JP5231392B2 - 酸化発色化合物またはその塩およびその製造方法、ならびに試薬組成物およびこれを用いた試験具 - Google Patents

Description

本発明は、酸化発色化合物およびその製法、ならびに試薬組成物およびこれを用いた試験具に関し、さらに詳細には、生体成分測定に好適に使用される酸化発色化合物およびその製法、ならびに試薬組成物およびこれを用いた試験具に関する。

今日、血液や尿をはじめとする体液（検体）中の生体成分の測定法の１つとして、酵素を用いた比色分析法が広く用いられている。これらの方法は、測定キット、自動分析機、ドライケミストリー試験具等に組み込まれ、日常的な臨床検査に数多く用いられている（例えば、特開２００４−２２３１１５号公報参照）。

このような測定法の１つとして、被測定物質に特異的なオキシダーゼ（酸化酵素）を作用させて発生する過酸化水素をさらにペルオキシダーゼの作用で活性酸素とし、これで発色試薬を酸化して生成する色素を比色定量する定量法がある。

ここで使用される酵素としては、例えば、グルコースの測定にはグルコースオキシダーゼ、コレステロールの測定にはコレステロールオキシダーゼ、尿酸の測定にはウリカーゼ、ピルビン酸の測定にはピルベートオキシダーゼ等が用いられる。これらの酵素は披測定物質の基質のみを特異的に酸化するために、色々な成分を含む検体からそれぞれの測定対象物のみを限定して定量することができる。

また、発色試薬としては、活性酸素で酸化されることによってその吸収波長特性や吸収強度等が変化する色素もしくは色素の前駆体（色原体）が用いられる。すなわち、活性酸素の量に応じて変化する色を測定することによって、被測定物質の量を定量することができる。これらの色素や色原体には、１分子だけで機能するものや、異なる２分子がカップリングして機能するものがある。

これらのうち、１分子で機能するものには、ロイコ型色素等があげられる。化合物としては、ベンチジン、ｏ−トリジン、ｏ−ジアニシジン、２，２’−アミノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリノン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ビス−（４−ジエチルアミノ）−２−スルホフェニルメタン（ＢＳＰＭ）、ビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチル−４−ジメチルアミノフェニル］アミン（ＢＣＭＡ）、１０−Ｎ−メチルカルバモイル−３，７−ジメチルアミノ−１０Ｈ−フェノチアジン（ＭＣＤＰ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢＺ）、ビス［４−（Ｎ−アルキル−Ｎ−スルホプロピル）−２，６−ジメチルフェニル］メタン（Ｂｉｓ−ＭＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４”−トリアミノトリフェニルメタン（ＴＭＰ）などが挙げられる。

また、２分子で機能する代表的なものには、カプラー化合物とトリンダー試薬とを酸化的にカップリングさせる方法がある（例えば、Ｔｒｉｎｄｅｒ，Ｐ．，Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６，２４，１９６９、およびＢａｒｈａｍ，Ｄ． ａｎｄ Ｔｒｉｎｄｅｒ，Ｐ．，Ａｎａｌｙｓｔ（Ｌｏｎｄｏｎ），９７，１４２，１９７２ 参照）。

カプラー化合物としては、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）、アミノジフェニルアミンまたはその誘導体などが用いられる。

トリンダー試薬としては、例えば、フェノール誘導体、アニリン誘導体が用いられる。フェノール誘導体の例としては、フェノール、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，６−ジクロロフェノール、３，５−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、２，６，４−トリクロロフェノール、２，６，４−トリブロモフェノール、３，５−ジクロロ−２−ヒドロキシベンゼンスルホン酸、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨードベンゾイル酸などが挙げられる。また、アニリン誘導体の例としては、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−３−アセチルエチレンジアミン（ＥＭＡＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ−サクシニルエチレンジアミン（ＥＭＳＥ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン（ＣＥＭＢ）、Ｎ，Ｎ−ビス−（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン（ＴＯＤＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−サクシニルアミノエチル）−３−メチルアニリン（ＥＳＥＴ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＳＤＡ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）などが挙げられる。

実際の製品においては、１分子で機能する色素は試薬組成物とした場合の安定性が悪い場合があるため、２分子で機能する色素がより多く用いられる傾向にある。また、２分子で機能する色素のうち、カプラー化合物としては前記のうち最も安定な４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）が多く用いられ、トリンダー試薬としては揮発性の高いフェノール誘導体と比べて、安定でかつ発色強度や波長の点でより有利なアニリン誘導体が多く用いられている。

近年、糖尿病や高脂血症といった生活習慣病に罹患した患者の増加に伴って、血中のグルコースやコレステロールの濃度を高い精度で極めて短時間に測定する技術に対するニーズが非常に高まっている。

かような現状に鑑みた場合に、発色原理を用いた試験具の価値を高めるためには、試薬の経時的劣化を低減させる、あるいは測定精度をさらに向上させることが求められる。また、より微量な成分を検出するという観点からも、現存のものと比較してさらに感度のよい検出系が必要となる。発色原理を用いた試験具の分野においては、これらの課題を解決するための手段の開発が望まれているのが現状である。

そこで、本発明は、高精度かつ迅速に、高感度で種々の成分の濃度（例えば、血中濃度）を測定する手段を提供することを目的とする。

本発明者らは、かかる課題を解決すべく種々検討を重ねた結果、これらの課題を解決しうる新規なカプラー化合物を見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、下記（１）〜（２１）で示される酸化発色化合物およびその製造方法、ならびに試薬組成物およびこれを用いた試験具を提供する。

（１）下記化学式（１）；

ただし、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、炭素数１〜５の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基であり、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７は、それぞれ独立して、水素原子、カルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、この際、Ｒ^３〜Ｒ^７のうち少なくとも１つは、カルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、かつ残りは水素原子である、
で示される酸化発色化合物またはその塩。

（２）前記化学式（１）中、Ｒ^１およびＲ^２がメチル基である、前記（１）に記載の化合物またはその塩。

（３）前記化学式（１）中、Ｒ^５がカルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、かつＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^６およびＲ^７が水素原子である、前記（１）または（２）に記載の酸化発色化合物またはその塩。

（４）前記化学式（１）中、Ｒ^４がカルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、かつＲ^３、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７が水素原子である、前記（１）または（２）に記載の酸化発色化合物またはその塩。

（５）前記化学式（１）中、Ｒ^４およびＲ^６がカルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、かつＲ^３、Ｒ^５およびＲ^７が水素原子である、前記（１）または（２）に記載の酸化発色化合物またはその塩。

（６）前記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の酸化発色化合物またはその塩、トリンダー試薬、オキシダーゼ、およびペルオキシダーゼを含む試薬組成物。

（７）前記トリンダー試薬が、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−３−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ビス−（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−サクシニルアミノエチル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン、およびＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリンからなる群より選択される１種または２種以上である、前記（６）に記載の試薬組成物。

（８）ｐＨ緩衝剤または可溶化剤をさらに含む、前記（６）または（７）に記載の試薬組成物。

（９）前記ｐＨ緩衝剤が有機酸塩である、前記（８）に記載の試薬組成物。

（１０）前記有機酸塩が有機カルボン酸塩である、前記（９）に記載の試薬組成物。

（１１）前記有機カルボン酸塩が、酢酸、プロピオン酸、酪酸、フマル酸、マレイン酸、フタル酸、コハク酸、マロン酸、クエン酸およびリンゴ酸からなる群より選択される１種または２種以上の酸の塩である、前記（１０）に記載の試薬組成物。

（１２）前記ｐＨ緩衝剤のｐＨが４．０〜６．０である、前記（８）〜（１１）のいずれか１つに記載の試薬組成物。

（１３）前記可溶化剤が、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール、ソルビタンアルキレート、ソルビタンポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシレン−エチレンオキシルブロックポリマー、ポリオキシエチレンノニルフェノール、およびポリオキシエチレン−ｎ−アルキルエーテルからなる群より選択される１種または２種以上である、前記（８）〜（１２）のいずれか１つに記載の試薬組成物。

（１４）前記酸化発色化合物またはその塩と前記トリンダー試薬との含有量のモル比が１：１〜２：１である、前記（６）〜（１３）のいずれか１つに記載の試薬組成物。

（１５）前記オキシダーゼがグルコースオキシダーゼである、前記（６）〜（１４）のいずれか１つに記載の試薬組成物。

（１６）前記（６）〜（１５）のいずれか１つに記載の試薬組成物が担体に保持されてなる、試験具。

（１７）前記担体が高分子膜である、前記（１６）に記載の試験具。

（１８）前記高分子膜を構成する材料が、ポリスルホンまたはポリエーテルスルホンである、前記（１７）に記載の試験具。

（１９）前記担体１ｃｍ^３あたりの、前記酸化発色化合物またはその塩の含有量が１５〜６２μｍｏｌであり、前記トリンダー試薬の含有量が７．５〜６２μｍｏｌであり、前記ｐＨ緩衝剤の含有量が４０〜１５５μｍｏｌであり、前記可溶化剤の含有量が１９〜４５ｍｇである、前記（１６）〜（１８）のいずれか１つに記載の試験具。

（２０）下記化学式（２）；

ただし、Ｒ^１は、炭素数１〜５の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基である、
で示される化合物と、下記化学式（３）；

ただし、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７は、それぞれ独立して、水素原子、カルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、この際、Ｒ^３〜Ｒ^７のうち少なくとも１つは、カルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、かつ残りは水素原子である、
で示される化合物と、を反応させる工程を有する、前記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の酸化発色化合物またはその塩の製造方法。

（２１）下記化学式（４）；

ただし、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、炭素数１〜５の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基であり、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７は、それぞれ独立して、水素原子、カルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、この際、Ｒ^３〜Ｒ^７のうち少なくとも１つは、カルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、かつ残りは水素原子である、
で示される化合物を出発物質として、ニトロソ化反応および引き続いて還元反応を行なう工程を有する、前記（１）〜（５）のいずれか１つに記載の酸化発色化合物またはその塩の製造方法。

本発明の酸化発色化合物および試薬組成物は、下記（ａ）〜（ｃ）の点で従来公知の発色化合物または試薬組成物よりも優れている。

（ａ）溶解性が高い：特に膜状担体に保持して使用する場合には、検体を付与（提供）した時に本発明の酸化発色化合物は、検体にすばやく溶解して均一化し呈色反応が起こるので、迅速で安定した測定が可能となる。また、その他の試薬成分や検体中成分の影響で化合物が析出するなどして、正しい測定が行なわれない不具合を避けることができる。

上記利点に加えて、高濃度の試薬液が調整可能であり、感度の向上に寄与しうる。その結果、紙や膜状担体に担持して使用する場合、塗布液濃度を高くしてより多くの試薬を担体に保持させることが可能となる。

（ｂ）試薬濃度の変化における測定値への影響が少ない：すなわち、酸化発色化合物が経時的に劣化し、その量が減少した場合でも測定値への影響が少ない。また、紙や膜状担体に担持して使用する場合、塗布のむらによる試薬濃度のばらつきが測定値に与える影響が少なくなる。

（ｃ）感度が高い：本発明の酸化発色化合物または試薬組成物を用いて対象物質を検出・定量すると、従来のカプラー化合物を用いた場合と比較して、吸光度が大きくなり、測定感度が向上することが期待できる。

本発明のさらに他の目的、特徴および特質は、以後の説明および添付図面に例示される好ましい実施の形態を参酌することによって、明らかになるであろう。

は、後述の実施例５において、カプラー濃度に対する反射吸光度変化率を示すグラフである。 は、後述の実施例６において、１０秒反射吸光度に対する血糖値を示すグラフである。 は、後述の実施例７において、反射吸光度の時間変化を示すグラフである。 は、後述の実施例８において、血糖値濃度を変化させた場合の反射吸光度値に基づいて作成した検量線を示すグラフである。 は、後述の実施例９において、熱加速後の試験片に含まれる４−ＡＡおよびＣＰ２の残存率を示すグラフである。 は、後述の実施例１０において、Ｌ１８直交表によりｐＨ緩衝剤のｐＨおよび種類の変化に対する測定感度の変化を測定した結果を示すグラフである。 は、後述の実施例１１において、可溶化剤の種類を変化させて相対感度の経時変化を測定した結果を示すグラフである。 は、後述の実施例１２において、カプラー化合物の濃度およびトリンダー試薬の濃度の変化に対する測定感度の変化を測定した結果を示すグラフである。

以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。

［酸化発色化合物またはその塩］
本発明の第１は、下記化学式（１）；

ただし、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、炭素数１〜５の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基であり、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７は、それぞれ独立して、水素原子、カルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、この際、Ｒ^３〜Ｒ^７のうち少なくとも１つは、カルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、かつ残りは水素原子である、
で示される酸化発色化合物またはその塩（以下、単に「酸化発色化合物／塩」とも称する）を提供するものである。

上記化学式（１）において、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、炭素数１〜５の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基である。好ましくは、Ｒ^１およびＲ^２は、同一のアルキル基である。炭素数１〜５の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基の例としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、およびネオペンチル基が挙げられる。なかでも、上記化学式（１）で表される酸化発色化合物／塩の溶解性を考慮すると、Ｒ^１および／またはＲ^２は、メチル基、エチル基、プロピル基がより好ましく、Ｒ^１およびＲ^２はともにメチル基であることが最も好ましい。かような形態であれば、上記化学式（１）で表される酸化発色化合物／塩は、十分な溶媒溶解性を示し、担体に担持させた際の塗り斑の発生抑制し、試薬濃度が変動した場合の測定値への影響が最小限に抑えられる。また、適当なトリンダー試薬と組み合わせて酸化発色させる際の測定精度が有意に向上しうる。

また、上記化学式（１）において、Ｒ^３〜Ｒ^７は、水素原子、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）もしくはスルホン酸基（−ＳＯ_３Ｈ）またはこれらの塩である。この際、Ｒ^３〜Ｒ７のうち少なくとも１つは、カルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、かつ残りのＲ^３〜Ｒ^７は水素原子である。なお、Ｒ^３〜Ｒ^７は、同一であってもよいし、異なっていてもよい。なかでも、上記化学式（１）で表される酸化発色化合物／塩の溶解性を考慮すると、Ｒ^５がカルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６およびＲ^７が水素原子である；Ｒ^４がカルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７が水素原子である；あるいはＲ^４およびＲ^６がカルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^７が水素原子である、といった形態が好ましい。かような形態によれば、上記化学式（１）で表される酸化発色化合物／塩は、十分な溶媒溶解性を示し、担体に担持させた際の塗り斑が抑制され、試薬濃度が変動した場合の測定値への影響が最小限に抑えられる。また、適当なトリンダー試薬と組み合わせて酸化発色させる際の測定精度が有意に向上しうる。

すなわち、本発明の好ましい酸化発色化合物としては、下記の化合物が挙げられる。
・４−アミノ−１−（４−カルボキシフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン（上記化学式（１）中、Ｒ^１、Ｒ^２＝−ＣＨ_３、Ｒ^５＝−ＣＯＯＨ、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６、Ｒ^７＝Ｈ）
・４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン（上記化学式（１）中、Ｒ^１、Ｒ^２＝−ＣＨ_３、Ｒ^５＝−ＳＯ_３Ｈ、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６、Ｒ^７＝Ｈ）
・４−アミノ−１−（３−カルボキシフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン（上記化学式（１）中、Ｒ^１、Ｒ^２＝−ＣＨ_３、Ｒ^４＝−ＣＯＯＨ、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７＝Ｈ）
・４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン（上記化学式（１）中、Ｒ^１、Ｒ^２＝−ＣＨ_３、Ｒ^４＝−ＳＯ_３Ｈ、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ７＝Ｈ）
・４−アミノ−１−（３，５−ジカルボキシフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン（上記化学式（１）中、Ｒ^１、Ｒ^２＝−ＣＨ_３、Ｒ^４、Ｒ^６＝−ＣＯＯＨ、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^７＝Ｈ）
・４−アミノ−１−（３，５−ジスルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン（上記化学式（１）中、Ｒ^１、Ｒ^２＝−ＣＨ_３、Ｒ^４、Ｒ^６＝−ＳＯ_３Ｈ、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^７＝Ｈ）
・４−アミノ−１−（３−カルボキシ−５−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン（上記化学式（１）中、Ｒ^１，Ｒ^２＝−ＣＨ_３、Ｒ^４＝−ＣＯＯＨ、Ｒ^６＝−ＳＯ_３Ｈ、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^７＝Ｈ）
なかでも、本発明のより好ましい酸化発色化合物としては、下記の化合物が挙げられる。
・４−アミノ−１−（４−カルボキシフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン（上記化学式（１）中、Ｒ^１，Ｒ^２＝−ＣＨ_３、Ｒ^５＝−ＣＯＯＨ、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６、Ｒ^７＝Ｈ）
・４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン（上記化学式（１）中、Ｒ^１、Ｒ^２＝−ＣＨ^３、Ｒ^５＝−ＳＯ_３Ｈ、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６、Ｒ^７＝Ｈ）
・４−アミノ−１−（３−カルボキシフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン（上記化学式（１）中、Ｒ^１、Ｒ^２＝−ＣＨ_３、Ｒ^４＝−ＣＯＯＨ、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７＝Ｈ）
・４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン（上記
式（１）中、Ｒ^１、Ｒ^２＝−ＣＨ_３、Ｒ^４＝−ＳＯ_３Ｈ、Ｒ^３、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７＝Ｈ）
なお、カルボキシル基およびスルホン酸基は、イオン性官能基であるが、これらの官能基は、遊離の状態であっても、または塩を形成していてもよい、すなわち、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７は、カルボキシル基またはスルホン酸基の塩であってもよい。この際、これらの酸基と塩を形成する対イオンは、無機イオンでもよいし、有機イオンでもよい。例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン等の無機塩基由来の陽イオン；アンモニウムイオン；アルキルアミン類等の有機塩基由来の陽イオン；およびアミノ酸類等の両性化合物由来のイオンなどが挙げられる。なかでも、上記化学式（１）で示される酸化発色化合物が塩の形態である場合には、好ましくはナトリウム塩、カリウム塩、またはアンモニウム塩であり、より好ましくはナトリウム塩である。ここで、本発明の試薬組成物中に、上述した酸化発色化合物／塩は１種のみが含まれてもよいし、２種以上が含まれてもよい。

本発明の酸化発色化合物／塩の製造方法は特に制限されず、従来公知の製造方法が同様にしてあるいは適宜修飾してあるいは適宜組合せて適用されうる。以下、本発明の酸化発色化合物／塩の製造方法の好ましい実施形態を説明するが、本発明の技術的範囲は下記の実施形態に限定されない。

本発明の酸化発色化合物／塩は、例えば、下記化学式（２）；

で表される化合物（以下、「化合物（２）」とも称する）と、下記化学式（３）；

で示される化合物（以下、「化合物（３）」とも称する）とを反応させる工程（以下、「工程（Ａ）」とも称する）を有する製造方法により製造されることが好ましい。なお、上記化学式（２）および化学式（３）において、Ｒ^１およびＲ^３〜Ｒ^７の定義は、上記化学式（１）における定義と同様であるので、ここでは詳細な説明を省略する。

工程（Ａ）において、化合物（２）と化合物（３）とを反応させる際の混合比は、特に制限されない。好ましくは、化合物（２）と化合物（３）とをそれぞれ等モル混合するか、または化合物（２）を化合物（３）に対してやや多めに混合する。具体的には、化合物（２）の混合量は、化合物（３）１モルに対して、好ましくは０．８〜２モルであり、より好ましくは１〜１．２モルである。また、化合物（２）と化合物（３）との反応条件は、これらの反応が進行する条件であれば特に制限されない。例えば、反応温度は、好ましくは２０〜２００℃であり、より好ましくは８０〜１５０℃である。また、反応時間は、好ましくは０．５〜５時間であり、より好ましくは１〜１．５時間である。さらに、化合物（２）と化合物（３）との反応は、無溶媒下で行なってもよく、または溶媒中で行なってもよい。後者の場合に使用できる溶媒としては、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類；テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジエチルエーテル、ジオキサン等のエーテル類；ピリジン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の溶媒が挙げられる。これらのうち、ＴＨＦが好ましく用いられる。化合物（２）と化合物（３）との反応後は、反応混合物を適当な溶媒中に加えて生成物を固化させることによって、生成物を原料化合物から分離し、回収することができる。なお、工程（Ａ）で得られた反応生成物は、後述する化学式（４）において、Ｒ^２が水素原子（Ｈ）である構造を有する。

続いて、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物をアルキル化することによって、下記化学式（４）；

で示される化合物（以下、「化合物（４）」とも称する）が得られる（工程（Ｂ））。

工程（Ｂ）において、アルキル化反応は、ヨウ化メチル、ヨウ化エチルなどのハロゲン化アルキルをはじめとするアルキル化剤を用いて行なわれうる。ただし、アルキル化剤はハロゲン化アルキルに限定されず、他の公知のアルキル化剤も同様にして使用されうる。工程（Ｂ）の反応には適当な溶媒や塩基を用いてもよい。また、反応は室温または加熱下で行なわれうる。具体的には、用いられうる溶媒としては、上記工程（Ａ）の説明の欄で列挙したのと同様の溶媒が挙げられ、これらのうち、メタノールまたはＴＨＦが好ましく用いられうる。また、塩基としては、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジンなどが挙げられ、なかでもＴＥＡが好ましく用いられうる。

工程（Ｂ）において、アルキル化剤の使用量は、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物を十分にアルキル化することができる量であれば特に制限されない。一例を挙げると、アルキル化剤の使用量は、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物１モルに対して、好ましくは０．５〜５モルであり、より好ましくは１〜２モルである。反応条件もまた特に制限されないが、上記工程（Ａ）で得られた反応生成物のアルキル化反応を、好ましくは４０〜２００℃で、より好ましくは１００〜１４０℃で、好ましくは１〜２４時間、より好ましくは１０〜２０時間、行う。

続いて、上記工程（Ｂ）で得られた化合物（４）を出発物質として、ニトロソ化反応を行い、当該ニトロソ化反応に引き続いて還元反応を行う（工程（Ｃ））。

工程（Ｃ）において、ニトロソ化反応は、無溶媒下で行なわれてもよいが、溶媒中で行なわれることが好ましい。具体的には、ニトロソ化反応は、水、有機酸、または両者の混合物を溶媒として用い、塩酸や硝酸（好ましくは塩酸）等で、反応系を酸性に、好ましくはｐＨ１〜５に、より好ましくはｐＨ１〜２にまで調整した後、亜硝酸ナトリウムを加えることによって行なわれる。ここで、有機酸としては、酢酸、プロピオン酸、酪酸、ギ酸、乳酸、コハク酸、クエン酸などが挙げられ、好ましくは酢酸である。また、亜硝酸ナトリウムの量は特に制限されないが、通常、出発物質と等モルもしくは過剰量で用いられ、好ましくは出発物質に対して１．０〜４．０当量、より好ましくは１．１〜１．５当量が用いられる。

工程（Ｃ）において、ニトロソ化反応の反応条件は、ニトロソ化反応が十分に進行しうる条件であれば特に制限されない。具体的には、反応温度は、好ましくは−２０℃〜４０℃であり、より好ましくは０〜２５℃である。また、反応時間は、好ましくは５秒間〜４０分間であり、より好ましくは１０秒間〜１５分間である。このニトロソ化反応により得られた生成物は析出するため、容易に反応系から分離回収されうる。

次に、工程（Ｃ）では、ニトロソ化反応に引き続いて還元反応を行う。ここで、還元反応は、無溶媒下で行われてもよいが、溶媒中で行われることが好ましい。還元反応において使用されうる溶媒としては、ニトロソ化反応で得られたニトロソ化反応生成物が溶解しうるものであれば特に制限されない。かような溶媒としては、例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール；酢酸、プロピオン酸、酪酸、ギ酸、乳酸、コハク酸、クエン酸等の有機酸などが挙げられる。これらの溶媒は、１種のみが単独で使用されてもよいし、２種以上が混合物の形態で併用されてもよい。また、還元剤も特に制限されないが、例えば亜鉛等の金属や、ハイドロサルファイトナトリウム等の還元性無機塩が用いられ、反応溶液は中性または、水酸化ナトリウムや塩酸の添加で塩基性もしくは酸性に適宜調整されうる。好ましくは、反応溶液のｐＨは１〜１２であり、より好ましくは１〜５である。

この還元反応の後、生成物は、適当な溶媒の添加により析出させて、濾過や適当な有機溶媒を用いた抽出によって回収される。ニトロソ化反応および還元反応は、ニトロソ化反応の生成物を取り出すことなく、ワンポットで連続して行ってもよい。回収された生成物は、再結晶やカラムクロマトグラフィー精製により、より純度の高いものが得られる場合がある。

上述した製造方法は、必要に応じて反応工程の前に適当な保護基を導入し、後に脱保護する工程をさらに含んでもよい。保護基としては、例えばカルボン酸に対しては、メチルエステル、エチルエステルなどが挙げられる。

以上、本発明の酸化発色化合物／塩の好ましい製造方法の例を説明したが、本発明はかような製造方法によって限定されることはない。

本発明の第２は、本発明の第１の酸化発色化合物／塩、トリンダー試薬、オキシダーゼ、およびペルオキシダーゼを含む試薬組成物である。

本発明の試薬組成物に含まれる酸化発色化合物／塩の具体的な形態については、上記の欄において説明した通りであるため、ここでは詳細な説明を省略する。

本発明の試薬組成物における酸化発色化合物／塩の含有量について特に制限はないが、好ましい一例を挙げると、試薬組成物が液体状である場合には、溶液中の酸化発色化合物／塩の濃度は、好ましくは７〜３０ｍｍｏｌ／１００ｍＬであり、より好ましくは１０〜１８ｍｍｏｌ／１００ｍＬである。

以下、本発明の試薬組成物に含まれる、酸化発色化合物／塩以外の成分の具体的な形態について説明する。しかしながら、本発明の技術的範囲は下記の形態のみには制限されない。

［トリンダー試薬］
トリンダー試薬の具体的な形態について特に制限はなく、従来公知の知見が適宜参照されうる。一例を挙げると、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−３−アセチルエチレンジアミン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ−サクシニルエチレンジアミン、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ビス−（４−スルホブチル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−サクシニルアミノエチル）−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリンなどである。これらのトリンダー試薬を上述した酸化発色化合物／塩と組み合わせて試薬組成物中に含ませると、４−アミノアンチピリン等の既存のカプラー化合物を用いた場合と比較して測定時の発光の際の吸光度が増大し、測定感度を向上させることができる。なかでも、検量線の傾きを改善させうる（すなわち、測定感度を向上させうる）という観点からは、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）が特に好ましい。なお、本発明の試薬組成物中に、トリンダー試薬は１種のみが含まれてもよいし、２種以上が含まれてもよい。

本発明の試薬組成物が試薬として対象物質の検出・定量に用いられる際、上述した酸化発色化合物／塩はトリンダー試薬と１：１（モル比）で結合し、色素を形成して呈色する。したがって、酸化発色化合物／塩とトリンダー試薬との含有量の比は、理論上は１：１（モル比）である。しかしながら、実際にはこれらの試薬はその溶解性や反応性の影響を受けるため、反応を効率的に進行させるという観点から、本発明の試薬組成物における酸化発色化合物／塩とトリンダー試薬との含有量の比は、モル比で好ましくは１：１〜２：１であり、より好ましくは１．３：１である。

［オキシダーゼ］
オキシダーゼは、本発明の試薬組成物の利用により検出・定量する対象物質を特異的に酸化して、過酸化水素を生成する。オキシダーゼの具体的な形態について特に制限はなく、従来公知の知見が適宜参照されうる。すなわち、本発明の試薬組成物を用いて検出・定量を希望する対象物質の種類に応じて、オキシダーゼの種類を適宜選択すればよい。例えば、グルコースの検出・定量にはグルコースオキシダーゼが用いられ、コレステロールの検出・定量にはコレステロールオキシダーゼが用いられ、尿酸の検出・定量にはウリカーゼが用いられ、ピルビン酸の検出・定量にはピルベートオキシダーゼが用いられる。ただし、これらのみには限定されず、その他のオキシダーゼが用いられても、勿論よい。本発明の試薬組成物におけるオキシダーゼの含有量は特に制限されないが、反応を効率的に進行させるという観点からは、上述した酸化発色化合物／塩の含有量（１モル）に対して、好ましくは２６〜１３０ｋＵであり、より好ましくは２６〜１０８ｋＵである。なお、本発明において、オキシダーゼの含有量の値としては、比色活性測定法により測定された値を採用するものとする。

［ペルオキシダーゼ］
ペルオキシダーゼは、検出・定量の対象物質の酸化により生成した過酸化水素に作用して、活性酸素を生成させる。ペルオキシダーゼの具体的な形態について特に制限はなく、従来公知の知見が適宜参照されうる。本発明の試薬組成物におけるペルオキシダーゼの含有量は特に制限されないが、反応を効率的に進行させるという観点からは、上述した酸化発色化合物／塩の含有量（１モル）に対して、好ましくは６９〜４７０ｋＵであり、より好ましくは６９〜３５０ｋＵである。なお、ペルオキシダーゼの含有量の値としては、比色活性測定法により測定された値を採用するものとする。

［その他の成分］
本発明の試薬組成物は、上述した必須成分に加えて、必要に応じてその他の成分を含んでもよい。試薬組成物に含まれうるその他の成分としては、例えば、ｐＨ緩衝剤、可溶化剤、浸透圧調整剤、界面活性剤、安定化剤、保護剤などが挙げられる。これらの各成分の具体的な形態について特に制限はなく、従来公知の知見が適宜参照されうる。特に、ｐＨ緩衝剤および可溶化剤の少なくとも一方をさらに含むことが好ましい。

ｐＨ緩衝剤は、対象物質の検出・定量時に試薬組成物が検体と接触した際のｐＨ変動を最小限に抑えるために配合され、これにより試験具にどのような検体が付与された場合でも反応系のｐＨが一定に維持されうる。その結果、常に同条件下で反応を進行させ、測定精度を向上させることが可能となる。ｐＨ緩衝剤の具体例としては、例えば、リン酸塩、ホウ酸塩などの無機酸塩や、有機カルボン酸塩、有機リン酸塩、有機スルホン酸塩、有機ホウ酸塩、アミノ酸またはその塩などの有機酸塩が挙げられる。なかでも、試薬の安定性や発色性能を向上させるという観点からは、有機酸塩が好ましく、有機カルボン酸塩がより好ましい。ｐＨ緩衝剤としての有機カルボン酸塩の例としては、例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、フマル酸、マレイン酸、フタル酸、シュウ酸、コハク酸、マロン酸、クエン酸、リンゴ酸、ピルビン酸、グリセリン酸、グルタル酸からなる群より選択される１種または２種以上の酸の塩が挙げられる。なかでも、試薬の安定性や発色性能を向上させるという観点から、フタル酸、コハク酸、クエン酸、マロン酸、シュウ酸、フマル酸、マレイン酸が好ましく、コハク酸、クエン酸が特に好ましい。ｐＨ緩衝剤が塩の形態の場合、酸とともに塩を形成する対イオンとしては、例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、アンモニウムイオン、アルキルアンモニウムイオンなどが挙げられ、ナトリウムイオン、カリウムイオンが特に好ましい。なお、試薬組成物中に、ｐＨ緩衝剤は１種のみが単独で含まれてもよいし、２種以上が含まれてもよい。

測定に用いる酵素や色素を形成する過程の反応においては、その反応速度がｐＨに依存する場合が少なくない。よって、反応系のｐＨを、試薬組成物中の酵素の至適ｐＨに設定することで反応速度を向上させることが可能となる。また、場合によっては、反応系の発色反応に適したｐＨに設定することで反応速度が向上することもある。さらに、適当なｐＨに設定することで試薬成分の溶解性が向上し、反応速度が向上することもある。また、適当なｐＨに設定することで試薬成分の保存安定性が向上することもある。これらのことから、ｐＨ緩衝剤のｐＨは特に制限されず、試薬組成物の他の成分に応じて適宜設定されうるが、発色の反応速度に優れるという観点からは、ｐＨ緩衝剤のｐＨは、好ましくは４．０〜６．０であり、より好ましくは４．０〜５．０である。また、好ましい形態において、試薬組成物におけるｐＨ緩衝剤の含有量は、上述した酸化発色化合物／塩の含有量（１モル）に対して、好ましくは１〜６．７モルであり、より好ましくは１．９〜５モルである。

可溶化剤は、対象物質の検出・定量時に試薬組成物が検体と接触した際に、両者を均一に混合させるために配合され、これにより迅速に反応を進行させうる。また、本発明の試薬組成物が例えば担体に担持されてなる試験具の形態で用いられる場合には、担体表面の濡れ性を向上させる機能をも有し、その結果、検体を担体表面で均一に展開させることも可能となる。さらには、検体が試薬成分と混合・反応しながら担体内部に浸透していく過程を均一かつ迅速に行わせることにも寄与する。また、可溶化剤は試薬成分を包括して空気との接触面積を減少させる効果も有し、酸化等に不安定な成分の経時的劣化を防ぐ機能をも有する。さらに、酵素などのタンパク質が乾燥状態にある場合には、可溶化剤が当該タンパク質の高次構造を安定化させて劣化を防ぐという機能も有している。可溶化剤としては、例えば、水溶性高分子、界面活性剤等が用いられうる。具体的には、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェノール（例えば、Ｕｎｉｏｎ Ｃａｒｂｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｃｏ．社製Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）シリーズ）、ソルビタンアルキレート（例えば、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．社製Ｓｐａｎ（登録商標）シリーズ）、ソルビタンポリオキシエチレンエーテル（例えば、Ｕｎｉｑｅｍａ社製Ｔｗｅｅｎシリーズ）、ポリオキシレン−エチレンオキシルブロックポリマー（例えば、ＢＡＳＦ ＡＧ．社製Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）シリーズ）、ポリオキシエチレンノニルフェノール（例えば、日光ケミカルズ社製Ｎｉｋｋｏｌ ＮＰシリーズ）、およびポリオキシエチレン−ｎ−アルキルエーテル（例えば、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．社製Ｂｒｉｊ（登録商標）シリーズ）が挙げられる。なかでも、ＣＭＣ、ＰＥＧ−５０００〜６００００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）、Ｔｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）、ＮＰ−４０、Ｂｒｉｊ（登録商標）−５８が好ましく、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）−Ｆ６８が特に好ましい。また、好ましい形態において、試薬組成物における可溶化剤の含有量は、上述した酸化発色化合物／塩の含有量（１モル）に対して、好ましくは４８０〜２０００ｇであり、より好ましくは６００〜１３００ｇである。

その他、本発明の試薬組成物に含まれうる成分としては、浸透圧調整剤、安定化剤、保護剤などが必要に応じて選択されうる。

本発明の試薬組成物の形態は特に制限されず、液体状、粉末状、錠剤などのいずれの形態であってもよい。また、好ましくは、本発明の試薬組成物は、担体に保持された形態として用いられる。すなわち、本発明の第３は、本発明の第２の試薬組成物が担体に担持されてなる試験具である。かような形態において、本発明の第３の試験具は、例えば、本発明の第２の試薬組成物が担持されてなる層を含み、これに加えて、必要に応じて計量層、展開層、濾過層、保持層などの他の層を含んでもよい。かような試験具を用いた対象物質の検出・定量には、検体を付与した後、色の変化を目視で判定するという形態や、分光光度計を用いて反射吸光度を測定するという形態が採用されうる。測定値については、予め作成した検量線と対照することで、測定目的物（対象物質）の量に換算すればよい。

以下、本発明の第３の具体的な形態をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみには制限されない。例えば、本発明の第２の試薬組成物が上述したように液体状の形態で用いられる場合には、本発明の第２の試薬組成物を検体と混合して反応させた後、色の変化を目視で判定するという形態や、分光光度計で透過吸光度を測定するという形態が採用されうる。

試薬組成物を担体に保持して用いる場合は、適当な溶剤に溶解させた試薬組成物の溶液を担体にコーティングする方法や、試薬組成物を含むマトリックス前駆体を成型して試験層を形成させる方法等の公知の方法が用いられうる。

担体の構成材料としては、紙、布帛、高分子膜等の多孔質物質が用いられうる。なかでも、発色性能に優れるという観点からは、特に高分子膜が担体の構成材料として用いられることが好ましい。なお、「高分子膜」とは、高分子からなる水不溶性の多孔質膜を意味する。高分子膜を構成する高分子について特に制限はないが、例えば、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、セルロース、セルロースアセテート、硝酸セルロース、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、芳香族ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリイミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコールが挙げられる。なかでも、発色性能に優れるという観点からは、好ましくはポリスルホンまたはポリエーテルスルホンが用いられる。これらの高分子を製膜して高分子膜とするには、一般的に知られている製膜方法が用いられうる。

試薬組成物を担体にコーティングするには、工業用に使用される一般的なコート法が用いられうる。

本発明の試験具においては、本発明の第２の試薬組成物が担体に保持されているが、担体に保持される各成分の量は特に制限されず、溶液の粘性などを考慮して適宜決定されうる。担体に保持される試薬組成物がｐＨ緩衝剤および可溶化剤を含む場合の好ましい一例として、上述した酸化発色化合物／塩の保持量は、担体１ｃｍ^３あたり、好ましくは１５〜６２μｍｏｌであり、より好ましくは２３〜３９μｍｏｌである。また、トリンダー試薬の保持量は、担体１ｃｍ^３あたり、好ましくは７．５〜６２μｍｏｌであり、より好ましくは１５〜３９μｍｏｌである。さらに、担体に保持される試薬組成物がｐＨ緩衝剤を含む場合、ｐＨ緩衝剤の保持量は、担体１ｃｍ^３あたり、好ましくは４０〜１５５μｍｏｌであり、より好ましくは７６〜１１５μｍｏｌである。また、担体に保持される試薬組成物が可溶化剤を含む場合、可溶化剤の保持量は、担体１ｃｍ^３あたり、好ましくは１９〜４５ｍｇであり、より好ましくは２４〜３０ｍｇである。

塗工後の液移動や不均一な乾燥を低減するためには、少量の液を正確に計量して塗工するような精密印刷技術が適するが、この方法では高い試薬濃度の塗工液を作成できることが必須となる。この点、４−アミノアンチピリン等の既存のカプラー化合物は、測定に用いる種々の試薬の中でも最も溶解性が低く、これが高い濃度の塗工液を作成する際にネックとなっていた。これに対し、本発明の試薬組成物に含まれる上述のカプラー化合物は溶解性が高く、濃度の高い塗工液を作成するという観点からも好ましい。

本発明の第２の試薬組成物が担体に保持されてなる本発明の第３の試験具では、検体付与後、まず試薬組成物中に含まれる各成分が検体中の液体成分に溶解し、混合して反応が起こる。次いで、呈色化合物が生成して通常は試験具の検体付与面の反対側に位置する読み取り面に移動し、当該読み取り面における色調変化を測定する、というステップを経て定量が行なわれる。このため、試薬成分の溶解性が高いことは、検体による均一な溶解、均一化、迅速な反応に有利であるだけでなく、生成する色素も溶解性に優れるために読み取り面への移動がスムースでかつ均一に起こるというメリットもある。これらの特徴は、測定時間の短縮化、測定精度の向上、測定値ばらつきの低減に寄与する。

従来のカプラー化合物である４−アミノアンチピリンを含む試薬組成物を担体に保持させて試験具を構成した場合には、試薬成分が経時的に劣化減少し、これに伴って測定値が上昇するという問題が生じる。試薬成分の減少に伴う測定値上昇の原因としては、酵素反応や呈色反応の阻害ではなく化合物の濃度が高いほど他の試薬類の溶解や移動、また生成色素の流動性に何らかの障害を与えるのではないかと考えられている。本発明によれば、従来の４−アミノアンチピリンを用いる場合と比較して、量が増減しても測定値への影響が低減され、４−アミノアンチピリンでみられた上記のような問題が改善されうる。

また、４−アミノアンチピリン等の既存のカプラー化合物は、担体に保持させて試験具として使用した場合、濃度変化が測定値に影響するという問題がある。バルク担体にコートする際にコートむらが生じた場合には、それを切り抜いて用いる各試験具間に感度差が生じる、あるいは保存中に劣化分解して量が変化した場合に測定値に影響が出るということが示唆される。これに対し、本発明によれば、従来の４−アミノアンチピリンと比較して濃度の測定値への影響も少なく、これらの問題を改善できる点でも有利である。

本発明を、以下の実施例を用いてさらに具体的に説明する、ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。

（実施例１）
４−アミノ−１−（４−カルボキシフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン（略称：ＣＰ１）の合成
１−１）１−（４−カルボキシフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンの合成
フェニルヒドラジン−４−カルボン酸（関東化学株式会社製 ４１１７９−１Ａ） ５．０ｇと３−オキソブタン酸エチル（東京化成工業株式会社製 Ａ０６４９） ５．９ｇの混合物を、１２０℃で１時間加熱攪拌した。放冷後析出した固体を濾集し、エタノールで洗浄後、乾燥し８．３ｇの目的物を得た。

１−２）１−（４−カルボキシフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンメチルエステルの合成
上記１−１）で得られた１−（４−カルボキシフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロン ３．０ｇ、ヨウ化メチル（関東化学株式会社製 Ｉ００６０） ３．９ｇ、メタノール １００ｍＬを高圧反応容器に入れ、１２０℃で１５時間加熱攪拌した。反応混合物を蒸発乾固した後、クロロホルムに溶解し、水洗後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。有機層を蒸発乾固して目的物２．６ｇを得た。

１−３）４−アミノ−１−（４−カルボキシフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンメチルエステルの合成
上記１−２）で得られた１−（４−カルボキシフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンメチルエステル ２．０ｇを０．４Ｎ塩酸 ２５ｍＬに溶解し、氷冷下４０％亜硝酸ナトリウム水溶液（関東化学株式会社製 ３７４０２−００） １．２ｍＬを２分間で加えた。引き続いて室温で１０分間攪拌し、析出した固体を濾集、洗浄、乾燥した。固体を１０ｍＬのメタノールに溶解し、２ｍＬの４Ｎ塩酸、亜鉛末（関東化学株式会社製 ４８００５−００） １．１ｇを加え、４５℃で１０分攪拌した。反応混合物をろ過後、濾液を濃縮乾固し、メタノール／クロロホルム（１：９）を溶媒とするシリカゲルカラムクロマトグラフに供した。主画分を濃縮乾固し、目的物１．０ｇを得た。

１−４）４−アミノ−１−（４−カルボキシフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
上記１−３）で得られた４−アミノ−１−（４−カルボキシフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンメチルエステル ０．３７ｇをメタノール５ｍＬに溶解し、４Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．２５ｍＬを加え、室温で３０分反応を行なった。反応混合物を強酸性陽イオン交換樹脂（アルドリッチ社製 ２１６５３４−２５０Ｇ）で処理後、濃縮乾固し、目的物０．２５ｇを得た。

このようにして得られた目的物のＮＭＲの分析結果を下記表１に示す。

（実施例２）
４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン（略称：ＣＰ２）の合成
２−１）１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
１−（４−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロン（アルドリッチ社製 １３４１６３−２５Ｇ） ３．０ｇ、ヨウ化メチル（関東化学株式会社製 Ｉ００６０） ３．４ｇ、メタノール １００ｍＬを高圧反応容器に入れ、１３０℃で１５時間加熱攪拌した。反応混合物を蒸発乾固した後、エタノールより再結晶を行い、目的物１．４ｇを得た。

２−２）４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
上記２−１）で得られた１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン ０．５ｇを０．４Ｎ塩酸１０ｍＬに溶解し、氷冷下亜硝酸ナトリウム（関東化学株式会社製 ３７４０２−００）の４０％水溶液０．３５ｍＬを加えて１分間攪拌し、亜鉛末（関東化学株式会社製 ４８００５−００） ５００ｍｇを加え、さらに室温で１０分攪拌した。反応混合物をろ過後、濾液を濃縮乾固し、目的物０．４１ｇを得た。

このようにして得られた目的物のＮＭＲの分析結果を下記表２に示す。

（実施例３）
４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン（略称：ＣＰ６）の合成
３−１）１−（３−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロンの合成
フェニルヒドラジン−３−スルホン酸 ５．０ｇと３−オキソブタン酸エチル６．１ｇの混合物を、１２０℃で１時間加熱攪拌した。反応混合物を放冷し、析出した固体を濾集、洗浄、乾燥し８．０ｇの目的物を得た。

３−２）１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
上記３−１）で得られた１−（３−スルホフェニル）−３−メチル−５−ピラゾロン ３．０ｇ、ヨウ化メチル ３．４ｇ、メタノール １００ｍＬを高圧反応容器に入れ、１３０℃で１５時間加熱攪拌した。反応混合物を蒸発乾固した後、エタノールより再結晶を行い、目的物１．５ｇを得た。

３−３）４−アミノ−１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロンの合成
上記３−２）で得られた１−（３−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン ０．５ｇを０．４Ｎ塩酸１０ｍＬに溶解し、氷冷下４０％亜硝酸ナトリウム水溶液０．３５ｍＬを加えて１分間攪拌し、亜鉛末５００ｍｇを加え、さらに室温で１０分攪拌した。反応混合物をろ過後、濾液を濃縮乾固し、目的物０．３７ｇを得た。

このようにして得られた目的物のＮＭＲの分析結果を下記表３に示す。

（実施例４）
グルコースを測定するための塗工液組成を例として、何倍濃厚な塗工液を作製することができるか否かについて、実験を行なった。すなわち、以下の基本組成で、それぞれカプラーの種類および量（４−アミノアンチピリンと等モル量になるよう）を変えた組成で全試薬を増加していった場合、何倍量まで均一な溶液が得られるかをみた。結果を、下記表４に示す。

基本組成（水１００ｍＬ中に）
カプラー化合物（４−ＡＡ）１．０ｇ、トリンダー試薬（ＴＯＯＳ）０．８ｇ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００ ５．０ｇ、グルコースオキシダーゼ ２．０ｇ、ペルオキシダーゼ ０．５ｇ、クエン酸ナトリウム−クエン酸 ０．０５Ｍ（ｐＨ＝５．０になるよう調整）

上記表４から、本発明の化合物（ＣＰ１、ＣＰ２及びＣＰ６）はいずれも、従来からカプラーとして一般的に用いられている４−アミノアンチピリンと比較して、高い溶解性を示すことから、本発明の化合物を用いることにより濃厚な塗工液をつくることが可能であることが分かる。

（実施例５）
カプラー濃度のみ変化させた組成の試験膜を作製し、グルコース定量値への影響を評価した。すなわち、下記の組成の塗工液を用い、ポリエーテルスルホン膜（テルモ株式会社製、膜厚１３０μｍ）にコートを行い、３５℃で１８時間乾燥を行なった。膜を１ｃｍ角の正方形に打ち抜き、反射分光光度計にセットした後、１μＬの検体を試験膜上部より滴下し、１０秒後の反射吸光度を測定した。検体としては、ヘマトクリット値４０、血糖値を１００ｍｇ／ｄＬに調整したヒト血液を用いた。その結果を図１に示す。

図１に示されるように、本発明の化合物（ＣＰ１、ＣＰ２、ＣＰ６）はいずれも、４−アミノアンチピリン（図１中の「４ＡＡ」）と比較して、感度の濃度依存性が低減することが観察された。

塗工液組成（０．１Ｍクエン酸ナトリウム−クエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）１００ｍＬ中に）
カプラー化合物 ４．０ｇ／５．６ｇ／８．０ｇ、トリンダー試薬（ＭＡＯＳ） ３．２ｇ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００ ２０．０ｇ、グルコースオキシダーゼ ８．０ｇ、ペルオキシダーゼ ２．０ｇ
（実施例６）
実施例５で作成したカプラー濃度のうち、ＣＰ２を使用したものについて、同様の基本組成の試験膜を作製した。この試験膜を用いて、種々のグルコース濃度で測定した値から検量線を作成し、定量感度を見た。なお、評価法は実施例５で示したものと同様である。その結果を、図２に検量線で示す。図２中、ｘ軸に反射吸収度、ｙ軸に血糖値をとっているため、傾きがなだらかなほど感度が高いことを意味する。

図２から示されるように、本発明の４−アミノ−１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−５−ピラゾロン（ＣＰ２）は、トリンダー試薬としてＭＡＯＳと組み合わせて発色させた場合、その検量線の傾きは４−アミノアンチピリンを用いた時より改善され、測定感度が有意に向上できることが示される。

（実施例７）
下記の表５に示す組成の塗工液を用い、キスコート法により、テルモ株式会社製ポリエーテルスルホン膜（膜厚：１３０μｍ）に塗工し、３７℃にて１８時間乾燥を行った。その後、膜を１ｃｍ角に切断して、試験片を得た。

血液を用いた評価は、試験片を反射分光光度計に固定した後、１μＬの検体を試験膜上部より滴下し、連続的にあるいは所定時間における反射吸光度を測定することにより行った。

カプラー化合物として、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、ＣＰ１、またはＣＰ２を用いて、上記の方法で作製した試験片を用い、ヘマトクリット値：４０％、血糖値：４００ｍｇ／ｄＬに調整したヒト血液を検体として、反射吸光度の時間変化を測定した。結果を図３に示す。図３に示す結果から、従来のカプラー化合物である４−ＡＡでは反射吸光度値が安定するまで１５秒程度かかるが、ＣＰ１では５秒未満で反射吸光度値が安定し、ＣＰ２に至っては３秒程度で反射吸光度値がピークを迎えることがわかる。すなわち、本発明の試薬組成物を採用することで、測定時間が短縮されうることが示された。

（実施例８）
実施例７で作製した試験片を用い、ヘマトクリット値：４０％、血糖値：５０、１００、４００、６００ｍｇ／ｄＬと血糖濃度を変化させたヒト血液を検体として用いて測定した反射吸光度値から検量線を作製し、測定感度を比較した。結果を図４に示す。図４のＹ軸（縦軸）が血糖値濃度（入力値）であり、Ｘ軸（横軸）が反射吸光度値（出力値）であるため、検量線の傾きが小さいほど、測定感度は高いことを意味する。図４に示す結果から、ＣＰ１およびＣＰ２では４−ＡＡと比較して検量線の傾きが小さくなることがわかる。すなわち、本発明の試薬組成物を採用することで、測定感度が向上しうることが示された。

（実施例９）
下記の表６に示す組成の塗工液を用い、キスコート法により、テルモ株式会社製ポリエーテルスルホン膜（膜厚：１３０μｍ）に塗工し、３７℃にて１８時間乾燥を行った。その後、膜をΦ６ｍｍ円に打ち抜き、試験片を得た。

試験片を真空状態の６０℃オーブン内で１時間保存して熱加速をかけた後、６０％アセトニトリル水溶液１ｍＬを用い、１０分間超音波処理を施して、抽出を行なった。得られた抽出液について、溶離液：６０％アセトニトリル／５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、溶離液流速：１ｍＬ／ｍｉｎ、カラム温度：４０℃、カラム：Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｃ１８ ２５０×４．６ｍｍ（株式会社ワイエムシィ製）、測定波長：２５４ｎｍ、注入量：２０μＬの条件でＨＰＬＣを用い、試薬量を測定した。この手法により、熱加速前の試験片に対する、熱加速後の試験片に含まれる４−ＡＡおよびＣＰ２の残存率を比較した。結果を図５に示す。図５に示す結果から、４−ＡＡでは残存率が７割以下であるのに対して、ＣＰ２はほぼ１００％の残存率であることがわかる。すなわち、本発明の試薬組成物を採用することで、試験具の経時安定性が向上しうることが示された。

（実施例１０）
下記の表７に示す組成の塗工液をＬ１８実験直交表（因子９種類、水準３種類）に従い組み合わせた塗工液を用い、キスコート法により、テルモ株式会社製ポリエーテルスルホン膜（膜厚：１３０μｍ）に塗工し、３７℃にて１８時間乾燥を行った。その後、膜を１ｃｍ角に切断し、試験片を得た。

血液を用いた評価は、試験片を反射分光光度計に固定した後、１μＬの検体を試験膜上部より滴下し、連続的にあるいは所定時間における反射吸光度を測定することにより行った。

各試験片に対して、ヘマトクリット値：４０％、血糖値：５０、１００、４００、６００ｍｇ／ｄＬと血糖濃度を変化させたヒト血液を検体として測定した反射吸光度値から検量線を作製し、測定感度を算出した。１８種類の組み合わせの中から、ｐＨ緩衝剤のｐＨおよびｐＨ緩衝剤の種類別に測定感度を計算し、比較した。結果を図６に示す。図６に示す結果から、ｐＨ緩衝剤のｐＨは低いほど測定感度が向上し、ｐＨ緩衝剤としてはコハク酸、クエン酸が優れていることが示された。

（実施例１１）
下記表８に示す組成の塗工液を用い、キスコート法により、テルモ株式会社製ポリエーテルスルホン膜（膜厚：１３０μｍ）に塗工し、３７℃にて１８時間乾燥を行った。その後、膜を１ｃｍ角に切断し、試験片を得た。

血液を用いた評価は、試験片を反射分光光度計に固定した後、１μＬの検体を試験膜上部より滴下し、連続的にあるいは所定時間における反射吸光度を測定することにより行った。

可溶化剤としてＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ−Ｆ６８を用いて、上記の方法で作製した試験片を６０℃にて遮光乾燥状態で一定期間保存した（熱加速試験）。ある期間保存された試験片について、ヘマトクリット値：４０％、血糖値：４００ｍｇ／ｄＬのヒト血液を検体として用いて測定した相対感度の経時変化を図７に示す。図７に示す結果から、これら３種の可溶化剤のなかではＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ−１００が最も相対感度の減少が少なく、経時安定性に優れていることが示された。

（実施例１２）
実施例１０で作製した試験片を用い、ヘマトクリット値：４０％、血糖値：５０、１００、４００、６００ｍｇ／ｄＬと血糖濃度を変化させたヒト血液を検体として用い、各試験片に対して測定した反射吸光度値から検量線を作製し、測定感度を算出した。１８種類の組み合わせの中から、カプラー化合物の濃度およびトリンダー試薬の濃度別に測定感度を計算し、比較した。結果を図８に示す。図８に示す結果から、カプラー化合物の濃度は５ｍｍｏｌ／１００ｍＬが１０ｍｍｏｌ／１００ｍＬよりも有意に測定感度が低く、１０ｍｍｏｌ／１００ｍＬ以上で測定感度が安定していることから、カプラー化合物の必要最低濃度が１０ｍｍｏｌ／１００ｍＬ以上であることが示された。また、トリンダー濃度は設定濃度範囲内で測定感度が安定していることから、カップリング相手であるカプラー濃度に合わせて設定できることが示された。

なお、本出願は、２００７年３月２０日に出願された日本特許出願第２００７−７２８０７号および２００７年９月２８日に出願された日本特許出願第２００７−２５４４７５号に基づいており、その開示内容は、参照により全体として引用されている。

Claims (15)

1. 下記化学式（１）；
   

   

   ただし、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、炭素数１〜５の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基であり、
   Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７は、それぞれ独立して、水素原子、カルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、この際、Ｒ^３〜Ｒ^７のうち少なくとも１つは、カルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、かつ残りは水素原子である、
   で示される酸化発色化合物またはその塩。
2. 上記式（１）中、Ｒ^１およびＲ^２がメチル基である、請求項１に記載の酸化発色化合物またはその塩。
3. 上記式（１）中、Ｒ^５がカルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、かつＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^６およびＲ^７が水素原子である、請求項１または２に記載の酸化発色化合物またはその塩。
4. 上記式（１）中、Ｒ^４がカルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、かつＲ^３、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７が水素原子である、請求項１または２に記載の酸化発色化合物またはその塩。
5. 上記式（１）中、Ｒ^４およびＲ^６がカルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、かつＲ^３、Ｒ^５およびＲ^７が水素原子である、請求項１または２に記載の酸化発色化合物またはその塩。
6. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の酸化発色化合物またはその塩、トリンダー試薬、オキシダーゼ、およびペルオキシダーゼを含む試薬組成物。
7. ｐＨ緩衝剤または可溶化剤をさらに含む、請求項６に記載の試薬組成物。
8. 前記ｐＨ緩衝剤が有機酸塩である、請求項７に記載の試薬組成物。
9. 前記ｐＨ緩衝剤のｐＨが４．０〜６．０である、請求項７または８に記載の試薬組成物。
10. 前記酸化発色化合物またはその塩と前記トリンダー試薬との含有量のモル比が１：１〜２：１である、請求項６〜９のいずれか１項に記載の試薬組成物。
11. 請求項６〜１０のいずれか１項に記載の試薬組成物が担体に保持されてなる、試験具。
12. 前記担体が高分子膜である、請求項１１に記載の試験具。
13. 前記担体１ｃｍ^３あたりの、前記酸化発色化合物またはその塩の含有量が１５〜６２μｍｏｌであり、前記トリンダー試薬の含有量が７．５〜６２μｍｏｌであり、前記ｐＨ緩衝剤の含有量が４０〜１５５μｍｏｌであり、前記可溶化剤の含有量が１９〜４５ｍｇである、請求項１１または１２に記載の試験具。
14. 下記化学式（２）：
    

    

    ただし、Ｒ１は、炭素数１〜５の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基である、
    で示される化合物と、下記化学式（３）：
    

    

    ただし、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７は、それぞれ独立して、水素原子、カルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、この際、Ｒ^３〜Ｒ^７のうち少なくとも１つは、カルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、かつ残りは水素原子である、
    で示される化合物と、を反応させる工程を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の酸化発色化合物またはその塩の製造方法。
15. 下記化学式（４）：
    

    

    ただし、Ｒ^１およびＲ^２は、それぞれ独立して、炭素数１〜５の直鎖状または分岐鎖状のアルキル基であり、
    Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７は、それぞれ独立して、水素原子、カルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、この際、Ｒ^３〜Ｒ^７のうち少なくとも１つは、カルボキシル基もしくはスルホン酸基またはこれらの塩であり、かつ残りは水素原子である、
    で示される化合物を出発物質として、ニトロソ化反応および引き続いて還元反応を行なう工程を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の酸化発色化合物またはその塩の製造方法。

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