JPS63201155A

JPS63201155A - ガンマグルタミルトランスフエラ−ゼの基質および測定方法

Info

Publication number: JPS63201155A
Application number: JP3426687A
Authority: JP
Inventors: Chiaki Osada; 千秋長田
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1987-02-17
Filing date: 1987-02-17
Publication date: 1988-08-19

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の分野〕本発明は、Ｔ−グルタミルトランスフェラーゼ（以下、
ｙ−ｃ’ｒｐという）の基質および測定方法に関するも
のである。

ｒ−ＧＴＰは肝臓機能検査上、重要な指標となる生体酵
素で、ｙ−ｃ’ｒｐの活性測定は極めて測定頻度の高い
測定項目である。

〔従来技術とその欠点〕

従来ｒ−ＧＴＰ活性値の測定には、基質としてｒ−Ｌ−
グルタミル−ｐ−ニトロアニリドが使用されている。し
かしながらこの基質は酵素反応を行うための緩衝液に極
めて溶は難く、そのための可溶化剤の使用を必要として
いる。且つ酵素反応によって生成したｐ−ニトロアニリ
ン量を波長４１ｈ−の曖光度で測定しているので、血清
成分中に存在する同波長域に吸収を持つ物賞、特にビリ
ルピンの影響を避けられないと言う欠点を有する。

〔発明の目的〕

本発明者の目的は、ｒ　−Ｇ　Ｔ　Ｐの基質としての反
応性が高く且つ十分な溶解性を有するｒ−Ｌ−グルタミ
ル−ｐ−アミノアニリド誘導体（１）又はその塩を用い
て上記欠点を悉く解消し、測定の波長も４１０ｎｍより
も長波長域で測定できる等の極めて顕著な利点を奏する
γ−ＧＴＰ活性測定法を見出すに至った。

〔発明の構成〕

本発明は、一般式（１）Ｃ式中、ＡＩおよびＡ８はそれぞれ低級アルキレン基を
表わし、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ低級アルキル基を表
わす、）で示されるｙ−ｔ、−グルタミル−ｐ−アミノ
アニリド誘導体又はその塩及びこれを基質として用いる
ことを特徴とする７−ＧＴＰ活性の測定方法である。

本発明のγ−Ｌ−グルタミルーｐ−アミノアニリド誘導
体（１）又はその塩の例としてはγ−り一グルタミル−
ｐ−（Ｎ、Ｎ−ジ（２−ヒドロキシエチル）アミノコア
ニリド、γ−Ｌ−グルタミルー〇−メチルーｐ−（Ｎ、
−Ｎ−ジ（２−ヒドキシエチル）アミノコアニリド、γ
−Ｌ−グルタミルーｐ−（Ｎ、Ｎ−ジ（３−ヒドロキシ
プロピル）アミノコアニリド又はこれらの塩が挙げられ
る。

本発明のＴ−Ｌ−グルタミル−ｐ−アミノアニリド誘導
体（１）又はその塩は、通常、例えば次のような方法に
より容易に製造することができる。

即ち、例えばＮ−フタリル−ｒ−Ｌ−グルタミン酸無水
物等のＮ位保護−γ−Ｌ−グルタミン酸無水物と一般式
（ＩＩ）「（式中、Ａ１．＾ｔ、ＲｔおよびＲｚの定義は一般式〔
！〕に同じ、）で示されるｐ−フェニレンジアミン誘導
体とを反応させて、Ｎ−フタリル−Ｔ　−Ｌ−グルタミ
ル−ｐ−アミノアニリド誘導体等のＮ−保護−ｒ−Ｌ−
グルタミル−ｐ−アミノアニリド誘導体を得、次いで公
知の方法によりフタリル基等の保護基を除去し、一般式
（１）のｒ−Ｌ−グルタミル−ｐ−アミノアニリド誘導
体又はその塩を得る。

ＡＩとＡｆで表わされる低級アルキレン基の例としては
メチレン基、エチレン基、プロピレン基等の炭素数１〜
５の低級アルキレン基が挙げられ、Ｒ１またはＲ２で表
わされる低級アルキル基の例としてはメチル基、エチル
基、プロピル基等の炭素数１〜５の低級アルキル基が挙
げられる　Ｒ１およびＲｔとしては水素原子が好ましい
０合成上好ましくはないが、ＡＩとＡｆｆｉが異なるア
ルキレン基であることもできる。

前段の反応に際し、Ｎ−保護−ｒ−Ｌ−グルタミン酸無
水物はｐ−フェニレンジアミン誘導体（ｎ）に対して当
量若しくはやや過剰に使用するのが好ましく、要すれば
溶媒例えばクロロホルム、ジクロルエタン等を使用し、
必要に応じて有機酸例えば酢酸等を共存させて、通常は
２０〜１００℃で反応させる０反応終了後は常法に従っ
てＮ−保護−Ｔ−Ｌ−グルタミル−ｐ−アミノアニリド
誘導体を分離し、次に例えばヒドラジンを、要すれば溶
媒の存在下に反応させる。ヒドラジンはそのままでも水
加物でもそれらの塩であっても良く、通常水加物の使用
が便利である。この反応は通常水又は溶削を用いるが、
反応に影響を与えないものであればいずれでもよく、例
えばメチルアルコール、エチルアルコール等のアルコー
ル類、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類
等水溶性溶剤の使用が好ましい。

後段の反応はＮ−保護−ｒ−ｔ、−グルタミル−ｐ−ア
ミノアニリド誘導体に対し当量若しくはやや過剰のヒド
ラジンを用いて６０℃以下、好ましくは１０〜３０℃で
行う０反応後、常法に従い目的物を単離し、要すれば酸
又はアルカリで中和すれば所望する塩が得られる。

本発明の新規なｒ−Ｌ−グルタミル−ｐ−アミノアニリ
ド誘導体（１）又はその塩はｒ−ＧＴＰ活性値測定用基
質として用いられ、通常は至適条件であるｐＨ８，０〜
８．５で測定されるが、従来のＴ−ＧＴＰ活性値測定用
基質として広く用いられてきた７−Ｌ−グルタミル−ｐ
−ニトロアニリドは上記弱アルカリ側のｐＨ範囲では溶
解度が極めて低く、たとえばＰＨ８，０の０．０５Ｍホ
ウ酸緩衝液に０．０９％（０，００３Ｍ）溶解するのみ
で基質量として必要な０．Ｏ１〜０．０１５Ｍ溶液にす
るには塩酸塩として溶解したのち、緩衝液でうすめ、過
飽和溶液として測定時間中かろうじて必要温度をもたせ
るか、界面活性剤等で溶解を補助する必要があり、いず
れの場合でも満足されるものではなかった。

しかるに本発明のｙ−Ｌ−グルタミル−ｐ−アミノアニ
リド誘導体〔１〕又はその塩は優れた溶解性を有する。

たとえば前記のＴ　−Ｇ　Ｔ　Ｐ活性値測定条件下で、
ｒ−Ｌ−グルタミル−ｐ−（Ｎ。

Ｎ−ジ（２−ヒドロキシエチル）アミノコアニリドは６
．８％（０，２２Ｍ）の溶液を作ることができ、必要濃
度を容易に得ることが出来る。・−例として１−Ｌ−グ
ルタミル−ｐ−（Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノ）アニリドの
溶解度は前記と同条件において１．３％（０，０４５Ｍ
）であり、本発明のＴ−Ｌ−グルタミル−ｐ−アミノア
ニリド誘導体〔！〕又はその塩の溶解度がいかに優れて
いるかがわかる。

加うるに工業的製造に際して溶解性が優れているので、
試薬製剤を製造するにあたっても本発明の７−Ｌ−グル
タミル−ｐ−アミノアニリド誘導体（１１又はその塩は
濃厚な状態で取り扱うことができ、たとえば凍結乾燥製
剤製造に際し、濃厚な溶液から凍結乾燥できるので蒸発
水分量が少なくてすみ省エネルギーという観点からも極
めて有利である。

本発明の新規なγ−Ｌ−グルタミルーｐ−アミノアニリ
ド誘導体（１）又はその塩はｒ−ＧＴＰに対して優れた
基質反応性を有している。

その１例を挙げると本発明のｒ−Ｌ−グルタミル−ｐ−
アミノアニリド誘導体（１）又はその塩のγ−ＧＴＰに
対する基質親和性（基質反応性）は従来量も広く使用さ
れてきたｒ−Ｌ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリドやＴ
−Ｌ−グルタミル−ｐ−（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）ア
ニリドやｒ−Ｌ−グルタミル−ｐ−（Ｎ、Ｎ−ジエチル
アミノ）アニリド等と比較して優れており、その若干例
についてこれを示すと表１のとおりである。

本発明のｒ−Ｌ−グルタミル−・ｐ−アミノアニリド誘
導体（１）又はその塩を基質として用いてｒ−ｃ’ｒｐ
活性値を測定するために、ｙ−Ｇｔｐの酵素反応によっ
て遊離生成するｐ−フェニレンジアミン誘導体（ＩＩ）
を定量するには、芳香族アミンを比色定置する従来公知
の方法、たとえばジアゾカップリング法やアルデヒド類
と反応させて生成するシッフ塩基を定量する方法などが
適用できるが、酸化によって生成する着色化合物を定量
する方法は、操作の簡便性、迅速性あるいは測定値の正
確度の点で最も好ましい方法である。すなわち、ｐ−フ
ェニレンジアミン誘導体（ｎ）を直接酸化して着色化合
物を生成させるか或は酸化縮合して着色化合物を生成す
る方法、たとえばフェノール、ｍ−アセチルアミノフェ
ノール、ｐ−クロロフェノール、ブチルヒドロキシアニ
ソールなどのフェノールＭ、１−ナフトール−２−スル
ホン酸、４−クロロ−１−ナフトール−２−スルホン酸
、８−オキシキノリンなどのナフトール類等の存在下に
メタ遇ヨウ素酸塩、過酸化水素とペルオキシダーゼまた
は赤血塩などの酸化剤で酸化して着色化合物に誘導して
比色定置する。

前記のほかに用いることのできるフェノール類は例えば
２．４−ジクロロ−３−メチルフェノール、２−クロロ
−３−メチル−４−メトキシカルボニルメトキシフェノ
ール、２−クロロ−３−メチル−４−カルボキシメトキ
シフェノール、２゜４−ジクロロ−３−メチル−６−ベ
ンズアミドフェノール、２．４−ジブロモ−３−メチル
フェノール、２−プロピオンアミドフェノール、２−プ
ロピオンアミド−５−メチルフェノール、２−フェニル
ジクロロメチル−４−クロロフェノール、２−メチル−
４−メタンスルホニルアミドフェノール、２−ヒドロキ
シベンズアミド、２−アセチルアミノフェノール、２．
５−ジクロロフェノール、オルトクレゾール、メタクレ
ゾール、２−クロロフェノール、３−クロロフェノール
、２−メトキシフェノール、（２−２３）３−メトキシ
フェノール、３−アセチルアミノ−５−メチルフェノー
ル、１−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−２−ナフトアミド、
１−ヒドロキシ−Ｎ−フェニル−２−ナフトアミド。

前記のナフトール類以外に用いることのできるナフトー
ル類の好ましい例は、１−ヒドロキシ−２−ナフトアミ
ドである。

本発明の７−Ｌ−グルタミル−ｐ−アミノアニリド誘導
体〔！〕又はその塩はｒ−ＧＴＰ活性値測定用の基質と
して、反応性、溶解性等に極めて優れ、正確かつ迅速に
測定できる比色定量法に導くことができ、またその簡便
さから自動分析、特に一体型乾式多層分析スライド等を
用いた乾式分析への適用も容易である。

以下に実施例を述べ本発明を更に説明する。

実施例ＩＮ−フタリル−し−グルタミン酸無水物２８．４ｇと４
−アミノ−Ｎ、Ｎ−ジー（β−ヒドロキシエチル）アニ
リン２１．３　ｇをジオキサン１００Ｍ１にとかし、ト
リエチルアミン１５．２ｊｌｉを加える。油浴上で２時
間還流する。その後濃縮し、残留物をメタノール４０Ｍ
１に加熱溶解する。抱水ヒドラジン４０−を加え放置す
ると全体が固まる。よくかきまぜ吸引ろ過する。メタノ
ールで十分洗浄後乾燥する。２Ｎ塩酸で抽出し炭酸ナト
リウム水溶液で中和すると目的物が析出する。ろ取し、
水洗後、メタノールで洗浄し乾燥する。精製は、塩酸に
溶解し炭酸ナトリウム水溶液で中和する方法をくり返す
、Ｔ−Ｌ−グルタミルルーｐ−（Ｎ、Ｎ−ジ−β−ヒド
ロキシエチルアミノ）アニリド４．２ｇが得られた。

融点１５１〜１５６℃ 実施例２　（分析例）Ａ　試薬（１）　　基質緩衝液：　ｒ−Ｌ、−グルタミル−Ｐ−
（Ｎ、Ｎ−ジ（２−ヒドロキシエチル）アミノコアニリ
ド１２５Ｍ／　ｊ！　、グリシｌレグリシン５０ｍＦ４
／　ｌ　。

ｌ−ナフトール−２−スルホン酸０．２−１ｆ／ｊ！、
エチレングリコール１重量％を含有する、ＰＩＩＢ、３
の０．０５Ｍ／ｆｆｉホウ酸緩衝液を調製する。

（支））　酸化試薬：０．５％フェリシアン化カリウム
を含有するｐＨ８，３の０．３Ｍ／Ｊ！ホウ酸緩衝液を
調製した。

Ｂ　測定操作基質緩衝液１．ＯＩＩ＆に血清試料０．０２ｍを加えて
よく混合した後３７℃の恒温槽で１５分間加温する０次
いで酸化試液２０ａｉを加えた。試料の代りに水０．０
２ｄを用い試料と同様に操作して得られる試薬盲検を対
照として６５０１−に於ける吸光度を測定した。

Ｎ、Ｎ−ジ（２−ヒドロキシエチル）アミノ）−４−ア
ミノアニリンを使用して常法に従ってあらかじめ作成し
た検量線と対比して、γ−ＧＴＰ活性値を算出した。

実施例３（分析例２）基質として分析例１の了−Ｌ−グルタミル−ｐ−（Ｎ−
エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアミノ）アニリドの代り
にＴ−Ｌ−グルタミル−ｐ−（Ｎ。

Ｎ−’；（２−ヒドロキシ−１−メチルエチル）アミノ
）アニリドを用い、実施例２に準じて６５０ｎｓに於け
る吸光度を測定しｒ−ＧＴＰ活性値を算出した。

実施例４（乾式分析法）Ａ層：厚さ１５０μ園透明ポリエステルフイルム上に下記組成
の溶液を、乾燥時の厚さ１５μ曽になるよう塗布乾燥し
た。

水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１３
Ｉｄゼラチン　　　　　　　　　　　　　　　２ｇフェ
リシアン化カリウム　　　　　　　１００１１ｇトリス
（ヒドロキシメチル）アミノメタン　　　　　　　　　　１０１００ｌ１溶解
後か性ソーダ水溶液でＰＨ８，３に調整）Ｂ層：下記組成の溶液を調製し、上記Ａ層上に乾燥時の厚さ１
５μ腸になるよう塗布・乾燥した。

水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１３
−ゼラチン　　　　　　　　　　　　　　　２ｇｍ−ア
セチルアミノフェノール　　　１００ｍトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン　　　　　　　　　　１２０■（溶解後か
性ソーダ水溶液でｐＨ８，３に調整）０層：下記組成の溶液を調製し酢酸セルロースから成るメンプ
ラン・フィルター（富士写真フィルム製フジミクロフィ
ルターＦＭ−３００）に含浸させ、乾燥させた。

水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４０
ｊｄｒ−Ｌ−グルタミル−ｐ− （Ｎ、Ｎ−ジ（２−ヒドロキシエチル）アミノコアニリド　　　　３００■グリシルグ
リシン　　　　　　　　　　　　１ｇトリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン　　　　　　　　　　３６０■（溶解後、
か性ソーダでＰＨ８，３に調整した。）少量の水で湿し
たＢ層の上に、上記フィルターを積層・固定（ラミネー
ト）シた。最後に全体を充分に乾燥させることによりＴ
−グルタミルトランスフェラーゼ測定用乾式分析素子を
完成した。

この素子にＴ−グルタミルトランスフェラーゼを含む液
を点着し３７℃に加温することにより６２５ｎｍに反射
吸収極大を有する青色の発色が観察された。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）一般式〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕（式中、Ａ＾１およびＡ＾２はそれぞれ低級アルキレン
基を表わし、Ｒ＾１およびＲ＾２はそれぞれ水素原子ま
たは低級アルキル基を表わす。）で示されるγ−Ｌ−グ
ルタミル−ｐ−アミノアニリド誘導体又はその塩
（２）一般式〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕（式中、Ａ＾１およびＡ＾２はそれぞれ低級アルキレン
基を表わし、Ｒ＾１およびＲ＾２はそれぞれ水素原子ま
たは低級アルキル基を表わす。）で示されるγ−Ｌ−グ
ルタミル−ｐ−アミノアニリド誘導体又はその塩を基質
として用いることを特徴とするγ−グルタミルトランス
フェラーゼ活性の測定方法。