Przedmiotem wynalazku jest srodek do ozna¬ czania esterolitycznych i/albo proteolitycznych en¬ zymów.W diagnostyce schorzen nerek i ukladu moczo¬ wo-plciowego duze znaczenie ma oznaczenie leuko¬ cytów w moczu. Dotychczas oznaczanie to prowa¬ dzono mikroskopowo w ten sposób, ze liczono pod mikroskopem leukocyty znajdujace sie w okreslonej objetosci moczu. Jednakze metoda ta jest bardzo czasochlonna, klopotliwa oraz mecza¬ ca i poza tym wymaga wyszkolonego personelu.Jako podstawe oznaczania leukocytów w róznych plynach ustrojowych próbowano od pewnego cza¬ su wprowadzic reakcje enzymatyczne, poniewaz leukocyty wykazuja szerokie spektrum enzyma¬ tyczne.Znane sa z opisów ogloszeniowych RFN nr 28 26 965 oraz nr 28 36 644 srodki do oznaczania leukocytów w plynach ustrojowych, w których do celów analitycznych wykorzystuje sie wystepuja¬ ca w leukocytach esterolityczna i/albo proteolitycz¬ na aktywnosc. Przy tym estry sulfonftaleinowe wzglednie estrowe barwniki azowe stosuje sie ja¬ ko substraty dla esteraz i/albo proteaz leukocy¬ tów. Uwalniane przy enzymatycznej reakcji barw¬ niki ocenia sie na ogól znanymi metodami. Przed¬ stawione w tych opisach srodki sa jeszcze za ma¬ lo czule. Wykazuja one zbyt dlugie czasy reakcji dla dolnej granicy oznaczania tak, ze praktyczne stosowanie ich zwiazane jest z pewnymi niedogod- 10 30 nosciami, a przede wszystkim za dlugimi czasami oczekiwania przy przeprowadzaniu testu.Rózne metody oznaczania proteaz i esteraz zna¬ ne sa tez z histo- i cytochemicznej enzymologii przykladowo A.G.E. Pearse, Histochemdstry, Theo- retical and Applied, 3. Ed., Churchill Livingstone, Edinburgh-London-New York 1968. W zasadzie sto¬ suje sie przy tym równiez bezbarwne albo slabo zabaorwione estry, które przez enzymatyczne roz¬ szczepianie najczesciej rozpadaja0sie na bezbarwny kwas i równiez bezbarwny skladnik akloholowy (fenolowy). Ostatni w reakcji nastepujacej po en¬ zymatycznym zmydleniu przeksztalca sie w barwne produkty, na przyklad przez sprzegniecie z solami dwuazoniowymi albo przez reakcje utlenienia.F. Schmalzl i H. Braunsteiner opisuja na przy¬ klad w Klin. Wschr. 46, 642 (1968) charaktery¬ styczne cytochemiczne oznaczanie esteraz leukocy¬ tów naftoio-ASjD^ohlorooctanem jako sufostralem i sola dwuazoniowa celem utworzenia barwnego azozwiazku.Dwuskladnikowe uklady tego rodzaju okazaly sie nieodpowiednie jako srodek do szybkiego i prostego oznaczania leukocytów w plynach ustro¬ jowych, jak na przyklad w moczu. Sa one o wiele za malo czule. Przykladowo próby o 5000 leuko¬ cytach jil nie wykazuja reakcji. Poza tym z sola¬ mi dwuazoniowymi reaguje, jak wiadomo, wiele zwiazków obecnych w moczu, jak urobilinogen, sterkobilinogen, bilirubina oraz inne. Tego dowo- 131123131123 s dza najlepiej znajdujace sie w handlu opatento¬ wane testy do oznaczania uróbilinogenu lub biliru¬ biny w moczu, które stosuje sie do reakcji wykry¬ wania soli dwuazoniowych. Stosowane wedlug li¬ teratury do oznaczania esteraz sole dwuazoniowe wykazuja opisana reakcje uboczna z innymi sklad¬ nikami moczu i nie nadaja sie do uzycia na test leukoeytowy po czesci takze ze wzgledu na wlasne zabarwienie.Zadaniem omawianego wynalazku bylo opraco¬ wanie srodka do oznaczania w krótkim czasie, w prosty i latwy do wykonania sposób i który nie daje zaklócajacych reakcji ubocznych z innymi skladnikami badanej próby, esterolitycznych i/albo proteolitycznych enzymów na bazie kombinacji estrów i soli dwuazoniowych jako skladników re¬ akcji dla tych enzymów.Zadanie to rozwiazano w ten sposób, ze stosuje sie okreslona kombinacje odpowiednich estrów i specjalnie podstawionych soli dwuazoniowych, przy czym stosowane sole dwuazoniowe nieoczeki¬ wanie nie wchodza w reakcje uboczne z innymi skladnikami moczu, jak na przyklad z bilirubina i urobilinogenem, lecz charakterystycznie i szybko sprzegaja skladniki fenolowe powstajace przy roz¬ szczepieniu stosowanych estrów, tworzac barwny zwiazek.Odpowiednie estry musza byc wystarczajaco reaktywne wobec estrolitycznych i/albo proteoli¬ tycznych enzymów, aby mozliwie szybko ulegaly rozszczepieniu na skladniki kwasowe i alkoholowe (pod którymi rozumie sie takze fenole). Estry wy¬ biera sie tak, aby uwolnione Skladniki alkoholowe dobrze i calkowicie ulegaly sprzegnieciu z uzyty¬ mi solami dwuazoniowymi. Reaktywnosc soli dwu¬ azoniowych musi byc tak dobrana przez odpowied¬ ni rwybór podstawników, aby odbylo sie szybkie sprzegniecie ze skladnikami alkoholowymi uwol¬ nionymi ze stosowanych w srodku wedlug wyna¬ lazku estrów, ale aby nie zachodzila reakcja ubo¬ czna z innymi skladnikami badanego roztworu..Przedmiotem omawianego wynalazku sa zatem srodki do oznaczania esterolitycznych i/albo proteo¬ litycznych enzymów, szczególnie obecnych w leuko¬ cytach esteraz i/albo proteaz, w postaci, pasków testowych na chlonnym nosniku, warstwy folii, mieszanki proszkowej, liofilizatu, roztworu lub ta¬ bletki odczynnikowej, które zawieraja odpowiednia podstawe, oznaczania esteraz wzglednie proteaz, bu¬ for oraz ewentualnie dalsze stosowane zwykle sub¬ stancje dodatkowe, charakteryzujace sie tym, ze jako podstawe oznaczania esteraz wzglednie pro¬ teaz stosuje sie kombinacje zlozona ze specjalnie podstawionej soli dwuazoniowej i odpowiedniego estru, których reaktywnosc dobiera sie przez od¬ powiedni wybór podstawników tak, aby nastapi¬ lo wystarczajaco szybkie sprzegniecie ze skladni¬ kiem alkoholowym uwolnionym z estru, jednak aby nie nastapila reakcja z innymi skladnikami badanego roztworu.Odpowiednio podstawionymi solami dwuazonio¬ wymi w srodku wedlug wynalazku sa zwiazki o wzorze ogólnym 1, w którym B.t oznacza niska grupe alkilowa, niska grupe alkoksylowa, niska grupe alkilomerkaptanowa, grupe N-morfolinowa, 4 N-tiomorfolinowa, N^pirolidynowa, ewentualnie tf-alkilowana grupe N-piperazynowa, grupe N-pi- perydynowa, atom chlorowca albo wodoru, R« oznacza niska grupe alkilowa, niska grupe alkoksy- s Iowa, grupe aryloksylowa, niska grupe alkilomer¬ kaptanowa, alkiloaminowa, dialkiloaminowa, hy¬ droksylowa, N-morfolinowa, N-tiomorfolinowa, N- -pirolidynowa, ewentualnie N^alkilowana grupe N-piperazynowa, Nnpiperydynowa, fenyloaminowa, u ewentualnie podstawiona przez niska reszte alki¬ lowa lub przez niska reszte alkoksylowa grupe fe- nylowa, atom chlorowca albo wodoru, R* R4, Rg sa jednakowe albo rózne, oznaczaja kazdorazowo niska grupe alkilowa, niska grupe alkoksylowa, 11 niska grupe alkilomerkaptanowa, atom chlorowca aibo wodoru, a X oznacza stabilizujacy anion.Odpowiednimi nadajacymi sie do stosowania w srodku wedlug wynalazku sa estry wybrane z gru¬ py zwiazków o wzorze ogólnym 2, w którym R'lf ii Ra', Rj', R/ sa kazdorazowo jednakowe lub rózne i kazdorazowo oznaczaja atom wodoru albo chlo¬ rowca, niska grupe alkilowa, niska grupe alkoksy¬ lowa, grupe arylowa, aryloalkilowa, aryloalkoksy- lowa, hydroksylowa, karboksylowa, karboksy-ni- H skoalkoksylowa, aryloalkoksykarbonylowa, aryloal- koksykarbonylo-niskoalkoksylowa, nitrowa albo niska grupe acyloaminowa, albo kazdorazowo dwa sasiadujace podstawniki oznaczaja ewentualnie podstawiona atomem chlorowca dokondensowana 30 reszte benzenowa, X' oznacza atom siarki albo grupe iminowa, ewentualnie podstawiona przez niska grupe alkilowa, arylowa, aryloalkilowa albo przez grupe acylowa, A oznacza reszte aminokwa¬ su albo reszte peptydowa, zas B oznacza stosowa¬ li na w chemii peptydów albo pochodzaca od niej grupe zabezpieczajaca azot, albo z grupy zwiazków o wzorze ogólnym 3, w którym R^, Rj", Rt", R/ sa jednakowe albo rózne, i oznaczaja kazdorazo¬ wo atom wodoru, niska grupe alkilowa* niska gru- 4i pe alkoksylowa, alkiloaminowa albo dialkiloamino- wa, przy czym ewentualnie dwa sasiadujace pod¬ stawniki oznaczaja , równiez dokondensowany pierscien benzenowy, zas A oraz B maja wyzej podane znaczenie. 45 Estry o wzorach ogólnych 2 i 3 zostaja szybko i calkowicie zmydlone przez esterazy i/albo pro- teazy, przykladowo przez esterazy i proteazy wy¬ stepujace w obojetnochlpnnych granulocytach.Uwolnione skladniki fenolowe reaguja dobrze, 50 szybko i selektywnie z wykazujacymi male powi¬ nowactwo elektronowe solami dwuazoniowymi o wzorze ogólnym 1. Dlatego mozna uzyskac zgod¬ nie z zasada wynalazku trwale i szybko wskazuja¬ ce srodki do oznaczania leukocytów w plynach 55 ustrojowych. Poza tym okazalo sie, ze srodki wed¬ lug wynalazku nadaja sie doskonale do ogólnego oznaczania proteolitycznych enzymów, jak np. ela- stazy, chymotrypsyny lub trypsyny w wodnych roztworach wzglednie w plynach ustrojowych, jak M np. we krwi calkowitej, surowicy i plynie, w wy¬ dzielinie trzustki albo w wodnych ekstraktach stolca.Sole dwuazoniowe o wzorze ogólnym 1 sa zwiaz¬ kami czesciowo znanymi. Pochodne, w których gg podstawniki Ra i/lub Rf oznaczaja grupe N-tiomor-& 131123 6 folinowa, N-piirolidynowa, ewentualnie N'-alkilo- wana grupe Nnpiperazynowa albo grupe N-pipe- rydynowa, sa zwiazkami nowymi. Mozna je jednak wytwarzac znanymi metodami przez analogie do znanych substancji.Zwiazki o wzorze ogólnym 2 opisane sa w nie* mieckim opisie patentowym nr P 28 54 987.3.Estry o wzorze ogólnym 3 sa zwiazkami nowy¬ mi. Mozna je wytwarzac w ten sposób, ze zwiazki o wzorze ogólnym 4, w którym R^, R2", R$* oraz R4" maja wyzej podane znaczenie, poddaje sie reakcji z aminokwasami i peptydami o wzorze ogólnym HO-A-B, w którym A i B maja wyzej podane znaczenie, wzglednie z odpowiednimi ich reaktywnymi pochodnymi metodami stosowanymi w chemii peptydów.Jako reaktywne pochodne stosuje sie, np. chlorki kwasowe wzglednie uzywane zwykle w syntezie peptydów mieszane bezwodniki, przykladowo z chloroimrówczanem etylu, albo aktywne estry.Jako chlorowiec w okresleniu R^ R2, R8, R4 i R5 wzglednie R/, R2', R»' i R4' rozumie sie fluor, chlor, brom i jod, a zwlaszcza chlor i brom.Niskie grupy alkilowe, alkoksylowe, alkilomer- kaptanowe, alkilo- i dialkiloaminowe w okresle¬ niach Ri—R5, R/—R4' jak równiez Ri"—R4" za¬ wieraja 1 do 5, przewaznie 1 do 3 atomów wegla, przy czym calkiem szczególnie wyrózniaja sie od¬ powiednie reszty metylowe.Jako stabilizujacy anion X korzystny jest anion tetrafluoroboranu, tetrachlorocynkanu wzglednie nadchloranu.Pod grupa aryloalkoksylowa w okresleniu R/, R2', R8' i R4' oraz pod grupa aryloalkilowa w okresle¬ niu X' rozumie sie np. podstawione przez oksy- -niski alkil wzglednie przez niskie reszty alkilo¬ we grupy fenylowe i naftylowe, przy czym reszta alkilowa zawiera 1 do 5, zwlaszcza 1 do 3 ato¬ mów wegla. Szczególnie korzystna jest reszta ben- zyloksylowa wzglednie benzylowa.Jako niska grupa acyloaminowa R/, R/, R$' i R4' wchodza w rachube ugrupowania amidowe niskich alifatycznych kwasów karboksylowych o 1 do 5, zwlaszcza 1 do 3 atomach wegla. Szczególnie wyróznia sie reszta acetyloaminowa.Jaiko reszta acylowa w okresleniu X' wchodza w rachube reszty alifatycznych kwasów karboksy¬ lowych o 1 do 5, zwlaszcza 1 do 3 atomach wegla albo tez aromatycznych kwasów karboksylowych, jak na przyklad kwasu benzoesowego lub nafto- esowego. Szczególnie wyróznia sie reszta acetylo- wa i benzoilowa.Pod reszta arylowa wzglednie aryloalkilowa w okresleniu R/, R2', Rs', R4' oraz X' rozumie sie przewaznie grupe fenylowa albo naftylowa wzgled¬ nie reszte benzylowa.Jako reszta aminokwasu w okresleniu A wcho¬ dza w rachube przewazanie reszty naturalnych a-aminokwasów w odmianie L albo D albo tez w postaci racemicznej. Szczególnie korzystne sa reszty glicyny, alaniny, waliny, leucyny, izoleu- cyny, fenyloalaniny i tyrozyny, przy czym kazdo¬ razowo calkiem szczególnie wyróznia sie odmiana L. Ewentualnie obecne wolne grupy hydroksylo¬ we moga byc acylowane, przewaznie acetylowane.Pod reszta peptydowa w okresleniu A rozumie sie np. di-, tri-, tetra i pentapeptydy, zwlaszcza di- i tripeptydy, przy czym jako skladniki aminokwa- sowe znajduja zastosowanie zwlaszcza wyzej wy- 5 mienione aminokwasy.Jako stosowane w chemii peptydów grupy za¬ bezpieczajace azot w okresleniu B rozumie sie np. grupy acylowa, oksykarbonylowa, tiokarbonylowa, sulfonyIowa, sulfenylowa, winylowa, cyklohekseny- 10 Iowa, fosforylowa lub karbamoilowa.Stosowane w srodku wedlug wynalazku sole dwuazoniowe o wzorze ogólnym 1 oraz estry o wzorze ogólnym 2 i 3 uzywa sie w stezeniach 10—* mola/l do 10—x mola/l, zwlaszcza 10—* mola/l do 10—* mola/l roztworu impregnacyjnego — ma¬ sy pokryciowej albo przeznaczonego do badania plynu.Dalszym skladnikiem srodka wedlug wynalazku do oznaczania proteolitycznych enzymów, a zwla¬ szcza proteaz leukocytów jest odpowiedni uklad buforowy. Wchodza tu w rachube na przyklad bu¬ for fosforanowy, boranowy, barbituranowy, tris- (hydroksymetylo/pamino-metan) = Tris (,2-amino- metan) = Tris(,2-ammo-2Hmetylo-il,3-propanodiol/ = Amediol) albo 'bufor aminokwasowy, przy czym wartosc pH i pojemnosc nalezy tak dobrac, aby wartosc pH w mierzonym roztworze wzglednie na pasku testowym ustawic na 6—10, przewaznie 7—9.Dalszym skladnikiem srodka wedlug wynalazku do oznaczania proteolitycznych enzymów moze byc srodek zwilzajacy, gdyz przez to mozna uzyskac bardziej jednorodny rozdzial zabarwienia i po czesci bardziej jaskrawe zabarwienie. Mozna sto¬ sowac kationowo albo tez aninowo czynne, jak tez amfoteryczne i niejonowe srodki zwilzajace w ste¬ zeniach 0,05—2% (wagowo/objetosciowo), zwlaszcza 0,1—1% (wagowo/objetosciowo).Jako dalszy skladniki srodka wedlug wynalazku moze sluzyc jako stabilizator amid kwasu fosforo¬ wego wzglednie fosfonowego o wzorze ogólnym 5, w którym R6 oznacza grupe dialkiloaminowa, alko- ksylowa, aryloksylowa, alkilowa albo grupe arylo¬ wa, albo grupe N^morfolinowa, a R7 i R8 oznaczaja grupe dialkiloaminowa lub grupe N-morfolinowa.Jako dalszy skladnik srodka wedlug wynalazku okresleniu R6 wchodza w rachube grupy weglowo¬ dorowe zawierajace do 10 atomów wegla.Pod grupa arylowa wzglednie aryloksylowa w okresleniu R« rozumie sie ewentualnie podstawione przez atom chlorowca, przez niskie grupy alkilowe lub alkoksylowe grupy fenylowa lub naftylowa.Przy uzyciu zwiazków o wzorze ogólnym 5 uzy¬ skuje sie zadziwiajaca stabilizacje receptur.Amidy kwasu fosforowego i fosfonowego o wzo¬ rze ogólnym 5 sa zwiazkami znanymi, znajduja one zastosowanie znane np. z niemieckiego opisu wy- lozeniowego nr 22 35127 jako stabilizatory recep¬ tur na paski testowe, które pracuja na zasadzie wykrywania peroksydazy.Stabilizatory typu amidu kwasu fosforowego i fosfonowego o wzorze ogólnym 5 dodaje sie do wodnych albo korzystnie organicznych roztworów impregnacyjnych w stezeniach 1—20% (wagowo/ob¬ jetosciowo), zwlaszcza 5—15% (wagowo/objetoscio¬ wo). 29 18 30 35 40 45 50 55 60T IM 123 » NiespCKMetwanie stwierdzono, ze czas reakcji srodfca wedlug wynalazku do oznaczania proteoli¬ tycznych enzymów leukocytów, mozna znacznie skrócic, gdy cko soli dwuazoniowych, estrów i do¬ tychczas uzywanych .substancji ipomocTMCzycii do¬ datkowo wprowadzi sde jeden ailibo Mika aktywa¬ torów. Odpowiednimi do srodka Wedlug wynalaz¬ ku aMywatoraimi okazaly sie -zwiazki opisane i za¬ strzezone w opisie patentowymi iRFN nr 29 05 531.0.Aktywatory dodaje sie do roztworu impregna¬ cyjnego w stezeniach 0,5—10%, korzystnie 1—5% (wagowo/objetosciowo).W celu wytworzenia srodka wedlug wynalazku impregnuje sie na przyklad chlonny nosnik, zwla¬ szcza bibule filtracyjna, runo celulozowe lub z wlókna sztucznego, roztworami wymaganych, zwykle stosowanych do wytwarzania pasków testo¬ wych odczynników (substrat, bufor, ewentualnie srodki zwilzajace) W latwo lotnych rozpuszczalni¬ kach, jak np. w wodzie, metanolu, etanolu lub ace¬ tonie. Odbywa sie to korzystnie w dwu oddziel¬ nych etapach, najpierw impregnuje sie wodnym Toztworem, który zawiera bufor oraz inne rozpusz¬ czalne w wodzie substancje dodatkowe. Nastepnie impregnuje sie roztworem substratów proteaz o wzorze ogólnym 2 wzglednie 3, soli dwuazonio- wych o wzorze ogólnym 1 i aktywatorów. Jednak¬ ze impregnacje mozna prowadzic w innej kolejnos¬ ci wzglednie stosujac inny sklad obydwu roztwo¬ rów impregnacyjnych.Gotowe paski testowe mozna stosowac jako takie albo w znany sposób naklejone na uchwyty, albo zwlaszcza wspawane miedzy tworzywo sztuczne i siatke o drobnych oczkach wedlug opisu paten¬ towego RFN nr 2118 455.W celu wytworzenia pasków testowych pokry¬ tych powloka wszystkie odczynniki wprowadza sie do roztworu lub dyspersji substancji powlokotwór- czej, jak np. estru poliwinylowego lub poliamidu, i miesza do ujednorodnienia. Mieszanine rozsma- rowuje sie cienka warstwa na nosniku z tworzywa sztucznego i suszy. Pokryte powloka paski testo¬ we wedlug wynalazku po wysuszeniu tnie sie i mozna je stosowac jako takie albo w znany sposób naklejone na uchwyty albo np. wspawane miedzy tworzywo sztuczne i siatke o drobnych oczkach wedlug opisu patentowego RFN nr 2118 455.Srodek wedlug wynalazku do oznaczania proteo¬ litycznych enzymów, szczególnie proteaz leukocy¬ tów, w postaci mieszanek proszkowych albo table¬ tek odczynnikowych wytwarza sie w ten sposób, ze wymienione wyzej skladniki testu zadaje sie zwyklymi galenowymi substancjami dodatkowymi i granuluje. Tego rodzaju substancjami dodatko¬ wymi sa np. weglowodany, jak np. mono-j oligo- albo polisacharydy, albo cukroalkohole, jak np. mannit, sorbit lub ksylit, albo inne rozpuszczalne obojetne zwiazki, jak glikole polietylenowe albo poliwinylopirolidon.Mieszanki proszkowe lub tabletki odczynnikowe wykazuja na ogól ciezar koncowy okolo 50—200 mg, zwlaszcza 50—80 mg.W celu wytworzenia liofilizatów o ciezarze cal¬ kowitym kazdorazowo okolo 5—20 mg, zwlaszcza okolo 10 mg, odparowuje sie ze stanu zamrozenia roztwór, który obok wszystkich potrzebnych do B testu odczynników zawiera zwykle substancje wzmacniajace, jak np. poliwinylopirolidon, i ewen¬ tualnie dalsze napelnlacze, jak np. mannit, sorbit albo ksylit. grodek wedlug wynalazku w postaci roztworu zawiera zwlaszcza wszystkie potrzebne do testu odczynniki. Jako rozpuszczalnik wchodza w rachu* be woda albo mieszaniny wody z rozpuszczalnym w wodzie rozpuszczalnikiem organicznym, jak np. metanolem, etanolem, acetonem lub dimetylofor- M mamidem. Ze wzgledu na trwalosc moze byc ko¬ rzystne rozdzielenie potrzebnych do testu odczyn¬ ników na dwa albo wiecej roztworów, które la¬ czy sie odpowiednio przy wlasciwym badaniu. m Tak wytworzone srodki po zanurzeniu w bada¬ nym plynie ustrojowym albo po dodaniu do od¬ nosnego plynu ustrojowego, umozliwiaja szybkie i proste oznaczenie obecnosci proteolitycznych en¬ zymów, szczególnie proteaz leukocytów, przez po- m wstanie zabarwienia, które mozna oceniac wizual¬ nie albo fotometrycznie, np. za pomoca fotometru reemisyjnego, albo w kiuwecie. Ze wzgledu na to, ze aktywnosc proteaz leukocytów na komórke mozna uznac w zasadzie jako wielkosc stala, z in- 3e tensywnosci powstalego zabarwienia mozna ustalic stezenie leukocytów w badanym plynie ustrojo¬ wym. Przy tym srodkiem wedlug wynalazku obej¬ muje sie zarówno nieuszkodzone jak tez rozpad- niete leukocyty, poniewaz aktywnosc proteaz leu- n kocytów zostaje w pelni utrzymana takze po roz¬ padzie leukocytów. A zatem blad rozpadu nie wy¬ stepuje.Ponizsze przyklady wyjasniaja blizej wynalazek.M Przyklad I. Bibule filtracyjna (np. Schleicher u. Schiill 23 SL) impregnuje sie kolejno nastepu¬ jacymi roztworami i potem suszy w temperaturze 60°C: Roztwór 1 45 0,2 molowy bufor boraks — kwas solny pH 8 10% trimorfolid kwasu fosforowego Roztwór 2 2X10-* mola/l substratu 10—* mola/l soli dwuazoniowej rozpuszczone w mieszaninie aceton/dekanol 98:2 Substraty S 1: 3-fN-(tolueno-4'-sulfonylo)-I^alanyloksy]-indol S 2: 3-[N-(tolueno^'-6ulfonylo)-Li-alanyloksy]-l- w -metoksynaftalen S 3: l-[N-(tolueno-4'-sulfonylo)-L-alanyloksy]-4- -metoksynaftalen S 4: l-(N-(tolueno-4'HSulfonylo)-L-alanyloksy]-4- izopropoksynaftalen m S 5: l-(N-(tolueno-47-sulfonylo)-Li-alanyIoksy]-4- pentyloksynaftalen S 6: 14N-(tolueno-4'-sulfonylo)-L-alanyloksy]-3-di- metyloaminobenzen S 7: ln[N^tolueno-4'-sulfonylo)-L-alanyloksy]-3- N -dietyloaminobenzen131123 10 S 8: l-(N-(tolueno-4'^ulfonylo)-L-alanyloksy]-3,5- -diimetoksybenzen S 9: l^-(tolueno-4'-sulfonylo)-L-aiamyloksy]-3- -metylo^5-nietoksybenzen Sole dwuazoniowe D 1: tetrafluorolboran 2,4-dimetoksyfoenzenodwuazo- niowy D 2: tetrafluoroboran 4^metoksynaftaleno-l-dwu- azoniowy D 3: tetrafluoroboran 2,5-dimetoksy-4-dimetyloami- nobenzenodwuazondowy D 4: tetrafluoroboran 4-dimetyloaminobenzenodwu- azoniowy Otrzymuje sie papierki, które przy zanurzeniu w moczu zawierajacym 100 leukocytów/jU w ciagu okolo 3 minut wykazuja zaibrwienia przedstawione w tablicy 1. Oceny mozna dokonywac tez za pomo¬ ca fotometru reemisyjnego.Tablica 1 10 15 Substrat S 1 S 1 S 1 1 S * S 2 S 2 S 2 | S 2 S 3 S 3 1 S 3 S 4 S 5 S 6 S 7 S 8 S 9 Sól dwu- azoniowa D 1 D 2 D 3 D 4 D 1 D 2 D 3 D 4 D 1 D 2 D 3 D 1 D 1 D 1 D 1 D 1 D 1 Zabarwienie czerwonobrunatne czerwonobrunatne niebieskoszare zielone czerwone jasnoczerwone fioletowe liliowe czerwonofioletowe 1 fioletowe 1 niebieskoszare liliowe liliowe jasnoczerwone jasnoczerwone czerwonofioletowe czerwonobrunatne Przyklad II. Bibule filtracyjna impregnuje sie kolejno ponizszymi roztworami i suszy w tem¬ peraturze 60°C: Roztwór 1 0,1 molowy bufor boranowy pH 8 Roztwór 2 2 X 10—• mol/l tetrachlorocyhkanu 2-mteoksy-4-(N- -(morfolino)-benzenodwuazoniowego 2 X10-» mola/l substratu * 10% trimorfolidu kwasu fosforowego w mieszaninie etanol/l-dekanol 98 : 2 * Substrat A: 3-(N^benzyloksykarbonylo-L-alanyloksy)-indol B: 3-(N-benzyloksykarbonylo-L-alanyloksy)-5-me- tyloindol C: 3-(N-benzyloksykarbonylo-L-alanyloksy)-7-me- tyloindol 25 30 35 40 45 50 55 60 D: 3-(N-benzyloksykarbonylo-L-alanyloksy)-4-chlo- roindol E: 3-(N-benzyloksykarbonylo-L-alanyloksy)-5-bro- moindol P: 3-[N-(tolueno-4'-sulfonylo)-L-alanyloksy]-indol G: 3-[N-(tolueno-4'-6ulfonylo)-L-alanyloksy]-5-me- toksyindol H: 3-[N-(4'-acetamidobenzenosulfonylo)-L-alany- loksy]-indol I: 3-[N-(4'-metoksytosylo)-L-alanyloksy]-indol K: [N-(tolueno-4/-sulfonylo)-Li-alanyloksy]-benzen L: l-[N^tolueno-4'-sulfonylo)-L-alanyloksy]-nafta- len M: l-[N-(tolueno-4,-sulfonylo)-L-alanyloksy]-3-me- toksybenzen Tak otrzymanymi papierkami odczynnikowymi mozna wykazywac w moczu zawierajacym leuko¬ cyty 100 leukocytów pi.Papierki odczynnikowe o porównywalnej reak¬ tywnosci mozna takze otrzymac, gdy zamiast wy¬ mienionej wyzej soli dwuazoniowej uzyje sie: tetrafluoroboran 2-metoksy-4-(N-pirolidyno)-benze- nodwuazoniowy, tetrafluoroboran 2-metoksy-4-(N-piperydyno)-ben- zenodwuazoniowy, tetrafluoroboran 2,6^dimetoksy-4-(N-morfolino)-ben- zenodwuazoniowy, tetrafluoroboran 4Hmetoksy-2-(N-morfolino)-benze- nodwuazoniowy, tetrafluoroboran 2-metoksy-4-[N-(N'Hmetylo)-pipe- razyno]-'benzenodwuaz0niowy, tetrafluoroboran 2-metoksy-4-(N-tiomorfolino)-ben- zenodwuazoniowy.Przyklad III. Wytwarza sie nastepujace roz¬ twory podstawowe: Roztwór 1 2 X 10—» mola/1 ln[N-(tolueno-4'-sulfonylo)-L-ala- nyloksy]-4nizopropoksynaftalenu 10—* mola/l tetrafluoToboranu 2,4-dimetoksybenze- nodwuazoniowego w mieszaninie aceton/1-dekanol Tablica 2 Aktywator bez aktywatora 4-azafluoreri chinina ibenzo-(h)-chinolina l^-bis-4-piryidylo- 1 etylen I 1-dekanol 1-tetradekanol ndtroprusydek so¬ dowy szesciocyjano- zelazian-(II)-pota- sowy Dodatek aktywatora w mg do 20 ml roztwo¬ ru 1 33 33 36 37 400 400 — roztwo¬ ru 2 — — — — — — 31 40 Czas reakcji (sek.) 54 17 32 8 34 5 I 4 1 38 30*** 11 Roztwór 2 0,2 molowy bufor boraks — kwas solny 10% trimorfolidu kwasu fosforowego.Kazdorazowo albo do roztworu 1, albo/do roz¬ tworu 2 dodaje sie podane w tablicy 2 aktywatory w podanych tam stezeniach, a potem bibuly fil¬ tracyjne nasyca roztworami 1 i 2 i kazdorazowo suszy w temperaturze 60°C.Przy badaniu w izotonicznym roztworze soli ku¬ chennej z 3ÓG Ieukocytami/jU reaguja testy w po¬ danych czasach. ' Przyklad IV. Bibule filtracyjna nasyca sie nastepujacymi roztworami i po nasyceniu kazdora¬ zowo suszy w temperaturze 60°C.Roztwór 1 2X10-* mola/l 34N^tolueno-4'-sutfonylp)-L-alany- loksy]-indolu 2 X 1°—a mola/1 tetrachlorocynkanu 2-metoksy-4- -moriolmobenzenodwuazoniowego w mieszaninie aeeton/1-dekanol 93 : 2.Roztwór 2 0,2 molowy bufor boraks — kwas solny pH 8 10% trimorfolidu kwasu fosforowego.W dalszym doswiadczeniu nie stosowano do roz¬ tworu 2 trimorfolidu kwasu fosforowego. , Próbki z trimorfolidem kwasu fosforowego po ogrzewaniu przez 2 dni w temperaturze 60°C pozo¬ staly niezabarwione i dawaly dobre reakcje z roz¬ tworami zawierajacymi leukocyty. Próbki bez tri¬ morfolidu kwasu fosforowego wykazywaly szare zabarwienie.Przyklad V. W znany sposób wytworzono tabletke odczynnikowa, zawierajaca nastepujace skladniki: 2 mg 3-[N-(tolueno-4'-sulfonylo)-Lr-alanyloksy]-in*- dolu, 2 mg tetrachlorocynkanu 2-metoksy-4-(N-morfoli- no)-benzenodwuazoniowego, 1,5 mg dihydrofosforanu potasowego, 301 mg dwuwodnego^ bydrofosfosanu disodowego, 20 mg mannitu.Tabletke te rozpuszczono w 2 ml moczu zawie¬ rajacego leukocyty i dobrze wymieszano. W przy¬ padku obecnosci leukocytów wystepowalo czerwo- nofioletowe zabarwienie. Tak 100 leukocytów moz¬ na bylo oznaczyc w okolo 2 minuty.Jezeli przed dodaniem tabletki i w czasie reakcji mocz utrzymywano w temperaturze 37°C, mozna bylo w tym samym czasie oznaczyc 20 leukocytów.Przyklad VI. Wytwarzanie l-[N-(tolueno-4'- -sulfonylo)-L-alanyloksy]-3,5-Hdimetoksybenzenu w celu przeprowadzenia reakcji metoda aktywnego estr*' 14,6 g (0,06 mola) N-(tolueno-4-sulfonylo)- -alaniny i 12,2 g (0,09 mola) N-hydroksybenzotria- zolu rozpuszcza sie w 300 ml absolutnego octanu etyli*, schladza do temperatury 0°C i zadaje 12,4 g ^0,06 mola) dicykloheksylokarbodiimddu. Dla utwo¬ rzenia aktywnego estru calosc miesza sie przez 2 godziny w temperaturze 0°C, potem przez dal¬ sze 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po do¬ daniu 6,2 g (0,04 mola) 3,5-dimetoksyfenolu i 5,5 ml (0,04 mola) trietyloaminy calosc miesza sie przez 15 godzin w temperaturze pokojowej. Utworzony N,N'- szonym cisnieniem. Przesacz zateza sie pod zmniej- 11123 12 szonym cisnieniem przy maksymalnej temperatu¬ rze lazni 50°C. Pozostalosc przenosi sie do 200 ml octanu etylu i przemywa kolejno po 3 razy stosu¬ jac po 100 ml 5^procentowego kwasu cytrynowego f i potem odpowiednio po 100 ml 5-procentowego roztworu wodoroweglanu sodowego. Faze organicz¬ na suszy sie siarczanem sodowym i zateza pod zmniejszonym cisnieniem., Oleisty surowy produkt oczyszcza sie droga chromatografii kolumnowej na 10 kolumnie z zelu krzemionkowego stosujac jako eluent mieszanine toluen-octan etylu (4:1). Odpo¬ wiednio zebrane frakcje zateza sie, pozostalosc roz¬ puszcza w malej ilosci chlorku metylenu i wytra¬ ca przez dodanie eteru. Otrzymuje sie 5,8 g, co lf odpowiada 38% wydajnosci teoretycznej l-[N-(tolu- eno-4'^sulfonylo)-L-alanyloksy]-3,5-dimetoksybenze- nu w postaci bezbarwnych krysztalów o tempera¬ turze topnienia 110°C. aDao: —52,5° (c = 1%, aceton). 20 W analogiczny sposób, przez reakcje N-(tolueno- -4-sulfonylo)-L-alaniny z odpowiednio podstawio¬ nymi fenolami lub naftolami, otrzymuje sie na¬ stepujace substancje: ^ 6.1. [iN^tolueno^-sulfonylo^L-alanyloksypben- zen, bezbarwne krysztaly o temperaturze topnienia 113°C u aD»: —63,8° (c = 1%, aceton) 6.2. l^[N- -dimetyloaminobenzen, bezbarwny, bezpostaciowy proszek chromatografia cienkowarstwowa: gotowe plytki z zelu krzemionkowego (eluent: toluen-dioksan 2:1 wywolywanie: UV, wartosc RF: 0,68) 6.3. l-|[N-(tolueno-4'-sulfónylo)-L-alanyloksy]-3- -metoksybenzen, ^ bezbarwne krysztaly o temperaturze topnienia 60—61°C Gd*: —62,9° (c = 1%, metanol) 6.4. l^[N^(tolueno-4'-sulfonylo)-L-alanyloksy]-naf¬ talen, ^ bezbarwny, gesty olej a**: —27,3° (c = 1%, metanol) chromatografia cienkowarstwowa; gotowe plytki z zelu krzemionkowego (eluent: toluen-dioksan 4:1, 50 wywolywanie: UV, wartosc RF: 0,53) 6.5. l-t[N-(tolueno-4/-sulfonylo)-L-alanyloksy]-4- -metoksynaftalen bezbarwne krysztaly o temperaturze topnienia 136°C M aD2*: ^12,6° (c = 1%, aceton) 6.6. ln[N-(1;olueno-4'-sulfonylo)-L-alanyloksy]-4- -izopropoksynaftalen bezbarwne krysztaly o temperaturze topnienia 93—96°C an20: —38,0° (c = 1%, aceton) m 6.7. l-CN-(tolueno-4/-sulfonylo)-L-alanyloksy]-4- -pentyloksynaftalen bezbarwne krysztaly o temperaturze topnienia 87°C Cd20: —36,9° (c = l%, aceton) 6.8. l-i[N-(toluen-4'-sulfonylo)-Lr-alanyloksyl-3- tó -dietyloaminobenzen131123 U *A bezbarwne krysztaly o temperaturze topnienia *3r-84°C .on,*: -^59,4° chromatografia cienkowarstwowa: gotowe plytki z zelu krzemionkowego (eluent: ksylen-metyloety- loketon 1:1, wartosc Rr: 0,6S) 6.9, l^[N-(tolueno-4'-sulfonylo)-L-alanyloksy)-3- -metylo-^Hmetoksybenzen bezbarwne krysztaly o temperaturze topnienia 79-^81°C W*: 62^° (c = l%, metanol) chromatografia cienkowarstwowa: gotowe plytki z zelu krzemionkowego (eluent: chloroform-metanol 20 :1, wartosc RF: 0,79).Przyklad VII. Wytwarzanie 2-[N-(tolueno-4'- -sulfonylo)-L-alanyloksy]-4nmetoksynaftalenu.Roztwór 1 W celu wytworzenia chlorku kwasowego wedlug metody jednostopniowej 19,44 g (0,08 mola) N-(to- lueno-4^sulfonylo)-L-alaniny rozpuszcza sie w 100 ml absolutnego dimetyloformamidu i oziebia do temperatury —20°C. Potem przy mieszaniu i chlodzeniu dodaje sie pipeta 5,81 ml (0,08 mola) chlorku tionylu i mieszanine reakcyjna utrzymuje sie przez 30 minut w lazni ziebiacej w temperatu¬ rze —20°C.Roztwór 2 Do roztworu 6,96 g (0,04 mola) 4-metoksy-2-naf- tolu w 50 ml absolutnego dimetyloformamidu do¬ daje sie 11,0 ml (0,08 mola) trietyloaminy. Miesza¬ nine oziebia sie do temperatury —20°C.Reakcja Roztwór 1 wlewa sie do roztworu 2 i miesza z wykluczeniem wody przez okolo 4 godziny w temperaturze —20°C, po czym mieszanine pozosta¬ wia przez noc w lodówce.W celu przerobienia zateza sie roztwór reakcyjny pod zmniejszonym cisnieniem przy temperaturze lazni maksymum 50°C. Pozostalosc przenosi sie do okolo 150 ml octanu etylu i przemywa kolejno po 3 razy stosujac po 100 ml 5%-owego kwasu cytry¬ nowego i potem po 100 ml 5%-owego roztworu wo¬ doroweglanu sodowego. Po wysuszeniu siarczanem sodowym faze organiczna zateza sie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem. Surowy produkt oczyszcza sie droga chromatografii kolumnowej na kolumnie z zelu krzemionkowego stosujac jako eluent mie¬ szanine toluen-octan etylu (4:1). Po zatezeniu od¬ powiednich zebranych frakcji pod zmniejszonym cisnieniem pozostalosc przenosi sie do malej ilosci chlorku metylenu i potem wytraca mieszanine ete¬ ru i ligroiny (1 :2), Otrzymuje sie 2,8 g, co sta¬ nowi 18% wydajnosci teoretycznej 2-[N-(tolueno-4'- -sulfonylo)-L-alanyloksy]-4Hmetoksynaftalenu w po¬ staci bezbarwnych krysztalów o temperaturze top¬ nienia 119° dm: —57,9°C(c = 1%, aceton) Przyklad VIII. Wytwarzanie tetrachlorocyn- kanu2-metoksy-4-(N-morfolino)-benzenodwuazonio- wego 5-chloro-2-nitroanizol poddaje sie reakcji z 1,5-krotnym nadmiarem molowym morfoliny w toluenie jako rozpuszczalniku, przez wielogodzinne {10—14 godzin) utrzymywanie w stanie wrzenia pod chlodnica zwrotna. Reakcje mozna tez korzyst¬ nie prowadzic w morfolinie jako rozpuszczalniku.Wówczas 5-chloro-2-nitroanizol zadaje sie 5—10- -krotna objetoscia morfóHny. Ewentualnie o lowany produkt oddziela sie przez wytrzasanie z lugiem sodowym albo metyluje sie przez reakcje 5 z ddazometanem.Otrzymany riititozwiazefc redukuje sie do alniny w zwykly sposób palladem na weglu w metanolu albo chlorkiem cyny (II) w kwasie solnyni I amine te dwuazuje. Zwia2ek dwuazoniowy w znany spo- 10 sób w roztworze kwasu solnego przeprowadza sie przez dodanie stezonego roztworu chlorku cynku w tetrachlorocynkan allbo przez dodanie kwasu tetra- fluorobórowego w tetrafluoroboran i jako taki wy¬ odrebnia. lig Temperatura topnienia 170—172°C (tetrachlorocyn¬ kan) 166—168°C (rozkl.) (tetraflu¬ oroboran) Przyklad IX. Wytwarzanie tetrafluorobora- 20 nu 4-metoksy-2-(N^morfolino)^benzodwuazoniowego 18,76 g (0,1 mola) 3-chloro-4-nitroanizolu, o tem¬ peraturze topnienia 52°C, ogrzewa sie przez 4 go¬ dziny pod chlodnica zwrotna z 87,1 g (1 mol) mor¬ foliny. Potem schlacfza sie do temperatury pokojo- re wej, dodaje do roztworu reakcyjnego 100 ml wody z lodu, odsacza wytracony, zólty produkt reakcji, przemywa schlodzonym lodem 10% kwasem octo¬ wym i suszy otrzymany produkt pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 60°C. Otrzymuje sie ^ 19,5 g mieszaniny skladajacej sie z N-(3-hydróksy- -6-nitrofenylo)Hmorfoldny i N-(3-metoksy-6-nitfofe- nylo)-morfoliny. Produkt ten rozpuszcza sie w ' chlorku metylenu i dodaje eterowy roztwór dwu- azometanu i pozostawia przez 2 dni w temperatu- 35 rze pokojowej. Po tym czasie rozklada sie nadmiar dwuazometanu przez wkroplenie 2 n kwasu octo¬ wego, faze organiczna wytrzasa sie kilkakrotnie z 2n lugiiem sodowym i oddestylowuje rozpuszczal¬ nik pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymuje sie 40 19,1 g, co stanowi 80,2% wydajnosci teoretycznej, N-(3^metoksy-6-nitrofenylo)-morfoliriy, o tempera¬ turze topnienia 84—86°C. Nastepnie substancje ta zawiesza sie w 250 ml metanolu i uwodornia z do¬ datkiem 1,9 g 10% palladu na weglu w tempera- turze 20—30°C. Po odsaczeniu katalizatora przesacz zateza sie, wolna zasade przeprowadza w chloro¬ wodorek za pomoca eterowego roztworu kwasu solnego. Wykrystalizowuje 20,6 g, co stanowi 73,1% wydajnosci teoretycznej, dwuchlorowodorku N-0- -metoksy-6-aminofenylo)-morfoliny, o temperaturze topnienia 237—240°C.Produkt ten zawiesza sie, przy temperaturze —5°C w 96 ml 6n — kwasu solnego i wkrapla do niego w czasie 30 minut roztwór 6 g azotynu so- 55 dowego w 12 ml wody. Powstaly brazowo-czerwo- ny roztwór soli dwuazoniowej dodaje sie w tempe¬ raturze 0°C, przy mieszaniu do 120 ml 35% kwasu tetrafluoroborowego. Po kilka godzinnym staniu otrzymuje sie 19,5 g, co stanowi 63,5% wydajnosci teoretycznej, tetrafluoroboranu 4-metoksy-2- -morfolino)-benzenodwuazoniowego, w postaci zól¬ tych krysztalów, o temperaturze topnienia 115— 116°C (z rozkladem).W analogiczny sposób otrzymuje sie: a) z 5-chloro-2-nitroandzolu i tiomorfoliny tetra- •o131 123 15 16 fluoroboran 2-metoksy-4- dwuazoniowy, o temperaturze topnienia 106—108°C, z rozkladem.Produkt posredni dwuchlorowodorek 2-amino-5- -(N-tiomorfolino)-anizolu wytwarza sie nastepuja¬ co: Do 1 1 kolby trójszyjnej z mieszadlem wprowa¬ dza sie 100 g dwuwodzianu chlorku cynku-II, w 400 ml 6n- kwasu solnego i do tego dodaje porcja¬ mi przy mieszaniu w temperaturze pokojowej 25,4 g (1 mol) 2-nitro-5-(N-tiomorfolino)-anizolu.Po czym calosc ogrzewa sie w czasie 30 minut, w temperaturze 75°C, chlodzi do temperatury poko¬ jowej i wkrapla przy chlodzeniu lodem roztwór reakcyjny do 750 ml 30% lugu sodowego. Wolna zasade ekstrahuje sie kilkakrotnie eterem i prze¬ prowadza ja, po wysuszeniu i oddestylowaniu roz¬ puszczalnika, w chlorowodorek przez dodanie ete¬ rowego roztworu kwasu solnego. Otrzymuje sie 24,9 g, co stanowi 83,8% wydajnosci teoretycznej, dwuchlorowodorku 2-amino-5-(N-tiomorfolino)-ani- zclu, o temperaturze topnienia 218—220°C. b) z 5-chloro-2-nitroanizolu i piperydyny tetra- fluoroboran 2-metoksy-4-(N-piperydyno)-benzeno- dwuazoniowy, o temperaturze topnienia 123—125°C, z rozkladem. c) z 5^chloro-2-nitroanizolu i pirolidyny tetraflu- oroboran 2-metoksy-4-(NHpirolidyno)-benzenodwu- azoniowy, o temperaturze topnienia 137—139°C, z rozkladem. d) z 5-chloro-2-nitroanizolu i N-metylopiperazy- ny tetrafluoroborano-dihydró-tetrafluoroboran 2- jmetoksy-4-[N- dwuazoniowy, o temperaturze topnienia 163°C, z rozkladem.Przy wytwarzaniu tego zwiazku dwuazowanie przeprowadza sie azotynem amylu w metanolu.Przy tym 39,6 g (0,1 mola) dihydro-tetrafluorobo- ranu 2-amino-5-(N-metylopiperazyno)-anizolu roz¬ puszcza sie w 175 ml metanolu, dodaje 11,6 g (0,1 mola) azotynu amylu w 25 ml metanolu i powoli, przy mieszaniu w temperaturze 0°C wkrapla 35% kwas tetrafluoroborowy i pozostawia w spokoju.Wykrystalizowuje 24,8 g, co stanowi 51,7% wydaj¬ nosci teoretycznej, brazowanych krysztalów tetra- fluorOborano-dihydro-tetrafluoroboranu 2-metoksy- -4-[N-(N'-metylo)^piperazyno]-benzenodwuazonio- wego, o temperaturze topnienia 163°C, z rozkla¬ dem. e) z 5-chloro-2^nitroanizolu i morfoliny tetraflu- oroboran 2^metoksy-4^(Nnmorfolino)-benzenodwu- azoniowy, o temperaturze 166—168°C, z rozkladem.Zastrzezenie patentowe Srodek do oznaczania esterolitycznych i/albo pro¬ teolitycznych enzymów, w postaci pasków testo¬ wych na chlonnym nosniku, warstwy folii, mie¬ szanki proszkowej, liofilizatu, roztworu lub tablet- 10 ii 2t 39 35 40 45 50 51 ki odczynnikowej,, zawierajacych odpowiednia pod¬ stawe oznaczania esteraz i/albo proteaz, bufor oraz ewentualnie dalsze zwykle stosowane substancje dodatkowe, znamienny tym, ze jako podstawe oznaczania esteraz i/albo proteaz stosuje sie kom¬ binacje zlozona z soli dwuazoniowej o wzorze- ogólnym 1, w którym R2 oznacza niska grupe alki¬ lowa, niska grupe alkoksylowa, niska grupe alkilo¬ merkaptanowa, grupe N-morfolinowa, N-tiomor- folinowa, N^pirolidynowa, ewentualnie N'-alkilo- wana grupe N-piperazynowa, grupe N-piperydyno- wa, atom chlorowca albo wodoru, R8 oznacza niska grupe alkilowa, niska grupe alkoksylowa, grupe aryloksylowa, niska grupe alkilomerkaptanowa, al- kiloaminowa, dialkiloaminowa, hydroksylowa, N- -morfolinowa, N-tiomorfolinowa, N-pirolidynowa, ewentualnie N'-alkilowana grupe N-piperazynowa, Nnpiperydynowa, fenyloaminowa, grupe fenylowa, ewentualnie podstawiona przez niska reszte alkilo¬ wa albo przez niska reszte alkoksylowa, dalej oznacza atom chlorowca albo wodoru, R2, R4, R5 sa jednakowe albo rózne i oznaczaja kazdorazowo niska grupe alkilowa, niska grupe alkoksylowa, niska grupe alkilomerkaptanowa, atom chlorowca lub wodoru, a X oznacza stabilizujacy anion, oraz: estru wybranego z grupy zwiazków o wzorze ogól¬ nym 2, w którym R^R/jR/jR/ sa kazdorazowo jednakowe albo rózne i oznaczaja kazdorazowo atom wodoru albo chlorowca, niska grupe alkilo¬ wa, niska grupe alkoksylowa, arylowa, aryloalkilo- wa, aryloalkoksyIowa, hydroksylowa, karboksylo¬ wa, karboksy-niskoalkoksylowa, aryloalkoksykar- bonylowa, aryloalkoksykarbonylo-niskoalkoksylowa, grupe nitrowa, albo niska grupe acyloaminowa, albo kazdorazowo dwa sasiadujace podstawniki oznaczaja ewentualnie podstawiona przez atom chlorowca dokondensowana reszte benzenowa, X' oznacza atom siarki albo grupe iminowa, ewentual¬ nie podstawiona przez niska reszte alkilowa, ary¬ lowa, aryloalkilowa albo przez reszte acylowa, A oznacza reszte aminokwasu albo peptydowa, B oznacza stosowana w chemii peptydów albo po¬ chodzaca od niej grupe zabezpieczajaca azot, albo estru wybranego z grupy zwiazków o wzorze ogól¬ nym 3, w którym R/', R2", R3", R4" sa jednakowe albo rózne, oznaczaja kazdorazowo atom wodoru, niska grupe alkilowa, niska grupe alkoksylowa, al- kiloaminowa, dialkiloaminowa, przy czym dwa sa¬ siadujace podstawniki moga takze oznaczac dokon- densowany pierscien benzenowy, A i B maja wy¬ zej podane znaczenie, przy czym sole dwuazcniowe oraz estry uzywa sie w stezeniach 10^* mole/l do 10—1 mola/l, zwlaszcza 10—» mola/l do 10—2 mola/l roztworu impregnacyjnego — masy pokryciowej albo przeznaczonego do badania plynu i stosowane jako dodatkowe srodki pomocnicze srodki zwilza¬ jace, stabilizatory, aktywatory, srodki blonotwór- cze, galenowe substancje dodatkowe i/albo srodki wzmacniajace uzywa sie w ilosci 0—2% wagowych.131123 Ra R1 R3-V-NEN X RA R5 WZÓR WZÓR 2 R R2 O-A-B R4 R- WZOR 3 ?6 R7- P = O Rfl WZÓR 4 WZÓR 5 PL PL PL PL PLThe subject of the invention is an agent for the determination of esterolytic and / or proteolytic enzymes. In the diagnosis of diseases of the kidneys and the genitourinary system, the determination of leukocytes in the urine is of great importance. Until now, this determination was carried out microscopically in such a way that leukocytes in a specific volume of urine were counted under the microscope. However, this method is very time-consuming, troublesome and tedious, and requires trained personnel. As a basis for the determination of leukocytes in various body fluids, attempts have been made for some time to introduce enzymatic reactions because leukocytes exhibit a wide enzymatic spectrum. German Advertisements 28,26,965 and 28,36,644 agents for the determination of leukocytes in body fluids, in which the esterolytic and / or proteolytic activity present in leukocytes is used for analytical purposes. Here, sulfonphthalic esters or ester azo dyes are used as substrates for esterases and / or proteases of leukocytes. The dyes released by the enzymatic reaction are assessed by generally known methods. The agents described in these descriptions are still too insensitive. They exhibit reaction times that are too long for the lower limit of the determination, so that their practical use is associated with certain inconveniences and, above all, long waiting times when carrying out the test. Different methods for the determination of proteases and esterases are also known historically. - and cytochemical enzymology for example AGE Pearse, Histochemistry, Theoretical and Applied, 3rd Ed., Churchill Livingstone, Edinburgh-London-New York 1968. In principle, also colorless or weakly colored esters are also used, which are usually broken down by enzymatic cleavage. a colorless acid and also a colorless alcohol (phenolic) component. The last, in the reaction following enzymatic saponification, is transformed into colored products, for example by coupling with diazonium salts or by oxidation reactions. Schmalzl and H. Braunsteiner describe, for example, in Klin. East 46, 642 (1968) Characteristic cytochemical determination of leukocyte esterases with naphtho-ASiD-chloroacetate as suffostral and diazonium salt to form a colored azo compound. Two-component systems of this kind have proved inadequate as a means for a quick and simple determination of the oral leachocytes in the fluid. such as in urine. They are far too little affectionate. For example, tests with 5,000 leucocytes showed no reaction. Moreover, many compounds present in urine, such as urobilinogen, stercobilinogen, bilirubin and others, are known to react with diazonium salts. This is evidenced by the best commercially available patented tests for the determination of urobilinogen or bilirubin in urine, which are used in the reaction for the detection of diazonium salts. The diazonium salts used according to the literature for the determination of esterase show the described side reactions with other urine components and are not suitable for use in the leucoid test, partly also because of their own color. time, in a simple and easy-to-carry manner and which does not cause interfering side reactions with other components of the test sample, esterolytic and / or proteolytic enzymes based on a combination of esters and diazonium salts as reaction components for these enzymes. that a certain combination of appropriate esters and specially substituted diazonium salts is used, and the used diazonium salts unexpectedly do not react side-effects with other urinary components, such as bilirubin and urobilinogen, but characteristically and quickly bind to phenolic components formed in the ¬ grafting of the esters used, forming a ba Corresponding esters must be sufficiently reactive towards estrolytic and / or proteolytic enzymes to break down as rapidly as possible into acid and alcohol components (which also includes phenols). The esters are selected so that the released alcohol components will couple well and completely with the used diazonium salts. The reactivity of the diazonium salts must be selected by an appropriate selection of the substituents that there is a quick coupling with the alcohol components liberated from the esters used in the agent, but that there is no post-reactivity with other components of the test solution. The subject of the present invention is therefore means for the determination of esterolytic and / or prosthetic enzymes, especially esterases and / or proteases present in leukocytes, in the form of test strips on an absorbent carrier, a film layer, a powder mixture, a lyophilisate, a solution or reagent tablets, which contain a suitable basis, for the determination of esterases or proteases, buffer and possibly other additional substances usually used, characterized in that combinations consisting of a specially substituted diazonium salt are used as the basis for the determination of esterases or proteases. and the corresponding ester, the reactivity of which is selected by the corresponding parameters The selection of the substituents so that there is a sufficiently quick coupling with the alcohol component released from the ester, but that there is no reaction with the other components of the test solution. Appropriately substituted diazo salts in the agent according to the invention are compounds of general formula I, in which Bt is low alkyl, low alkoxy, low alkyl mercaptane, N-morpholino, 4 N-thiomorpholino, N-pyrrolidine, optionally tf-alkylated N-piperazine, N-piperidine, halogen or hydrogen, R "Denotes low alkyl, low alkoxy Iowa, aryloxy, low alkyl mercaptan, alkylamino, dialkylamino, hydroxyl, N-morpholine, N-thiomorpholino, N-pyrrolidine, optionally N-alkylated N-group. piperazine, N-piperidine, phenylamine, u optionally substituted by a low alkyl residue or by a low alkoxy phenyl moiety, halogen or hydrogen, R * R4, Rg are being identical or different, each means a low alkyl group, a low alkoxy group, a low alkyl mercaptan group, a halogen atom or a hydrogen atom, and X is a stabilizing anion. Esters selected from the group of compounds of the general formula are suitable for use in the invention. 2, wherein R'lf and Ra ', Rj', R / are the same or different in each case and each represent a hydrogen or halogen atom, a low alkyl group, a low alkoxy group, an aryl, aralkyl, aralkoxy group, hydroxy, carboxy, carboxy-n-H-alkoxy, aralkoxycarbonyl, arylalkoxycarbonyl-low alkoxy, nitro or low acylamino, or the two adjacent substituents each represent an optionally substituted halogen fused benzene residue, or X 'is substituted by a low alkyl, aryl, arylalkyl group or by an acyl group, A is an amino acid residue or a peptide residue, and B denotes either a nitrogen protecting group used in peptide chemistry, or from the group of compounds of the general formula (III), where R 1, R 1 ", R t", R 1 are the same or different, and denote each hydrogen atom, low alkyl group, low alkoxy, alkylamino or dialkylamino group, where two optionally adjacent substituents also denote a fused benzene ring, and A and B have the meaning given above. 45 The esters of the general formulas 2 and 3 are quickly and completely saponified by esterases and / or proteases, for example by esterases and proteases occurring in the neutralizing granulocytes. The released phenolic components react well, 50 quickly and selectively with those showing little affinity electrons with diazonium salts of general formula 1. Therefore, according to the principle of the invention, it is possible to obtain a stable and fast-indicating means for the determination of leukocytes in body fluids. Moreover, it has turned out that the agents according to the invention are perfectly suited for the general determination of proteolytic enzymes, such as, for example, elastase, chymotrypsin or trypsin in aqueous solutions or in body fluids, such as M, for example, in whole blood, serum and fluids, in pancreatic secretions or in aqueous stool extracts. Diazonium salts of general formula I are partially known compounds. Derivatives in which the gg substituents Ra and / or Rf represent N-thiomorpholino, N-pyrrolidine, optionally N'-alkylated N-piperazine or N-piperidine are novel compounds. However, they can be prepared by known methods by analogy with known substances. The compounds of the general formula 2 are described in the German patent publication no. P 28 54 987.3. The esters of the general formula 3 are novel compounds. They can be prepared in such a way that compounds of general formula 4, in which R ^, R2 ", R ^ * and R4" have the meaning given above, are reacted with amino acids and peptides of general formula HO-AB, in which A and B have the meaning given above, or the corresponding reactive derivatives thereof by methods used in peptide chemistry. As reactive derivatives, e.g. acid chlorides or mixed anhydrides, for example with ethyl chloroformate, or active esters are used as reactive derivatives. by the term R2, R2, R8, R4 and R5 or R1, R2 ', R' 'and R4' is meant fluorine, chlorine, bromine and iodine, in particular chlorine and bromine. Low alkyl, alkoxy, captan alkyl, alkyl - and dialkylamines in the terms Ri-R5, Rf-R4 'as well as Ri "-R4" contain 1 to 5, preferably 1 to 3, carbon atoms, the corresponding methyl residues being quite particularly distinguishable. stabilizing the X anion, tetrafluoroborate, tetrachloro-zincate anion is preferred or perchlorate. Under the arylalkoxy group in the term R 1, R2 ', R8' and R4 'and under the aralkyl group in the term X' are meant, for example, substituted by oxy-low alkyl or by low alkyl residues of phenyl groups and naphthyls, the alkyl moiety containing 1 to 5, especially 1 to 3, carbon atoms. A benzyloxy or a benzyl residue is particularly preferred. As the low acylamino group R 1, R 1, R A 'and R 4' are amide groups of low aliphatic carboxylic acids having 1 to 5, in particular 1 to 3, carbon atoms. In particular, the acetylamino residue is distinguished. Any acyl residue in the term X 'includes aliphatic carboxylic acid residues with 1 to 5, in particular 1 to 3, carbon atoms, or aromatic carboxylic acids, such as benzoic acid or naphthoic acid, for example. In particular, acetyl and benzoyl residues are distinguished. Under R /, R2 ', Rs', R4 'and X', an aryl or arylalkyl residue is usually understood to be a phenyl or naphthyl group or a benzyl residue. As an amino acid residue in A it is possible to consider the natural α-amino acid residues in the L or D form or also in the racemic form. Particularly preferred are glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine and tyrosine residues, with the modification L being particularly distinguished in each case. Any free hydroxyl groups present may be acylated, mostly acetylated. the term A is understood to mean, for example, di-, tri-, tetra and pentapeptides, especially di- and tripeptides, where the amino acid components are especially the above-mentioned amino acids. the term B is understood to mean, for example, acyl, oxycarbonyl, thiocarbonyl, sulfonyl, sulfenyl, vinyl, cyclohexenyl, phosphoryl or carbamoyl groups. The diazonium salts of general formula 1 and esters of general formula 2 and 3 used in the invention are used in the present invention. concentrations of 10 - * mol / l to 10 - x mol / l, especially 10 - * mol / l to 10 - * mol / l of impregnating solution - coating mass or liquid to be tested. A suitable buffer system is the agent of the means according to the invention for the determination of proteolytic enzymes, in particular leukocyte proteases. These include, for example, phosphate, borate, barbiturate, tris- (hydroxymethyl) paminomethane = Tris (, 2-amino-methane) = Tris (, 2-ammo-2H-methyl-yl, 3-propanediol) = Amediol) or 'amino acid buffer, the pH value and the capacity should be selected so that the pH value in the measured solution or on the test strip is set to 6-10, usually 7-9. A further component of the agent according to the invention for the determination of proteolytic enzymes may be A wetting agent, as a more homogeneous color distribution and, in part, a brighter color can thus be obtained. Cationic or aninic active as well as amphoteric and non-ionic wetting agents can be used in concentrations of 0.05-2% (w / v), especially 0.1-1% (w / v). according to the invention, it may serve as a stabilizer of a phosphorous or phosphonic acid amide of the general formula 5, in which R6 is a dialkylamino, alkoxyl, aryloxy, alkyl or aryl group, or an N-morpholino group, and R7 and R8 represent the group dialkylamino or N-morpholino. As a further component of the present invention, R6 includes hydrocarbyl groups of up to 10 carbon atoms. A aryl or aryloxy group in R "is understood to mean optionally substituted by a halogen atom, by low alkyl groups, or phenyl or naphthyl alkoxy groups. With compounds of general formula 5, surprising stabilization of the formulas is obtained. The amides of phosphoric and phosphonic acid of general formula 5 are compounds of the general formula 5. These are known, for example, from DE-A-2235127 as stabilizers for test strip formulations which operate on the principle of peroxidase detection. Phosphonic acid amide stabilizers of general formula 5 are added to aqueous or preferably organic impregnating solutions in concentrations of 1 to 20% (w / v), in particular 5 to 15% (w / v). 29 18 30 35 40 45 50 55 60T IM 123. He will introduce one or two Mika of the activators. According to the invention, the compounds described and claimed in IRFN Patent No. 29 05 531.0 have proved to be suitable for the measure. The activators are added to the impregnation solution in concentrations of 0.5-10%, preferably 1-5% (by weight). In order to prepare the agent according to the invention, for example, an absorbent carrier, in particular filter paper, cellulose or synthetic fiber fleece, is impregnated with the solutions required, usually used for the production of test strips of reagents (substrate, buffer, and possibly wetting agents). ) In easily volatile solvents, such as, for example, in water, methanol, ethanol or acetone. This is preferably done in two separate steps, first impregnating with an aqueous solution which contains a buffer and other water-soluble additives. The protease substrates solution of general formula 2 or 3, diazonium salts of general formula 1 and activators are then impregnated with the substrate solution. However, the impregnations can be carried out in a different order or by using a different composition of the two impregnating solutions. The finished test strips can be used as such or glued to the lugs in a known manner or, in particular, welded between the plastic and the fine mesh as described in the patents. German Federal No. 2,118,455. To produce coated test strips, all the reagents are added to a solution or dispersion of a film-forming agent, such as, for example, polyvinyl ester or polyamide, and mixed until homogeneous. The mixture is spread out in a thin layer on a plastic carrier and dried. The coated test strips according to the invention are cut after drying and can be used as such or glued to handles or welded in a known manner between plastic and a fine mesh according to German Patent Specification No. 2,118,455. Protheolytic enzymes, in particular leukocyte proteases, are prepared in the form of powder mixtures or reagent tablets by treating the above-mentioned test components with conventional galenical additives and granulating. Such additives are, for example, carbohydrates, such as, for example, mono-oligo- or polysaccharides, or sugar alcohols, such as, for example, mannitol, sorbitol or xylitol, or other soluble inert compounds, such as polyethylene glycols or polyvinylpyrrolidone. In general, the total weight of the reagents is about 50-200 mg, in particular 50-80 mg. In order to produce lyophilisates with a total weight of about 5-20 mg each, especially about 10 mg, the solution is evaporated from the freezing state, which in addition to all necessary to B of the reagent test, usually it contains enhancers, such as, for example, polyvinylpyrrolidone, and optionally further fillers, such as, for example, mannitol, sorbitol or xylitol. In the form of a solution, the pear according to the invention comprises in particular all the reagents required for the test. Suitable solvents are water or mixtures of water with a water-soluble organic solvent, such as, for example, methanol, ethanol, acetone or dimethylform mamide. For stability reasons, it may be advantageous to separate the reagents needed for the test into two or more solutions, which are combined appropriately on appropriate testing. The materials thus prepared, when immersed in the test body fluid or added to a suitable body fluid, allow a quick and simple determination of the presence of proteolytic enzymes, especially leukocyte proteases, by the appearance of a color that can be assessed visually either photometrically, e.g. with a re-emission photometer, or in a cuvette. Due to the fact that the activity of leukocyte proteases per cell can in principle be regarded as a constant value, it is possible to determine the concentration of leukocytes in the test body fluid from the intensity of the color developed. The measure according to the invention covers both intact and disintegrated leukocytes, since the activity of the leukocyte proteases is also fully maintained after the breakdown of leukocytes. Thus, the disintegration error does not occur. The following examples explain the invention in more detail. Example 1. Filter paper (e.g. Schleicher u. Schiill 23 SL) is impregnated successively with the following solutions and then dried at a temperature of 60 ° C: Solution 1 45 0.2 molar borax buffer - hydrochloric acid pH 8 10% phosphoric acid trimorpholide Solution 2 2X10- * mol / l substrate 10— * mol / l diazonium salt dissolved in acetone / decanol 98: 2 Substrates S 1: 3-fN- (toluene-4'-sulfonyl) -1- alanyloxy] -indole S 2: 3- [N- (toluene-4'-6ulfonyl) -Li-alanyloxy] -1- n-methoxynaphthalene S 3: 1- [N- ( toluene-4'-sulfonyl) -L-alanyloxy] -4-methoxynaphthalene S 4: 1- (N- (toluene-4'HSulfonyl) -L-alanyloxy] -4- isopropoxynaphthalene m S 5: 1- (N- (toluene-47-sulfonyl) -Li-alanyloxy] -4-pentyloxynaphthalene S 6: 14N- (toluene-4'-sulfonyl) -L-alanyloxy] -3-dimethylaminobenzene S 7: ln [N, toluene-4 '-sulfonyl) -L-alanyloxy] -3-N-diethylaminobenzene 131 123 10 S 8: 1- (N- (toluene-4'-ulfonyl) -L-alanyloxy] -3,5-dimethoxybenzene S 9: 1- (toluene-4'-sulfonyl) -L-aiamyloxy] -3-methyl-5-nontoxybenzene Diazonium salts D 1: 2,4-dimethoxy-benzenediazonium tetrafluorolborane D 2: 4-methoxynaphthalene-1-di- tetrafluoroborate azonium D 3: 2,5-dimethoxy-4-dimethylaminobenzene diazone tetrafluoroborate D 4: 4-dimethylaminobenzene diazonium tetrafluoroborate Papers are obtained, which, when immersed in urine, contain 100 leukocytes / µU within approximately 3 minutes of the list in the table 1 The assessment can also be made with a re-emission photometer. Table 1 10 15 Substrate S 1 S 1 S 1 1 S * S 2 S 2 S 2 | S 2 S 3 S 3 1 S 3 S 4 S 5 S 6 S 7 S 8 S 9 Diazonium salt D 1 D 2 D 3 D 4 D 1 D 2 D 3 D 4 D 1 D 2 D 3 D 1 D 1 D 1 D 1 D 1 D 1 Red-brown color red-brown blue-gray green red light red violet lilac red-violet 1 violet 1 blue-gray lilac light red light red red-violet red-brown Example II. The filter papers are impregnated successively with the following solutions and dried at 60 ° C: Solution 1 0.1 M borate buffer pH 8 Solution 2 2 X 10 · mol / l 2-mteoxy-4- tetrachlorocyanide (N- - (morpholine ) -benzene diazonium 2 X10- »mol / l substrate * 10% phosphoric acid trimorpholide in a mixture of ethanol / l-decanol 98: 2 * substrate A: 3- (N, benzyloxycarbonyl-L-alanyloxy) -indole B: 3- (N -benzyloxycarbonyl-L-alanyloxy) -5-methylindole C: 3- (N-benzyloxycarbonyl-L-alanyloxy) -7-methylindole 25 30 35 40 45 50 55 60 D: 3- (N-benzyloxycarbonyl-L -alanyloxy) -4-chloroindole E: 3- (N-benzyloxycarbonyl-L-alanyloxy) -5-bromoindole P: 3- [N- (toluene-4'-sulfonyl) -L-alanyloxy] -indole G: 3- [N- (toluene-4'-6ulfonyl) -L-alanyloxy] -5-methoxyindole H: 3- [N- (4'-acetamidobenzenesulfonyl) -L-alanyloxy] -indole I: 3- [N- (4'-methoxytosyl) -L-alanyloxy] -indole K: [N- (toluene-4H-sulfonyl) -Li-alanyloxy] -benzene L: 1- [N- toluene-4'- sulfonyl) -L-alanyloxy] -naphthalene M: 1- [N- (toluene-4, -sulfonyl ) -L-alanyloxy] -3-methoxybenzene The reagent papers thus obtained can be shown in the urine containing leucocytes of 100 pi leukocytes. Reagent papers of comparable reactivity can also be obtained if, instead of the diazonium salt mentioned above, the following is used: 2-methoxy-4- (N-pyrrolidino) -benzene-diazonium tetrafluoroborate, 2-methoxy-4- (N-piperidine) -ben- zenediazonium tetrafluoroborate, 2,6-dimethoxy-4- (N-morpholine) -benium tetrafluoroborate - zenediazonium, 4H-methoxy-2- (N-morpholino) -benzene-diazonium tetrafluoroborate, 2-methoxy-4- [N- (N'Hmethyl) piperazonium] - 'benzenediazonium tetrafluoroborate, (2-methoxy-4- (2-methoxy-4-) tetrafluoroborate N-thiomorpholino) -ben- zenediazonium. Example III. The following stock solutions are prepared: 1 2 x 10 · mole / 1 ln [N- (toluene-4'-sulfonyl) -L-alanyloxy] -4-isopropoxynaphthalene 10 · mole / l tetrafluo-borate solution 2,4- dimethoxybenzene diazonium in a mixture of acetone / 1-decanol Table 2 Activator without activator 4-azafluoreri quinine ibenzo- (h) -quinoline 1 -bis-4-pyridyl-1 ethylene I 1-decanol 1-tetradecanol ndtroprusside sodium hexcyocyanate iron- (II) -potassium Activator addition in mg to 20 ml of solution 1 33 33 36 37 400 400 - solution 2 - - - - - - 31 40 Reaction time (sec.) 54 17 32 8 34 5 I 4 1 38 30 *** 11 Solution 2 0.2 molar borax buffer - hydrochloric acid 10% phosphoric acid trimorpholide. In each case either to solution 1 or / to solution 2 are added the activators specified in Table 2 in the concentration, and then saturate the filter papers with solutions 1 and 2 and dry each time at 60 ° C. When tested in an isotonic salt solution with 3% leukocytes / µU, the tests reacted at the desired times. 'Example IV. The filter paper is saturated with the following solutions and, after saturation, each time dried at 60 ° C. Solution 1 2 × 10 mole / l 34 N toluene-4'-sutphonylp) -L-alanyloxy] -indole 2 × 1 ° - a mole / 1 2-methoxy-4-moriolmobenzene diazonium tetrachlorozinate in aeeton / 1-decanol mixture 93: 2 Solution 2 0.2 molar borax-hydrochloric acid buffer pH 8 10% phosphoric acid trimorpholide. ¬ Form 2 of phosphoric acid trimorpholide. Samples with phosphoric acid trimorpholide, after heating for 2 days at 60 ° C, remained unstained and reacted well with leukocyte-containing solutions. Samples without phosphoric acid tri-morpholide showed a gray color. Example 5 A reagent tablet was prepared in a known manner, containing the following ingredients: 2 mg 3- [N- (toluene-4'-sulfonyl) -Lr-alanyloxy] -in * lower , 2 mg of 2-methoxy-4- (N-morpholin) -benzene diazonium tetrachloro-zincate, 1.5 mg of potassium dihydrophosphate, 301 mg of disodium bisodium bisphosphate dihydrate, 20 mg of mannitol. These tablets were dissolved in 2 ml of urine containing leukocytes and mixed well. When leukocytes were present, a red-violet color was present. Thus, 100 leukocytes could be measured in approximately 2 minutes. If the urine was kept at 37 ° C before adding the tablet and during the reaction, 20 leukocytes could be measured at the same time. Example VI. Preparation of 1- [N- (toluene-4'-sulfonyl) -L-alanyloxy] -3,5-H-dimethoxybenzene for active ester * reaction 14.6 g (0.06 mol) N- (toluene- 4-sulfonyl) -alanine and 12.2 g (0.09 mol) of N-hydroxybenzotriazole are dissolved in 300 ml of absolute ethyl acetate *, cooled to 0 ° C and treated with 12.4 g 0.06 mol. ) dicyclohexylcarbodiimdide. To form the active ester, the mixture is stirred for 2 hours at 0 ° C. and then for a further 2 hours at room temperature. After adding 6.2 g (0.04 mol) of 3,5-dimethoxyphenol and 5.5 ml (0.04 mol) of triethylamine, the mixture was stirred for 15 hours at room temperature. Formed at N, N 'pressure. The slurry is concentrated under reduced pressure with a maximum bath temperature of 50 ° C. The residue is taken up in 200 ml of ethyl acetate and washed successively 3 times with 100 ml of 5% citric acid each and then respectively 100 ml of 5% sodium bicarbonate solution. The organic phase is dried over sodium sulfate and concentrated under reduced pressure. The oily crude product is purified by column chromatography on a silica gel column using toluene-ethyl acetate (4: 1) as eluent. The appropriately collected fractions are concentrated, the residue is dissolved in a small amount of methylene chloride and precipitated by adding ether. 5.8 g are obtained, i.e. lf corresponds to 38% of the theoretical yield of 1- [N- (toluene-4'-sulfonyl) -L-alanyloxy] -3,5-dimethoxybenzene in the form of colorless crystals with a temperature of mp 110 ° C. audio: —52.5 ° (c = 1%, acetone). In an analogous manner, by reacting N- (toluene-4-sulfonyl) -L-alanine with appropriately substituted phenols or naphtholes, the following substances are obtained: 6.1. [N, toluene, sulfonyl, L-alanyloxypbenZene, colorless crystals, m.p. 113 ° C. u aD ": -63.8 ° (c = 1%, acetone) 6.2. 1,2 [N-dimethylaminobenzene, colorless, amorphous powder thin layer chromatography: ready-made silica gel plates (eluent: toluene-dioxane 2: 1 development: UV, RF value: 0.68) 6.3. 1- | [N- (toluene-4'-sulfonyl) -L-alanyloxy] -3-methoxybenzene, colorless crystals melting at 60-61 ° C Gd *: -62.9 ° (c = 1%, methanol) 6.4. 1, [N, 2 (toluene-4'-sulfonyl) -L-alanyloxy] -naphthalene, colorless, thick oil a **: -27.3 ° (c = 1%, methanol) thin layer chromatography; ready-made silica gel plates (eluent: toluene-dioxane 4: 1, 50 development: UV, RF value: 0.53) 6.5. 1-t [N- (toluene-4'-sulfonyl) -L-alanyloxy] -4-methoxynaphthalene colorless crystals, m.p. 136 ° C M aD2 *:? 12.6 ° (c = 1%, acetone) 6.6. ln [N- (1; oluene-4'-sulfonyl) -L-alanyloxy] -4-isopropoxynaphthalene colorless crystals, melting point 93-96 ° C an20: -38.0 ° (c = 1%, acetone) m 6.7. l-CN- (toluene-4'-sulfonyl) -L-alanyloxy] -4-pentyloxynaphthalene colorless crystals, mp 87 ° C Cd20: -36.9 ° (c = 1%, acetone) 6.8. li [N- (toluene-4'-sulfonyl) -Lr-alanyloxy-3-tetra-diethylaminobenzene 131 123 U * A colorless crystals, melting point * 3r-84 ° C. on, *: - ^ 59.4 ° thin layer chromatography: ready-made silica gel plates (eluent: xylene-methyl ethyl ketone 1: 1, Rr value: 0.6S) 6.9.1 ^ [N- (toluene-4'-sulfonyl) -L-alanyloxy) -3-methyl- ^ H-methoxybenzene, colorless crystals, m.p. 79- ^ 81 ° C *: 62 ° C (c = 1%, methanol) thin layer chromatography: finished silica gel plates (eluent: chloroform-methanol 20: 1, RF value: 0.79 Example VII. Preparation of 2- [N- (toluene-4'-sulfonyl) -L-alanyloxy] -4-methoxynaphthalene Solution 1 For the preparation of the acid chloride according to the one-step method 19.44 g (0.08 mol) N- (toluene) 4-sulfonyl) -L-alanine is dissolved in 100 ml of absolute dimethylformamide and cooled to -20 ° C. Then, while stirring and cooling, 5.81 ml (0.08 mol) of thionyl chloride are added by pipette and the reaction mixture is kept for 30 minutes in a cooling bath at -20 ° C. Solution 2 To a solution of 6.96 g (0 0.04 mol) 4-methoxy-2-naphthol in 50 ml of absolute dimethylformamide are added 11.0 ml (0.08 mol) of triethylamine. The mixture is cooled to -20 ° C. The reaction solution 1 is poured into solution 2 and stirred, excluding water, for about 4 hours at -20 ° C, after which the mixture is left in the refrigerator overnight. the reaction solution is concentrated under reduced pressure at a bath temperature of 50 ° C maximum. The residue is taken up in about 150 ml of ethyl acetate and washed successively with 100 ml of 5% citric acid each and then with 100 ml of 5% sodium hydrogen carbonate solution. After drying over sodium sulfate, the organic phase is concentrated under reduced pressure. The crude product was purified by column chromatography on a silica gel column using a toluene-ethyl acetate mixture (4: 1) as eluent. After concentration of the appropriate collected fractions under reduced pressure, the residue is taken up in a small amount of methylene chloride and then with a mixture of ether and ligroin (1: 2). [N- (toluene-4'-sulfonyl) -L-alanyloxy] -4H-methoxynaphthalene in the form of colorless crystals with a melting point of 119 ° dm: -57.9 ° C (c = 1%, acetone). . The preparation of 2-methoxy-4- (N-morpholino) -benzene-diazonium-tetrachlorocinane 5-chloro-2-nitroanisole is reacted with a 1.5-fold molar excess of morpholine in toluene as a solvent for several hours {10-14 hours) boiling under reflux. The reactions can also advantageously be carried out in morpholine as solvent. The 5-chloro-2-nitroanisole is then added 5-10 times the volume of morpholine. Optionally, the olefinated product is separated by shaking with sodium hydroxide or methylated by reaction with dazomethane. The obtained riitite bond is reduced to alnine in the usual way, palladium on carbon in methanol or tin (II) chloride in hydrochloric acid and the amine diazotized. The diazonium compound is converted in a known manner in a hydrochloric acid solution by adding a concentrated solution of zinc chloride in allbo tetrachlorocinate by adding tetrafluoroborate to the tetrafluoroborate and isolating it as such. Melting point 170-172 ° C. (tetrachlorozinate) 166-168 ° C. (dec) (tetrafluoroborate). Preparation of 4-methoxy-2- (N-morpholine) -benzodiazonium tetrafluoroboron 20.76 g (0.1 mol) of 3-chloro-4-nitroanisole, melting point 52 ° C., is heated for 4 hours. Hours under reflux with 87.1 g (1 mole) of morpholine. It is then cooled to room temperature, 100 ml of ice water are added to the reaction solution, the precipitated yellow reaction product is filtered off, washed with ice-cooled 10% acetic acid and the product obtained is dried in vacuo at 60 ° C. 19.5 g of a mixture consisting of N- (3-Hydroxy-6-nitrophenyl) Hmorfoldny and N- (3-methoxy-6-nitphophenyl) morpholine are obtained. This product was dissolved in methylene chloride and ethereal diazomethane was added and left for 2 days at room temperature. After this time, the excess diazomethane is decomposed by the dropwise addition of 2 N acetic acid, the organic phase is shaken several times with 2 N sodium liquor and the solvent is distilled off under reduced pressure. 19.1 g, corresponding to 80.2% of the theoretical yield, of N- (3-methoxy-6-nitrophenyl) -morpholyri, mp 84-86 ° C, are obtained. The material is then suspended in 250 ml of methanol and hydrogenated with the addition of 1.9 g of 10% palladium on carbon at 20-30 ° C. After filtering off the catalyst, the filtrate is concentrated and the free base is converted to the hydrochloride with ethereal hydrochloric acid. 20.6 g of N-O-methoxy-6-aminophenyl) -morpholine dihydrochloride crystallizes out, representing 73.1% of theoretical yield, mp 237-240 ° C. The product is suspended at a temperature of -5 ° C. in 96 ml of 6N-hydrochloric acid and a solution of 6 g of sodium nitrite in 12 ml of water is added dropwise thereto within 30 minutes. The resulting brown-red solution of the diazonium salt is added at 0 ° C. with stirring to 120 ml of 35% strength tetrafluoroboric acid. After standing for several hours, 19.5 g (63.5% of theory) of 4-methoxy-2-morpholine) -benzene diazonium tetrafluoroborate are obtained in the form of yellow crystals, m.p. 115-116 ° C (with The following is prepared in an analogous manner: a) from 5-chloro-2-nitroandzole and thiomorpholine tetra- • o131 123 15 16 2-methoxy-4-diazonium fluoroborate, mp 106-108 ° C, decomposed. 2-amino-5- (N-thiomorpholin) -anisole dihydrochloride intermediate is prepared as follows: 100 g of zinc II chloride dihydrate, in 400 ml of 6N-hydrochloric acid are introduced into a 1 liter three-necked flask with stirrer. 25.4 g (1 mole) of 2-nitro-5- (N-thiomorpholine) -anisole are added in portions while stirring at room temperature. The mixture is heated for 30 minutes at 75 ° C and cooled to room temperature and the reaction solution is added dropwise, under ice-cooling, to 750 ml of 30% strength sodium liquor. The free base is extracted several times with ether and converted, after drying and the solvent has been distilled off, into the hydrochloride by adding ethereal hydrochloric acid. 24.9 g (83.8% of theory) of 2-amino-5- (N-thiomorpholine) -anisole dihydrochloride, mp 218-220 ° C, are obtained. b) from 5-chloro-2-nitroanisole and piperidine, 2-methoxy-4- (N-piperidino) -benzene-diazonium tetrafluoroborate, mp 123-125 ° C, with decomposition. c) from 5-chloro-2-nitroanisole and pyrrolidine, 2-methoxy-4- (NH-pyrrolidine) -benzene diazonium tetrafluoroborate, mp 137-139 ° C, with decomposition. d) from 5-chloro-2-nitroanisole and N-methylpiperazine tetrafluoroborane-dihydro-tetrafluoroborate 2-methoxy-4- [N-diazonium, m.p. 163 ° C, decomposed. In the preparation of this compound, diazotization is carried out with nitrite amyl amyl in methanol. 39.6 g (0.1 mole) of 2-amino-5- (N-methylpiperazine) anisole dihydro-tetrafluoroborate were dissolved in 175 ml of methanol, and 11.6 g (0.1 mole) of 1 mole) of amyl nitrite in 25 ml of methanol and slowly, while stirring at 0 ° C., 35% tetrafluoroboric acid is added dropwise and allowed to stand still. 24.8 g crystallize out, which is 51.7% of the theoretical yield, of bronzed tetra crystals. - 2-methoxy -4- [N- (N'-methyl) -piperazine] -benzene-diazonium fluoroborane-dihydro-tetrafluoroborate, m.p. 163 ° C., decomposed. e) from 5-chloro-2-nitroanisole and morpholine 2-methoxy-4-tetrafluoroborate (N-morpholino) -benzene-diazonium, temperature 166-168 ° C, decomposed. Patent claim Agent for determination of esterolytic and / or pro ¬ theolytic enzymes in the form of test strips on an absorbent carrier, foil layer, powder mixture, lyophilisate, solution or tablet 39 35 40 45 50 51 reagent containing a suitable basis for the determination of esterases and / or or proteases, a buffer and, if appropriate, further customary additives, characterized in that combinations consisting of a diazonium salt of general formula I are used as the basis for the determination of esterases and / or proteases, in which R2 is low alkyl, low alkoxy, low alkyl mercaptan, N-morpholino, N-thiomorpholine, N-pyrrolidine, optionally N'-alkylated N-piperazine, N-piperidino, halogen or hydrogen, R8 is low alkyl group, low a group lkoxy, aryloxy, low alkyl mercaptan, alkylamino, dialkylamino, hydroxy, N-morpholino, N-thiomorpholino, N-pyrrolidine, optionally N'-alkylated N-piperazine, N-piperidine, phenylamino, optionally substituted by phenyl, a low alkyl residue or a low alkoxy residue, hereinafter denotes a halogen or hydrogen atom, R2, R4, R5 are the same or different and each denote a low alkyl group, a low alkoxy group, a low alkyl mercaptan group, a halogen atom or a hydrogen atom, and X is stabilizing anion, and: an ester selected from the group of compounds of general formula 2, in which R ^ R (R) (R) are in each case the same or different and each represent a hydrogen or halogen atom, a low alkyl group, a low alkoxy group, aryl, aralkyl, aralkoxy, hydroxy, carboxyl, carboxy low alkoxy, aralkoxycarbonyl, aralkoxycarbonyl low alkoxy, nitro or low the acylamino group or the two adjacent substituents in each case represent an optionally halogen-substituted fused benzene residue, X 'is a sulfur atom or an imino group, optionally substituted with a low alkyl, aryl, arylalkyl residue or an acyl residue, A is an amino acid residue or peptide, B denotes a nitrogen protecting group derived therefrom, or an ester selected from the group of compounds of general formula 3, wherein R 1 ', R 2 ", R 3", R 4 "are the same or different , each denote a hydrogen atom, a low alkyl group, a low alkoxy group, an alkylamino group, a dialkylamino group, whereby two adjacent substituents can also represent a refined benzene ring, A and B having the meaning given above, and esters are used in concentrations of 10% mol / L to 10-1 mol / L, especially 10% mol / L to 10-2 mol / L of impregnating solution - coating mass or intended for testing For fluid treatment and as additional auxiliaries, wetting agents, stabilizers, activators, film-forming agents, galenic additives and / or enhancing agents are used at 0-2% by weight. 131 123 Ra R1 R3-V-NEN X RA R5 MODEL 2 R R2 OAB R4 R- MODEL 3? 6 R7- P = O Rfl MODEL 4 MODEL 5 PL PL PL PL PL