CN101641334B - 氧化显色化合物或其盐及其制备方法、以及试剂组合物及使用其的试验用具 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种以高精度且迅速地、高灵敏度测定各种成分浓度的方法。本发明涉及下述化学式(1)表示的氧化显色化合物或其盐及其制备方法、以及试剂组合物及使用其的试验用具，在所述化学式(1)中，R1及R2分别独立地为碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基，R3、R4、R5、R6和R7分别独立地为氢原子、羧基或磺酸基、或它们的盐，此时，R3～R7中的至少一个为羧基或磺酸基、或它们的盐，且其他为氢原子。

Description

氧化显色化合物或其盐及其制备方法、以及试剂组合物及使用其的试验用具
技术领域
本发明涉及氧化显色化合物及其制法、以及试剂组合物及使用其的试验用具，更详细而言，本发明涉及优选用于生物成分测定的氧化显色化合物及其制法、以及试剂组合物及使用其的试验用具。 
背景技术
目前，作为以血液和尿为代表的体液(样品)中的生物成分的测定法之一，广泛使用利用酶的比色分析法。这些方法将测定试剂盒、自动分析仪、干化学法试验用具等组合，多用于日常的临床检查中(例如参见特开2004-223115号公报)。 
作为上述测定法之一，有下述定量方法，即，使特异性氧化酶(氧化酶)作用于被测物质生成过氧化氢，进而使过氧化氢在过氧化物酶的作用下形成活性氧，用该活性氧将显色试剂氧化，对生成的色素进行比色定量。 
作为此处使用的酶，例如在葡萄糖测定中可以使用葡萄糖氧化酶、在胆固醇测定中可以使用胆固醇氧化酶、在尿酸测定中可以使用尿酸酶、在丙酮酸测定中可以使用丙酮酸氧化酶等。由于上述酶仅特异性地氧化被测物质的基质，所以能够从含有多种成分的样品中仅限定地定量各测定对象物。 
另外，作为显色试剂，可以使用通过被活性氧氧化其吸收波长特性或吸收强度等发生变化的色素或色素的前体(显色团)。即，通过测定根据活性氧的量而变化的颜色，能够定量被测物质的量。上述色素或显色团，包括仅一分子发挥功能或不同的两分子偶合(coupling)发挥功能的色素或显色团。 
其中，以一分子发挥功能的色素或显色团，可以举出无色型色素(leuco type pigment)等。作为化合物，可以举出联苯胺、邻联甲苯胺、邻联茴香胺、2，2’-氨基-双(3-乙基苯并噻唑啉酮-6-磺酸)(ABTS)、双-(4-二乙氨基)-2-磺苯基甲烷(BSPM)、双[3-双(4-氯苯基)甲基-4-二甲氨基苯基]胺(BCMA)、10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-二甲氨基-10H-吩噻嗪(MCDP)、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMBZ)、双[4-(N-烷基-N-磺丙基)-2，6-二甲基苯基]甲烷(Bis-MAPS)、N，N，N’，N’，N”，N”-六(3-磺丙基)-4，4’，4”-三氨基三苯甲烷(TMP)等。 
另外，以两分子发挥功能的代表性的方法，包括使成色化合物(coupler compound)和Trinder’s试剂氧化偶合的方法(例如参见Trinder，P.，Am.Clin.Biochem.，6，24，1969及Barham，D.and Trinder，P.，Analyst(London)，97，142，1972)。 
作为成色化合物，可以使用4-氨基安替比林(4-AA)、香草醛双胺磺酸(vanillin diamine sulfonic acid)、甲基苯并噻唑啉酮腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉酮腙(SMBTH)、氨基二苯胺或其衍生物等 
作为Trinder’s试剂，例如可以使用苯酚衍生物、苯胺衍生物。作为苯酚衍生物的例子，可以举出苯酚、4-氯苯酚、2，4-二氯苯酚、2，6-二氯苯酚、3，5-二氯苯酚、2，4-二溴苯酚、2，6，4-三氯苯酚、2，6，4-三溴苯酚、3，5-二氯-2-羟基苯磺酸、3-羟基-2，4，6-三碘苯甲酸等。另外，作为苯胺衍生物的例子，可以举出N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-3-乙酰基乙二胺(EMAE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-(2-羧基乙基)-N-乙基-3-甲基苯胺(CEMB)、N，N-双-(4-磺丁基)-3-甲基苯胺(TODB)、N-乙基-N-(2-琥珀酰氨基乙基)-3-甲基苯胺(ESET)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺(ADPS)、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HSDA)、N-乙基-N-(2 -羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基-4-氟苯胺(FDAOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)等。 
在实际产品中，由于存在以一分子发挥功能的色素形成试剂组合物时稳定性差的情况，所以有更多使用以两分子发挥功能的色素的倾向。另外，在以两分子发挥功能的色素中，多使用上述化合物中最稳定的4-氨基安替比林(4-AA)作为成色化合物，与挥发性高的苯酚衍生物相比，多使用稳定且在显色强度或波长方面更有利的苯胺衍生物作为Trinder’s试剂。 
发明内容
近年，随着患有糖尿病和高血脂症之类生活习惯病的患者的增加，对以高精度在极短时间内测定血中葡萄糖和胆固醇浓度的技术的需求急剧增加。 
鉴于上述现状，为了增加利用显色原理的试验用具的价值，要求降低试剂的经时劣化，或进一步提高测定精度。另外，从检测较微量成分的观点考虑，也需要比现有试验用具更加灵敏的检测体系。现状是在利用显色原理的试验用具领域中期望开发用于解决上述课题的方法。 
因此，本发明的目的在于提供一种以高精度且迅速地、以高灵敏度测定各种成分浓度(例如血中浓度)的方法。 
本发明人等为了解决上述课题深入地进行了各种研究，结果发现了能解决上述课题的新型成色化合物，从而完成了本发明。 
即，本发明提供下述(1)～(21)所示的氧化显色化合物及其制备方法、以及试剂组合物及使用其的试验用具。 
(1)一种氧化显色化合物或其盐，如下述化学式(1)所示： 
Figure G2008800087915D00041
式中，R1及R2分别独立地为碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基， 
R3、R4、R5、R6和R7分别独立地为氢原子、羧基或磺酸基、或它们的盐，此时，R3～R7中的至少一个为羧基或磺酸基或它们的盐，且其他为氢原子。 
(2)如上述(1)所述的化合物或其盐，在上述化学式(1)中，R1及R2为甲基。 
(3)如上述(1)或(2)所述的氧化显色化合物或其盐，在上述化学式(1)中，R5为羧基或磺酸基或它们的盐，且R3、R4、R6和R7为氢原子。 
(4)如上述(1)或(2)所述的氧化显色化合物或其盐，在上述化学式(1)中，R4为羧基或磺酸基或它们的盐，且R3、R5、R6和R7为氢原子。 
(5)如上述(1)或(2)所述的氧化显色化合物或其盐，在上述化学式(1)中，R4及R6为羧基或磺酸基或它们的盐，且R3、R5和R7为氢原子。 
(6)一种试剂组合物，含有上述(1)～(5)中任一项所述的氧化显色化合物或其盐、Trinder’s试剂、氧化酶和过氧化物酶。 
(7)如上述(6)所述的试剂组合物，其中，上述Trinder’s试剂是选自N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-3-乙酰基乙二胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N-琥珀酰乙二胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺、N-(2-羧基乙基)-N-乙基-3-甲基苯胺、N，N-双-(4-磺丁基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(2-琥珀酰氨基乙基)-3 -甲基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基-4-氟苯胺和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺中的一种或两种以上。 
(8)如上述(6)或(7)所述的试剂组合物，还含有pH缓冲剂或增溶剂。 
(9)如上述(8)所述的试剂组合物，其中，上述pH缓冲剂为有机酸盐。 
(10)如上述(9)所述的试剂组合物，其中，上述有机酸盐为有机羧酸盐。 
(11)如上述(10)所述的试剂组合物，其中，上述有机羧酸盐是选自由乙酸、丙酸、丁酸、富马酸、马来酸、苯二甲酸、琥珀酸、丙二酸、柠檬酸和苹果酸构成的组的一种或两种以上的酸盐。 
(12)如上述(8)～(11)中任一项所述的试剂组合物，其中，上述pH缓冲剂的pH为4.0～6.0。 
(13)如上述(8)～(12)中任一项所述的试剂组合物，其中，上述增溶剂是选自羧甲基纤维素、聚乙二醇、对叔辛基苯酚聚氧乙烯醚、脱水山梨醇烷基化物、脱水山梨醇聚氧乙烯醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚氧乙烯壬基酚(polyoxyethylene nonylphenol)和聚氧乙烯正烷基醚中的一种或两种以上。 
(14)如上述(6)～(13)中任一项所述的试剂组合物，其中，上述氧化显色化合物或其盐与上述Trinder’s试剂的含量的摩尔比为1∶1～2∶1。 
(15)如上述(6)～(14)中任一项所述的试剂组合物，其中，上述氧化酶为葡萄糖氧化酶。 
(16)一种试验用具，将上述(6)～(15)中任一项所述的试剂组合物保持在载体上。 
(17)如上述(16)所述的试验用具，其中，上述载体为高分子膜。 
(18)如上述(17)所述的试验用具，其中，构成上述高分子膜的材料为聚砜或聚醚砜。 
(19)如上述(16)～(18)中任一项所述的试验用具，其中，每1cm3上述载体上的上述氧化显色化合物或其盐的含量为15～62μmol，上述Trinder’s试剂的含量为7.5～62μmol，上述pH缓冲剂的含量为40～155μmol，上述增溶剂的含量为19～45mg。 
(20)上述(1)～(5)中任一项所述的氧化显色化合物或其盐的制备方法，包括使化学式(2)表示的化合物和化学式(3)表示的化合物反应的步骤， 
Figure G2008800087915D00061
式中，R1为碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基， 
Figure G2008800087915D00062
式中，R3、R4、R5、R6和R7分别独立地为氢原子、羧基或磺酸基或它们的盐，此时，R3～R7中至少有一个为羧基或磺酸基或它们的盐，其他为氢原子。 
(21)上述(1)～(5)中任一项所述的氧化显色化合物或其盐的制备方法，包括以化学式(4)表示的化合物作为起始物质，进行亚硝化反应和随后的还原反应的步骤， 
Figure G2008800087915D00063
式中，R1及R2分别独立地为碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基， 
R3、R4、R5、R6和R7分别独立地为氢原子、羧基或磺酸基或它们的盐，此时，R3～R7中至少有一个为羧基或磺酸基或它们的盐，且其他为氢原子。 
从下述(a)～(c)方面考虑，本发明的氧化显色化合物及试剂组合物比现有公知的显色化合物或试剂组合物更优异。 
(a)溶解性高：特别是在保持在膜状载体上进行使用的情况下，给与(提供)样品时本发明的氧化显色化合物在样品中迅速溶解，均匀化，发生呈色反应，因此可以迅速且稳定地测定。另外，可以避免在其他试剂成分和样品中成分的影响下化合物析出等导致无法正确测定的不良情况。 
除了上述优点之外，还可以调节高浓度的试剂液，有助于提高灵敏度。结果，载持在纸或膜状载体上进行使用时，可以提高涂布液浓度，使更多的试剂保持在载体上。 
(b)试剂浓度变化时对测定值的影响小：即，即使在氧化显色化合物经时地劣化，其量减少的情况下，也对测定值的影响小。另外，载持在纸或膜状载体上进行使用时，由于涂布不匀导致的试剂浓度不均对测定值的影响变小。 
(c)灵敏度高：使用本发明的氧化显色化合物或试剂组合物检测·定量对象物质时，与使用现有的成色化合物的情况相比，可以期待吸光度变大、测定灵敏度提高。 
参考下述说明和附图中列举的优选实施方式，说明本发明的进一步的其他目的、特点和特质。 
附图说明
[图1]为表示在下述实施例5中相对于成色剂浓度的反射吸光度变化率的曲线图。 
[图2]为表示在下述实施例6中相对于10秒反射吸光度的血糖值的 曲线图。 
[图3]为表示在下述实施例7中反射吸光度的时间变化的曲线图。 
[图4]为表示在下述实施例8中基于改变血糖值浓度时的反射吸光度值而绘制的标准曲线的曲线图。 
[图5]为表示在下述实施例9中热加速(heat acceleration)后的试验片中含有的4-AA和CP2的残留率的曲线图。 
[图6]为表示在下述实施例10中按照L18正交表测定相对于pH缓冲剂的pH和种类的变化的测定灵敏度变化的结果的曲线图。 
[图7]为表示在下述实施例11中改变增溶剂的种类，测定相对灵敏度经时变化的结果的曲线图。 
[图8]为表示下述实施例12中测定相对于成色化合物的浓度和Trinder’s试剂的浓度变化的测定灵敏度变化的结果的曲线图。 
具体实施方式
以下，详细说明本发明的实施方式。 
[氧化显色化合物或其盐] 
本发明的第1发明提供下述化学式(1)表示的氧化显色化合物或其盐(以下也简单地称作“氧化显色化合物/盐”)， 
Figure G2008800087915D00081
式中，R1及R2分别独立地为碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基， 
R3、R4、R5、R6和R7分别独立地为氢原子、羧基或磺酸基或它们的盐，此时，R3～R7中的至少一个为羧基或磺酸基或它们的盐，且其他为 氢原子。 
在上述化学式(1)中，R1及R2分别独立地为碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基。优选R1及R2为相同的烷基。作为碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基的例子，例如可以举出甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基和新戊基。其中，如果考虑上述化学式(1)表示的氧化显色化合物/盐的溶解性，则R1及/或R2较优选为甲基、乙基、丙基，最优选R1及R2都是甲基。如果为上述实施方式，则上述化学式(1)表示的氧化显色化合物/盐显示出充分的溶剂溶解性，抑制产生使其载持于载体上时的涂布不均，可以将试剂浓度变化时对测定值的影响抑制在最低限度。另外，与适当的Trinder’s试剂组合使其氧化显色时可以显著地提高测定精度。 
另外，在上述化学式(1)中，R3～R7为氢原子、羧基(-COOH)或磺酸基(-SO3H)或它们的盐。此时，R3～R7中至少有一个为羧基或磺酸基或它们的盐，且其他的R3～R7为氢原子。需要说明的是，R3～R7可以相同，也可以不同。其中，如果考虑上述化学式(1)表示的氧化显色化合物/盐的溶解性，则优选下述实施方式，R5为羧基或磺酸基或它们的盐，R3、R4、R6和R7为氢原子；R4为羧基或磺酸基或它们的盐，R3、R5、R6和R7为氢原子；或R4及R6为羧基或磺酸基或它们的盐，R3、R5和R7为氢原子。根据上述实施方式，上述化学式(1)表示的氧化显色化合物/盐显示出充分的溶剂溶解性，能够抑制产生使其载持于载体上时的涂布不均，可以将试剂浓度变化时对测定值的影响抑制在最低限度。另外，与适当的Trinder’s试剂组合使其氧化显色时可以显著地提高测定精度。 
即，作为本发明的优选氧化显色化合物，可以举出下述化合物。 
·4-氨基-1-(4-羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化学式(1)中，R1、R2＝-CH3、R5＝-COOH、R3、R4、R6、R7＝H) 
·4-氨基-1-(4-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化学式(1)中，R1、R2＝-CH3、R5＝-SO3H、R3、R4、R6、R7＝H) 
·4-氨基-1-(3-羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化学式(1)中，R1、R2＝-CH3、R4＝-COOH、R3、R5、R6、R7＝H) 
·4-氨基-1-(3-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化学式(1)中，R1、R2＝-CH3、R4＝-SO3H、R3、R5、R6、R7＝H) 
·4-氨基-1-(3，5-二羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化学式(1)中，R1、R2＝-CH3、R4、R6＝-COOH、R3、R5、R7＝H) 
·4-氨基-1-(3，5-二磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化学式(1)中，R1、R2＝-CH3、R4、R6＝-SO3H、R3、R5、R7＝H) 
·4-氨基-1-(3-羧基-5-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化学式(1)中，R1，R2＝-CH3、R4＝-COOH、R6＝-SO3H、R3、R5、R7＝H) 
其中，作为本发明的较优选氧化显色化合物，可以举出下述化合物。 
·4-氨基-1-(4-羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化学式(1)中，R1、R2＝-CH3、R5＝-COOH、R3、R4、R6、R7＝H) 
·4-氨基-1-(4-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化学式(1)中，R1、R2＝-CH3、R5＝-SO3H、R3、R4、R6、R7＝H) 
·4-氨基-1-(3-羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化学式(1)中，R1、R2＝-CH3、R4＝-COOH、R3、R5、R6、R7＝H) 
·4-氨基-1-(3-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(上述化学式(1)中，R1、R2＝-CH3、R4＝-SO3H、R3、R5、R6、R7＝H) 
需要说明的是，羧基及磺酸基为离子性官能团，这些官能团可以是游离状态，或者也可以形成盐，即，R3、R4、R5、R6和R7可以是羧基或磺酸基的盐。此时，与上述酸基形成盐的反荷离子可以是无机离子， 也可以是有机离子。例如可以举出钠离子、钾离子、钙离子等来自无机碱的阳离子；铵离子；来自烷基胺类等有机碱的阳离子；以及来自氨基酸类等两性化合物的离子等。其中，上述化学式(1)表示的氧化显色化合物是盐的形态时，优选为钠盐、钾盐或铵盐，较优选为钠盐。此处，在本发明的试剂组合物中，可以仅含有一种上述氧化显色化合物/盐，也可以含有两种以上。 
本发明的氧化显色化合物/盐的制备方法没有特别限定，可以以同样的方式应用现有公知的制备方法，或者对其进行适当修饰或适当组合后适当地应用。以下，说明本发明的氧化显色化合物/盐的制备方法的优选实施方式，但本发明的技术范围并不限定于下述实施方式。 
本发明的氧化显色化合物/盐优选例如通过下述制备方法进行制备，所述制备方法具有使下述化学式(2)表示的化合物(以下，也称作“化合物(2)”)和下述化学式(3)表示的化合物(以下，也称作“化合物(3)”)反应的步骤(以下，也称作“步骤(A)”)。需要说明的是，在下述化学式(2)及化学式(3)中，R1及R3～R7的定义与上述化学式(1)中的定义相同，所以此处省略详细的说明。 
在步骤(A)中，使化合物(2)与化合物(3)反应时的混合比没有特别限定。优选化合物(2)与化合物(3)分别以等摩尔混合，或相对于化合物(3)使化合物(2)稍多地进行混合。具体而言，化合物(2)的混合量相对于1摩尔化合物(3)优选为0.8～2摩尔，较优选为1～1.2摩尔。另外，化合物(2)与化合物(3)的反应条件只要是它们的反应 进行的条件即可，没有特别限定。例如反应温度优选为20～200℃，较优选为80～150℃。另外，反应时间优选为0.5～5小时，较优选为1～1.5小时。进而，化合物(2)与化合物(3)的反应可以在无溶剂条件下进行，或也可以在溶剂中进行。作为在后者情况下可以使用的溶剂，可以举出甲醇、乙醇、丙醇等醇类；四氢呋喃(THF)、乙醚、二氧杂环己烷等醚类；吡啶、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等溶剂。其中，优选使用THF。在化合物(2)与化合物(3)的反应后，通过向适当的溶剂中加入反应混合物使产物固化，可以将产物从原料化合物中分离、回收。需要说明的是，步骤(A)中得到的反应产物具有下述化学式(4)中R2为氢原子(H)的结构。 
接着，通过将上述步骤(A)中得到的反应产物烷基化，得到下述化学式(4)表示的化合物(以下，也称作“化合物(4)”)(步骤(B))， 
Figure G2008800087915D00121
在步骤(B)中，烷基化反应可以使用以碘甲烷、碘乙烷等卤代烃为代表的烷化剂来进行。但是，烷化剂不限定于卤代烃，其他公知的烷化剂也可以同样地进行使用。在步骤(B)的反应中也可以使用适当的溶剂或碱。另外，反应可以在室温或加热条件下进行。具体而言，作为可以使用的溶剂，可以举出与上述步骤(A)的说明栏中列举的溶剂相同的溶剂，其中，可以优选使用甲醇或THF。另外，作为碱，可以举出三乙胺(TEA)、二异丙基乙基胺(DIEA)、4-(二甲氨基)吡啶等，其中可以优选使用TEA。 
在步骤(B)中，烷化剂的使用量只要是可以充分地将上述步骤(A)中得到的反应产物进行烷基化的量即可，没有特别限定。如果举出一例， 则烷化剂的使用量相对于1摩尔上述步骤(A)中得到的反应产物优选为0.5～5摩尔，较优选为1～2摩尔。另外反应条件也没有特别限定，但上述步骤(A)中得到的反应产物的烷基化反应优选在40～200℃下，较优选在100～140℃下进行，且优选进行1～24小时，较优选为10～20小时。 
接着，以上述步骤(B)中得到的化合物(4)作为起始物质，进行亚硝化反应，该亚硝化反应之后进行还原反应(步骤(C))。 
在步骤(C)中，亚硝化反应也可以在无溶剂条件下进行，但优选在溶剂中进行。具体而言，亚硝化反应如下进行，将水、有机酸、或两者的混合物用作溶剂，用盐酸或硝酸(优选为盐酸)等将反应体系调节至酸性，优选pH1～5，较优选pH1～2，然后加入亚硝酸钠。此处，作为有机酸，可以举出乙酸、丙酸、丁酸、甲酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸等，优选为乙酸。另外，亚硝酸钠的量没有特别限定，但通常以与起始物质摩尔数相等或过剩的量进行使用，相对于起始物质优选使用1.0～4.0当量，较优选使用1.1～1.5当量。 
在步骤(C)中，亚硝化反应的反应条件只要是可以充分进行亚硝化反应的条件即可，没有特别限定。具体而言，反应温度优选为-20℃～40℃，较优选为0～25℃。另外，反应时间优选为5秒钟～40分钟，较优选为10秒钟～15分钟。由于通过该亚硝化反应得到的产物析出，所以容易将其从反应体系中分离回收。 
然后，步骤(C)在亚硝化反应之后进行还原反应。此处，还原反应可以在无溶剂条件下进行，但优选在溶剂中进行。作为可以在还原反应中使用的溶剂，只要是可以溶解亚硝化反应中得到的亚硝化反应产物的溶剂即可，没有特别限定。作为上述溶剂，例如可以举出水；甲醇、乙醇、丙醇等醇；乙酸、丙酸、丁酸、甲酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸等有机酸等。上述溶剂可以仅单独使用一种，也可以以混合物的形态同时使用两种以上。另外，还原剂也没有特别限定，例如可以使用锌等金属或连二亚硫酸钠等还原性无机盐，反应溶液可以为中性，或通过加入氢氧化钠或盐酸适当地调节至碱性或酸性。优选反应溶液的pH为1～12，较优选为1～5。 
在上述还原反应后，通过添加适当的溶剂使产物析出，通过过滤或使用适当的有机溶剂提取进行回收。亚硝化反应及还原反应也可以不取出亚硝化反应的产物，在同一釜中连续进行。有时被回收的产物通过重结晶或柱色谱纯化，能够得到更高纯度的产物。 
上述制备方法根据需要还可以包括在反应步骤之前导入适当的保护基，之后脱去保护基的步骤。作为保护基，例如相对于羧酸，可以举出甲酯、乙酯等。 
以上，说明了本发明的氧化显色化合物/盐的优选制备方法的例子，但本发明并不限定于这些制备方法。 
本发明的第2发明是一种含有本发明第1发明的氧化显色化合物/盐、Trinder’s试剂、氧化酶和过氧化物酶的试剂组合物。 
对本发明的试剂组合物中含有的氧化显色化合物/盐的具体形态如上栏中所述，此处省略详细的说明。 
对本发明的试剂组合物中的氧化显色化合物/盐的含量没有特别限定，举出一优选例为，试剂组合物为液体状态时，溶液中的氧化显色化合物/盐的浓度优选为7～30mmol/100mL，较优选为10～18mmol/100mL。 
以下，对本发明的试剂组合物中含有的除氧化显色化合物/盐之外的成分的具体实施方式进行说明。但是，本发明的技术范围并不限定于下述实施方式。 
[Trinder’s试剂] 
对Trinder’s试剂的具体形态没有特别限定，可以适当参见现有公知技术。如果举出一例，则可以举出N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-3-乙酰基乙二胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N-琥珀酰乙二胺、N-(2-羧基乙基)-N-乙基-3-甲基苯胺、N，N-双-(4-磺丁基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(2-琥珀酰氨基乙基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N- (3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基-4-氟苯胺等。将这些Trinder’s试剂与上述氧化显色化合物/盐组合包含在试剂组合物中时，与使用4-氨基安替比林等已知的成色化合物时相比，测定时的发光时的吸光度增大，可以提高测定灵敏度。其中，从可以改善标准曲线斜率(即，可以提高测定灵敏度)的观点考虑，特别优选N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)。需要说明的是，在本发明的试剂组合物中，可以仅含有一种Trinder’s试剂，也可以含有两种以上。 
将本发明的试剂组合物作为试剂用于检测·定量对象物质时，上述氧化显色化合物/盐与Trinder’s试剂以1∶1(摩尔比)结合，形成色素，从而呈色。因此，氧化显色化合物/盐与Trinder’s试剂的含量比在理论上为1∶1(摩尔比)。但是，实际上由于上述试剂受溶解性或反应性能的影响，所以从使反应有效地进行的观点考虑，本发明的试剂组合物中的氧化显色化合物/盐与Trinder’s试剂的含量比以摩尔比计优选为1∶1～2∶1，较优选为1.3∶1。 
[氧化酶] 
氧化酶特异性地氧化通过利用本发明的试剂组合物进行检测·定量的对象物质，生成过氧化氢。对氧化酶的具体形态没有特别的限定，可以适当地参见现有公知的知识。即，可以根据期望使用本发明的试剂组合物进行检测·定量的对象物质的种类，适当地选择氧化酶的种类。例如在葡萄糖的检测·定量中使用葡萄糖氧化酶、在胆固醇的检测·定量中使用胆固醇氧化酶、在尿酸的检测·定量中使用尿酸酶、在丙酮酸的检测·定量中使用丙酮酸氧化酶。但是，并不限定于此，当然也可以使用其他的氧化酶。本发明的试剂组合物中的氧化酶的含量没有特别限定，但从使反应有效地进行的观点考虑，相对于上述氧化显色化合物/盐的含量(1摩尔)，优选为26～130kU，较优选为26～108kU。需要说明的 是，在本发明中，采用按照比色活性测定法测定得到的值作为氧化酶含量的值。 
[过氧化物酶] 
过氧化物酶作用于由检测·定量的对象物质的氧化而生成的过氧化氢，生成活性氧。对过氧化物酶的具体形态没有特别限定，可以适当参见现有公知的知识。本发明的试剂组合物中的过氧化物酶的含量没有特别限定，但从使反应有效地进行的观点考虑，相对于上述氧化显色化合物/盐的含量(1摩尔)，优选为69～470kU，较优选为69～350kU。需要说明的是，采用由比色活性测定法测定得到的值作为过氧化物酶含量的值。 
[其他成分] 
本发明的试剂组合物，除上述必须成分之外，根据需要还可以含有其他成分。作为试剂组合物中可以含有的其他成分，例如可以举出pH缓冲剂、增溶剂、渗透压调节剂、表面活性剂、稳定剂、保护剂等。对上述各成分的具体形态没有特别限定，可以适当参见现有公知的知识。特别优选还含有pH缓冲剂和增溶剂中的至少一方。 
检测·定量对象物质时为了尽量抑制试剂组合物与样品接触时的pH变化，可以配合pH缓冲剂，由此，无论对试验用具给与何种样品都可以将反应体系的pH维持一定。结果，可以一直在相同条件下进行反应，并提高测定精度。作为pH缓冲剂的具体例，例如可以举出磷酸盐、硼酸盐等无机酸盐、或有机羧酸盐、有机磷酸盐、有机磺酸盐、有机硼酸盐、氨基酸或其盐等有机酸盐。其中，从提高试剂稳定性和显色性能的观点考虑，优选有机酸盐，较优选有机羧酸盐。作为用作pH缓冲剂的有机羧酸盐的例子，例如可以举出选自乙酸、丙酸、丁酸、富马酸、马来酸、苯二甲酸、乙二酸、琥珀酸、丙二酸、柠檬酸、苹果酸、丙酮酸、甘油酸、戊二酸中的一种或两种以上的酸的盐。其中，从提高试剂稳定性和显色性能的观点考虑，优选苯二甲酸、琥珀酸、柠檬酸、丙二酸、乙二酸、富马酸、马来酸，特别优选琥珀酸、柠檬酸。pH缓冲剂为盐的形态时，作为与酸一同形成盐的反荷离子，例如可以举出锂离子、钠离子、 钾离子、镁离子、钙离子、铵离子、烷基铵离子等，特别优选钠离子、钾离子。需要说明的是，在试剂组合物中可以单独含有仅一种pH缓冲剂，也可以含有两种以上。 
在形成用于测定的酶或色素的过程的反应中，其反应速度多依赖于pH。因此，通过将反应体系的pH设定为试剂组合物中的酶的最适pH，可以加快反应速度。另外，根据不同情况，通过设定为适于反应体系的显色反应的pH，也可以加快反应速度。进而，通过设定为适当的pH，也可以提高试剂成分的溶解性，加快反应速度。另外，通过设定为适当的pH，还可以提高试剂成分的保存稳定性。考虑到上述情况，pH缓冲剂的pH没有特别限定，可以根据试剂组合物的其他成分进行适当地设定，但从显色的反应速度优异的观点考虑，pH缓冲剂的pH优选为4.0～6.0，较优选为4.0～5.0。另外，在优选的实施方式中，试剂组合物中的pH缓冲剂的含量，相对于上述氧化显色化合物/盐的含量(1摩尔)优选为1～6.7摩尔，较优选为1.9～5摩尔。 
在检测·定量对象物质时为了试剂组合物与样品接触时使两者均匀地混合，可以配合增溶剂，由此可以使反应迅速地进行。另外，在本发明的试剂组合物例如以载持在载体上形成试验用具的形态进行使用时，增溶剂也具有使载体表面的润湿性提高的功能，结果也可以使样品在载体表面均匀地展开。进而，也有助于使样品一边与试剂成分混合·反应一边向载体内部渗透的过程均匀且迅速地进行。另外，增溶剂还具有包围试剂成分从而减小与空气的接触面积的效果，还具有防止对氧化等不稳定的成分的经时劣化的功能。进而，酶等蛋白质处于干燥状态时，增溶剂还具有使该蛋白质的高级结构稳定化，防止其劣化的功能。作为增溶剂，例如可以使用水溶性高分子、表面活性剂等。具体而言可以举出羧甲基纤维素(CMC)、聚乙二醇(PEG)、对叔辛基苯酚聚氧乙烯醚(例如，Union Carbide Chemicals and Plastic Co.公司制Triton(注册商标)系列)、脱水山梨醇烷基化物(例如，ICI Americas，Inc.公司制Span(注册商标)系列)、脱水山梨醇聚氧乙烯醚(例如，Uniqema公司制Tween系列)、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物(例如，BASF AG公司 制Pluronic(注册商标)系列)、聚氧乙烯壬基酚(例如，日光Chemicals公司制Nikkol NP系列)和聚氧乙烯正烷基醚(例如，ICI Americas，Inc.公司制Brij(注册商标)系列)。其中，优选CMC、PEG-5000～60000、Triton(注册商标)、Tween、Pluronic(注册商标)、NP-40、Brij(注册商标)-58，特别优选Triton(注册商标)X-100、Tween 20、Pluronic(注册商标)-F68。另外，在优选方案中，试剂组合物中的增溶剂的含量，相对于上述氧化显色化合物/盐的含量(1摩尔)优选为480～2000g，较优选为600～1300g。 
除此之外，作为本发明的试剂组合物中可以含有的成分，根据需要可以选择渗透压调节剂、稳定剂、保护剂等。 
本发明的试剂组合物的形态没有特别限定，可以是液体状、粉末状、片剂等任何一种形态。另外，优选以保持在载体上的形态使用本发明的试剂组合物。即，本发明的第3发明是将本发明第2发明的试剂组合物载持在载体上而形成的试验用具。在上述方案中，本发明的第3发明的试验用具包括例如载持本发明第2发明的试剂组合物形成的层，除此之外，根据需要还可以包括测量层、展开层、过滤层、固定层等其他层。使用上述试验用具的对象物质的检测·定量中，给与样品后，可以采用目视判定颜色变化的方式或用分光光度计测定反射吸光度的方式。对于测定值，通过与预先制作的标准曲线相对照，可以换算为测定目标物(对象物质)的量。 
以下，更详细地说明本发明的第3发明的具体实施方式，但本发明的技术范围并不限定于下述实施方式。例如本发明的第2发明的试剂组合物如上所述以液体状态使用时，将本发明的第2发明的试剂组合物与样品混合，使之反应后，可以采用以目视判定颜色变化的方式或用分光光度计测定透过吸光度的方式。 
将试剂组合物保持在载体上进行使用时，可以使用将溶解于适当溶剂的试剂组合物的溶液涂布在载体上的方法、或将含有试剂组合物的母体前体成型使其形成试验层的方法等公知的方法。 
作为载体的构成材料，可以使用纸、布帛、高分子膜等多孔质物质。 其中，从显色性能优异的观点考虑，特别优选将高分子膜用作载体的构成材料。需要说明的是，所谓“高分子膜”是指由高分子形成的水不溶性的多孔质膜。对构成高分子膜的高分子没有特别限定，例如可以举出聚砜、聚醚砜、纤维素、乙酸纤维素、硝酸纤维素、聚丙烯腈、聚酰胺、芳香族聚酰胺、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚酰亚胺、聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯、聚偏1，1-二氟乙烯、聚氯乙烯、聚乙烯醇。其中，从显色性能优异的观点考虑，优选使用聚砜或聚醚砜。为了将上述高分子制膜形成高分子膜，可以使用公知的制膜方法。 
为了将试剂组合物涂布在载体上，可以采用工业上使用的一般涂布法。 
在本发明的试验用具中，将本发明的第2发明的试剂组合物保持在载体上，保持在载体上的各成分的量没有特别限定，可以考虑到溶液的粘性等来适当地决定各成分的量。作为保持在载体上的试剂组合物含有pH缓冲剂和增溶剂时的优选例为，每1cm3载体上，上述氧化显色化合物/盐的保持量优选为15～62μmol，较优选为23～39μmol。另外，每1cm3载体上Trinder’s试剂的保持量优选为7.5～62μmol，较优选为15～39μmol。进而，保持在载体上的试剂组合物含有pH缓冲剂时，每1cm3载体上pH缓冲剂的保持量优选为40～155μmol，较优选为76～115μmol。另外，保持在载体上的试剂组合物含有增溶剂时，每1cm3载体上增溶剂的保持量优选为19～45mg，较优选为24～30mg。 
为了降低涂布后的液体流动和不均匀干燥，使用准确测量少量液体后进行涂布之类的精密印刷技术，但该方法必需制备高试剂浓度的涂布液。在此方面，4-氨基安替比林等已知的成色化合物是在用于测定的各种试剂中溶解性最低的化合物，不易将其制成高浓度的涂布液。相对于此，本发明的试剂组合物中含有的上述成色化合物溶解性高，从制成高浓度的涂布液的观点考虑，也为优选。 
将本发明的第2发明的试剂组合物保持在载体上形成的本发明的第3发明的试验用具，在给与样品后，首先试剂组合物中含有的各成分溶解于样品中的液体成分中，与其混合引起反应。然后，生成呈色化合物， 通常向位于试验用具的给与样品面的相对侧的读取面移动，测定该读取面上的色调变化，经过上述步骤进行定量。因此，试剂成分的溶解性高不仅有利于由样品产生的均匀溶解、均匀化、迅速反应，而且还具有下述优点，即由于生成的色素也具有优异的溶解性，所以可以顺利且均匀地向读取面移动。上述特征有助于缩短测定时间、提高测定精度、降低测定值不均。 
使含有现有的作为成色化合物的4-氨基安替比林的试剂组合物保持在载体上构成试验用具时，试剂成分经时劣化减少，与之相伴产生测定值升高的问题。作为伴有试剂成分减少的测定值升高的原因，一般认为不是由于酶反应或呈色反应的阻碍，而是由于化合物的浓度越高，对其他试剂类的溶解和移动、或生成色素的流动性产成了某种妨碍。根据本发明，与使用现有的4-氨基安替比林的情况相比较，即使量有所增减，对测定值的影响也较小，可以改善使用4-氨基安替比林呈现出的上述问题。 
另外，使4-氨基安替比林等已知的成色化合物保持在载体上作为试验用具使用时，存在浓度变化对测定值产生影响的问题。可以推测出：在对大块载体涂布时产生涂布不均的情况下，在除去涂布不均使用的各试验用具之间产生灵敏度差，或在保存中经劣化分解使量发生变化的情况下对测定值产生影响。相对于此，根据本发明，与现有的4-氨基安替比林相比，对浓度的测定值的影响小，而且在能够改善上述问题方面也是有利的。 
实施例 
用以下实施例更具体地说明本发明，但本发明的技术范围并不限于以下实施例。 
(实施例1) 
4-氨基-1-(4-羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(简称：CP1)的合成 
1-1)1-(4-羧基苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮的合成 
将5.0g苯肼-4-甲酸(关东化学株式会社制41179-1A)与5.9g 3-氧代丁酸乙基酯(东京化成工业株式会社制A0649)的混合物于120℃下加热搅拌1小时。放冷后过滤收集析出的固体，用乙醇洗涤后，干燥，得到8.3g目标物。 
1-2)1-(4-羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮甲酯的合成 
将3.0g上述1-1)中得到的1-(4-羧基苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮、3.9g碘甲烷(关东化学株式会社制I0060)、100mL甲醇加入高压反应容器中，于120℃下加热搅拌15小时。蒸发干固反应混合物后，使之溶解于氯仿中，水洗后，用无水硫酸钠干燥有机层。蒸发干固有机层，得到2.6g目标物。 
1-3)4-氨基-1-(4-羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮甲酯的合成 
将2.0g上述1-2)中得到的1-(4-羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮甲酯溶解于25mL 0.4N盐酸中，在冰冷下经2分钟加入1.2mL40％亚硝酸钠水溶液(关东化学株式会社制37402-00)。接着，于室温下搅拌10分钟，将析出的固体过滤收集、洗涤、干燥。将固体溶解于10mL甲醇中，加入2mL 4N盐酸、1.1g锌粉(关东化学株式会社制48005-00)，于45℃下搅拌10分钟。过滤反应混合物后，将滤液浓缩干固，用于以甲醇/氯仿(1∶9)作为溶剂的硅胶柱色谱。浓缩干固主要馏分，得到1.0g目标物。 
1-4)4-氨基-1-(4-羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮的合成 
将0.37g上述1-3)中得到的4-氨基-1-(4-羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮甲酯溶解于5mL甲醇，加入0.25mL 4N氢氧化钠水溶液，于室温下反应30分钟。将反应混合物用强酸性阳离子交换树脂(Aldrich公司制216534-250G)处理后，浓缩干固，得到0.25g目标物。 
如上所述得到的目标物的NMR的分析结果如下述表1所示。 
[表1] 
1H -NMR(DMSO-d6)2.08ppm(s，3H，C-CH3)，2.73ppm(s，3H，N-CH3)，3.83pm(br，2H ，NH2)，7.29-7.94ppm(4H，芳香性) 
(实施例2) 
4-氨基-1-(4-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(简称：CP2)的合成 
2-1)1-(4-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮的合成 
将3.0g 1-(4-磺苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮(Aldrich公司制134163-25G)、3.4g碘甲烷(关东化学株式会社制I0060)、100mL甲醇加入高压反应容器中，于130℃下加热搅拌15小时。蒸发干固反应混合物后，用乙醇进行重结晶，得到1.4g目标物。 
2-2)4-氨基-1-(4-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮的合成 
将0.5g上述2-1)中得到的1-(4-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮溶解于10mL 0.4N盐酸中，在冰冷下加入亚硝酸钠(关东化学株式会社制37402-00)的40％水溶液0.35mL，搅拌1分钟，加入500mg锌粉(关东化学株式会社制48005-00)，进而于室温下搅拌10分钟。过滤反应混合物后，浓缩干固滤液，得到0.41g目标物。 
如上所述得到的目标物的NMR的分析结果如下述表2所示。 
[表2] 
1H NMR(D2O)2.27ppm(s，3H，C CH3)，3.15ppm(s，3H，N-CH3)，7.44-7.99ppm(4H，芳香性) 
(实施例3) 
4-氨基-1-(3-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(简称：CP6)的合成 
3-1)1-(3-磺苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮的合成 
将5.0g苯肼-3-磺酸与6.1g 3-氧代丁酸乙基酯的混合物于120℃下加热搅拌1小时。将反应混合物放冷，将析出的固体过滤收集，洗涤、干燥，得到8.0g目标物。 
3-2)1-(3-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮的合成 
将3.0g上述3-1)中得到的1-(3-磺苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮、3.4g碘甲烷、100mL甲醇加入高压反应容器中，于130℃下加热搅拌15小时。蒸发干固反应混合物后，用乙醇进行重结晶，得到1.5g目标物。 
3-3)4-氨基-1-(3-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮的合成 
将0.5g上述3-2)中得到的1-(3-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮溶解于10mL 0.4N盐酸中，在冰冷下加入0.35mL 40％亚硝酸钠水溶液，搅拌1分钟，加入500mg锌粉，进而于室温下搅拌10分钟。过滤反应混合物后，将滤液浓缩干固，得到0.37g目标物。 
如上所述得到的目标物的NMR的分析结果如下述表3所示。 
[表3] 
1H-NMR(D2O)2.24ppm(s，3H，C-CH3)，3.11ppm(s，3H，N-CH3)，7.35-8.21ppm(4H，芳香性) 
(实施例4) 
以用于测定葡萄糖的涂布液组成为例，对能否制成几倍厚度的涂布液进行实验。即，使用下述基本组成，即使用改变各成色剂的种类和量(使其成为与4-氨基安替比林相等的摩尔量)的组成，来增加全部试剂时，观察是否可以得到达到几倍量的均匀溶液。结果如下述表4所示。 
基本组成(在100mL水中) 
1.0g成色化合物(4-AA)、0.8g Trinder’s试剂(TOOS)、5.0g Triton(注册商标)X-100、2.0g葡萄糖氧化酶、0.5g过氧化物酶、0.05M柠檬酸钠-柠檬酸(调节pH＝5.0) 
[表4] 
  成色剂的种类   成色剂的溶解量
  4-氨基安替比林   5倍量
  4-氨基-1-(4-羧基苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮   8倍量
  4-氨基-1-(4-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮   10倍量
  4-氨基-1-(3-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮   10倍量
由上表4可知，与目前作为成色剂通常使用的4-氨基安替比林相比，本发明的化合物(CP1、CP2和CP6)均显示出较高溶解性，因此通过使 用本发明的化合物，可以制备浓厚的涂布液。 
(实施例5) 
制备仅改变成色剂浓度的组成的试验膜，评价对葡萄糖定量值的影响。即，使用下述组成的涂布液，在聚醚砜膜(泰尔茂株式会社制、膜厚130μm)上进行涂布，于35℃下干燥18小时。将膜冲载为边长1cm的正方形，将其置于反射分光光度计后，从试验膜上部滴加1μL的样品，测定10秒后的反射吸光度。使用将红细胞比积值调节至40％、血糖值调节至100mg/dL的人血液作为样品。其结果示于图1。 
如图1所示，与4-氨基安替比林(图1中的“4AA”)相比，本发明的化合物(CP1、CP2、CP6)均呈现出灵敏度的浓度依存性降低。 
涂布液组成(在100mL 0.1M柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液(pH＝5.0)中) 
4.0g/5.6g/8.0g成色化合物、3.2g Trinder’s试剂(MAOS)、20.0gTriton(注册商标)X-100、8.0g葡萄糖氧化酶、2.0g过氧化物酶 
(实施例6) 
在实施例5制备得到的成色剂浓度中，对于使用CP2的所得的产物，制成基本组成相同的试验膜。使用此试验膜，根据在多种葡萄糖浓度下测定得到的值，绘制标准曲线，观察定量灵敏度。需要说明的是，评价法与实施例5所示的方法相同。结果如图2中标准曲线所示。在图2中，由于x轴表示反射吸收度、y轴表示血糖值，所以斜率越平缓，表示灵敏度越高。 
如图2所示，本发明的4-氨基-1-(4-磺苯基)-2，3-二甲基-5-吡唑啉酮(CP2)与作为Trinder’s试剂的MAOS组合使之显色时，与使用4-氨基安替比林时相比，该标准曲线的斜率有所改善、可以显著地提高测定灵敏度。 
(实施例7) 
使用如下述表5所示组成的涂布液，通过吻合涂布法(kiss-coat)，将其涂布在泰尔茂株式会社制聚醚砜膜(膜厚：130μm)上，于37℃干燥18小时。之后，将膜裁成边长1cm的正方形，得到试验片。 
[表5] 
涂布液组成(在100mL 0.4M琥珀酸钠缓冲液(pH＝5.0)中) 
      试剂载带量
  成色化合物   15mmol   30.7μmol/cm3
  Trinder’s试剂(MAOS)   15mmol   30.7μmol/cm3
  Triton X-100   13.0g   26.7mg/cm3
  葡萄糖氧化酶   1300kU   2.7U/cm3
  过氧化物酶   1000kU   2.1U/cm3
利用血液的评价如下进行：将试验片固定在反射分光光度计上后，从试验膜上部滴加1μL样品，通过测定连续的或规定时间内的反射吸光度进行评价。 
作为成色化合物，使用4-氨基安替比林(4-AA)、CP1或CP2，使用按上述方法制成的试验片，将红细胞比积值调节为40％、血糖值调节为400mg/dL的人血液作为样品，测定反射吸光度的时间变化。结果示于图3。由图3所示的结果可知，作为现有成色化合物的4-AA，反射吸光度值达到稳定需要15秒左右，但CP1在不足5秒内反射吸光度值达到稳定，CP2在3秒左右反射吸光度值达到峰值。即，表明通过采用本发明的试剂组合物，可以缩短测定时间。 
(实施例8) 
使用实施例7中制作的试验片，将红细胞比积值为40％、使血糖浓度变化为血糖值50、100、400、600mg/dL的人血液作为样品，测定反射吸光度值，由所得的反射吸光度值绘制标准曲线，对测定灵敏度进行比较。结果示于图4。由于图4的Y轴(纵轴)为血糖值浓度(输入值)，X轴(横轴)为反射吸光度值(输出值)，所以标准曲线的斜率越小表示测定灵敏度越高。由图4所示的结果可知，CP1及CP2与4-AA相比，标准曲线的斜率变小。即，表明通过采用本发明的试剂组合物，可以提 高测定灵敏度。 
(实施例9) 
使用如下述表6所示的组成的涂布液，通过吻合涂布法，将其涂布在泰尔茂株式会社制聚醚砜膜(膜厚：130μm)上，于37℃干燥18小时。之后，将膜裁成成Φ6mm的圆，得到试验片。 
[表6] 
涂布液组成(在100mL 0.4M琥珀酸钠缓冲液(pH＝5.0)中) 
      试剂载带量
  成色化合物   15mmol   30.7μmol/cm3
  Trinder’s试剂(MAOS)   15mmol   30.7μmol/cm3
  Triton X-100   13.0g   26.7mg/cm3
  葡萄糖氧化酶   1900kU   3.9U/cm3
  过氧化物酶   1000kU   2.1U/cm3
将试验片在真空状态的60℃烘箱内保存1小时，实施热加速后，用1mL 60％乙腈水溶液，进行超声波处理10分钟，进行提取。所得的提取液在下述条件下用HPLC测定试剂量，洗脱液：60％乙腈/50mM磷酸缓冲液(pH7.5)、洗脱液流速：1mL/min、柱温：40℃、色谱柱：HydrosphereC18250×4.6mm(株式会社YMC制)、测定波长：254nm、进样量：20μL。通过上述方法，比较相对于热加速前的试验片、热加速后的试验片中含有的4-AA和CP2的残留率。结果示于图5。由图5所示的结果可知，4-AA的残留率为70％以下，相对于此CP2的残留率约为100％。即，表明通过采用本发明的试剂组合物，可以提高试验用具的经时稳定性。 
(实施例10) 
使用根据L18实验正交表(9因素、3水平)将下述表7所示的组成的涂布液组合所得的涂布液，通过吻合涂布法，将其涂布在泰尔茂株式会社制聚醚砜膜(膜厚：130μm)上，于37℃干燥18小时。之后，将膜裁成成边长为1cm的正方形，得到试验片。 
[表7] 
涂布液组成(在100mL缓冲液中) 
      试剂载带量
  成色化合物(CP2)   5～15mmol   10.3～30.8μmol/cm3
  Trinder’s试剂(MAOS)   5～15mmol   10.3～30.8μmol/cm3
  缓冲剂pH   5.0～6.0   -
  缓冲剂种类   琥珀酸、柠檬酸、乙酸   -
  增溶剂   13.0g   26.7mg/cm3
  葡萄糖氧化酶   1300kU   2.7U/cm3
  过氧化物酶   500kU   1.0U/cm3
  缓冲剂浓度   400mM   76.9μmol/cm3
利用血液的评价如下进行：将试验片固定在反射分光光度计上后，从试验膜上部滴加1μL的样品，通过测定连续的或规定时间内的反射吸光度进行评价。 
对于各试验片，将红细胞比积值为40％、使血糖浓度变化为血糖值50、100、400、600mg/dL的人血液作为样品，测定反射吸光度值，由得到的反射吸光度值绘制标准曲线，计算测定灵敏度。在18种组合中，对pH缓冲剂的pH和pH缓冲剂的种类分别计算测定灵敏度，并进行比较。结果如图6所示。由图6所示的结果可知，pH缓冲剂的pH越低，测定灵敏度越高，琥珀酸、柠檬酸作为pH缓冲剂优异。 
(实施例11) 
使用如下述表8所示组成的涂布液，通过吻合涂布法，将其涂布在泰尔茂株式会社制聚醚砜膜(膜厚：130μm)上，于37℃干燥18小时。之后，将膜裁成边长1cm的正方形，得到试验片。 
[表8] 
涂布液组成(在100mL 0.4M琥珀酸钠缓冲液(pH＝5.0)中) 
      试剂载带量
  成色化合物   10mmol   20.5μmol/cm3
  Trinder’s试剂(MAOS)   10mmol   20.5μmol/cm3
  Triton X-100   13.0g   26.7mg/cm3
  葡萄糖氧化酶   1300kU   2.7U/cm3
  过氧化物酶   500kU   1.0U/cm3
利用血液的评价如下进行：将试验片固定在反射分光光度计上后，从试验膜上部滴加1μL的样品，通过测定连续的或规定时间内的反射吸光度进行评价。 
使用Triton(注册商标)X-100、Tween20、Pluronic-F68作为增溶剂，将按上述方法制成的试验片于60℃下在避光干燥状态下保存一定时间(热加速试验)。对保存一定时间的试验片，使用红细胞比积值：40％、血糖值：400mg/dL的人血液作为样品进行测定，将测定得到的相对灵敏度的经时变化示于图7。由图7所示的结果可知，上述3种增溶剂中，Triton(注册商标)X-100的相对灵敏度的减小最少，经时稳定性优异。 
(实施例12) 
利用实施例10中制成的试验片，使用红细胞比积值为40％、使血糖浓度变化为血糖值50、100、400、600mg/dL的人血液作为样品，对各试验片进行测定，由所得的反射吸光度值绘制标准曲线，计算测定灵敏度。在18种组合中，对成色化合物的浓度和Trinder’s试剂的浓度分别计算测定灵敏度，并进行比较。结果示于图8。由图8所示的结果可知，成色化合物的浓度为5mmol/100mL与为10mmol/100mL相比，测定灵敏度明显低，在10mmol/100mL以上的状态下，测定灵敏度稳定，因此成色化合物的必要最低浓度为10mmol/100mL以上。另外，Trinder浓度在设定的浓度范围内测定灵敏度稳定，因此可以依照作为偶合对象的成色剂的浓度进行设定。 
需要说明的是，本申请以2007年3月20日申请的日本专利申请第 2007-72807号及2007年9月28日申请的日本专利申请第2007-254475号为基础，作为参考，其公开的内容全文引用。 

Claims (21)

1.一种氧化显色化合物或其盐，如下述化学式(1)所示：
Figure FSB00000529496600011
式中，R1及R2分别独立地为碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基，
R3、R4、R5、R6和R7分别独立地为氢原子、羧基或磺酸基，此时，R3～R7中的至少一个为羧基或磺酸基，且其他为氢原子，所述羧基或磺酸基可以形成盐。
2.如权利要求1所述的氧化显色化合物或其盐，在所述化学式(1)中，R1及R2为甲基。
3.如权利要求1或2所述的氧化显色化合物或其盐，在所述化学式(1)中，R5为羧基或磺酸基，且R3、R4、R6和R7为氢原子，所述羧基或磺酸基可以形成盐。
4.如权利要求1或2所述的氧化显色化合物或其盐，在所述化学式(1)中，R4为羧基或磺酸基，且R3、R5、R6和R7为氢原子，所述羧基或磺酸基可以形成盐。
5.如权利要求1或2所述的氧化显色化合物或其盐，在所述化学式(1)中，R4及R6为羧基或磺酸基，且R3、R5和R7为氢原子，所述羧基或磺酸基可以形成盐。
6.一种试剂组合物，含有权利要求1～5中任一项所述的氧化显色化合物或其盐、Trinder’s试剂、氧化酶和过氧化物酶。
7.如权利要求6所述的试剂组合物，其中，所述Trinder’s试剂是选自N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-3-乙酰基乙二胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N-琥珀酰乙二胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺、N-(2-羧基乙基)-N-乙基-3-甲基苯胺、N，N-双-(4-磺丁基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(2-琥珀酰氨基乙基)-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基-4-氟苯胺和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺中的一种或两种以上。
8.如权利要求6或7所述的试剂组合物，还含有pH缓冲剂或增溶剂。
9.如权利要求8所述的试剂组合物，其中，所述pH缓冲剂为有机酸盐。
10.如权利要求9所述的试剂组合物，其中，所述有机酸盐为有机羧酸盐。
11.如权利要求10所述的试剂组合物，其中，所述有机羧酸盐是选自由乙酸、丙酸、丁酸、富马酸、马来酸、苯二甲酸、琥珀酸、丙二酸、柠檬酸和苹果酸构成的组的一种或两种以上的酸盐。
12.如权利要求8所述的试剂组合物，其中，所述pH缓冲剂的pH为4.0～6.0。
13.如权利要求8所述的试剂组合物，其中，所述增溶剂是选自羧甲基纤维素、聚乙二醇、对叔辛基苯酚聚氧乙烯醚、脱水山梨醇烷基化物、脱水山梨醇聚氧乙烯醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚氧乙烯壬基酚和聚氧乙烯正烷基醚中的一种或两种以上。
14.如权利要求6所述的试剂组合物，其中，所述氧化显色化合物或其盐与所述Trinder’s试剂的含量的摩尔比为1∶1～2∶1。
15.如权利要6所述的试剂组合物，其中，所述氧化酶为葡萄糖氧化酶。
16.一种试验用具，是将权利要求6～15中任一项所述的试剂组合物保持在载体上而形成的。
17.如权利要求16所述的试验用具，其中，所述载体为高分子膜。
18.如权利要求17所述的试验用具，其中，构成所述高分子膜的材料为聚砜或聚醚砜。
19.如权利要求16～18中任一项所述的试验用具，其中，每1cm3所述载体上的所述氧化显色化合物或其盐的含量为15～62μmol，所述Trinder’s试剂的含量为7.5～62μmol，所述pH缓冲剂的含量为40～155μmol，所述增溶剂的含量为19～45mg。
20.权利要求1～5中任一项所述的氧化显色化合物或其盐的制备方法，包括使化学式(2)表示的化合物和化学式(3)表示的化合物反应的步骤，
Figure FSB00000529496600031
式中，R1为碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基，
Figure FSB00000529496600032
式中，R3、R4、R5、R6和R7分别独立地为氢原子、羧基或磺酸基，此时，R3～R7中的至少一个为羧基或磺酸基，其他为氢原子，所述羧基或磺酸基可以形成盐。
21.权利要求1～5中任一项所述的氧化显色化合物或其盐的制备方法，包括以化学式(4)表示的化合物作为起始物质，进行亚硝化反应和随后的还原反应的步骤，
式中，R1及R2分别独立地为碳原子数1～5的直链状或支链状的烷基，
R3、R4、R5、R6和R7分别独立地为氢原子、羧基或磺酸基，此时，R3～R7中至少有一个为羧基或磺酸基、且其他为氢原子，所述羧基或磺酸基可以形成盐。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103592381B (zh) * 2013-10-28 2015-01-14 湖北神舟化工有限公司 高效液相色谱检测磺酸苯肼硫酸盐系列的方法
CN104195219A (zh) * 2014-09-17 2014-12-10 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种基于双酶偶联高通量检测d-阿洛糖的新方法
CN105017808A (zh) * 2015-07-16 2015-11-04 牛吉海 一种红色耐高温染料组合物及其制备方法
CN116355461A (zh) * 2023-03-31 2023-06-30 广州迅捷数码科技有限责任公司 一种墨水缓冲剂、喷墨墨水及其制备方法和应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3079256A (en) * 1959-11-20 1963-02-26 Gevaert Photo Prod Nv Silver halide emulsion containing n-(alkylsulfonylphenyl)-1-hydroxy-2-naphthoic acid amide color couplers
EP0033539A1 (de) * 1980-02-05 1981-08-12 Roche Diagnostics GmbH Verwendung von Aminoantipyrin-Verbindungen und neue Aminoantipyrinderivative
US4321397A (en) * 1979-01-31 1982-03-23 Millipore Corporation 4-Aminoantipyrine dye for the analytic determination of hydrogen peroxide

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57173513A (en) 1981-04-17 1982-10-25 Nippon Soken Inc Variable valve engine
JP2656995B2 (ja) 1989-03-17 1997-09-24 カイロン コーポレイション Ｎａｎｂｖの診断用薬
JP4138512B2 (ja) 2003-01-27 2008-08-27 テルモ株式会社 体液採取具
US20050061289A1 (en) 2003-09-18 2005-03-24 Plenzler Jeremy M. Engine oil system with oil pressure regulator to increase cam phaser oil pressure
JP2007072807A (ja) 2005-09-07 2007-03-22 Toshiba Corp Ｖｍｅシステムコントローラ。

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3079256A (en) * 1959-11-20 1963-02-26 Gevaert Photo Prod Nv Silver halide emulsion containing n-(alkylsulfonylphenyl)-1-hydroxy-2-naphthoic acid amide color couplers
US4321397A (en) * 1979-01-31 1982-03-23 Millipore Corporation 4-Aminoantipyrine dye for the analytic determination of hydrogen peroxide
EP0033539A1 (de) * 1980-02-05 1981-08-12 Roche Diagnostics GmbH Verwendung von Aminoantipyrin-Verbindungen und neue Aminoantipyrinderivative

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Musil V.等.New dericatives of 1,2-diphenyl-3,5-dioxopyrazolidine.《Collection of Czechoslovak Chemical Communications》.1964,第29卷1669-1674. *
Tamaoku K.等.New water-soluble htdrogen donors for the enzymatic photometric determination of hydrogen peroxide. II. N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl) aniline derivatives.《Chem. Pharm. Bull.》.1982,第30卷(第7期),2492-2497. *

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