級プルキルメ
ルカプト基、アルキルアミノ基、ジアルキル了ミノ基、
ヒＦロキシ基、Ｎ−モルホリノ基、Ｎ−チオ−モルホリ
ノ基、Ｎ−ピロリジノ基、Ｎ／ −フルキル化さｔ１″
′ＣいてもよいＮ−ピペラジノ基、Ｎ−ｆベリジノ基、
フェニルアミノ基、低級アルキル又は低級アルコキシ基
で置換されていてもよいフェニル基、ハロゲン又は水素
を表わし、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５は同−又は異なるものであ
つ℃よく、それぞれ、低級アルキル基、低級アルコキシ
基、低級フルキルメルカプト基、ハロゲン又は水素を表
わし、Ｘは安定化性アニオンを表わす〕の化合物である
。
本発明により使用可能な好適なエステルは、例えば一般
式■： Ｂ／。
式■： Ｂ／。
〔式中Ｒ’０、Ｒ’２、Ｒ’、 、Ｒ’、は同−又は異
なるものであってよく、それぞれ、水素原子又はへ−ン
原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アリール基
、アラルキル基、アラルコキシ基、とドロキシ基、カル
ボキシ基、カルボキシ低級アルコキシ基、アラルコキシ
カルボニル基、アラルコキシ−カルボニル−低級アルコ
キシ基、ニトロ基又は低級アシルアミノ基金表わすか、
又は各々隣接している２個の置換分は一緒になってハロ
ゲン原子で置換されていてもよいベンゾ縮合基を表わし
Ｘ／は硫黄原子又は１個の低級アルキル、アリール、
アラルキル又はアシル基で置換されていてもよいイミノ
基を表わし＼Ａはアミノ酸残基又はペデチＦ基を表わし
、ＢはペデチＶ化学に慣用の又はこれから誘導された窒
素保誦基を表わす〕の化合物である。
なるものであってよく、それぞれ、水素原子又はへ−ン
原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アリール基
、アラルキル基、アラルコキシ基、とドロキシ基、カル
ボキシ基、カルボキシ低級アルコキシ基、アラルコキシ
カルボニル基、アラルコキシ−カルボニル−低級アルコ
キシ基、ニトロ基又は低級アシルアミノ基金表わすか、
又は各々隣接している２個の置換分は一緒になってハロ
ゲン原子で置換されていてもよいベンゾ縮合基を表わし
Ｘ／は硫黄原子又は１個の低級アルキル、アリール、
アラルキル又はアシル基で置換されていてもよいイミノ
基を表わし＼Ａはアミノ酸残基又はペデチＦ基を表わし
、ＢはペデチＶ化学に慣用の又はこれから誘導された窒
素保誦基を表わす〕の化合物である。
一般式■のエステルは、エステラーゼ及び／又はテロテ
アーゼ例えば好中性顆粒性白血球中に存在するエステラ
ーゼ及びテロテアーゼにより迅速かつ完全に鹸化される
。遊離さｈたフェノール成分は良好、迅速かつ通釈的に
低い親電子性の一般式ｌのジアゾニウム塩と反応する。
アーゼ例えば好中性顆粒性白血球中に存在するエステラ
ーゼ及びテロテアーゼにより迅速かつ完全に鹸化される
。遊離さｈたフェノール成分は良好、迅速かつ通釈的に
低い親電子性の一般式ｌのジアゾニウム塩と反応する。
従って、本発明の原理により、体液中の白血球を検出す
るための安定で迅速に指示する検出剤を人造することが
できる。更に、本発明による検出剤は蛋白分解酵素例え
は水溶液又は体液例えは完全血液、血清及び髄液、膵液
又は便抽出液中のエラスターゼ、キモトリプシン又はト
リプシンの一般的検出にも優れている。
るための安定で迅速に指示する検出剤を人造することが
できる。更に、本発明による検出剤は蛋白分解酵素例え
は水溶液又は体液例えは完全血液、血清及び髄液、膵液
又は便抽出液中のエラスターゼ、キモトリプシン又はト
リプシンの一般的検出にも優れている。
一般式■のジアゾニウム塩は部分的に公知の化合物であ
る。置換分Ｒ１及び／又はＲ３がＮ−チオモルホリノ−
１Ｎ−ｆロリジノー、場合によりＲ′−アルキル化され
たＮ−ピペラジノ−又はｎ−ｔ＝ベリジノ基管表わす誘
導体は、新規化合物である。しかしながら、これらは、
公知物質な得ると同時に公知方法で製造できる。
る。置換分Ｒ１及び／又はＲ３がＮ−チオモルホリノ−
１Ｎ−ｆロリジノー、場合によりＲ′−アルキル化され
たＮ−ピペラジノ−又はｎ−ｔ＝ベリジノ基管表わす誘
導体は、新規化合物である。しかしながら、これらは、
公知物質な得ると同時に公知方法で製造できる。
一般式■の化合物は、西ドイツ特許出願第Ｐ２Ｂ５４９
８７．５号明細書に記載されている。
８７．５号明細書に記載されている。
Ｒ工、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及ヒＲ５モジくハＢ／０、Ｆｒ
２、Ｒ／、及びＲ／、の定義におけるハロゲンとは、弗
素、塩素、臭素及び沃素％に塩素及び臭素である。
２、Ｒ／、及びＲ／、の定義におけるハロゲンとは、弗
素、塩素、臭素及び沃素％に塩素及び臭素である。
Ｒ工〜Ｒ５、Ｒ′、〜Ｒ／、の定義における低級アルキ
ル−、アルコキシ−、アルキルメルカゾトー、プルキル
アミノ−１及びジアルキルアミノ−基は、炭素原子１〜
５特に１〜３を有し、この際相応するメチル基が特に有
利である。
ル−、アルコキシ−、アルキルメルカゾトー、プルキル
アミノ−１及びジアルキルアミノ−基は、炭素原子１〜
５特に１〜３を有し、この際相応するメチル基が特に有
利である。
安定性アニオンＸとしては、テトラフルオロポレート、
テトラクロルジンケートもしくはベルクロレートが有利
である。
テトラクロルジンケートもしくはベルクロレートが有利
である。
Ｒ／工、”２ 、”’３及びＲ１，の定義におけるアラ
ルコキシ基並びＫｘ′の定義におけるアラルキル基とは
、オキシ−低級−アルキルもしくは低級アルキル基、置
換されたフェニル及びナフチル基であり、ここでアルキ
ル基は炭素原子１〜５、特に１〜３含有する。特にベン
ジルオキシ−もしくはベンジル基が有利である。
ルコキシ基並びＫｘ′の定義におけるアラルキル基とは
、オキシ−低級−アルキルもしくは低級アルキル基、置
換されたフェニル及びナフチル基であり、ここでアルキ
ル基は炭素原子１〜５、特に１〜３含有する。特にベン
ジルオキシ−もしくはベンジル基が有利である。
”０、”！ 、’３及び１１／、の低級アシルアミノ基
としては、炭素原子数１〜５特に１〜３の低級脂肪族カ
ルボン酸のアミド基がこれに該当する。
としては、炭素原子数１〜５特に１〜３の低級脂肪族カ
ルボン酸のアミド基がこれに該当する。
特にアセチルアミノ基が有利である。
Ｘ′の定義における了ミノ基としては、炭素原子数１〜
５％に１〜６の脂肪族カルボン酸又は芳香族カルボン酸
例えば安息香酸又はナフトエ酸の残基がこれに該当する
。特にアセチル基及びベンゾイル基が有利である。
５％に１〜６の脂肪族カルボン酸又は芳香族カルボン酸
例えば安息香酸又はナフトエ酸の残基がこれに該当する
。特にアセチル基及びベンゾイル基が有利である。
”１ 、Ｒ′２ 、”３ 、”４及びｘ′ノ定義ニオは
ルア１Ｊ−ルもしくはアラルキル基とは、特にフエエル
基、ナフチル基もしくはベンジル基である。
ルア１Ｊ−ルもしくはアラルキル基とは、特にフエエル
基、ナフチル基もしくはベンジル基である。
Ａの定義におけるアミノ酸残基とは、有利にＬ−又はＤ
−盤又はラセミ形の天然の一アミノ酸の残基である。特
にグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、インロイシ
ン、フェニルアラニン及びチロシンの残基であり、この
際それぞれＬ−型が特に有利である。場合によって存在
する遊離ヒドロキシル基はアシル化特にアセチル化され
ていてよい。
−盤又はラセミ形の天然の一アミノ酸の残基である。特
にグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、インロイシ
ン、フェニルアラニン及びチロシンの残基であり、この
際それぞれＬ−型が特に有利である。場合によって存在
する遊離ヒドロキシル基はアシル化特にアセチル化され
ていてよい。
Ｂの定義におけるアミノ保騰基とは、例えばプルルー、
オキシカルボニル−、チオカルボニル−、スルホニル−
、スルフェニル、ビニル−、シクロヘキセニル−、ホス
ホリル−又はカルバモイル基である。
オキシカルボニル−、チオカルボニル−、スルホニル−
、スルフェニル、ビニル−、シクロヘキセニル−、ホス
ホリル−又はカルバモイル基である。
一般式■の本発明により使用されるジアゾニウム塩及び
一般式Ｈのエステルは、含浸溶液被願物質又は被検液体
１１当り１０−４モル／ｌ−１０−１モル／ｌ特に１０
−３モル／ｌ−１０−２モル／ｌの濃度で使用される。
一般式Ｈのエステルは、含浸溶液被願物質又は被検液体
１１当り１０−４モル／ｌ−１０−１モル／ｌ特に１０
−３モル／ｌ−１０−２モル／ｌの濃度で使用される。
蛋白分解酵素及び殊に白血球−テロチアーゼ含検出する
ための本発明による検出剤のもう１つの成分は適当な緩
衝剤系である。これには、例えば燐酸塩−、ホウ酸塩−
、バルビッール酸塩、トリス−（ヒドロキシルチル）−
アミノメタン−（＝トリス） 、２−アミノ−２−メチ
ル−プロパンジオール−１，３−（＝アメジオール）−
又はアミノ酸−緩衝剤が該当し、この際−値及びキャパ
シティは、測定溶液中もしくは試験片上の一値が６〜１
０特に７〜９になろように選択すべきである。
ための本発明による検出剤のもう１つの成分は適当な緩
衝剤系である。これには、例えば燐酸塩−、ホウ酸塩−
、バルビッール酸塩、トリス−（ヒドロキシルチル）−
アミノメタン−（＝トリス） 、２−アミノ−２−メチ
ル−プロパンジオール−１，３−（＝アメジオール）−
又はアミノ酸−緩衝剤が該当し、この際−値及びキャパ
シティは、測定溶液中もしくは試験片上の一値が６〜１
０特に７〜９になろように選択すべきである。
本発明による蛋白分解酵素の検出剤のもう１つの成分は
、湿潤剤であってよい。それというのも、これによって
均一な色素分配及び部分的に鮮明な色を得ることができ
るからである。カチオン−及びアニオン活性、かつ無定
形及び非イオン性湿潤剤も０．０５〜２（ｗ／ｖ）％特
に０．１〜１（ｗ／ｖ）＊の濃度で使用できる。
、湿潤剤であってよい。それというのも、これによって
均一な色素分配及び部分的に鮮明な色を得ることができ
るからである。カチオン−及びアニオン活性、かつ無定
形及び非イオン性湿潤剤も０．０５〜２（ｗ／ｖ）％特
に０．１〜１（ｗ／ｖ）＊の濃度で使用できる。
本発明の検出剤のもう１つの成分は安定剤としての一般
式■： Ｒ，＋ Ｐ ：Ｏ（ＶＩ） 〔式中Ｒ６はジアルキルアミノ−、アルコキシ−１了リ
ロキシ、アルキル又はアリール基又はＮ−モルホリノ基
を表わし、Ｒ７とＲ８はジアルキルアミノ基又はＮ−モ
ルホリノ基を表わす〕の燐酸−もしくはホスホン酸−了
ミドを使用することができる。
式■： Ｒ，＋ Ｐ ：Ｏ（ＶＩ） 〔式中Ｒ６はジアルキルアミノ−、アルコキシ−１了リ
ロキシ、アルキル又はアリール基又はＮ−モルホリノ基
を表わし、Ｒ７とＲ８はジアルキルアミノ基又はＮ−モ
ルホリノ基を表わす〕の燐酸−もしくはホスホン酸−了
ミドを使用することができる。
Ｆｌ、の定ａＫおけるアルコキシもしくはアルキル基と
しては、炭素原子数１０までの炭化水素基がこれに該幽
する。
しては、炭素原子数１０までの炭化水素基がこれに該幽
する。
Ｐ６．の定義における了り−ルもしくはアリロキシ基と
は、場合によってはハロゲン、低級プルキル−又は低級
アルコキシ基で置換されたフェニルースはナフチル基で
ある。
は、場合によってはハロゲン、低級プルキル−又は低級
アルコキシ基で置換されたフェニルースはナフチル基で
ある。
一般式■の化合物を用いて、処方の意想外の安定化が得
られる。
られる。
一般式■の燐酸アミド及びホスホン酸アミｙは、公知化
合物であり、これらは例えば西ドイツ特許出願公告第２
２３５１２７号明細書中で１ペルオキシダーゼ検出を基
礎として作用する試験片処方の安定剤として使用される
。
合物であり、これらは例えば西ドイツ特許出願公告第２
２３５１２７号明細書中で１ペルオキシダーゼ検出を基
礎として作用する試験片処方の安定剤として使用される
。
一般式■の燐酸アミド及びホスホン酸アミＦ型の安定剤
は、水性又は有利に有機含浸液に１〜２０（ｗ／ｖ）１
特に５〜１５（Ｗ／ｖ）％の濃度で添加される。
は、水性又は有利に有機含浸液に１〜２０（ｗ／ｖ）１
特に５〜１５（Ｗ／ｖ）％の濃度で添加される。
意外にも、本発明による珍断剤の蛋白分解酵素殊に蛋白
分解性白血球醇素の検出剤の反応時間は、ジアゾニウム
塩、エステル類及び従来挙げられている助剤に加えて、
１種以上の活性剤を使用する際に着るしく短縮される。
分解性白血球醇素の検出剤の反応時間は、ジアゾニウム
塩、エステル類及び従来挙げられている助剤に加えて、
１種以上の活性剤を使用する際に着るしく短縮される。
本発明による検出剤に好適な活性化剤としては、西ドイ
ツ特許出願第Ｐ２９０５５３１．０号明細書に記載され
ている化合物が判明している。
ツ特許出願第Ｐ２９０５５３１．０号明細書に記載され
ている化合物が判明している。
この活性化剤は、含浸溶液中で０．５〜１０％特１ｃ１
〜５（ｗ／ｖ）％の濃度で使用される。
〜５（ｗ／ｖ）％の濃度で使用される。
本発明による検出剤の製造のために、例えば吸着性担体
有利に濾紙、セルロース又は人造繊維フリースに、易揮
発性溶剤例えば水、メタノール、エタノール又はアセト
ン中のｇｍ片製造のために必要な通前使用される試薬（
基質、緩衝剤、場合によっては湿潤剤）の溶液を含浸さ
せる。これは、有利に２つの別個の工程で行なう即ち、
まず、緩衝液及び他の水溶性添加物金含有する水溶液で
含浸させる。その後、一般式「もしくは電のプロテアー
ゼ基質、一般式■のジアゾニウム塩及び活性化剤の溶液
で含浸する。
有利に濾紙、セルロース又は人造繊維フリースに、易揮
発性溶剤例えば水、メタノール、エタノール又はアセト
ン中のｇｍ片製造のために必要な通前使用される試薬（
基質、緩衝剤、場合によっては湿潤剤）の溶液を含浸さ
せる。これは、有利に２つの別個の工程で行なう即ち、
まず、緩衝液及び他の水溶性添加物金含有する水溶液で
含浸させる。その後、一般式「もしくは電のプロテアー
ゼ基質、一般式■のジアゾニウム塩及び活性化剤の溶液
で含浸する。
しかしながらとの含浸は、他の順序でもしくは双方の含
浸剤溶液の他の組成のものを用いて実施することかでき
る。
浸剤溶液の他の組成のものを用いて実施することかでき
る。
得られた試験紙は、そのまま使用できるか又は公知方法
で把手に接着して又は有利にプラスチックと細かい目の
網との間に西ドイツ特許第２１１８４５５号明細書記載
の方法で封入することもできる。
で把手に接着して又は有利にプラスチックと細かい目の
網との間に西ドイツ特許第２１１８４５５号明細書記載
の方法で封入することもできる。
膜被覆された試験片を製造するために１全試薬を膜形成
性物質例えばポリビニルエステル又はポリ了ミドの溶液
又は分散液中に入れ、均一に混合する。この混合物を薄
層でテラスチック担体上に塗布し、乾燥させる。本発明
による膜被覆された試験片管乾燥後に切断し、そのまま
使用するか又は公知方法で把手に接着し又は例えばプラ
スチックと細かい目の網との間に西ドイツ特許第２１１
８４５５号明細書記載の方法で封入することができる。
性物質例えばポリビニルエステル又はポリ了ミドの溶液
又は分散液中に入れ、均一に混合する。この混合物を薄
層でテラスチック担体上に塗布し、乾燥させる。本発明
による膜被覆された試験片管乾燥後に切断し、そのまま
使用するか又は公知方法で把手に接着し又は例えばプラ
スチックと細かい目の網との間に西ドイツ特許第２１１
８４５５号明細書記載の方法で封入することができる。
蛋白分解酵素殊に白血球プロテアーゼを検出するための
本発明による診断剤は、粉末混合物又は試薬錠剤の形で
製造でき、この際、テストの前記成分に慣用のガレヌス
製剤添加物を加え、造粒する。この種の添加物質は例え
ば炭水化物例えば七ノー、オリが−又はポリサッカライ
ド、又は糖アルコール例えばマンニット、ンルぎット又
はキシリット又は他の可溶性の不活性化合物例えはポリ
エチレングリコール又はポリビニルｔロリドンである。
本発明による診断剤は、粉末混合物又は試薬錠剤の形で
製造でき、この際、テストの前記成分に慣用のガレヌス
製剤添加物を加え、造粒する。この種の添加物質は例え
ば炭水化物例えば七ノー、オリが−又はポリサッカライ
ド、又は糖アルコール例えばマンニット、ンルぎット又
はキシリット又は他の可溶性の不活性化合物例えはポリ
エチレングリコール又はポリビニルｔロリドンである。
粉末混合物又は試薬錠剤は一般に約５０〜２００ＩＩ９
特に５０〜８０ダの最終重量を有する。
特に５０〜８０ダの最終重量を有する。
全重量的５〜２０Ｗ９特に約１０１ｎ９の凍結乾燥物を
製造するために１試験に必要なすべての試薬と共に慣用
の基剤物質例えばポリｔニルｔロリドン及び場合によっ
ては他の填料例えばマンニット、ソルビット又はキシリ
ットを含有する溶液を凍結乾燥させる。
製造するために１試験に必要なすべての試薬と共に慣用
の基剤物質例えばポリｔニルｔロリドン及び場合によっ
ては他の填料例えばマンニット、ソルビット又はキシリ
ットを含有する溶液を凍結乾燥させる。
本発明による溶液の形の診断剤は有利に試験に必要なす
べての試薬を含有している。溶剤として、水又は水と水
溶性有機溶剤例えばメタノール、エタノール、アセトン
又はジメチルホルムアミドとの混合物がこれに該当する
。貯蔵性の理由から、試験に必要な試薬ｔ−２種以上の
溶液に分け、これを、実際の検査の際にはじめて一緒に
するのが有利に可能である。
べての試薬を含有している。溶剤として、水又は水と水
溶性有機溶剤例えばメタノール、エタノール、アセトン
又はジメチルホルムアミドとの混合物がこれに該当する
。貯蔵性の理由から、試験に必要な試薬ｔ−２種以上の
溶液に分け、これを、実際の検査の際にはじめて一緒に
するのが有利に可能である。
こうし工製造した診断剤は、被検体液に浸漬するか又は
当該体液の添加の後に、蛋白分解酵素殊に白血球プロテ
アーゼの存在を、迅速かつ簡単に可視で又は光度測定に
より、例えばレミッションフォトメトリーにより又はキ
ュヘラ）中で評価できる色素形成により検出可能とする
＠１細胞当りの白血球−デロチアーゼの活性は実際に一
定の大きさとみなすことができるから、色形成の強さか
ら被検体液の白血球濃度を測定することができる。この
場合、本発明による診断剤を用いて、完全な白血球も溶
解した白血球も捕捉される。それというのも、白血球−
デロチアーゼの活性は、白血球の溶解の後にも完全に残
存するからである。溶解１差は結果的に現われない。
当該体液の添加の後に、蛋白分解酵素殊に白血球プロテ
アーゼの存在を、迅速かつ簡単に可視で又は光度測定に
より、例えばレミッションフォトメトリーにより又はキ
ュヘラ）中で評価できる色素形成により検出可能とする
＠１細胞当りの白血球−デロチアーゼの活性は実際に一
定の大きさとみなすことができるから、色形成の強さか
ら被検体液の白血球濃度を測定することができる。この
場合、本発明による診断剤を用いて、完全な白血球も溶
解した白血球も捕捉される。それというのも、白血球−
デロチアーゼの活性は、白血球の溶解の後にも完全に残
存するからである。溶解１差は結果的に現われない。
例 １
濾紙（例えば５ｃｈｌｅｉａｈｅｒ ＆ ８ｃｈｕａｌ
ｌ ２３８Ｌ）管順次に次の溶液で含浸し、次いて６０
℃で乾燥させる： 溶液１ ０．２モルホラックス−塩酸−緩衝液（ｐＨ８）燐酸ト
リモルホリド １０％ 溶液２ 基質 ２に１０−３モル／フジ
了ψニウム塩 １０−２モル／ｌを
７七トン／１−デカノール９８：２中に溶かす。
ｌ ２３８Ｌ）管順次に次の溶液で含浸し、次いて６０
℃で乾燥させる： 溶液１ ０．２モルホラックス−塩酸−緩衝液（ｐＨ８）燐酸ト
リモルホリド １０％ 溶液２ 基質 ２に１０−３モル／フジ
了ψニウム塩 １０−２モル／ｌを
７七トン／１−デカノール９８：２中に溶かす。
基質
８１：３−ＣＮ−（）ルオールー４′−スルホニル）−
Ｌ−アラニルオキシ〕−インドール ジアゾニウム塩 Ｄｌ：２．４−ジメトキシ−ペンゾールジアゾニウム−
テトラフルオロボレート Ｄ２：４−メトキシ−ナフタリン−１−シアゾニウム−
テトラフルオロボレート Ｄ３：２，５−ジメトキシ−４−ジメチルアミノ−ペン
ゾールジアゾニウム−テト ラフルオロポレート Ｄ４：４−ジメチルアミノ−ペンゾールジアゾニウム−
テトラフルオロポレート 白血球含有尿（白血球１００／尿μｌ）中に浸漬する際
に、約３分以内に表に示すような色を示す試験紙が得ら
れる。評価はレミッションフォトメーターで行なうこと
もできる。
Ｌ−アラニルオキシ〕−インドール ジアゾニウム塩 Ｄｌ：２．４−ジメトキシ−ペンゾールジアゾニウム−
テトラフルオロボレート Ｄ２：４−メトキシ−ナフタリン−１−シアゾニウム−
テトラフルオロボレート Ｄ３：２，５−ジメトキシ−４−ジメチルアミノ−ペン
ゾールジアゾニウム−テト ラフルオロポレート Ｄ４：４−ジメチルアミノ−ペンゾールジアゾニウム−
テトラフルオロポレート 白血球含有尿（白血球１００／尿μｌ）中に浸漬する際
に、約３分以内に表に示すような色を示す試験紙が得ら
れる。評価はレミッションフォトメーターで行なうこと
もできる。
基質 ジアゾニウム塩 色８１Ｄ１
赤褐色 θＩ Ｄ２ 赤褐色８１Ｄ３
青灰色 日Ｉ Ｄ４ 緑色 例 ２ 濾紙に次の溶液を含浸させ６０℃で乾燥させる。
赤褐色 θＩ Ｄ２ 赤褐色８１Ｄ３
青灰色 日Ｉ Ｄ４ 緑色 例 ２ 濾紙に次の溶液を含浸させ６０℃で乾燥させる。
溶液１
０６１モルのホウ酸塩−緩衝液（ｐ）１８）溶液２
２−メトキシ−４−（Ｎ−モルホリノ）−ベンゾールジ
アゾニウムテトラクロルジンケー）
２Ｘ１０−３モル／ｌ基 質
２に１０−ζル／ｌ
燐酸トリモルホリド １０％を
エタノール／１−デカノール９８：２中に溶かす。
アゾニウムテトラクロルジンケー）
２Ｘ１０−３モル／ｌ基 質
２に１０−ζル／ｌ
燐酸トリモルホリド １０％を
エタノール／１−デカノール９８：２中に溶かす。
基質
Ａ：３−［Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−了う二
ルオ中シ〕−インドール Ｂ： ３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラ
ニルオキシ〕−５−メチル−インＦ−ル ０：３−（１１−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−７ラ
ニルオキシ〕−７−メチル−インＦ−ル Ｄ：３−［１１−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラ
ニルオキシ］−４−クロル−インドール ！ｌ：３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラ
ニルオ中シ〕−５−ブロムーインｒ−ル ＩＦ：３−（Ｎ−（トルオ−ルー４′−スルホニル）−
Ｉａ−７ラエルオキシ〕−インドール Ｇ：３−（Ｎ−（トルオ−ルー４′−スルホニル）−ｒ
、＋−アラニルオキシ〕−５−メトキシ−インドール Ｂ ： ３− ＣＭ −（４’−アセタミドペンゾール
スルホニル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−インｒ−ル エ：３−［１−（４’−メトキシトシル）−Ｌ−アラニ
ルオΦシ〕−インドール こうして得た試験紙を用いて、白血球含有尿中の白血球
１００／μｌを検出することができる。
ルオ中シ〕−インドール Ｂ： ３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラ
ニルオキシ〕−５−メチル−インＦ−ル ０：３−（１１−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−７ラ
ニルオキシ〕−７−メチル−インＦ−ル Ｄ：３−［１１−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラ
ニルオキシ］−４−クロル−インドール ！ｌ：３−（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−アラ
ニルオ中シ〕−５−ブロムーインｒ−ル ＩＦ：３−（Ｎ−（トルオ−ルー４′−スルホニル）−
Ｉａ−７ラエルオキシ〕−インドール Ｇ：３−（Ｎ−（トルオ−ルー４′−スルホニル）−ｒ
、＋−アラニルオキシ〕−５−メトキシ−インドール Ｂ ： ３− ＣＭ −（４’−アセタミドペンゾール
スルホニル）−Ｌ−アラニルオキシ〕−インｒ−ル エ：３−［１−（４’−メトキシトシル）−Ｌ−アラニ
ルオΦシ〕−インドール こうして得た試験紙を用いて、白血球含有尿中の白血球
１００／μｌを検出することができる。
前記のジアゾニウム塩の代りに次のものを使用する際に
匹敵しうる反応性を有する試験紙を得ることもできる： ２−メトキシ−４−（Ｎ−ピペリジノ）−ペンゾールジ
アゾニウム−テトラフルオロボレート、２−メトキシ−
４−（Ｍ−ピペリジノ）−ペンゾールジアゾニウム−テ
トラフルオロボレート、２．６−シメトキシー４−（Ｎ
−モルホリノ）−ペンゾールジ了ゾニウムーテトラフル
オロポレード、４７メトΦシー２− （Ｎ−モルホリノ
）−ペンゾールジアゾニウム−テトラフルオロポレート
、２−メトキシ−４−（Ｎ−（Ｎ／−メチル）−ピペラ
ジノコ−ペンゾールジアゾニウム−テトラフルオロポレ
ート、２−メトキシ−４−（Ｎ−チオモルホリノ）−ペ
ンゾールジアゾニウム−テトラフルオロポレート。
匹敵しうる反応性を有する試験紙を得ることもできる： ２−メトキシ−４−（Ｎ−ピペリジノ）−ペンゾールジ
アゾニウム−テトラフルオロボレート、２−メトキシ−
４−（Ｍ−ピペリジノ）−ペンゾールジアゾニウム−テ
トラフルオロボレート、２．６−シメトキシー４−（Ｎ
−モルホリノ）−ペンゾールジ了ゾニウムーテトラフル
オロポレード、４７メトΦシー２− （Ｎ−モルホリノ
）−ペンゾールジアゾニウム−テトラフルオロポレート
、２−メトキシ−４−（Ｎ−（Ｎ／−メチル）−ピペラ
ジノコ−ペンゾールジアゾニウム−テトラフルオロポレ
ート、２−メトキシ−４−（Ｎ−チオモルホリノ）−ペ
ンゾールジアゾニウム−テトラフルオロポレート。
例 ３
濾紙に次の溶液を含浸させ、との含浸の後にそれぞれ６
０ ’Ｃで乾燥させる。
０ ’Ｃで乾燥させる。
溶液１
アセトン／１−デカノール（９８：２）中の３−（Ｎ−
トルオ−ルー４′−ス ルホニル−Ｌ−７ラニルオキシ）− インド−／Ｌ−２に１０−３モル／Ｅ ２−メトキシー４−モルホリノー ベンゾールジアゾニウム−テトラ クロルジンケー） ２Ｘ１０
−３モへ／ｌ溶液２ ０．２モルのボラツクスー塙酸− 緩衝液（ｐ）１８ ）燐酸トリモルホ リド １０ｑｂもう１
つの実験で、溶液２中の燐酸トリモルホリドを用いた。
トルオ−ルー４′−ス ルホニル−Ｌ−７ラニルオキシ）− インド−／Ｌ−２に１０−３モル／Ｅ ２−メトキシー４−モルホリノー ベンゾールジアゾニウム−テトラ クロルジンケー） ２Ｘ１０
−３モへ／ｌ溶液２ ０．２モルのボラツクスー塙酸− 緩衝液（ｐ）１８ ）燐酸トリモルホ リド １０ｑｂもう１
つの実験で、溶液２中の燐酸トリモルホリドを用いた。
燐酸トリモルホリドを有する見本は６０°Ｃで２日間に
わたる負荷の後に変色しないまま残った。燐酸トリモル
ホリドを含まない見本は灰色に変色する。
わたる負荷の後に変色しないまま残った。燐酸トリモル
ホリドを含まない見本は灰色に変色する。
例 ４
公知方法で、次の成分を含有する試薬錠剤を製造した：
３−（Ｎ−）ルオールー４′−スルホニルーＬ−アラニ
ルオキシ）−インドール ２Ｉｎ９２−メトキシ
−４−（Ｎ−モルホリノ）−ベンプール−ジアゾニウム
テトラクロルジンケート
２■燐酸二水素カリウム １
．５１９燐酸水素ジナトリウム・２水和物 ３
０■マンニツト ２０■
この錠剤を白血球２０個２１中に溶かし、良好に混合す
る。白血球が存在する場合に赤紫色変色が現われた。
ルオキシ）−インドール ２Ｉｎ９２−メトキシ
−４−（Ｎ−モルホリノ）−ベンプール−ジアゾニウム
テトラクロルジンケート
２■燐酸二水素カリウム １
．５１９燐酸水素ジナトリウム・２水和物 ３
０■マンニツト ２０■
この錠剤を白血球２０個２１中に溶かし、良好に混合す
る。白血球が存在する場合に赤紫色変色が現われた。
白血球１００個は約２分以内に検出できた。
尿を錠剤添加前及び反応の間に３７℃の温度に保持する
と、同じ時間内に白血球２０個が検出できた。
と、同じ時間内に白血球２０個が検出できた。
例 ５
２−メトキシ−４−（Ｎ−モルホリノ）−ベン！−ルジ
了ゾニウムーテトラクロルジンケート５−／コル−２−
二トロチ＝７−ルヲ１．５倍モル過剰のモルホリンと共
に溶剤としてのドルオール中で数時間加熱により還流下
Ｋ（１０〜１４時間）反応させる。反応は溶剤としての
モルホリン中で実施するのが有利である。このために、
この５−クロル−２−ニトロアニソールに５〜１０倍景
のモルホリンを加える。場合により脱メチル化された生
成物を苛性ソーダと共に振ることにより分離させるか又
はジアゾメタンとの反応により後メチル化する。
了ゾニウムーテトラクロルジンケート５−／コル−２−
二トロチ＝７−ルヲ１．５倍モル過剰のモルホリンと共
に溶剤としてのドルオール中で数時間加熱により還流下
Ｋ（１０〜１４時間）反応させる。反応は溶剤としての
モルホリン中で実施するのが有利である。このために、
この５−クロル−２−ニトロアニソールに５〜１０倍景
のモルホリンを加える。場合により脱メチル化された生
成物を苛性ソーダと共に振ることにより分離させるか又
はジアゾメタンとの反応により後メチル化する。
得られたニトロ化合物を常法でメタノール中のパラジウ
ム／炭又は塩酸中の塩化錫（１）で還元してアミドにし
、次いでこれをジアゾ化する。
ム／炭又は塩酸中の塩化錫（１）で還元してアミドにし
、次いでこれをジアゾ化する。
このジアゾニウム化合物を公知方法で塩酸溶液中で製塩
化錫溶液の添加により、テトラクロルジンケートに変る
か又はテトラフルオロホウ酸−の添加によりテトラフル
オロポレートＫｆｆｉえ、そわ自身を単離する。
化錫溶液の添加により、テトラクロルジンケートに変る
か又はテトラフルオロホウ酸−の添加によりテトラフル
オロポレートＫｆｆｉえ、そわ自身を単離する。
融点１７０〜１７２°Ｃ
（テトラクロルジンケート）
１６６〜１６８°Ｃ
（テトラフルオロポレート）
例 ６
４−メトキシ−２−（Ｎ−モルホリノ）−ンゾールジア
プニウムーテトラフルオロポレート３−クロル−４−二
トロアニソール（融点５２°Ｃ）１８．７６ｇ（０，１
モル）をモルホリノ８７．１９ （１モル）と共に還流
下に４時間加熱する。その後、室温まで冷却し、反応溶
液に氷水１００ｉｙｔ加え、析出した黄色反応生成物を
吸引し、水冷１０％酢酸で洗浄し、得られた物質′ｔ−
６０℃、真空中で乾燥させる。Ｎ−（３−ヒドロキシ−
６−ニトロフェニル）−モルホリン及ヒＮ −（３−メ
トキシ−６−ニトロフェニル）−モルホリンかうなる混
合物１９．５ｇが生じる。この生成物を塩化メチンン中
に溶かし、ジアゾメタンのエーテル溶液を加える。室温
で２日放置の後に過剰のジアゾメタンを２Ｎ酢酸の添加
により分解し、有機相を２Ｎ苛性ンーダで数回振出し、
溶剤を真空中で溜去する。Ｎ−（３−メトキシ−６−二
トロフエニル）モルホリン（融点８４〜８６°０） １
９．１ 、！ｉ’ （−８０，２％）が得られる。引続
き、これら物質をメタノール２５０１中で懸濁させ、パ
ラジウム−炭（１０％）１．９Ｆの添加の後に２０〜３
０’Ｃで水性添加する。
プニウムーテトラフルオロポレート３−クロル−４−二
トロアニソール（融点５２°Ｃ）１８．７６ｇ（０，１
モル）をモルホリノ８７．１９ （１モル）と共に還流
下に４時間加熱する。その後、室温まで冷却し、反応溶
液に氷水１００ｉｙｔ加え、析出した黄色反応生成物を
吸引し、水冷１０％酢酸で洗浄し、得られた物質′ｔ−
６０℃、真空中で乾燥させる。Ｎ−（３−ヒドロキシ−
６−ニトロフェニル）−モルホリン及ヒＮ −（３−メ
トキシ−６−ニトロフェニル）−モルホリンかうなる混
合物１９．５ｇが生じる。この生成物を塩化メチンン中
に溶かし、ジアゾメタンのエーテル溶液を加える。室温
で２日放置の後に過剰のジアゾメタンを２Ｎ酢酸の添加
により分解し、有機相を２Ｎ苛性ンーダで数回振出し、
溶剤を真空中で溜去する。Ｎ−（３−メトキシ−６−二
トロフエニル）モルホリン（融点８４〜８６°０） １
９．１ 、！ｉ’ （−８０，２％）が得られる。引続
き、これら物質をメタノール２５０１中で懸濁させ、パ
ラジウム−炭（１０％）１．９Ｆの添加の後に２０〜３
０’Ｃで水性添加する。
触媒の濾去の後に、充分に濃縮し、遊離した塩基をエー
テル性塩酸の添加により塩酸塩に変える。Ｎ−（６−ノ
ドキシ−６−アミノ−フェニル）モルホリン−２塩酸（
融点２３７〜２４０℃）２０．６ｇ（−理論量の７３．
１％）が晶出する。
テル性塩酸の添加により塩酸塩に変える。Ｎ−（６−ノ
ドキシ−６−アミノ−フェニル）モルホリン−２塩酸（
融点２３７〜２４０℃）２０．６ｇ（−理論量の７３．
１％）が晶出する。
この物質を一５°Ｃで６Ｎ塩酸９６ｗ１中に懸濁させ、
３０分かかって水１２１中に亜硝酸ナトリウム６ｇの溶
液を滴加し、生じる褐赤色シアゾニウム塩溶液を０°Ｃ
１攪拌下に３５％テトラフルオロホウ酸１２０罰に加え
る。数時間放置の後に４−メトキシ−２−（Ｎ−モルホ
リノ）−ペンゾールジアゾニウムテトラフルオロボレー
） １９．５ ｇ（−理論量の６３５チ）が得られる
。黄色結晶、融点１１５〜１１６°Ｃ（分解）。
３０分かかって水１２１中に亜硝酸ナトリウム６ｇの溶
液を滴加し、生じる褐赤色シアゾニウム塩溶液を０°Ｃ
１攪拌下に３５％テトラフルオロホウ酸１２０罰に加え
る。数時間放置の後に４−メトキシ−２−（Ｎ−モルホ
リノ）−ペンゾールジアゾニウムテトラフルオロボレー
） １９．５ ｇ（−理論量の６３５チ）が得られる
。黄色結晶、融点１１５〜１１６°Ｃ（分解）。
同様な方法で、
（ａ） ５−クロル−２−ニトロアニンール及ヒチオ
モルホリンから２−メトキシ−４−（Ｎ−チオモルホリ
ノ）−ベンシールシアゾニウムテトラフルオロボレート
が得られる。
モルホリンから２−メトキシ−４−（Ｎ−チオモルホリ
ノ）−ベンシールシアゾニウムテトラフルオロボレート
が得られる。
融点１０６〜１０８°Ｃ（分解）。
中間体２−アミノ−５−（Ｎ−チオモルホリノ）−アニ
ソール・２塩酸は次のようにして製造される。
ソール・２塩酸は次のようにして製造される。
攪拌機全備えた１ｊ−三頚フラスコ中に、６Ｎ塩酸４０
０罵１中の塩化錫（［１）・２水和物１００ｇを装入し
、Ｎ−ニトロ−５−（Ｎ−チオモルホリノ）アニソール
２５．４９ ｔ−少量宛室温で攪拌下に加える。その後
７５℃に３０分間加熱し、室温まで冷却し、反応溶液を
氷冷下に３０チ苛性ンーダ７５０１ｔｌ中に滴加する。
０罵１中の塩化錫（［１）・２水和物１００ｇを装入し
、Ｎ−ニトロ−５−（Ｎ−チオモルホリノ）アニソール
２５．４９ ｔ−少量宛室温で攪拌下に加える。その後
７５℃に３０分間加熱し、室温まで冷却し、反応溶液を
氷冷下に３０チ苛性ンーダ７５０１ｔｌ中に滴加する。
遊離した塩基をエーテルで数回抽出し、これを乾燥及び
溶剤の部分的蒸発の後に、エーテル性塩酸の添加により
塩酸塩に変える。
溶剤の部分的蒸発の後に、エーテル性塩酸の添加により
塩酸塩に変える。
２−アミノ−５−（Ｎ−チオモルホリノ）−アニソール
・２塩酸（融点２１８〜２２０°Ｃ）２４．９ ｇ（−
理論量の８６．８％）が得られる。
・２塩酸（融点２１８〜２２０°Ｃ）２４．９ ｇ（−
理論量の８６．８％）が得られる。
（ｂ１５１０ルー２−ニトロアニンール及びぎリシンか
ら２−メトキシ−４−（Ｎ−ビペリゾノ）−ペンゾール
ジアゾニウム−テトラフルオロボレートが得られた。
ら２−メトキシ−４−（Ｎ−ビペリゾノ）−ペンゾール
ジアゾニウム−テトラフルオロボレートが得られた。
融点１２６〜１２５℃（分解）
（ｃ１５−／コル−２−ニトロアニンール及びピロリシ
ンから２−メトキシ−４−（Ｎ−ピロリシン）−ベンシ
ールジアゾニウム−テトラフルオロボレートが得られた
。
ンから２−メトキシ−４−（Ｎ−ピロリシン）−ベンシ
ールジアゾニウム−テトラフルオロボレートが得られた
。
融点１３７〜１３９°Ｃ（分解）
（ｄ）５−クロル−２−ニトロアニンール及びＮ−メチ
ルー−ペラジンから２−メトキシ−４−（Ｎ −（Ｎ’
−メチル）−ピペラジノ〕−ベンゾールジアゾニウムー
テトラフルオロピレートが得られる。
ルー−ペラジンから２−メトキシ−４−（Ｎ −（Ｎ’
−メチル）−ピペラジノ〕−ベンゾールジアゾニウムー
テトラフルオロピレートが得られる。
融点１６３°Ｃ（分解）。
この化合物の製造時に、メタノール中の亜硝酸アミルを
用いるジアゾ化を行なう。このために、２−アミノ−５
−（Ｎ−メチルービペラゾノ）アニン−ルージヒドロ−
テトラフルオロボレート３９．６ ｇ（０，１モル）全
メタノール１７５ｄ中に溶かし、メタノール２５１中の
亜硝酸アミル１１．６ｇ（０，１モル）″に加え、徐々
に０℃で攪拌下に６５％四弗化ホウ酸６０１ｔ−滴加す
る。放置時に２−メトキシ−４−ＣＮ −（Ｎ’−メチ
ル）ピペラジノ〕−ベンゾールゾアゾニウムーテトラフ
ルオロボレートージヒドローテトラフルオロボレ−トの
褐色結晶２４．８ ｇ（−理論量の５１．７％）が得ら
れ喪。
用いるジアゾ化を行なう。このために、２−アミノ−５
−（Ｎ−メチルービペラゾノ）アニン−ルージヒドロ−
テトラフルオロボレート３９．６ ｇ（０，１モル）全
メタノール１７５ｄ中に溶かし、メタノール２５１中の
亜硝酸アミル１１．６ｇ（０，１モル）″に加え、徐々
に０℃で攪拌下に６５％四弗化ホウ酸６０１ｔ−滴加す
る。放置時に２−メトキシ−４−ＣＮ −（Ｎ’−メチ
ル）ピペラジノ〕−ベンゾールゾアゾニウムーテトラフ
ルオロボレートージヒドローテトラフルオロボレ−トの
褐色結晶２４．８ ｇ（−理論量の５１．７％）が得ら
れ喪。
融点１６３°Ｃ（分解）。
（ｅ１５−クロル−２−ニトロアニンールとモルホリン
とから２−メトキシ−４−（Ｎ−モルホリノ）−ペンゾ
ールジアゾニウム−テトラフルオロ？レートが得られた
。
とから２−メトキシ−４−（Ｎ−モルホリノ）−ペンゾ
ールジアゾニウム−テトラフルオロ？レートが得られた
。
融点１６６〜１６８℃（分解）。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、吸着性担体、フィルム層、粉末混合物、凍結乾燥物
質、過当なエステラーゼ−及び／又はプロテアーゼ−検
出系、緩衝液、並びに場合によつては、更に慣用の添加
物を含有する溶液又は試薬錠剤よりなるエステル分解−
及び／又は蛋白質分解酵素の検出剤において、エステラ
ーゼ−及び／又はプロテアーゼ−検出系として、一般式
I ： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 〔式中、Ｒ＿１は低級アルキル基、低級アルコキシ基、
低級アルキルメルカプト基、Ｎ−モルホリノ基、Ｎ−チ
オ−モルホリノ基、Ｎ−ピロリジノ基、Ｎ′−アルキル
化されていてもよいＮ−ピペラジノ基、Ｎ−ピペリジノ
基、ハロゲン又は水素を表わし、Ｒ＿３は低級アルキル
基、低級アルコキシ基、アリールオキシ基、低級アルキ
ルメルカプト基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ
基、ヒドロキシ基、Ｎ−モルホリノ基、Ｎ−チオ−モル
ホリノ基、Ｎ−ピロリジノ基、Ｎ′−アルキル化されて
いてもよいＮ−ピペラジノ基、Ｎ−ピペリジノ基、フェ
ニルアミノ基、低級アルキル又は低級アルコキシ基で置
換されていてもよいフェニル基、ハロゲン又は水素を表
わし、Ｒ＿２、Ｒ＿４、Ｒ＿５は同一又は異なるもので
あつてよく、それぞれ、低級アルキル基、低級アルコキ
シ基、低級アルキルメルカプト基、ハロゲン又は水素を
表わし、Ｘは安定化性アニオンを表わす〕のジアゾニウ
ム塩と一般式II： ▲数式、化学式、表等があります▼（II） 〔式中Ｒ′＿１、Ｒ′＿２、Ｒ′＿３、Ｒ′＿４は同一
又は異なるものであつてよく、それぞれ、水素原子又は
ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、ア
リール基、アラルキル基、アラルコキシ基、ヒドロキシ
基、カルボキシ基、カルボキシ低級アルコキシ基、アラ
ルコキシカルボニル基、アラルコキシ−カルボニル−低
級アルコキシ基、ニトロ基又は低級アシルアミノ基を表
わすか又は、各々隣接している２個の置換分は一緒にな
つてハロゲン原子で置換されていてもよいベンゾール環
を形成していてもよく、Ｘ′は硫黄原子又は１個の低級
アルキル、アリール、アラルキル又はアシル基で置換さ
れていてもよいイミノ基を表わし、Ａは天然α−アミノ
酸を表わし、Ｂはアミノ保護基を表わす〕の化合物〔式
中Ｒ″＿１、Ｒ″＿２、Ｒ″＿３、Ｒ″＿４は同一又は
異なるものであつてよく、それぞれ、水素、低級アルキ
ル基、低級アルコキシ基、アルキルアミノ基又はジアル
キルアミノ基を表わし、この際、隣接している２個の置
換分は縮合ベンゾール環を形成していてもよく、Ａ及び
Ｂは前記のものを表わす〕の化合物とからなる組成物を
使用することを特徴とする、エステル分解及び／又は蛋
白質分解酵素の検出剤。 ２、付加的に、助剤、湿潤剤、安定剤、活性化剤、膜形
成剤、ガレヌス製剤添加物及び／又は基剤を使用する、
特許請求の範囲第１項記載の検出剤。
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|---|---|---|---|
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| DE19803017721 DE3017721A1 (de) | 1980-05-09 | 1980-05-09 | Mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme und dafuer geeignete substrate |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
| JP6927981A Granted JPS578798A (en) | 1980-05-09 | 1981-05-08 | Detecting agent of ester decomposing and / or protein decomposing enzyme and base medium thereof |
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| DE3309544A1 (de) * | 1983-03-17 | 1984-09-20 | Macherey-Nagel & Co Chemikalienhandel, 5160 Düren | Teststreifen zum nachweis von leukozyten im harn |
| DE3329394A1 (de) * | 1983-08-13 | 1985-02-28 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Chromogene und fluorogene carbonsaeureester, verfahren zu deren herstellung sowie verfahren und mittel zum nachweis und zur bestimmung von hydrolasen |
| DE3484867D1 (de) * | 1983-12-14 | 1991-09-05 | Upjohn Co | Substituierte naphthalene, indole, benzofurane und benzothiophene als lypoxygenase-inhibitoren. |
| US4657855A (en) * | 1984-04-06 | 1987-04-14 | Miles Laboratories, Inc. | Composition and test device for determining the presence of leukocytes, esterase and protease in a test sample |
| DE3413118A1 (de) * | 1984-04-06 | 1985-10-24 | Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. | Analysenverfahren und mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme |
| US4637979A (en) * | 1984-04-06 | 1987-01-20 | Miles Laboratories, Inc. | Composition and test device for determining the presence of leukocytes containing a zwitterion coupling agent |
| DE3413077A1 (de) * | 1984-04-06 | 1985-10-17 | Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. | Chromogene aminosaeure- und peptidester, verfahren zu deren herstellung, verwendung dieser verbindungen in analysenverfahren sowie mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme |
| DE3413120A1 (de) * | 1984-04-06 | 1985-10-24 | Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. | Analysenverfahren und mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme |
| DE3413119A1 (de) * | 1984-04-06 | 1985-10-24 | Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. | Analysenverfahren und mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme |
| DE3413078A1 (de) * | 1984-04-06 | 1985-10-24 | Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. | Chromogene aminosaeure- und peptidester, verfahren zu deren herstellung, verwendung dieser verbindungen in analysenverfahren sowie mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme |
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