JPS61112092A - 新規グルコサミン誘導体及びこれを基質として用いるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ−ゼの活性測定試薬 - Google Patents

新規グルコサミン誘導体及びこれを基質として用いるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ−ゼの活性測定試薬

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JPS61112092A
JPS61112092A JP59233327A JP23332784A JPS61112092A JP S61112092 A JPS61112092 A JP S61112092A JP 59233327 A JP59233327 A JP 59233327A JP 23332784 A JP23332784 A JP 23332784A JP S61112092 A JPS61112092 A JP S61112092A
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牧瀬　淳子
Kazuo Ichikawa
市川　一雄
Kenji Yoshida
健治 吉田
Tadao Watanabe
渡辺　宰男
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    • C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分腎 本発明は各種腎疾患の指標となる、Ｎ−７セチルーβ−
〇−グルフサミニグーゼ（以下ＮＡ（ｉアーゼと略す。
）活性測定用基質およびそれを用いた試薬に関する。
堕木０扶轍 ＮＡＧアーゼの活性測定用基質としてはｐ−二）ロフェ
ニル　Ｎ−７セチルーβ−Ｄ−クルコサミニド［口１ｏ
ｃｌ＋ｃｑｓｉｃａｌ　　ＰｒｅｐａｒａＬｉｏｎｓ＋
ｌＯ泪Ｓ（＋９６３）］および］４−メチルウンベリフ
ェリルＮ−７セチル−β−Ｄ−グルコサミニド［Ｃｌ１
ｎｉｃａ　ｃｈｉ＋ａｉｃａ　八ｅｔａ、６９（１）、
５５−９１（１９７６）］が広く用いられている。
前者は検体ごとにブランクを測定する必要があり、測定
掻体が煩雑であるなどの欠点を有ｔ。後者は蛍光光度計
Ｃような特殊な機器が必要であるなどの欠点を有してい
る。さらにフランクテストを行なわなくてもよいように
改良した基質として、随一クレゾールスルホ７タリルＮ
−７セチルーβ−Ｄ−グルコサミニドが知られている（
ＩＮ昭５８−９９４）。しかし、これらは反応停止剤試
薬を加え、アルカリ性で発色させて測定するエンドポイ
ント法を用いるため、２試薬法で測定する必要があり時
間もかかるので、自動化するための機種も限定されるな
どの欠点がある。
及肌＠民生籐護吸 本発明者らは、前記した既知の基質の欠点を克服し、高
感度にして精密かつ短時間に多数の検体を測定可能なＮ
ＡＧアーゼ活性測定用基質を発見し、これを用いるＮＡ
Ｇ７−ゼ測定試薬を完成した。
即も、本発明は新規Ｎ−７セチルーβ−Ｄ−グルコサミ
ン誘導体および、これを基質として用いるＮＡＧアーゼ
活性測定試薬に関する。本発明における新規Ｎ−７セチ
ルーβ−グルコサミン誘導体は下記一般式（１）で示さ
れる。
（式中Ｒ１およびＲ７はハロゲンまたはニトロ基を示す
。） 従来のＮ　Ａ　Ｃ，アーゼ測定用基質はいずれら酵素反
応を行なった後に、反応停止液（アルカリ性忍液）を加
え発色させて測定するエンドポイント法でなければ使用
できないが、本発明のＮＡ（、アーゼ測定用基質は反応
停止液を用いることなく、酵素反応進行中の一定特開間
隔のＮ　Ａ　Ｇ７−ゼ活性の吸光度差を測定するレート
法で測定できる。従って、本発明の基質を使った方法は
市販の汎用測定機に適用され、短時間に高精度で多数の
検体を測定することができる。また従来の測定法と同様
エンドポイント法でも測定することができる。
本発明基質の具体例 上記（１）式においてハロゲンとは７０口、クロロ、ブ
ロモおよびヨードを意味するが、クロロまたはブロモが
より好ましい。また置換基の組み合わせは２−クロｏ−
４−二トロが特に好ましい。具体的＋：ｌｉ　２−　ク
ロロ−４−二トロフェニルＮ−７セチルーβ−Ｄ−ゲル
コサミニＹ、４−９０ロー２−二トロフェニルＮ−７セ
チルーβ−Ｄ−７’ルフサミニドがあげられる。
克（記ｌゆ倉皇 本発明化合物（１）は、下記式（Ｉｆ）で示される１−
クロロ−１−デオキシ−２，３，４，６−チトラアセチ
ルーα−Ｄ−グルフサミンと下記式（ｌｉｔ）で示さＫ
るフェノール誘導体（７グリコン）より容易に合成する
ことができる。
（ｎ）　　　　　　　　（Ｉｌｌ） （式中Ｒ１およびＲ２は前記と同意義であり、ＡＣはア
セチル基を示す。） 化合物（■）は公知物質［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　１
＋ｒｅｌ＋ａｒａＬｉｏｎＳ。
埃、＋１８　（１９６３）１であり、アグリコン（１）
は市販品として容易に人手することができる。（Ｉｌｌ
と（１）を反応させ縮合し、一部アセチル基を常法によ
り、脱離することにより、目的化合物が得られる。
微定鳳星 緩衝液（，８３，５〜７．０）に化合物（１）を溶解し
、検体と反応させると、検体中のＮＡＣ，アーゼの作用
により基質（１）が加水分解されアグリコン（Ｉ［ｌ）
を遊離し、直ちに発色するのでレート７ソセイ可能な装
置を用いて定量する。また一定時間反応後、アルカリ液
、阻害剤などを加えて反応を停止させ比色定量すること
もできる。
測定操作 １、レートアッセイ法 市販の汎用測定機を用いて、一定量の基質Ｉ＆（２〜５
−Ｍ、５０μｍ〜１．２５ｍ１）に一定量の検体（尿ま
たは血清、２．５μｍ〜１００μｍ）を加え、３７℃で
一定時間（４，５分〜１５分）反応させ、分光光度計で
４００１１１１１付近の吸光度の差を測定する。
２、用手法 検体用および検体ブランク用に１０−１試験管２本を用
意し、検体用に基質液（２〜５ｍＭ）、検体ブランク用
にブランク試液（ｐＨ３，５〜７．０）を１．ｏｍｌづ
つ入れ、３７°Ｃで５分間加熱する。検体用試験管に検
体（尿または血清）１００μｍを加えて３７°Ｃで１５
分反応させる。反応後、反応停止液を加えて反応を停止
させる。
試薬ブランク用試験管に精製水１００μｍを加え、同様
に反応させた後反応停止液を加える。検体吸光度は基質
ブランクを対照に、検体ブランク吸光度は水を′Ｎ照に
して、遊離する７グリフンの最大吸収波長（４００ｏｍ
）で測定する。
蝮１ 公知のｐ−ニトロフェニルＮ−７セチルーβ−Ｄ−グル
コサミニドを基質としたキラ）　（ＰＮＰ−Ｎ＾ＩＪ）
および−一クレゾールスルホ７タリルＮ−７セチルーβ
−Ｄ−グルコサミニドを基質としたキット（ＭＣＰ−Ｎ
ＡＩＩ、法）は１５〜３０分反応させた後、反応停止液
を加え、反応液を発色させて吸光度を測定する。
一方本発明のレート７ツセイ法では酵素と反応させると
、直ちに発色するので反応途中の任意の二点の吸光度の
差を測定すれはよく、繰作ら簡単で短時間測定が可能と
なる。
Ｕ口ち、従来の４−二トロフェノールを（１飾した基質
と比較し本基質を用いる場合は、遊離する２−クロロ−
４−二トロフェノールのｐＫａが５．５付近に認ぬられ
る。その結果本発明の基質を使用することにより、ＮＡ
Ｇ７−ゼを高感度で測定できる。
実施例１ （１）７セトクロルグルコサミ：ｚ［Ｂｉ６ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏ＋ｕ１０１１８（１９６
３）］　３３．６５ｇ１０ｓ　ｍｏｌ）と２−クロロ−
４−二トロア↓ノール３．４７ｇ（２０端晴０１）を７
セトン８０ｍ　ｌに溶かし、撹拌下にＩＮ　　ＮａＯＨ
２０ｍ１を加え、室温で５時間撹拌し、４°Ｃで一夜放
置する。
反応液を減圧濃縮し、残渣を水洗する。メタノール　　
　　　　　　　　　　　　　　　［から再結して白色針
状結晶の２−クロロ−４−二トロフェニル２，３．４，
６−チトラ７セチルーβ−Ｄ−グルコサミニド２．１ｇ
を得る。輪ｐ、　１９６℃ＩＲ（ＫＢｒ）　　１７６０
．１６７３．７５０　　ｃｉ’（２）上記（＋）で得ら
れた生成物２．１ｇ（３，９＋　ｍｏｌ）を乾燥メタノ
ール５０ｍ１に加え、室温で２８％ナトリウムメトキシ
ド０．４ｍｌを滴下し、−夜装置する。生成した結晶を
濾取し、冷メタノールで洗う。水から再結して白色針状
結晶の２−クロロ−４−二）０フェニルＮ−７セチルー
β−Ｄ−グルコサミニド１゜ＯＲを得る。　１．１６８
℃ ＩＲ（ＫＢｒ）　３２８０．１６５０．１５３ｏ、７５
４　ｃｉｉ’実施例２ （１）実施例１（１）に準じ７セトクロルグルコサミン
３．６５ｇ（１０ｍ諧０１）、４−クロロ−２−二トロ
フェノール（２０ｖａ　Ｉｆｉｏｌ）、７セ）　７ＳＯ
＋ｇｌトｌＮ−Ｎａ０１１２０ｍ１を用い、処理して白
色針状結晶の・ｔ−クロロ−２−二トロフェニル２，３
，４．６−チトラアセチルーβ−Ｄ−グルフサミニド２
．６８を１）る。
ｍｐ、　１７３°ＣＩＲ（ＫＢｒ）　１７４０．１６５
８．７：１０　ｃｈｉ’（２）実施例】（２）に準じ、
上記（１）で１１１られな生成物２．０ｇ（３，９−−
ｏｆ）、乾燥メタノール５０輸１を用い処理して４−７
０ロー２−ニトロフェニルＮ−７４！チル−β−Ｄ−グ
ルグルミニド１．１ｇを得る。

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）下記一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１およびＲ＿２はハロゲンまたはニトロ基
    を示す。）で示されるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
    ミン誘導体。
  2. （２）下記一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１およびＲ＿２はハロゲンまたはニトロ基
    を示す。）で示されるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
    ミン誘導体を含有するＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサ
    ミニダーゼ測定試薬。
JP59233327A 1984-11-07 1984-11-07 新規グルコサミン誘導体及びこれを基質として用いるＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダ−ゼの活性測定試薬 Granted JPS61112092A (ja)

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EP0180961A2 (en) 1986-05-14
EP0180961B1 (en) 1991-05-29
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