CS223999B2 - Means for evidence of esterolytic and/or proteolytic enzymes - Google Patents

Description

Vynález se týká prostředků pro důkaz esterulytCc^ýuU a/nebo prsteslyticlých enzymů.

V diagnostice onemocněni ledvin a ursgee0tSlníUu traktu má velký význam důkaz leukocytů v mooč. Až dosud se tento důkaz prováděl mikroskopicky. tím,že se spooital pod mikroskopem počeH leukocytů, které se nacházely v určiéém objemu moče. Tato metoda je ale velmi náročná na ias, namáhavá a kromě toho vyžaduje, aby ji prováděl školený personál.

Od jisté doby se proto zkouši získat jako princip důkazu leukocytů v různých tělesných tekutinách enzymmaiekt reakce, nebo! leukocyty mají široké enzymaaickt spektrum.

Prostředky k důkazu leukocytů v tělesných tekutinách, u nichž se pro analytické účely vyuuivaai esterolytická a/nebo prote^o^i^ti^c^ká aktivita existuuící v leukocytech, jsou známy z němecc^ých zveřejňovacich spisů 28 26 965 a 28 36 644. Jako subsSráty pro esterázy leukocytů a/nebo proteázy leukocytů se při tom . používá ester snufoftaleinu popřípadě ester azobaaviva. Barviva, uvolněná při enzymaaické reakci se vyh^cd^oo^uuí obecně znáními metodami. Prostředky popsané v těchto spisech jsou ppíliš málo citlivé. Vykazuuí ppíliš dlouhé reakiní doby pro dolní mez postřehu, takže praktické použiií je ještě·spojeno s určitými nedootatky, především ppíliš dlouhými čekacími dobami, při provádění testu.

Různé metody k důkazu proteáz a esteráz jsou rovněž známy z hisSochemiukt a cytochemické enzymooogie (srov. například A.G.E. Pearse, Histochemissry, Theeue'eieal and Applied,

3. vyd., СигсМП Livingstone, Edinburgh-]Sondon-New York 1968). V principu ' se i zde pouŽÍvaji rovněž bezbarvé nebo slabě zabarvené estery, které se enzymatickým štěpením ruupaddZÍ nejčazStji v bezbarvou kyselinu a rovněž bezbarvé zltuhиU-/feoul/sové složky. Posledně jmenované složky se potom necheaí zreagovat při reakci, následující po enzyme^^^m zimýuenění, na barevné produkty, napHHa. kopulací s dizuon0osýýi solemi nebo oxidací.

F. Schmalzl a H. Braunsteiner popisují například v Kliň. Wschr. 46, 642 (1968) specifický cytochemický důkaz esteráz leukocytů za přítomnosti naftol-AS-D-chloracetátu jako substrátu a diazoniové soli pro tvorbu barevné azosloučeniny.

Pro prostředek к rychlému a jednoduchému důkazu leukocytů v tělesných tekutinách, jako například v moči, se tyto dvousložkové systémy uvedeného druhu ukázaly být nevhodné. Reagují příliš málo citlivě. Například vzorky 8 5 000 leukocyty^ul nevykazovaly žádnou reakci. Kromě toho reagují, jak je známo, četné v moči přítomné sloučeniny, jako urobilinogen, sterkobilinogen, bilirubin, a jiné, s diazoniovými solemi. To dokazují nejlépe prodávané patentované testy pro důkaz urobilinogenu nebo bilirubinu v moči, které používají pro prokazující reakce diazoniové soli. Diazoniové soli, používané v literatuře, pro důkaz esterázy vykazují popsané vedlejší reakce s jinými součástmi moče a dílem nejsou také použitelné pro test s leukocyty vzhledem к jejich vlastnímu zbarvení.

Úkolem předloženého vynálezu tedy bylo dát к dispozici prostředek к důkazu esterolytických a/nebo proteolytických enzymů s kombinací esterů a diazoniových solí jako reakčních partnerů těchto enzymů, pomocí něhož se tyto mohou stanovit! v krátké době jednoduchým a lehce ovladatelným způsobem, a který nevykazuje žádné vedlejší rušící reakce s ostatními součástmi analyzovaného vzorku.

Tato úloha byla vyřešena tím, že se použije určitá kombinace vhodných esterů a speciálně substituovaných diazoniových solí, přičemž s překvapením bylo zjištěno, že použité diazoniové soli nevstupují v žádné vedlejší reakce s ostatními součástmi moče, jako například bilirubinem a urobilinogenem, nýbrž specificky a rychle kopulují fenolické složky, vznikající při štěpení použitých esterů, za tvorby barevné sloučeniny.

Vhodné estery musí být dostatečně reaktivní vůči esterolytickým a/nebo proteolytickým enzymům, aby se co možná rychle rozštěpily v složky kyselin a alkoholů (pod nimiž se rozumí i fenoly). Estery je nutné volit také tak, aby se uvolněné alkoholické složky dobře a dokonale kopulovaly s použitými diazoniovými solemi. Reaktivita diazoniových solí musí být vhodnou volbou substituentů určena tak, aby sice docházelo к dostatečně rychlé kopulaci s alkoholickými složkami, uvolněnými z esterů, použitých podle vynálezu, ale aby nedocházelo к žádné reakci s ostatními součástmi testovaného roztoku.

Předmětem vynálezu je tedy prostředek к důkazu esterolytických a/nebo proteolytických enzymů, zejména esteráz a/nebo proteáz, přítomných v leukocytech, sestávající z nasákavého nosiče, například filtračního papíru, celulózy nebo rouna z umělého vlákna, filmotvomé vrstvy, například polyvinylesteru nebo polyamidu, práškovité směsi, lyofilizátu, roztoku nebo reagenční tablety, obsahujících systém pro důkaz esterázy a/nebo proteázy, pufr s účinností v oblasti pH 6 až 10, například fosforečnenový, boritanový, barbiturátový, tris-(hydroxymethyl)-aminomethaní = tris)-pufr,2-aminú-2-methyip/'pandiol-1,3-(=amediol)-ový pufr nebo pufr tvořený aminokyselinou, jakož i popřípadě smáčedla,naprIad natrium-2-hexylsulfát, stabilizátory například 4-azafluoren, benz-(h)-chinolin, chinin,1,2-u's-4-pyridylethylen, 1-dekanol, 1-tetradekanol, nitroprusid sodný, ferrokyanid draselný, filmotvurné látky, např. vodnou dispersi směsného polymeru vinylpropionátu, galenické přísady například manit a/nebo látky vytvářející kostru například celulózu, jehož podstata spočívá v tom, že jako systém pro důkaz esterázy nebo proteázy obsahuje kombinaci sestávající z diazoniové soli obecného vzorce I ve kterém znamenají

(I)

-morfolinovou skupinu, N-thiomorfolinovou skupinu, N-pyrrolidinovou skupinu, popřípadě N*-alkylovanou N-piperazinovou skupinu s Cj-Cj v alkyoovém zbytku, N-piperidinovou skupinu, halogen nebo vodík, íC-Cj-alkyoovou skupinu, C-Cj-alkoxrskupinu, fenrloxrskupinu, C-CC-alkylmmrkaptoskupinu, -C^aalkylamínoskupinu,cdi(C₁-C--alkyl)-ттпюskupinu, hydroxyskupinu, N-ltiorfllinovlu skupinu, N-thiomolfolinlvou skupinu, N-ppi^rolidínovou skupinu, popřípadě N'-C|-Суа/kylovanou N-piperazinovou skupinou, N-pipeгidinovlu skupinu, fenrlaminoskupinu, popřípadě 's CyC^ alkyoovým nebo i₁-i--allxxyzbyteem substituovanou fenrlskupinu, halogen nebo vodík, které mohou být stejné nebo různé, znanmnají C₁-Ci-jltylrvlu skupinu, ^-^-/1^xrskupinu, Cj-i--alkylmnrkaptlsktpi.nu, halogen nebo vodík, .přieemž dva sousedící subittuenni mohou společné dlhrlmady znamenat anelovaný benzenový kruh a

X tntraftuorlblritan nebo tntrachlorzineδnatan, a esteru, vybraného ze skupinr sloučenin obecného vzorce II

ve kterém zn/mee/jí

Rp H₂,

Ri,

R^, které mohou být stejné nebo různé, atom vodíku, nebo halogenu, C|-Cy azylovou skupinu, Cj-Cyalkoxrskupinu, benzylovou skupinu, benzylox^kupinu, hydroxrlovou sapinu, karboxylovou skupinu, karb1xy-iyCyj1toxrtkuiint, benzyllxyksrblnylovlu skupinu, bennyl15χrkG/bb1yУ-C₁-Cyjlk1χyttupinu, nitoosktpint nebo.jcetylamin1sktpinu nebo dva souseeící subbsituentr anelovaný benzenový

X' zbytek, atom síry nebo popřípadě CyC^ alkylovým zbytkem, fenylovým zbytkem, benzylovým zbytkem, acetylovým nebo benzoylovým zbytkem substituovanlu iminoskupi-

	nou,
A	zbytek p^ilúzené alfdi- nebo t^irp^c^ptd^ov^ý zbytek, sestávající z těchto /lfa-aminokyssein,
B	skupina chráiící dusík, obvyklá v chemii peptidů, nebo od ní odvozené staupiпу, chránící dusík, například acylové skupiny, o^ykarbonylové skupiny, thiokjrb1ny11vé skupiny, suLf1nylovU skupiny, sulfenylové skupiny, vinylové skupiny, cyklohexylové skupiny, fosfory/lové skupiny nebo k/rbamoylové
nebo	ny. sloučeniny obecného vzorce III

ve kterém

R', Rg, R— , * mohou být stejné nebo různé a znaInenají vodík, CyC--alky^v^ skupinu, C yCy/l^xy-skupinu, CyCj-/lkyjaiinosttρint nebo íí/C-·^-alkyl/aminoskupinu, přieemž dva s^t^bsi^tu^i^ni m^hou znamenat také anelovaný benzenový kruh, mají shora uvedený význam.

Estery obecných vzorců II a III se rychle a dokonale z^čeení esterázami a/nebo proteázami, například esterázami a proteázami, příoomnými v neu^oniních grjnullcrtnch. Uvolněné fenolické složky reaguj dobře, rychle a selektivně s málo elektrofilními diazoniovými solemi obecného vzorce I. Způsobem podle vynálezu se t^edy dají vyroobii stjbblní, rrchle uka/z jcí prostředky pro důkaz leukocytů v tělesných tekutinách. Kromě toho se ukázalo, že prostřed ky podle vynálezu se také výborně hodí k obecnému důkazu proteolyticlých enzymů, jako například elastázy, chyrnoorypsinu nebo trypsinu ve . vodných roztocích, popřípadě v tělesných tekutinách, jako například.plné krvi, séru a likuoru, sekretu slinivky břišní nebo vodných extraktech stolice.

Diazoniové sooi obecného vzorce I jsou zčássi známé sloučeniny, Deeiváty, ve kterých subbsituent Rj a/nebo R^ znamená N-thioooofoinnovou skupinu, N-ppyrolidnnovou skupinu nebo popřípadě N*-alkylovanou N-piperazinovou skupinu nebo N-piperidnnovou · skupinu, jsou nové sloučeniny, Tyto lze aialogicky vyrdbii známými metodami, jimiž se vyrábbjí známé látky.

Sloučeniny obecného vzorce II jsou popsány v německé patentové přihlášce P 28 54 987.3.

Estery obecného·vzorce III jsou nové sloučeniny. Dají se vyrobb^ tím, že se sloučeniny obecného vzorce IV

ve kterém znamenaaí

R, *’ R*, R*’ Rj” í^-Í · shora uvedený význam, nechaa! zreagovat·aminokyselinami obecného vzorce V ' HO-A-B (V) kde

A a B maaí shora uvedený význam, .» popřípadě s jejich vhodnými reaktivními deriváty způsoby obvyklými v ^βιπϋ peptidů.

Jako reaktivní deriváty se používvaí například chloridy kyseein, popřípadě směsné anhydridy, používané obvykle při syntéze peptidů, například s ntaylnsteeeo kyseliny cUlororaveačí nebo aktivní estery.

Dalším předmětem vynálezu jsou proto nové estery obecného vzorce III jakož i jejich poožítí pro výrobu prostředků k důkazu a/nebo ρrltnolyticiýca enzymů.

Pod · pg;^n^e^m halogen v deeiaici subbsituentů R, Rg, R,, R^ a R^popřípadě R*, R^, Rj a Rj je možné rozu^ěi fluor, chlor, brom i jod, s výhodou pak chlor a brom.

Nízké alkylové skupiny, alkoryskupiny, alkylonrkaptlskupiay, alkylaoialskupiny a dialkylaoialskupny v deeiaici R, až R^, R, až Rj, jakož i Raí Rj* obsahují 1 až 5, s výhodou 1 až 3 atomy uhlíku, přieemž především jsou vhodné me ethylové zbytky.

Jako staabiizující anton X je vhodný tetrafjulrblritaa, tntracalorzanečaataa, popřípadě choristan.

Pod pojmem aralkylo^yskupiny v dělnici R*, R^, R a Rj jakož i nralkylové skupiny v deeinici K* . lze například rozumět l:χy-aíziýoi-aliylovýoi, popřípadě nízkými alkylovými zbytky subs tipované fenylové a naftylové skupiny, přičemž alkylový zbytek obsahuje 1 až

5, β výhodou 1 až 3 ·atomy uhlíku. Zejména výhodné jsou beazyllxyzbytnk_>plpřípadě beazylový zbytek.

Jako nízké acylaminoskupiny Rf, Rg Rf a Rf přichází v úvahu amidové skupiny nízkých alifatických karboxylových kyselin s 1 až 5, s výhodou 1 - až 3 atomy uhlíku. Zejména výhodný je acetylaminový zbytek.

Jako acylový zbytek v definici -X* přichází v úvahu zbytky alifatcdých karboxylových kyselin s . 1 až 5, s výhodou 1 až 3 atomy uhlíku nebo také aromatické karboxylové kyseliny, jako například kyselina benzoová nebo naftoová. Zejména výhodné jsou acetylový a benzoylový zbytek.

Pod pojmem arylový zbytek,popřípadě aralkylový zbytek v definici Rf, Rg, Rf, Rf a X' lze s výhodou rozumčti fenylovou nebo naftylovou skupinu, popřípadě benzylový zbytek.

Jako zbytek aminokysseiny přichází v úvahu v definici A s výhbdou zbytky přírodních alfa-aminokyselin v jejich L nebo D formě nebo i ve své racemické formě. Zejména výhodné zbytky jsou glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, fenylalanin, a tyrosin, přičemž především výhodná je L forma. Popřípadě přítomné volné hydroxyskupiny mohou být acylované, s výhodou acetylované.

Pod pojmem peptidový zbytek v definici A je možné rozuměti například dipeptidy, tripeptidy, tetrapeptidy a pentapeptidy, s výhodou dipeptidy a tripeptidy, přičemž se jako složky aminnкksslin používají s výhodou shora uvedené aminnкkssliny. ,

Pod pojmem skupiny chránící dusík, obvyklé v chemii pej^^ti^dů v definici B je možné rozuměti například acylové skupiny, oxykarbonylové skupiny, thiokarbonylové skupiný, sulfonylové skupiny, sulfenylové skupiny, vinylové skupiny, cyklohexylové skupiny, fosforylové skupiny nebo karbamoylové 'skupiny.

Diazoniové sc-li obecného vzorce I a estery obecných vzorců II a III, použité podle vynálezu, se ^uřvají v ^konccntraci 10 mo°./l a^ž ‘ 10 mo^o/l^, s výhodou io\ml/l až mol/1 povlékací hmoty impregnačního roztoku nebo analyzované tekutniy·

Další součástí prostředku k důkazu prltollstických enzymů a zejména k důkazu proteáz leukocytú podle vynálezu je vhodný pufrační systém. Zde přichází v úvahu fosforečnanový pUr, boritanový pufr, barbiturátový pufr, ·trSs-(hyrooxymethsl)-amitomethalt(=tris) pufr, 2-amino-2-methylpropandiol-1,3-(=amediol)-ový pufr nebo pufr tvořený aminolyselinou, přičemž hodnota pH i kapacita se musí voUt tak, aby se v měřicím roztoku, popřípadě na testovacím proužku nastavila hodnota pH 6 až 10, s výhodou 7 až 9.

Daaší součáátí prostředku k důkazu prltellstických enzymů podle vynálezu může být smááedlo, nebot jeho pomocí lze dosáhnout homoognntěšího rozdělení barviva a zčásSi brilantnějších barev. Je možné pouužt CаtionаCtivtí, ale i lnilaktivtí smáčedlo, jakož i amoot^e'n:í a neionogenní smáČedla v kontcnCraci 0,05 až 2 % (hmv), s výhodou 0,1 až 1 % (hm/v).

Jako další součást prostředku podle vynálezu může jako stabilizátor sloužit amid kyseliny fosforečné, popřípadě amid kyseliny fosfonové obecného vzorce VI

R?-P=O (VI) dialkyeaminoskupinu, alkoxyskupinu, aryloxyskupinu, alkylovou skupinu nebo arylovou skupinu nebo N-moofolinový zbytek a dialkylaminohkupinu nebo N-moofolinový zbytek.

ve kterém ' znamenají

Jako alkoxyskupiny, popřípadě alkylové skupiny v definici Rg přichází v úvahu uhlovodíkové zbytky až s 10 atomy uhlíku.

Pod pommem· arylové skupiny popřípadě aryloxyskupiny v deeinici Rg je možné fozummti fenylové nebo naftylové zbytky, substituované popřípadě halogenem, nízkými alkylovýi ' nebo alkoxaskup i^nam.

Amid ' kyseliny fosforečné a amidy kyseliny fosfonové obecného vzorce VI jsou^n^é slou^п1^пу ^uHwIí se napřík¹^ ^podl · německ^o zveřejnovaclbo s^pisu 22 35 ¹27 jako s^(^^a^il^lLzátory receptur testovacích proužků, které pracuj na bázi důkazu peroxidáz.

Stalilizétory typu amidu kyseliny fosforečné a amidu kyseliny fosfonové obecného vzorce VI se přidávaj k vodnému nebo s výhodou organickému impregnačnímu roztoku v koncentracích 1 až 20 % (uOv), s výhodou 5 až 15 % (hi^v).

S překvapením bylo zjištěno, že reakcí doby prostředku k důkazu proteolytcckých enzymů, a zejména proteolytcclých enzymů l^eukoe^^-tů, podle vynálezu, se mohou podstatně zkráétt, když se dodatečně k diazoniovým solím, esterům a dalším až dosud uvedeným pomocným láká^m přidá jeden nebo více aktivátorů. Jako aktivátory, vhodné pro prostředek podle vynálezu se osvěědily sloučeniny popsané a nárokované v německé přihlášce P 29 05 531.0.

Aktivátory se v impregnačním roztoku· po^ívaj v ronceniracích 0,5 až 10 · , . s výhodou až 5 % (hrn/v).

Pro výrobu prostředku podle vynálezu se impreegnu^ například nasákavé nosiče, s výhodou fittaační papír, celulóza, nebo rouna ummiého vlákna, roztoky potřebných, obvyklech pro výrobu testovacích proužků používaných ^agendí (subbtrát, puf, popř. smáčelo) ve snadno těkavých rozpouštědlech jako například vodě, m^e^l^i^nc^o.u, ethanolu nebo acetonu.

Tato impregnace se provádí s výhodou · ve dvou oddělených stupních: nejdříve se impregnuje vodným roztokem, který obsahuje pifr a ostatní ve vodě rozpustné přísady. Potom se impregnuje roztokem subbtrátu proteázy obecného vzorce II,oopříppádě III, difzsnisvý/i solemi obecného vzorce I a aktivátory. Impregnace se může ale provádět i v jiném pořadí, popiřípadě jiným složením obou impregnačních roztoků.

Hotové testovací papírky se mohou používat jako takové nebo se mohou o sobě známým způsobem nalepK na držadla nebo s výhodou na^ařt meei umělé hmoty a síťovinu s jemnými oky podle NSR patentu 21 18 455·

Pro výrobu testovacích proužků povlečených fi0me/ se všechny ^agencie vnesou·do roztoku nebo disperze f10motvot’ré látky jako například ^^viny^ste^ nebo polyamidu a homogenně se íroo/íCalí. Směs se natře v jemné vrstvě ns nosič z,umělé hmoty·a usuší. Testovací proužky povlečené ÍL^/^i^/, podle vynálezu, se po usušení rozřežou a mohou se používat jako takové nebo se nalepí o sobě známým způsobem na držadla nebo se navejří mmei umělé hmoty a síťoviny s jemnými oky podle NSR patentu 21 18 455. .

Diagnssický prostředek k důkazu prote^lLytit^lý^eh enzymů, zejména ^^ot^eáz ·leukoeytů, po* dle vynálezu, ve formě pτéйrovitýfh směsí nebo regenčních tablet se daj vyrobbt · tím, že se · obvyklými 8alfnicrý/i přísadami a 8^гanUutí. Přísady tohoto druhu jsou nappíklad uhlohydráty jako například monosacharidy, oligosacharidy nebo polysacharidy, nebo alkoholické cidcry, jako například marOt, soobit, nebo x'lit nebo jOné rozpustné inertní sloučeniny jako polyetOyleoglykoly nebo polyvioylpyrillědlo. Práškovíté směsi nebo reagenční tablety vykazují obecně konečnou hmoonost asi 50 až 200 mg, s výhodou 50 až 80 m?· . Pro výrobu o celkové amolnolSi asi 5 až 20 mg, s výhodou asi 10 mg, se suší vymezováním roztok, který vedle ostatních pro test nezbytných reagennhí obsahuje obvyklé látky pro vytváření kostry, jako například pollvioylpyrillidlo a event. další plniva, jako například oaaOt, sor^t nebo xylit.

^tagy-osický prostředek podle vynálezu, ve formě roztoku obsahuje s výhodou všechny reageycie potřebné pro test. Jako rozpouštědla přichází v úvahu voda nebo směsi vody s organickým rozpouštědlem, rozpustným ve vodě, jako například metanolem) ethan^em, acetonem nebo dimethylnmcamidem. S ohledem na trvanlivost může být výhodné rozděSit reagencie, potřebné pro test ve dva nebo více roztoků, které se smísí teprve.při vlastní ' analýze.

Takto vyrobené . prostředky diagnostické.ποο^^ί rychle a jednoduše pomocí·vytvořeného zbarvení dokázzti po ponoření do zkoumané tělesné tekutiny nebo po přídavku k dotyčné tělesné tekutině přítomnost proteolythckýcO enzymů, zejména prot^oáz leukocytů, přičemž vytvořené zbarvení se může posuzovat vizuálně nebo fltlíetricky, například remsn:í ШюееИ nebo v ky větě.

Vzhledem k tomu, že se na aktivitu prot^edz leukocytů v buňce může poOOížet jako na . v podstatě konstantní veličinu, dá se z intenzity tvorby barviva zjistit koncentrace ^^cytů ve vyšetřované tělesné tekutině. PřUoo se diagnost^kým prosteedkem podle vynálezu «ссСо!! jak iotaktoí, tak . i uvolněné (rozpuštěné) leuklcyty, oebot cktivitc lejklcytů zůstává i po lysi (rozpuštění) leukocytů zcela zachována. Chyba lyse se tedy οεο^ονί.

P ř í k 1 a d : 1

Filtrační. pappr (například SchOeicaer a Schall 23 SL) se impregnuje po sobě οάβίοά^ίcíoi rozto^ a ^tom se usuší ^při ⁶⁰ °^C.

Roztok 1 pirfr 0,2 ooOároí roztok síísí boraxu a kyseliny solné pH 8 10 % triílrflliěj kyseliny fosforečné

Roztok 2 ² x 10 3 moL/¹ su^trátu

10“² ooO/1 ^diazlnilv^é soli rozpuštěno ve síOs! acetonu s Ι^ο^^^ο 98:2

Slbstráty

S 1: [3- N-í-toluen-A ^,-tulfloyl)-L-clcnlllXll“ioěll

S 2: [3- N-(tlluen-4'tjul0nyyl)-L-clnlyloly]-1-ee0hoxyocftcleo

S 3: [1- N-(tlljeo-4*~sul0onyl)-lraCnlyloly]-4-me0hc>xlocfteleo

S 4: [1- N-(tlluen-4^г-tulOonyl)-Lceeonyloxy]-4-tlPilopc)χloaftcleo

S 5: [1- N-(tlljen-4'-sulOonyl)-Lclanlyrloзyr]44peentc>xloaftcleo

S 6: [i- N-(toluenů^лИПуу!)-r-anlnnllxy]-3-íemollcíaϊoioieonzeo

S 7: [1- N-(tlluen-4'-sulfonyl)-IaaCoУlloyy]-3-etoУlrlímilbeeyueo

S 8: [1- ^-(tllueo-4^Ztjullnyyl)-.lc-alayyloxy]-5,ě-íemolhoyyeoУzeo

S 9: p- N-Ctoluen-^4ísjul^lnyyl⁾..^r-cⁿlУ^ollχy]-í-mothy⁵-^o-metⁿoy^ieenzeo

D 1: 2,4-dimetho:xybennznniazzniumtetrafluorobooitan

D 2: 4-meehooynn*taaen-1-ddazzoiumtetrafluzrz0ooitan

D 3: 2_>5-ditet0zxy-4-diteeto^rlfminc>0onienclidZznlnDQtttnafluooz0ooitfn

D 4: 4-ditetlO-lftinoOonnzndiafoniniotthnafluoroOooihfn

Získafí sn papír-, které při ponoření do moče, obsafoOící leokoc-h-, inditaijí asi za 3 minuty 100 leoocytů^ul zbarverýcCojak je uvedeno v habolce. Hodnocení se může provádět i remisní fotomeerií.

Diazinové soli

Suuotrát	Diazoniová sůl	Barva
S 1	D 1	červenoOnědá
S 1	D 2	červenoOnědá
S 1	D 3	modrošedá
S 1	D 4	zelená
S 2	D 1	červená
S 2	D 2	světle červená
S 2	D 3	liatová
S 2	D 4	lila
S 3	• D 1	červenoOlftová
S 3	D 2	fBatová
S 3	O 3	modrošedá
S 4	D 1	lila
S 5	D 1	lila
S 6	D 1	světle červená
S 7	D 1	světle červená
S 8	D 1	^^rver^a^O^ifJ^o^^á
S 9	D 1	červenoOnědá

Příklad 2

Filtrační ^pap^pr se ^po sobě impregnuje následuj^mi roztok^- a suší ^při . 60 °C.

Roztok 1

0,1 moOární bořitFmovC putfr pH 8 '

Roztok 2 y ^10-3 m]./¹ 2-mteho^0y-d4(N-mtrff0ino)^benzθn^ndazolⁿumtherachlorzine^čnfhfn ² y to“³ moO/⁰ subotrátu % trimorfolid kyselin- fosforečné ve srnměi etOanolu a 1-dekanolu 98:2

Substrát

A: 3-(N-bennzlooy^,kefbo:ion-d-dfaBnlooy)-indol

B: 3-(N-benizloэyrl:aвrooyl-ILalfnnloxy )-5dite]o^řlindol

C: 3-( M-tMenytooy-aarooyl-lLalainrtoyy) -7-meeto-indol

O: 3-(K-benizlooy-aв^bO!ornlL-aBlвnlooy)--4-hOorindol

E: 3-(N-benzyloxykarbonyl-L-alanyloxy)-5-bromindol

F: 3-[N-(tnluen-4'-sulfnnyl)-L-alanilnxy]-indnl

G: 3-[N-(tnluen-4^z-sulfonil)LL-alniyOxiy]-5~niethnxyindoO

H: 3-)[N-(4*-acetamidononzenenSfonnn)-LL_ax_ennloox]-)indol

I: 3- [N-( 4 '-ieehonxltoyl)-L-aOaniOoxi- -indol

K: [N-(toluen-4 '-sufoorirl)LLnoaaiyooiyloeenzen

L: 1-[N-Ltoluen-4*LSulfoayl)-L-nlnalOool]-nnftnlen

M: 1 - [N-(toluen-4'-sulfonyl)-L-anaallool -3-raetOoχybeazea

Pomocí takto získaných indikačních .papírků'Oze dokáázai v mooích, obsařiojícícO leukocyty 100 Oeukocytů/jiO.

Indikátorové papírky se srovnatelnou reaktivitou Oze získat i tak, když se namísto shora uvedených diazoni^ovýcO sooí použije

2-ieeltony-44)^-ρyrroOOdino)Lbenzeeaiaazoeumtieгrnluorobonitna

2-iethonχl44) N-Lippeidiao )Lbenzenaiaaznaιшmetrrnluoroboritan

2,6-ϋπιβ^οι-·44- (N-mo lOcnou-) -beneandnaoanžimtetnaUluoгbnornaan

i.-ee00oУL-2- (N-rnoofooino) Lbenzeead8aznaumtitrrnluoгobonitaa

2-meehooχl4-[N(N'LOo'eth^rl)Lpiperaaiao--beaaendinzonaumteeгanluorobonitan

2-oeehoox<y4-(N-thioooorooino)-OenzeeaianzoauutotranOuorononitan.

Příklad 3 ’

Vyrobí se následující základní roztoky;

Roztok 1 x ^10-3 mo^o/l ¹-[N-⁽ to^Ouea-⁴'-sulfon^l 1 )-^L-n^OnayOoxy] -44зо propoxynaf taOen _2 moo/l 2,4-dioetOoxyloeazadiaaoaOumtotraffuooononitan ve směsí acetonu a 1-dekaaolu v poměru 98:2

Roztok 2

0,2 mooo^iri^zí roztok boraxu v kyselině solné jako pufr

10% trimorfoOid kyseliny fosforečné ^pot^é, c^o se ^bu^á к roztok ¹ ne^bo к roztok ² přidáj dole uvedené aktivátor v níže uvedených koaceenracích, impregnují se filtjačeí papíry roztoky 1 a 2 a při 60 °C se usuší.

Při kontrole v isotonokkém roztoku kuchyňské sooi s 300 ieukocytů^uO reagovaly testy v uvedených dobách.

Aktivátor	mg přidávaného aktivá-	reakční doba (sek)
toru ke 1	20 ml roztoku 2
bez			54
^azafluoren	33	-	17
benzo-(0)LcOiaolia	36	-	8
chinin	33	-	32
1,2-0iSL4-pyridy0et0ylen	37	-	34
1 -dekanol	400	-	5
1-tetaadekanol	400	-<	4
nitroprusid sodný	-	31	38
ferokynnid draselný	-	40	30

P ř i k 1 8 d 4

Filtrační papír se impregnuje následujícími roztoky a:,po impregnaci se usuší při ⁶⁰ °C. Roztok 1 x 10^-3 moO/1 3-(N-toluen-4'-sulfo^nyl-L-alanyloxy)-Indol ² x 10~³ mol/¹ 2-meehooyy--moofo^oino-benzen^ndazonniuntt^eracKLorzinečnaten v aceton/1-dekanolu 98:2

Roztok 2 piďr 0,2 moi^iri^zí roztok boraxu v kyselině solně pH 8 % ti*im^irfo].i^d kyseliny fosforečné

Při dalším pokusu byl v roztoku 2 vynechán trimorfolid kyseliny fosforečné.

Vzorky s ^imorfol^em kyselí.^ ^fosforečná zůstaly ^po zadívání na ⁶⁰ °C ^pc dva dny .nezbarveny a poskytovaly dobré reakce s roztoky, obsahou^ími leukocyty. Vzorky bez trimo fondu kyseliny fosforečné se zabarvovaly do Šeda.

PPíkl a d 5 ‘

Známým způsobem byly vyrobeny reagenční tablety, které obsahovaly nássedduíci složky:

mg 3-(N-toluen-4-sujOon^гl-L·-hlhiyloyy)-indolj mg 2-Inethooy--4(N-щoofoliiю)-benzeidihzo]iiuttetrθehlorzinečnhthnu

1,5 mg khljuodiOydrogenfosforečnanu mg dinhtrUoπOydrogeíífosforeδnanu diOydrátu mg mma^u

Tyto tablety byly rozpuštěny ve 2 ml mooč, obsaaouící leukocyty a dobře promíchány. Za přítomnoosi leukocytů se objevilo červenofialové zbarvení

Asi za 2 minuty se mohlo prokázat 100 leukocytů.

Jestliže se moč ^pře^{d p}řídevkem tablet a ^během reakce zadívala na 37 °^C, tylo mošno prokázat za stejnou dobu 20 leukocytů.

PPíkl a d 6

-[N-(toluen-^ '-tulftiy1)-L-hlanyltyy]-3,5-dimethoxy^benzen

Pro reakci podle způsobu aktivace esterů se rozpuusí 14,6 g (0,06 molu) N-Ctoluen-4-^10onyD-L-alanimu a 12,2 g (0,09 molu) N-ihУiroэχгbeliZtrihzolu v 300 ml absolutního esteru tyseUny octový ochladí na 0 °C a .^doplní ¹²,4 ^{g (0,0}6 mol^ ^dLcyk^l^o^Oe^y^].^kar^bi^d^i:Lm.du. ^pro tvorbu aktivního esteru se míc^há ^{2 h}o^diny ^při 0 °C, ^potom talší ^dvě bodiny ^při teplotě mistrnou. Po přídavku 6,2 g (0,04 molu) 3₎5-di^m^lLh^:y^fe^c^lu a 5,5 ml (0,04 molu) tr^ 601x^801^ se směs míchá 15 hodin při teplotě oííSnitSi. Vzznklá N,N^/-aicyktohexyloočooina se odsaje. Finrát se zahuutí ve vakuu ^při ^t^epLo^t^ě ^lázn^ě m^a^^y.m^].n^ě 50 °C. Zbytek se vyjme do 200 esteru kyseliny octové a po sobě třikrát promyje vždy 100 ml 5% kyseliny citrónové a potom přiměřeně 100 ml 5% roztoku iatrjuohydrogelijLičithiu· Organická - fáze se po usušení sírazem sodným odpaří ve vakuu. Oleeovitý surový produkt se čistí sloupcovou chrooahotraa0í na- sloupci tilkhagllj směsí toluenu a esteru kyseliny octové (4:1). Po zahuštění o^povídaících shromážděných frakcí se -zbytek rozpásl v malém mn^ž^í meetwlencchoridu a vysráží - přddavkem etheru. Získá se 5,8 g (38 %) 1-[N-(ttljlZ-4'-tjlftiyl)-L-ahaiyltyy]. 1 1

-S^-diaethojqfbenzenu, ve foraě . bezbarvých krystalů, teplota tání 110 % -52,5° (c » 1 %, aceton)

Analogickým způsobem se získaaí reakcí N-( toluen-4-sulfonyl)-L-alaninu s odppoídaaícími sub8tiluovanými fenoly nebo naftoly násSedalící látky: _t

6.1. [N-(toluen-4 *-sulfonyl)LLaiaamloyr]-eenzen, bezbarvé krystaly, teplota tání 113 °C . ^ai?· -638⁰ (c = 1, aceton) . .

6.2. . 1-®i-(tolueo-4^,-sufOeyl)-]L·-aeenlOoxL]-a-iemethylimeloeenzee_t bezbarvý amorfní prášek, «D° : -3^6,6° . ⁽c = ¹ %, ootaanol)

TLC: hotové silkaagelové desky (elučoí činidlo: směs toluenu a aiooanu 2:1 detekce UV, hodnota Rp: 0,68) ^6.3. ¹ - [№-( tolu^en-4 *^-sul^lonyl^)LL-·alan^llox^-3-⁰-methoyybenzeo heztařvé kr^ystal^y, teplota ta^- 60 až ⁶¹ °C «^p®^: -⁶2,9° ⁽c = ¹ %, oothanol)

6.4. 1 - [H-(toluen-4'sluflenyl)LL-llenylooy]-eaftaleo bezbarvý viskózní olej “p⁰: -27,3° (^c = 1 %, iwehanol)

TLC: hotové siliaagelové desky (elučoí činidlo: tolueo-aioxao 4:1, detekce: UV, hodnot? Rp: 0,53)

6.5. 1L[NL(tolueo-4 --ufoeyyl)-4-methooyoaftaleo beztarv^é kystaty, teplota ^tání ¹³⁶ °C · ^aD°^{: -}42^,6 ⁰ (^c = 1 % кеИ^-)

6.6. 1 -[^(toluen-- '-stufony ^---Ι-ουloxy] -4-isoproppjkyeftalen bezbarv^é kystal¹, teplota ^tá-í ⁹3 až ⁹⁶ °C op⁰: -38^,0° (^c = 1 % ^etoo)

6.7. 1 -[N-(toluen-4 '-sulfonyl)-LLflfoylloy]L4Lpentooynaftaleo bez^barv^é ^^^-Ι^ teplota taoí 87 °C *D°: -36^° (^c = 1 ' «^, ^etoo)

6.8. 1-[N-( toluen-4 'LSllflOll)-L--l-Olllo₎y]L³-aiet^yllaim0юbenzen ^bez^barvé ^^^-Ι^ teplota ^tá-í ⁸³ až 84 °C e£°: ^-59^,4 °‘⁽c = 1 imeheaio^ *

TLC: hotové sHikaa^^e^^c^v^é desky (elučoí činidlo: směs oyleou a oeethyethylketoou v poměru 1:1 hodnota Rp: 0,68)

6.9. 1 - [N-( toluen-4 )ssullelyl)-f-f0lnl0lXL3-0-mtthL5-0~metloyybeozeo bezbarvé taplota ^táoí ⁷⁹ a^{ž 81} °C ^ap⁰: -^62,2° ⁽c = 1 %^, methanol

TLC: hotové silkaagelové desky (eluční činidlo : směs chloroformu a methanolu 20:1

Rp hodnota: 0,79)

Příklad 7

2-[N-(tolleo-4^Z)-slllelyll)LL-a-oly0oyy]-4-methooyo-ft-leo

Roztok 1

Pro výrobu Chloridu kyseliny podle jedoottupříové metody se rozpuutí 1*9,44 g (0,08 molu) N-- t^ll^uen-·4-8ulfooyl)-L--l-oiou ve ¹⁰⁰ ml absolutn^o ^oet^lforoaii^du a ochladí na -²° °C. Potom se za míchání a chlazení připipetuje 5,81 i. (0,08 molu) thiooyl chloridu a rehkční směs se nechá ³⁰ minut v chladicí si^si při ^-20 °C.

Roztok 2

K roztoku 6,96 g (0,04 molu) 4-methoxy-2-naftolu v 50 ml absolutního dimethylformamidu 80 přidá 11,0 ml - (^0,08 molu) trleOtylaminu. Směs st ochladí na -2⁰ °C.

Reakce

Roztok 1 st ppilije ' k roztoku 2 a míchá se za vyloučení přístupu vlhkos8i asi 4 hodiny při -20 °C,- potom se směs ponechá přes noc v ledničce.

Pro z^pracování se rea^kční roztrá zahusH ve va^kuu při te^plotě !.ázně maximálně ⁵⁰ °C. Zbytek se vyjme asi do 150 ml esteru kyseliny octové a promuje se po sobě vždy třikrát po 100 ml 5% kyseliny citrónové a potom po 100 ml 5% roztoku natriurhydrogennUOičitanu. Po usušení síranem sodným se organická fáze zahuuSí ve vakuu. Surový produkt se čistí sloupcovou c]hromrtofraafí na sloupci silkkagelu směsí toluenu a esteru kyseliny octové v poměru 4:1. Po zahuštění odp^vídaících nashromážděných frakcí ve vakuu se zbytek rozpusSí v malém mioOssví rθtthУ.enchОoridu a potom se vysráží sirésí etheru a ligroinu (1:2). Získá se 2,8 g (18%) 2-[N2(t©Suβn-4'8sul0oyyl)-L-alarιcloyy]-4-ee0foχynθftalenu.

Bezbarvé krkaly, teplota tání ¹¹⁹ °C.

“B°: -57,9° (c = 1 %, ^aceton)

Příklad 8

2-me0fo:y24 4-(2<-ooffonfn2 )tnztzendiaznnirmtetraohlornennčnanan

5-chlo2-n-tifanasf8Ol se nechá zreagovat s 1,5násobrým přebytkem olinu v toluenu jako rozpouštědle vícehodinovým zahříváním při zpětném toku (10 až 14 - hodin). Reakce se může také s výhodou provádět v mor olinu jakožto rozpouutědle. Za tím účelem se S-chOoo^-niSroanisol doplní 5až lOnásobným objemem mo^linu. Eventuálně dimeShylovaný produkt se odddlí třepáním s louhem sodným nebo se dodatečně meShoyuje reakcí s diazorethaner. Získaná nitrosloučenina se redukuje obvyklým způsobem siTsí paládia a uhlí v ^ίΙΙοβηο^ nebo ^lo^dem zinečnatým v kyselině solné na amid a tento se diazotuje. Diazoniová sloučenina st známým způsobem převede v roztoku kyseliny solné přídavkem koncentrovaného roztoku chloridu zinečnatého na tet^i^c^c^hl^c^i^c^ziii^e^č^nat^an nebo přídavkem kyseliny tetrafuuoroborité na tetrafuuoroboriten a jako takový izoluje.

Teplota ttoí ¹⁷⁰ ,.··až 17² °C ⁽tetaachlorozⁿnečnatan) ¹⁶⁶ až 168 °^{C (}tetrafuuoroboritan)

Příklad 9

4-me0fo:y222..(N-lf>f0l1ino)tbentnddazfnniumtetrafluorofrranan.

18,76 g (0,1 molu) 3·2Cl01cr·24-nitrfani8flu, teplota tání 52 °C, st zahřívá s 87,1 g (1 molem) moofolinu 4 hodiny pod zpětrým tokem. Potom st ochladí na teploiu místnoosi, k rtakčnímu roztoku st přidá 100 ml ledové vody, vyloučený žlutý produkt se odsaje, promj ledlem ochlazenou 10% kyselinou octovou a získaná látka st usuší při 60 °C ve vakuu. Rezuutuje 19,5- g samsi sessáávjící z N-(3-hydr oj^yó-nitrof enyl morfo linu a N-(3-rethooyy6-2itf0fenyl)roffflinu. Tento produkt st rozpuutí v ^Ο^^ηοΗΟο^^ a přidá st etherický roztok diazomethanu. Po dvoudenním - stání při teplotě místnoosi se přebytečný diazomethan rozruší přikapáním 2N kyseliny octové, organická fáze st vícekráte protřepe 2N hydroxidem sodným a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Získá st 19,1 g (=80,2 %) N-H-methooy-ó^itrofejnfD-morfolinu. ^Teplota t^ání ⁸4 a^{ž 86} °C. ^Potom ^- se tato l^át^ka suspenduje ve 25° ml methanolu a ^po přídavku 1,9 ^g směsi ^pal^ádia a u!^^o^:í (10 %) st hytoogenuje při ²⁰ a^ž 3⁰ °C. ^Po ods^sáí ^{- k}atalyzátoru st maximálně zahussí a - uvolněná báze st převede přídavkem etherického roztoku kyseliny solné v ОубгосЬОог!^

Vykrystaluje 20,6 g (=73,1 % teor.) · 'N-^-methoxy-ó-sminofenyDmorfolindiřhdrochloridu, tep» lota táO 237 ež 240 °C.

Tento oattrOál se suspenduje · při -5 °C v 96 ml kyšeliод solné ·a během 3⁰ oinut se přikape roztok 6 g dusitanu sodného ve 12 ml vody; vzniklý hnědočerveoý roztok riazoniové soli se přidá ^při ⁰ °^C za ^ic^lái^:í ^re >²⁰ ml 35% tetrafluorborité tyseli-o^ Po vicehodonovém stáni se získá 19,5 g (= 63,5 % teoo.) 4-oeehllys--(morfelioo)-blnzenOrazoliumtetrraluoroboritaou, žluté to^staty, te^plota tooí H5 až 116 °C ⁽roz^kla^d). '

Analogickým způsobem se získá

a) z 5-chlrr-2-°itrraoisrls a tliroooOoliou ²-oelhllys4>-(N-tliooolellino)bl°nze°daazl°iuotetrafluoroboritao

Teplna táO 106 až 108 °C (^klad)

Meez^pndukt 2-яIninoo55(N--hlor₁₀rOoOino )-anisoirilydrochlorir se vyrobí náslerlvně:

Do trojlorié baňky s míchadlem se vrnse 100 g chloridu zineδnaténl dihydrátu ve 400 ml 6 N kyselily soloé a po částech při teplotě místnousi a za míchání se přidá 25,4 g (1 mol) 2-nitro-5-(N-th^rooolfllioo⁾aoisolu. ^tom se zahř^ív^{á 30} minut oa 75 °^C, ochladí se·oa teplotu míísnoosi a rea^mí roztok se za chlazeoí ledem přikape do 750 ml 30% louhu so^é» ho. Uvolněná báze se extrahuje vícekráte etherem a převede se po usněmi a částečném odpaření rozpouštědla přídavkem etheric^ho roztoku kyseli-oy soloé v h^ydrorhlolir. Získá se 24,9 g (= 83,8 % tur.) ²-amiaio--((N-tiomorfe0lno)aaisoldiУsdгochloridu. Teplota ·táoí 218 až 220 °C.

b) z 5 chllr-2-oitroaiisllu a pipe^nou 2-oeehllys--(N--ppelidino)-benzendiazmiumtteraflul0lboritao

Teplota táoí ¹²³ a^{ž 12}5 °^C ^ozW.a^

c) z 5-chlor-²-oitroaoislls a pyrrolidiou ²-oeehllys--((i--yyro0idial)-benzl°diazl°iuotetraflulrlbl]0itao

Tepina tá°í 137 až 139 °C (мОШ)

d) z 5-chloг-²-oitrr>aoisllu a N-meetySpiperaziou ²-oeetllys4-[N-(N^z-^noetyУ)piperazi°l]-blnzenOriZZliumtitlaf luoloOorrttai-rilУr0l-teraeluoroboritao

Teplota ‘táoí ¹⁶³ °C ^ozHa^

Při výrobě této sllučl°i°y se diazotace provádí· aIoSaitrieeo v oolhaa°lu. Pro účel se rozpussí 39,6 g (0,1 molu) ²-amiail--(N--iteylyippraziai)aaissldriyУdo0teraflulrlboritaou ve 175 ml ^€^l]^^^r^ol_u_> přidá se 11,6 g (0,1 molu) anmlníttitu ve 25 ml meehanolu a pomalu se za míhání při _ ⁰ °C přikape ⁶⁰ ml ³⁵% totrafUímtorit^ kyseli^. ^při stáiní vykr^ystaluje 24,8 g (= 51,7 % teor.) до^ёй^^ krystalů 2-Ineltloy-4-[N-((N-meehyУ)piperazinol-beniZl0razzniiLmtitltfluslolbrrtaai-riySdoOtlraelulrlborita°u.

Teplota ^táoí b63 °^{C (}roz^kla^d)

e) z 5-chlor-²-oitrlaoislls a oolOolios ²-oeehllys--((N-orfelino)-blnzenOrazooiiШltelrafluorlboritθns ^Teplota t,áoí bS6 a^ž bS8 °C (^roz^a^

Přiklad 10

Roztok 1

0,2 molární roztok kyseliny chlorovodíkové s boraxem pufr pro pH Θ

Roztok 2 .

71,7 mg N-tosyl-L-alaninnadoxylesterp

7,5 g t^rmwrřoLid^u kyseliny fosforečné mg diazoniové soH uvedené v tabulce I se· rozpusSí ve smésS, sestávající z 98 dílů ethanolu a 2 dílů dekanolu. Roztokem 1 se nejdříve impregnuje filtrační papír 23 SL Schleicher · a βο^Ι^ který se ^potom suší ^{2 h}odiny při · ⁶⁰ °C. '

Potom se ^papír impre^uje roztokem ² a suší ¹5 minut ^při 4⁰ °^C·

Pa^píry se ponoří do vodných roztoků s 1 000 leukocyty/ml, 10 mg bilisbbisu/100 · ml a 20 mg urlbili№ge.nu/100 ml a jejich reakce se stanoví po 1 minutě.

V následující tabulce jsou shrnuty výsledky těchto srovnávacích pokusů:

Tabulka

Diazoniová sůl	Leukoocty:	Reakční	Biliuubin	UroHli-
	1 000//U1	barva	10 mg/dl	nogen 20 mjgdl

Ηδ°°-<Ο>Λ	bfh	+	zelená		-
ςρ NZ	1BFŘ	+	zelená	-	-
ньс сг	+	zelená	-	-
Нзс0-г=\ + - H3C°-4_Z·^ *	. +	zelená	-	-
_ CHJ _	ZnCÍ* t	+	zelená	-	-
. /= ® Θ	+	faaoová	-	. ‘ -
/=\ ® ®	(+)	červenooialová

p tračování tabulky

Diazoniová . sůl	Leiutocyty: 1 000/ul	Reakční barva	Biliuubio 10 mm/dl	Urroilinogeo 20 mg/uti
© Θ W	+	iervenoUoědá	-	-
	(+)	iervenoUizluvS	-	-
HCO OC& π -8¾	(+)	červenofizlovS	-	-
/=\ /=\ ® Θ H5cXvtO~ Ni	+	červená	-	-
/=. © _Θ x N“G_N2flfÍi w	+	červená	-	-
G^O- NiBF>*	+	iervenoUialovS	-	-

Příklad 11

Roztok 1 ιω^/1 N-tusyl-L-zlzninOnUuxylesteru

2-meehиui-4-(N-mirff0inu)-benudizuuniumtetrzuhluгu0nečnztaou se rozp^Sí ve srnměi s^s^S^t^v^vající z 5 ml dekanolu z -5 ml ethanolu.

Povlékací flmmutvuгnS hmota g roztoku algiponu (3% roztok a^iponu v b^riZn^<^5^ť^m pufru, 0,2 moUární) g lruliufanu 70 D = vodná disperze směsného po^máru vioyllruliunStu (flimoivsrné čioidlo) g cellaUomu MB 25 (látka pro vytváření kostry) ml bldestiUvvané vody ml roztoku 1 se vmíchá do povlékací flimstvsrnt Uaa0y. Tato hmota se v síle 150 yum nastříká na fitrzačoi pappr 23 SL ScCiheicher a Schhll a suší 30 minut při 50 °C v sušičce. Potom se povlečené papíry rozřežou na proužky.

Proužky reagenčních papírků ^^^^ί při ponoření do vodných roztoků se 200 leukocyty po 52 sekundách načervenalé reakční zbarvení.

Příklad 12

Roztok 1в g trimorfolidu kyseliny fosforečné mg tergitolu (natrium-S-etýlhexylsuUfátu) (sm^í^(^d].o) se rozpuuSí v 50 ml 0,2 moOárního roztoku pufru boraxu v kyselině chlorovodíkové·, pH 8.

Roztok 1b ' 5 g trimorfolidu kyseliny fosforečné se rozpusSÍ v 50 ml 0,2 molárního roztoku pufru boraxu v kyselině chlorovodíkové pH 8.

Roztok 2 mmoy/1 N-tosyl-L-alaninindoxylesteru mamý/l 2-meehooxy-- (N-morfooino) -benzdiazoniumtetr atanu se rozpuusí ve 200 ml smOsi ethanolu a dekanolu v poměru 98:2.

Roztokem 1A,popřípadě 1b se impregnuje vždy jeden papír 23 SL Schheicher a Schhll a suěí se 3⁰ minut ^při ⁶⁰ °C. , Potom se o^ba ^papír^{y d}oimpreggnjí roztokem ² a suší se ²⁰ minut • při 40 °C.

Papíry se rozřežou v proužky 6 mm široké a ponoří do roztoků se 100 leukocyty^l. Pap^y se sméáeeiy ukazovaly homogeerní reakci.

Claims (1)

1. Prostředek k důkazu esterolytických a/nebo proteolyrických enzymů, seesáčající z nasákavého nosiče, například fll^e^ího papíru, celulózy nebo rouna z umělého vlákna, fllmotvorné vrstvy, například polyvinylesteru nebo polyamidu, práškovíté smmss, IioOíIízVíu, roztoku nebo reagenění tablety, obsahujících systém pro důkaz esterázy a/nebo protečzy, piďr s účinnoosí v oblasti pH 6 ež 10, například fosfoeečnjnový, boritanový, barbiturátový, tгS--ílddl0llmeOhyl)-mπlioomethjnový, 2-jιmnc>-2-mmehollřropjiiol-1,3-ový pufr nebo pufr tvořený jakož i popřípadě sméčeeia, například natrium-²-^ ex^sl^í, stabilizátory, například amid kyseliny fosforečné nebo fosforové, aktivátory, například 4-jzafluoren, beei-(h)-chíncl.in, chinin, 1,2-bis-4-řyridlletOllen, 1-dekanol, 1-tetyadekjnol, nitroprusid sodý, ferrokyanid draselný, filmltvlyré látky například vodnou disperzi směsného polymeru viillprlpiončtu, galenické přísady, napekl ad ' manit a/nebo látky vytvááející kostru například celulózu, vyznačuje! se v tom, že jako systém pro důkaz esterázy a/nebo pro^ázy obsahuje kombbnaci seesávvjíci· z diazoniové sooi obecného vzorce I

   N-m^ofolin^^ⁱ/pu skupinu, N-tOilmor0l1inovou skupinu, N-pyrrllidinovlu skupinu, popřípadě Ν-alkylovanou N-pipe¹*azinovou skupinu s С^-С^ v alkyovéém zbytku, N-piperidinovou skupinu, halogen nebo vodík, mmrkeptoskupinu, C^-C^-alkyjaminoskupinu, dK^-Cj-alkyl)ошГпоskupinu, hydroxyskupinu, N-moorolinovou skupinu, N-tOilmorfllinovlu skupinu, N-pyrrll]diюvlu skupinu, popřípadě N-Cj-C^-jlkyoovanou N-piperazinovou ^2’ ^R4’

   X skupinu, N-piperidinovou skupinu, fenylaminoskupinu, popřípadě s C^-C^-alkylovým nebo C₃-Calkoxyzbytkem substituovanou fenylskupinu, halogen nebo vodík, .

   které mohou být stejné nebo různé, znamenají C₁-C^-alkylovou skupinu, C^-C^alkoxyskupinu, C₁-C^-alkylmerkaptoskupinu, halogen nebo vodík, přičemž dva sousedící substituenti mohou společně dohromady znamenat anelovaný benzenový kruh a

   X tetrafluorboritan nebo tetrachlorzinečnatan, a esteru, vybraného ze skupiny sloučenin obecného vzorce II /

   ve kterém znamenají

   R', R^, Rý R^ , které mohou být stejné nebo různé, atom vodíku nebo halogenu, C^-C^ alkylovou skupinu, Cj-C^-alkoxyskupinu, benzylovou skupinu, benzyloxyskupinu, hydroxylovou skupinu, karboxylovou skupinu, karboxy-C-Calkoxyskupinu, nitroskupinu nebo acetylaminoskupinu nebo dva sousedící substituenti anelovaný benzenový zbytek,

   X' atom síry nebo popřípadě C^-C^ alkylovým zbytkem, fenylovým zbytkem, benzy»?

   lovým zbytkem, acetylovým nebo benzoylovým zbytkem substituovanou iininoskupinu,

   A zbytek přirozené alfa-aminokyseliny, di- nebo tripeptidový zbytek, sestávající z těchto přirozených alfa-aminokyselin,

   В skupina chránící dusík, obvyklá v chemii peptidů nebo od ní odvozené skupiny, chránící dusík, například acylové skupiny, oxykarbonylové skupiny, thiokarbonylové skupiny, sulfonylové skupiny, sulfenylové skupiny, vinylové skupiny, cyklohexylové skupiny, fosforylové skupiny nebo karbemoylové skupiny, nebo sloučeniny obecného vzorce III ve kterém

   Rj' R^ , R^' mohou být stejné nebo různé a znamenají vodík, C_t-C^-alkylovou skupinu,

   -C^-alkoxyskupinu, Cj-Calkylaminoskupinu nebo diČCj-Cyalkyl)aminoskupinu, přičemž dva sousedící substituenti mohou znamenat také anelovaný benzenový kruh,