JPS60256398A - 試験試料中の白血球、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在を測定するための組成物及び試験具 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （序　論） 本発明は、白血球、エステラーゼ及びプロテアーゼなど
の分析対象物の存在について試験試料を分析するうえに
有用な新規な化合物及び試験具に関する。本発明は、体
液例えば尿中の白血球レベルを検出するうえに特に有用
であシ、そのような分析のための実験室の手順を、顕微
鏡による観察を必要とする面倒な数える手順から、浸し
て読み取るだけの迅速で容易な手順に簡略化する。

患者の尿中に、異常に高いレベルの白血球が存在するこ
とは、腎臓又は尿生殖器路の１感・：染又は他の機能不
全（ｄｙｓｆｕｍｃｔｉｏｎ　）のような病理学的状態
を表わしていることがらシ得る。そのため尿中白血球の
正確な情報は医師にとってこれらの病気を診断し治療す
るための有用な道具となシうる。

従来の医療業者は、尿中の沈澱物又は遠心分離されてい
ない尿中の白血球の個数を数える目視による測定方法に
依存して来ているが、それは遠心　、、（′分離器及び
顕微鏡のような高価な機器並びに臨床医師の側の過度の
時間の消費を必要とする方法である。′また従来の方法
には、完全な細胞（ｉｎｔａｃｔｃｅｌｌｓ　ｌ　Ｌか
測定されないという不都合がある。

原糸に存在する白血球は、流況な細胞溶層に有利となシ
得る条件の下におかれる。例えばｐＨ値の異常に高い尿
の場合には、白血球の半減期は非常に短かく、６０分程
度になり得ることが知られている。分解された細胞は目
視検査技術による検出を逃れるため、誤った低い測定値
又は間違った陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅｓ　）　ｋ得るこ
とがある。

白血球の２つの顕微鏡分析技術−尿沈澱及び非遠心分離
均質化尿−のうち、明らかに前者の方法が最も望ましい
。後者の方法によれば、信頼できる結果は得られるが、
非常に多くの場合に、沈澱法の観察が用いられている。

尿試料は遠心分離し、沈澱物を単離し、顕微鏡検査に付
きなければならない。検査者は、視野内に現われた白血
球の個数を数える。しかしこの作業は、上皮細胞及び塩
粒子のような沈澱物中の他の尿成分の存在によって更に
複雑になる。沈澱成分の量が可変なことと、その他の複
雑化要因例えは試料の不均質及び顕微鏡装置間の光学的
出力の差異などが組み合わされて、最終的な測定値に大
きな誤差を生ずることがある。

多くの時間を要する技術並びに経費のかかる装置を無用
とし、エステラーゼ、プロテアーゼ及び白血球の細胞（
細胞が完全であろうと溶解していようとにかかわらず）
に正確に応答する、簡単ですみやかな白血球測定方法は
、実際、当該技術の現状における大きな進歩となるであ
ろう。本発明はそのような飛躍的進歩をもたらすもので
ある。

更に、本発明は、白血球レベルる〃能力にではなく、白
血球が示す酵素活性（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ａｃｔｉｖ
ｉｔｙ）に基づくため、前述したような不正確さを実質
的に免れている。

（発明の背景） 本発明以前の、加水分解分析対象物を測定する方法は、
色原体のエステルを含んでいたが、これらのエステルは
、エステラーゼ又はプロテアーゼによシ加水分解された
時に、有色アルコール生成物を生成させ、作用を受けな
いエステル（ｉｎｔａｃｔｅｓｔｅｒ　）の色は、遊離
アルコールの色と異なっている。これらの系の多くは、
促進剤化合物と、ジアゾニウム塩カップリング剤とを含
有していた。

色原体エステル 従って、酵素活性によって開裂された時に色その他の検
出可能な物質を形成する成る種のエステルの使用は、従
来から、多数の文献に記載されている。英国特許第１．
１２８，３７１号には、体液中の加水分解酵素の検出に
とって有用なりロモゲン（色原体）として、インドキシ
ルエステル及びチオインドキシルエステルを用いること
が開示されている。酵素はエステルを開裂して遊離イン
ドキシルを生成させ、このものは次に酸化し、容易に観
察可能な青色の染料である二量体生成物のインジゴを生
成する。この活性は他の酵素の中でも特にコリンエステ
ラーゼによる上首われている。前、　！ａ　、＊　ＩＮ
　％　′ｆ−１：・”″１５′″’Ｗ　７　Ｍ−ｊ’　
ｖ“９のほかに酸基が被検出酵素との特別の関連におい
て選択されることも教示している。例えば、エステラー
ゼ又はリパーゼの検出のために酸基がそれぞれ酢酸塩又
はラウリン酸塩もしくはステアリン酸塩であシうること
が記載されている。ホスファターゼ又はスル７アターゼ
のような酵素を検出するためには、アシル基は無機であ
ってもよい。従って＝ｉＪ記英国特許は、エステル分解
酵素を測定するための基質として、色原体エステルの使
用を教示しておシ、これらのエステルは、エステルのア
ルコール部分として、インドキシル又はチオインドキシ
ル？含み、アシル部分は、測足するべき特定の酵素に適
合はせられる。

アシル基がＮ−保護されたアミノ酸又はペプチドから成
るエステルに対するエステラーゼ特異性を実証している
下記の２つの文献はど、アシル基の注意深い選択の効果
がより明瞭に例示芒れている文献はない。即ち、ヤノフ
（Ｊａｎｏｆｆ　Ｈｌかのｒ　Ｐｒｏｃ、　Ｓａｃ、　
Ｅｘｐｅｒ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、　Ｊ　１３６　：
　１０４５〜１０４９（１９７１１は、アラニンエステ
ルが人の白血球から得られたエステラーゼの特異的基質
であることを教示している。この文献は特に人の白血球
顆粒の抽出物がＮ−アセチル−Ｌ−アラニル−Ｌ−７ラ
ニルーＬ−アラニンメチルエステルを加水分解しうろこ
とを教示している。更に、該抽出物は、Ｌ−アラニン−
ｐ−ニトロフェノールエステルを同様に加水分解し、黄
色のｐ−ニトロフェノール発色体を生成させる。

また、スィートマン（Ｓｗｅｅｔｍａｎ　）ほかの、ｒ
　Ｊｏｕｒ、Ｈｉｓｔ、　Ｓｏｃ、Ｊ　２２　：　３２
７−３３９は、エステラーゼの存在を示すために１−ナ
フチル−Ｎ−アセチル−ＤＬ−アラニン、１−す７チル
ーＮ−アセチルーＬ−アラニル−Ｌ−アラニル−し−ア
ラニン及び１−ナフチルブチレートを用いることを開示
している。

米国特許第４，２７８，７６３号は、ボーリンゲル１ン
ハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈｅｉｍ　Ｇ
ｍｂＨ）に譲渡されているが、これらの教示を組合せて
白血球のエステラーゼ活性の伝統的な色原体基質の更に
別の例として、アミノ酸又はペプチドのインドキシル又
はチオインドキシルエステルに到達している。更に、ヤ
ノ７　（Ｊａｎｏｆｆ　）及びスィートマン（Ｓｗｅｅ
ｔｍａｎ）の引例と同じく、ポーリンゲルの発明はｘ７
テル分解傾向（ｅｓｔｅｒｏｌｙｔｉｃ　ｐｅｎｃｈａ
ｎｔｓ）におけるグロテアーゼ及びエステラーゼの同等
性を教示している。

促進剤 周知のように、エステル加水分解反応は、非常に多くの
アルコール類を含む多くの核剤の存在によって活性化さ
せることができる。即ち、エステラーゼによるｐ−ニト
ロフェニルアセテート及び酢酸フェニルの加水分解速度
は、メタノール及びブタノールを添加すると２．５〜５
．５倍に増大する（グリーンザイド（Ｇｒｅｅｎｚａｉ
ｄ　）及びイエンクス（Ｊｅｎｃｋｓ　）、［生化学Ｊ
　１０　（７）、１２］０−１２２７　（１９７１）参
照）。更にその効果は、ｎ−アルキル基の長さと共に増
大する（ウィン（Ｗｙｎｎｅ　）及びシャラティン（５
ｈａｌａｔｉｎ）、［ユーロビアンーンヤーナルーオプ
・バイオケミストリ　−　（Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈ
ｅｒｎ、）　Ｊ　、３１　、　５５４−５６０　（１９
７２１参照）。

特に、アルコールのこの活性化効果は、アミン駿エステ
ルについて観察されている。ｐ−ニトロフェニルＮ−ア
セチル−Ｌ−アラニネートの加水分解は、メタノールの
存在によって活性化（加速〕される。７アストレツ（Ｆ
ａｓｔｒｅｚ　）及び７エルシト（Ｆｅｒｓｈｔ　）、
［生化学Ｊ　１２（１１）、２０２５〜２０３４（１９
７３）参照。高分子量アルコールは、ｐ−ニトロフェニ
ル・ｔ−ＢＯＣ−Ｌ−チロシネートの、ニステラー　ゼ
によって誘発される加水分解の速度を増大させる（アッ
シュ（Ａｓｈｅ　）及びチン？　−（Ｚｉｍｍｅｒ　）
、ｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、Ｊ　７５　（１）、１９４〜１９
５　（１９７７）参照。米国特許第４，２９９，９１７
号には、他の既知のエステル加水分解活性化剤、例えば
成る種の金属錯体、ピリリン誘導体及びイミダゾールが
開示されている。

ジアゾニウム塩カップリング剤 成る種のジアゾニウム塩を用いてフェノール及び擬似フ
ェノールと結合させアゾ染料を生成させることも知られ
ている（マーチネット（Ｍａｒｔｉｎｅｔ）及びドルニ
エ（Ｄｏｒｎｉｅｒ　）、ｒ　Ｃｏｍｐｔ、　Ｒｅｎｄ
、Ｊ　。

１７０．５９２　（１９２０）参照）。この技術をエス
テラーゼ分析に使用して、インドキシルエステルをエス
テラーゼによシ加水分解してインドキシルを生成させ、
このものを次にジアゾニウム塩と結合させて対応するア
ゾ染料を生成させる（ホルト（Ｍｏ１ｔ　Ｉ及びヒツク
ス（Ｈｉｃｋｓ　）、ｒ　Ｊ、　Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．Ｊ
２９，３６１〜３６６（１９６６）：ゴッスラウ（Ｇｏ
ｓｓｒａｕ　）　ｒ組織化学Ｊ５７，３２３〜３４２　
（１９７８１：西独国特許公開公報第３１１７　７２１
号（出勤日、１９８０年５月９日）参照）。

要約 本発明に至る技術的発達の背景を要約すると、溶解した
加水分解酵素及び白血球細胞を分析するためのいくつか
の方法が知られている。例えに尿中の白血球の個数を測
定する場合は長い間鏡検法が好ましい方法であった。従
って、医療業者は、尿試料の顕微鏡スライドを作成し、
顕微鏡の視野、１ に入る白血球細胞の数を数えなけれはならなかった。こ
の操作は、多くの時間の消費と、顕微鏡及び遠心分離器
のような高価な装置を必要とする。

化学的及び生化学的技法は、診断における白血球分析用
の顕微鏡の地位を急速におびやがしているが、それは実
験呈においては、以前から利用されている手段である。

化学的試験の根本原理を構成する色原体エステルには、
次のアルコール部分及びエステル部分が含まれる。

インドキシル　酢酸塩 チオインドキシル　酪酸塩 ｐ−ニトロフェニル　ラウリン酸塩 α−ナフトール　ステアリン酸塩 アミノ酸 ペプチド これらのエステルを使用する化学的技法は、種々の加水
分解促進剤並びにジアゾニウム塩カップリング剤によっ
て向上している。促進剤としては、成る棟の金属錯体、
ピリジン誘導体及びイミダゾールと同様に、多くのアル
コールが用いられている。適切なアニオンがイオン結合
または会合されているジアゾニウムカチオンは、これら
の化学的手法のためのカップリング剤として周知で６Ｄ
、エステルの加水分解によって生成したアルコール（フ
ェノールンは、ジアゾニウム塩と結合して、アゾ染料を
生成する。

（発明の概要ン 本発明は試験試料中の白血球、エステラーゼ又はグロテ
アーゼの存在を測定する為の新しい試験組成物及び試験
具を提供する。その組成物は、構造式 （式中、ＡｆｄＮ−ブロックでれたアミノ酸残基又はＮ
−ブロックされたペプチド酸残基であり；Ｘは、０、Ｓ
又はＮＲ’でおシ；Ｒは、アリール又は低級アルキルで
あり；Ｒ８は、水素又は低級アルキルであシ：そしてＲ
′は５水素、低級アルキル又はアリールである） を有するエステルから成る。さらに、この組成物には、
適当な緩衝物質が含まれる。組成物には促進剤（例えば
、炭素原子数１〜１５のアルカノール）及び／又はジア
ゾニウム塩カップリング剤も含まれていてもよい。

試験具は、エステル及び緩衝液を含有せしめた担体マト
リックスを有し、さらに促進剤及び／又はカップリング
剤を含んでいてもよい。

前記組成物又は試験具を使用する方法は、白血球細胞、
エステラーゼ又はグロテアーゼを含有すると考えられる
試験試料を組成物又は試験具と接触させ、検知可能な応
答を観察することから成る。

（定　義） 本明細書に用いられているいくつかの用語の意味につい
て以下に解説する。即ち、以下の定義は、本発明の範囲
を明らかにし、その製造及び使用を可能にするためにな
される。

ゞ）　「Ｎ−ブロックされたアミノ酸残基」又はｒＮ　
−ブロックされたペプチド残基」という表現については
、２つの点から定義する必要がある。ｒＮ−ブロックさ
れたｊとは、窒素原子に結合きれた水素が、保護基、例
えばアセチル、ｐｉミルエンスルホニルトシル（ｔｏｓ
ｙｌ　）　）及び第３ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂ
ＯＣ）及び他の当該技術において周知のＮ−保護基によ
ジ置換される、アミノ酸又はペプチドのアミン基の化学
に関する。

「アミノ酸残基Ｊ及び「ペプチド残基」という表現は、
そのカルボキシル基の一〇Ｈのないアミノ酸又はペプチ
ド分子を意味する。

「アリールＪという表現は、芳香族性を有する全ての環
系を意味する。この用語には、５員及び６員の環、例え
ばピロール、フェニル、ピリジル差びに縮合環系例えば
す７チルも含まれる。従って、芳香環系は、ペテロ環式
でも、ホモ環式でもよく、また白血球細胞、エステラー
ゼ又はグロテアーゼの存在下加水分解する組成物の能力
を置換基が妨害しない限シにおいて ゛　、置換基を有してい てもよく、また有していなくてもよい。これらの置換基
の選択は、本明細書の開示があれば日常の実験室の決定
事項となる。

本明細書中で使用されている「低級アルキル」という表
現は、炭素原子数約１〜６のアルキル基である。低級ア
ルキルの意味にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イン
グロビル、ｎ−ブチル、第２ブチル、第３ブチル並ひに
ペンチル及びヘキシルの全ての異性体が含１れる。これ
らは置換されていなくとも、１だ、白血球細胞、エステ
ラーゼ又はグロテアーゼを検出する組成物の能力が置換
基によって妨害されない限シ、置換さノ′とていてもよ
い。

「適当な緩衝物質」とは、試験試料水溶液と接触させた
時にその結果として少くとも約７のｐＨ値を与える緩衝
液を意味する。約７〜１０、最適には８．９〜９．０の
範囲ＯｐＨ値を生み出しうる緩衝液が好ましい。好適な
緩衝物質の例としては、ホウ酸−Ｎ　ａ　ＯＨｓ　ビシ
ン（Ｂｉｃｉｎｅｌ　［Ｎ　、　Ｎ−ビス（２−ヒドロ
キシエチル）−グリシン、１１、又ｕＣＨＥＳ［２−（
Ｎ−シクロヘキシルアミノ）−エタンスルホン酸〕が挙
けられる。

「促進剤」という表現は、本明細書に記述される色原体
エステルの加水分解速度を増大させる働きをする全ての
化合物を意味する。その例としては、ピリジン、イミダ
ゾール及びその誘導体；式Ｄｍ［Ｂ（ＣＮ）ｎ（ＮＯ）
ｐ〕（式中、Ｄはアルカリ金属であシ、Ｂは重金属イオ
ンであり、Ｐけ０又は１であり、ｍは２〜５であシ、ｎ
は４〜８であり、ｍはｎとＢの原子価との和、である）
によって示される金属錯体；並びにアルコールなどのよ
うな、化学的に多様な物質がある。適切なアルコールは
、１〜約１５個の炭素原子を有する。直鎖状のアルコー
ルのほうが分枝＠を有するアルコールよりも好ましいが
、後者も本発明の範囲に含まれる。

「縮合環系」とは、１対の炭素原子を共有する２個以上
の芳香環を意味する。例えば構造式において、両方のＧ
は、−緒になって、縮合壌Ｎ： ５０３ （式中、両方のＧは一緒に＋ＣＨ＋−ｅ形成する）を形
成してもよい。さらに別の例は、式 （式中、両方のＧが一緒になって＋ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝
Ｎ＋を形成する）によって表わされる、従って縮合環系
は多核系、芳香族系であシ、ヘテロ環式系又はホモ環式
系であシうる。

「検出可能な応答」という表現は、本明細書中において
は直接の観察によシ又は測定器機を用いて感知可能であ
シ、検査試料水溶液中の特足の分析対象物の存在の関数
である、試験手段系中のパラメーターの発生又はその変
化を意味する。検出可能な応答の中のあるものは、色、
蛍光、反射率、ｐＨ１化学ルミネセンス及び赤外線スペ
クトルの変化又は出現である。

（組成物） 本発明の組成物は、エステ！・と、緩衝液と・を含む。

これらの成分は、広範囲に選択されへが、最大の結果、
即ち、短時間に発生する高度の検出可能な応答をそれぞ
れが生み出す好ましい実施態様が存在する。この最適化
は、組成物中に促進剤及び／又はジアゾニウム塩を含め
ることによって更に促進される。

エステル 本発明による組成物と試験具は、共に、式（１）のエス
テル及び好適な緩衝剤とを含む。好ましいエステルは、
ＸがＮＲ’であシ、好ましい置換基Ｒ′がＨであるエス
テルである。別の好ましい実施態様は、アシル部分Ａが
Ｎ−ブロックされたアミノ酸残基特にＮ−ブロックされ
たし一アラニネートである実施態様である。特に、エス
テルとして、式 （式中、Ｔｓｉｉ：ｐ−）ルエンスルホニルで、！ｐる
）によって表わされる化合物、即ち、式（Ｉ）において
ＡがＮ−Ｔｓ−Ｌ−アラニネートであシ、Ｒか水素であ
シ、Ｒがフェニルであシ、ＸがＮ）ｌである化合物を、
用いることが好ましい。

緩衝液 緩衝物質には、前述したように、多くの化合物が含まれ
る。緩衝液によって生み出されるべき好ましいｐＩＩ（
値範囲は、約７〜１０であシ、８．５〜９．０が最適な
ｐＨ値範囲である。この最適ｐＨ値範囲を実現するには
、ホウ酸−ＮａＯＲ、ビシン（Ｂｉｃｉｎｅ）ＣＮ、Ｎ
−ビス（２−ヒドロキシエチルＩグリシン〕又はＣＨＥ
ＳＩ：　２−　（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンス
ルホン酸〕を緩衝液として用いることが現在は好ましい
。

促進剤 本発明による組成物は、エステル及び緩衝液のほかに、
種々の促進剤、例えば前記促進剤の定義の項で定義した
ような種々の促進剤を有していてもよい。アルコールは
、エステラーゼ及びグロテアーゼによって触媒される本
明細書中に論じられたエステルの加水分解を促進するう
えで特に有用であることが見出された。この目的のため
に好ましいのは、８〜１５個の炭素原子を有するアルコ
ールであシ、デカノール、ウンデカノール及びドデカノ
ールは、主として低分子量のアルコールに比べて低揮発
性であるという理由で、試験具に使用することが好まし
い。

ジアゾニウム塩 組成物にカップリング剤としてジアゾニウム塩が含まれ
てい−Ｃもよい。反応図式全体におけるジアゾニウム塩
の関与は次のように表わすことができる。

（式中、ＡｒＮ　＝Ｎは上記ジアゾニウム塩であシ、Ａ
、Ｒ，Ｒ，Ｘは、前に定義したとお９である。）反応生
成物■は、濃い、はつきシした色を示しうるアゾ染料で
ある。

塩ＡｒＮ＋＝Ｎは、いろいろの意味を取ることができる
。一般的には、この塩は芳香族ジアゾニウム塩であシ、
−殻構造として次の式 （式中、Ｒ“は同一でも、異なっていてもよいが、水素
、低級アルキルもしくはアリール表わすか、又は、２つ
の隣接したＲ“が、−緒〈縮合環系を形成するが、その
場合に、−万〇Ｒ“は、−Ｎ　ミＮ。

即ちジアゾニウムを表わし；ＹはＮ又はＣＲ“を表わし
；Ｄ−はアニオン例えば塩化物、臭化物又はジアゾニウ
ム部分に対する他の適当な対イオンを表わす） を有する。

自Ｒ（５ｅｌｆ　−ｃｏｎｔａｉｎｅｄ　）ジアゾニウ
ム塩即ち双性イオンは、すぐれたカップリング剤として
用いられる。そのような化合物は、式 （式中、Ｂは水素、低級アルキル又はＯＨを表わし；Ｄ
−は共有的に結合した（　ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ　ｂｏ
ｕｎｄ）アニオンを表わし：Ｇは同一でも、異なってい
てもよく、水素、低級アルキルもしくはアリールを表わ
し、或いはまた、両方のＧは一緒に縮合環系を形成する
） を有する。

このように、双性イオンは、ジアゾニウム基に対する対
イオンが環系に共有的に結合した（ｃｏｙａ−１ｅｎｔ
ｌｙ　ｂｏｕｎｄ）ジアゾニウム塩の種である。そのよ
うなアニオンの′例としては、スルホニル（ＳＯ３−）
、カルボニル（ＣＯ２−）、ホスホニル（ＰＯ３−）そ
の他がある。１−ジアゾ−２−ナフトール−４−スルホ
ネートを用いると最も有利なことがわかっている。

（試験具） 上記の組成物は、白血球、エステラーゼ又はグロテアー
ゼを測定するために、単独で使用しても、担体マトリッ
クスに含有せしめて試験具を形成することにより、分析
対象物の存在の迅速で高信頼性の推定を行なうための道
具を形成してもよい。

担体マトリックスは、必ずではないが通常は、多孔性物
質、例えばｐ紙である。当該技術において認識されたそ
の他の担体マ）　ＩＪラックス料の形式は、フェルト、
多孔性セラミック材片、製織又はマット化ガラス繊維で
ある（米国特許第：３．８４６，２４７号参照）。木、
布、スポンジ材料及び粘土質材料を用いることも示唆さ
れている（米国特許第３．５５２，９２８号参照）。ま
た、担体マトリックスは、無孔材例えば種々のポリマー
フィルム、ガラスその他から成るものとしてもよい。こ
れらの全ての担体マ）　ＩＪラックス料は、他の材料と
同様に、本発明に従って使用するのに適している。Ｆ紙
は特に好適な材料であることがわかっている。

試験具を製造する好ましい方法においては戸紙片を、緩
衝材の水溶液を用いて湿潤させる。この第１浸漬溶液は
、種々の処理付膨剤例えば洗浄剤、ノシ剤例えばポリビ
ニルピロリドン、及び他の不活性成分を含有してもよい
。

含浸させたＦ紙を次に乾燥させ、エステル並びに必要な
らば促進剤及び／又はジアゾニウム塩を含有したアセト
ン又は他の非水性溶剤中の第２浸漬液に湿潤させる。２
回含浸させた濾紙を次に２度目に再乾燥し、このように
して白血球又は他の分析対象物の存在を感知する試験具
を形成する。

乾燥した試薬含有担体マ）　ＩＪラックス、必要ならば
裏当て材に取付けてもよい。試験具の好ましい実施態様
においては濾紙担体マトリックスに、上述の組成物全含
有きせ、そのマトリックスを延伸した透明なポリスチレ
ンフィルム片の一方の側−に固定するマトリックスは、
両面接着テープ（スリーエム社（３Ｍ　Ｃｏｍｐａｎ）
’　）よシ得られる［ダブルスチック（Ｄｏｕｂｌｅ　
５ｔｉｃｋ）　ｊ　）のような適宜の手段によってフィ
ルムに固定され、ポリスチレンフィルムの他端は柄とし
て用いられる。この装置は、使用時に、ポリスチレンフ
ィルム裏当て材の自由端によって保持され、マ）　ＩＪ
ツクス端は、試験試料（例えば尿）中に浸漬され、速や
かに取シ出される。色形成又は他の検知可能な応答はい
かなるものであれ、所定時間後に観察され、白血球又は
エステラーゼ又はグロテアーゼ活性を有する他の分析対
象物の既知濃度に対する応答に対応する比較基準と比較
される。試薬含有ν紙中に発色を生ずるためには、通常
は約１〜３分の温置時間で足シることか見出湯れた。

冷　（実　験） 以下の実施例は、本発明の製造及び使用において読者を
さらに助けるために記載されている。従って、好ましい
実施態様を実験の許細を示して記述し、その結果につい
て分析がなされる。これらの実施例は、単に説明の為で
あり決してここに記述され請求される本発明の範囲を制
限する意図のものではない。

概括的資料 以下の実施例の記載に使用でれる略記号の意味は次の通
シである。

ｆ＝ダラム 陽＝キログラム Ｌ＝リットル ｍＬ＝ミリリットル Ｍ＝モル濃度 ｍＭ−ミリモル濃度 Ｎ＝規定度 ｅｑ−当量 ｍｏｂ　＝グラム分子（モル） 一８１＝　（グラム分子）　Ｘ　１Ｏ−３（ミ１ノモヤ
）″ａｑ−水性（水溶液の） ｈｒ＝時間 ＴＬＣ＝薄層クラマドグラフィー 赤外線（ＩＲＪスペクトルは、特に他の記載がない限Ｃ
ＣＨＣｔ３中溶液として、パーキンーエルマ（Ｐｅｒｋ
ｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　）　−７１０Ｂ又は２３７型赤外線
分光光度計によって得た。ポリスチレンフィルムの１６
０２ａｎ−１帯を外部較正規準として用いた。

信号はｃｒｎ−１として記録した。

ＪＥＯＬ　ＦＸ−９００分光計を用いて８９．５５ＭＨ
ｚで、又はバリアｎＶａｒｉａｎ）　Ｔ　−６０分光計
を用いて６０　ＭＨｚで、陽子磁気共鳴（”、ＨＮＭ、
Ｒ）スペクトルを得た。他の記載がない限り、Ｃ，ＤＣ
Ａａ溶液中においてスペクトルを得た。化学的シフトは
、内部標準テトラメチルシランから低磁場方向への百万
分率（ｐｐｍ　ｌで報告きれている。

炭素−１３磁気共鳴ＣＣＮＭＲ〕スペクトルは、フーリ
エ変換及び全陽子広帯域ノイズデカップリングに↓９、
ＪＥＯＬ　Ｆ’Ｘ９０Ｑ分元計を用いて、２２．５　Ｍ
Ｈｚにおいて得た。スペクトルは、他の記載がない限り
、ｅＤｃｔｓ溶液中において得た。炭素シフトは、内部
標準テトラメチルシランから低磁場方向への百万分率で
報告されている。

電子インパクト（ＥＩ）又は高速原子衝撃（ＦＡＢ）モ
ードにおいて作動するヒューレットーノくツカード（Ｈ
ｅｗｌｅｔｔ　−Ｐａｃｋａｒｄｌ　５９８５　Ａ分光
計を用いて、質量スペクトルを得た。ＡＥＩ　ＭＳ−９
Ｏ２型分光計によって高分解能質量スペクトルを得た。

有機試薬は、オールドリツヒ・ケミカル・カンバ＝　−
（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃａｐｐａｎｙ
　）から入手し、特に他の記載がない限り、精製せずに
使用した。

無機試薬は、フィッシャー・サイエンティフィック會カ
ンバ＝　−（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃ
ｏｍｐａｎｙ　）又は他の大手販売業者からのＡＣ３試
薬用であった。反応溶剤は、ＡＣＳ試薬用、テトラヒド
ロフラン（ＴＨＦ）は、シエイ・ティー中ベイカー・ケ
ミカル・カンパニー　（Ｊ、　Ｔ、　Ｂａｋｅｒ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ　）からのＨＰＬＣ用であ
った。プライン（ｂｒｉｎｅ　）は、塩化す）　ＩＪウ
ムの飽和水溶液を指す。

薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）Ｆｉ、Ｅ、メルク社
（Ｅ−Ｍｅｒｃｋ　）からのシリカゲル６０Ｆ−２５４
プレートを用いて行なった。カラムクロマトグラフィー
は、Ｅ、メルク社（’Ｅ０Ｍｅｒｃｋ）のシリカゲル６
０（７０−２３０メツシユ）を用いて行なった。

ここに報告される融点及び沸点は全て無修正値である、 エステルの製造 次の実験は、本発明のエステルの合成を説明するために
なされた。これらの実験は、特定の出発材料及び最終生
成物に関連しているが、製造手順は本明細書中に開示さ
れた一群のエステル類の中に含まれる広範囲の物質に適
用することができると信じられる。

３−（Ｎ−トシル−し−アラニニルオキシ）−５−フェ
ニルビロール（４〕の合成 （４）の合成を次の反応連鎖によって示ず：：） Ｎ−）シルーＬ−アラニン Ｌ−アラニン（１００ｆ　；　１．１１　ｍｏｔ　）　
ｅ、ＩＮ水酸化ナトリウム（ａｑ）２．２５　ＬＫ溶解
し、５℃に冷却し、撹拌しながらトルエン４５０　ｍＬ
中中温溶解たｐ−トルエンスルホニルクロリド（２１８
り：　１−１１　ｍｏｔ）溶液を徐々に添加した。

混合物を周囲温度で２０時間撹拌した。各層を分離し、
冷却した水性層を濃塩酸でｐＨ１に酸性化した。白色一
固体の表題化合物ｋＦ取し、水で洗浄し、乾燥させた。

収率１７８．５　Ｆ　（６６％）、融点１３４〜１３５
℃であった。Ｉ　Ｒ（ＣｋｌＣＬ３）ｃｍ　”１７２６
．１３４０，１１６５，１０９５．ＨＮＭＲ（ＤＭＳ　
ＯＤａ　）δ１．２０　（ｄ　、　Ｊ＝７　、３Ｈ１゜
２．４０　（ｓ　、　３ＨＪ　、　３．８５　（ｐ　、
　Ｊ＝８．ＩＨ）。

６．４　（ｂｒｓ、ＩＨＩ　（Ｃ’０２Ｈ）　、　７．
４１　（ｄ　。

１ＪＡＢ＋＝８．２ＨＪ、及び７．７５　（ｄ　、　Ｉ
ＪＡＢＩ＝８，２Ｈ）　（パターン中心、７．５８　；
ΔＶＡＢ＝２０．４９Ｈｚ）、　８．０３　（ｂｒｄ　
、Ｊ＝８．ＩＨ）（ＮＨＩ。

Ｎ−トシル−Ｌ−７ラニニルクＤ　ＩＪ　）’方法Ａ Ｎ−トシル−Ｌ−アラニン（１２，４ｆ　：　０．０５
ｍｏｂ）と塩化チオニル（２５ｍＬ）との混合物を９０
分間５５℃に加熱し、次に回転式蒸発器によって４０℃
で濃縮した。赤色の固体残留物を沸騰ＣＣｌ４２００　
ｍＬに溶解し、オープン乾燥Ｆノリット（Ｎｏｒｉｔ　
）　Ｊ　２１１　（アメリカンＯノリット社（Ａｒｎｅ
ｒｉｃａｎ　Ｎｏｒｉｔ　Ｃｏ、　、　Ｉｎｃ−）製）
２０ｖによって脱色し、沖過し、冷却した。クリーム色
の固形の表題化合物ｅＦ取し、ヘキサンで洗浄し、乾燥
させた。収率８．４８　Ｆ　（６５％）、融点１０１〜
］、　０１．５℃、Ｉｎ（ＣＨＣＬｓ）　ｃｍ　”　３
３６０　。

３２６０．３０２５，１７７５，１６０５゜１３５０．
１１’７０．９１０　、ＨＮＭＲ（ＣＤＣ４３１δ１．
４８（ｄ、Ｊ＝７，３）（）、２．４３（ｓ。

３Ｈ）、４．３３　（ｐ、Ｊ＝８　、ＩＨ）、５．９３
（ｂｒ　ｄ　、Ｊ＝８．１Ｂ、Ｉ　（ＮＨ）、７．３１
（ｄ。

ＩＪＡＢＩ＝８．２Ｈ）及び７．７６　（ｄ　、　ＩＪ
ＡＢ　＋−＝８．２Ｈｌパターン中心、７．５３　；Δ
ＶＡＢ＝　２６．８３　Ｈｚ）。

元素分析値（Ｃ＋ｎＨ−＋２ＣＩＮＯ３Ｓとして）：計
算値：　Ｃ，４５，８９；Ｈ，４，６２；Ｎ、５．３５
実測値：　Ｃ，４６，６３；Ｈ，４，９０；Ｎ、５．１
９方法Ｂ Ｎ−トシル−し−アラニン（３，１２；１３ｍｍｏｌ　
）と塩化チオニル（６ｍＬ）との混合物を、９０分間５
０℃で加熱し、乾燥ヘキサン５０ｍＬを用いて希釈した
。混合物を素早く撹拌し、冷却し、固形物を波数した。

収率３．１５　？　（９３％）、融点９９〜１００℃ｏ
ＩＲスペクトルは、方法Ａによシ製造した再結晶物のも
のと同一であった。

２−ヒドロキシ−３（カルボキシメチルアミン）−ヒド
ロ桂皮酸二カリウム塩工水化物（１）アセトン４．５Ｌ
中のトランス桂皮酸１．０ｋｐ６．７５　ｍｏｔｌの撹
拌スラリーを最初にＮａＨＣＯ３（２，４７に４；　２
９．４ｍｏｔ；　４．３６　ｅｑ）で、次に水（４，５
Ｌ　）で注意深く処理した。得られた濃厚な混合物を０
．４　ｍＭ水性エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡン二
ナトジナトリウム　４．５　Ｌ　；　ＥＤＴＡニナ１（
トリウム２水化物２．１７２を蒸留水１４．５　Ｌに溶
解させて製造した）中の０ＸＯＮＥ　（オキシン）モノ
過硫酸塩化合物（３，７８ｋｐ　；　ＫＩＨ８Ｏｓ　１
．８２５ｅｑを含有する）溶液によって滴下状に１．５
〜２，０時間かけて処理した。この添加の間、水浴を用
いて、反応温度を２４〜２７℃に保った。反応時のｐＨ
は約７．４であった。反応終了後に混合物を更に０．５
時間撹拌した後、約１０℃に冷却した。反応混合物を濃
塩酸（〜］、２Ｌ）を用いてｐＨ＝２の酸性とし、この
間温度を約１０℃に保った。次に反応混合物をＣＨ４Ｃ
ｌ２　（５−０５Ｌ　）で処理し、１０分間激しく撹拌
した。

混合物を沈降させた後、溶”ｉ層を傾瀉させて除去し、
不溶性塩を含有する有機層を紙によって吸引濾過した。

波数した固形物をＣＨ２Ｃ４冨（１，９Ｌｌを用いて洗
浄し、この涙液を用いて水性層を抽出した。波数した固
形物をＣＨ２Ｃ４冨　（３，１５Ｌ　）で再び洗浄し、
この涙液を用いて水溶液を抽出した。

１つにしたＣ　Ｈ２Ｃ１２層を、水（６，３１Ｌ　）中
のＫＯＨ（５９３，３Ｆ）の溶液を用いて抽出した（塩
基による抽出の間に分離しうる固形物を溶解　□するた
めには、約４０℃までの緩徐な加熱が屡々必賛である）
。次に水（１，Ｓ　Ｌ　Ｊ中のＫ　ＯＨ（９９７）溶液
を用いてＣＨ２ＣＬ　２層を抽出し、１つにした塩基抽
出液をグリシン（４８１，７ｆ　；　６．４１６ｍａｔ
　；　０．９５　ｅｑ　’）によって処理した。有機層
は廃棄した。

２５％ＫＯＨ水溶液によって上記水溶液のｐＨ全１１．
５に調節した後、加熱沸騰させた。低沸点液体（アセト
ン−水）約９００ｍＬを、蒸気温度が９９℃になるまで
留去させた後、混合物を２時間還流させた。冷却後に反
応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（３，１５Ｌ　）で抽出し、Ｃ
Ｈ２Ｃｔ２相は廃棄し、水相は減圧下に７０°Ｃ浴を用
いて蒸発乾個させた。

残留物を９５％エタノール（Ｅｔ　ＯＨ）（８，８３Ｌ
　ｌ中において３０分間沸騰させ、撹拌下に徐冷した後
、微細な結晶として生成物を分離した。これらの結晶を
沖過し、新しい９５％エタノール（１，２６Ｌ）で洗浄
し、５００〜６０℃オーブン中で乾燥させ、融点１２０
〜１２２°Ｃ（無修正）の白色結晶として表題化合物（
１，，７７ｋｒ　；　７４．６％）を得た。

Ｉ　Ｒ（ＫＢｒ）ｃｒｎ３４２０　（ｂｒ、）　、　１
．５９０（ｂｒ、ｌ。

１４１０．１１３０．７１０　：　ＨＮＭＲ（ＤａＯ−
ＴＳＰ）δ３．１　（ｓ、２Ｈ）、３．８９（ｄ、ＩＪ
ＡＢＩ　＝４　．１　Ｈ）及び４．５２　（ｄ　、　ｌ
　ＪＡＥ　ｌ　＝　４　、　］、　Ｈ：（パターン中心
：　４．２１　；　ΔＶＡＢ＝　１　８．８３Ｈｚ　）
　、４．．６８　（ａ　。

６Ｈ，交換可能な陽子　、　７．４　（ｓ　、５Ｈ）；
ＴＬＣＲｆ　＝０．５９　（ＥｔＯＨ：　１Ｍ重炭酸ト
リエチルアンモニウム、７：３）。

元素分析値（Ｃ＋　ｌＨ＋　５　Ｎｏｔ　Ｋ！として）
：計算仙：　Ｃ，３７，５９；Ｈ，４，３０；Ｎ、３．
９９実測値：　Ｃ，３７，２２：Ｈ，４，２４；Ｎ、３
．９６Ｎ−アセチル−３−アセトキシ−５−フェニルピ
ロール（２） ピリジン（３，□ＯＬＪ中の２−ヒドロキシ−３−（カ
ルボキシメチルアミン）−とドロ桂皮２ニカリウム塩２
水化物（１）　（１，Ｏｋｖ　；　２．８４　モ＃　）
の懸濁液を不活性ガス雰囲気下周囲温度で無水酢酸（４
，ＯＬ　＋により処理した。次に緩徐な発熱反応を行な
わせ、反応温度は、１．５〜２．５時ｍ］のｍ１６０〜
７０℃まで指数関数的に増大した。反応混合物が冷却し
始めた時に、１５分間、１２０〜１２３℃まで加熱し、
次に１時ｍ」かけて室温まで冷却させた。この間１に酢
酸ピリジニウムが結晶として分離した。混合物を紙によ
り吸引濾過し、無色となるまで酢酸エチル（ＥｔＯＡｅ
）によって塩を洗浄した。Ｆ液は真空下で蒸発乾個させ
た。

暗赤色の残留物を酢酸エチル（３，０Ｌ　）に溶解し、
水で３回（各回１．ＯＬずつ）洗浄し、Ｍｇ５Ｏｔ上で
乾燥濱せ、ダルコ（Ｄａｒｃｏ　）　−Ｇ６０　（ＩＣ
Ｉアメリカズ社（ＩＣＩ　Ａｍｅｒｉｃａｓ、　Ｉｎｃ
、）製）（３００ｇ？）で処理した。３０分間撹拌した
後、［セライト（Ｃｅ１ｉｔｅ　）　Ｊ　（ジョンズー
マンビル社（Ｊｏｈｎｓ　−Ｍａｎｎｖｉｌｌｅ　）製
）によシ混合物を濾過し、真空下に蒸発乾個させ、赤橙
色の油状物を得た。

この油状物を温２−グロパノール（１，２Ｌ　）に溶解
させ、−晩かけて周囲温度まで徐冷して、固形物を分離
した。結晶状生成物を濾過し、５０％水性２−プロパツ
ールで洗浄し、真空下で乾燥させ、−）　融点−５８〜
６０℃（無修正）の表題化合物を得た。一部＋ジエチル
エーテル°（ＥｔｚＯ）に吸収させ、フリット（Ｎｏｒ
ｉｔ　）　２１１で処理し、濾過し、減圧下で濃縮した
。０℃に放置し、無色の小さな針状の結晶が析出した。

これらの結晶を濾過し、ＥｔｚＯ：ヘキサン（１：１）
で洗浄し、真空中において乾燥させ、融点６０〜６２．
”Ｃ（無修正）の分析試料を得た。

ＩＲ（ＣＨＣＬ３）錆　３０２０，１７６０，１７３０
゜１５９５．１３７８，１３２０．１２２０（ｂｒ、）
、１０３０゜９６０．９０３．ＨＮＭＲ（ＣＤＣｔｓ）
δ２．２３　（８，３Ｈ）　。

２．２７（ｓ、３Ｈ）、６．１８（ｄ、Ｊ＝２”、ＩＨ
）、７．３５（ｓ、５Ｈ）、７．４２（ｄ、’Ｊ＝２．
］、Ｈ）：ＴＬＣＲｆ＝０．５６（）ルエン：ジオキサ
ンー、４：１）。

元素分析値（Ｃ１４Ｈ＋５ＮＯｓとして）：計算値：　
Ｃ’、６９．１２；Ｈ，５，３８：Ｎ、５．７６実測値
：　Ｃ，６８，８８；Ｈ，５，２５；Ｎ、５．５３３〜
ヒドロキシ−５−フェニルピロール（３）微細に分割し
たＮ−アセチル−３−アセトキシ−５−７ｘ＝ルビＣＩ
−ル（２）（７）少＊　（３６，８ｆ　：０．１５モル
）を、１０分間アルゴンガス流中において撹拌すること
によシ、脱酸素し、次に脱酸素メタノール（ＭｅＯＨＪ
　（３７９ｍＬｌ中に懸濁させ、不活性ガス雰囲気”）
’　（−１５℃メタノール（ＭｅＯＨ）ン乾燥氷浴中で
）−６℃に冷却し、２ＮのＮａ０Ｈ（３００ｍＬ）の水
冷脱２ｇ溶液によってすみやかに処理した。゛反応温度
は、塩基の添加によって直ちに１８℃に上昇し、反応混
合物は３分後に均質になった１、反応混合物が冷却する
につれて化合物３が微細結晶として分離した。１５分後
に、脱酸素面２Ｍ＜えん酸（１５０ｍＬ）溶液を饋加し
、得られた混合物を１０分間撹拌し、濾過した。生成物
の空気曝露を最小にするように注意しつつ固形物を脱酸
素水（２００ｒｎＬ）で十分に洗浄し、−晩真空下で乾
燥させ、薄いピンク色の微細な針状の結晶として表題化
合物（２２，３？　；　９３．６％）を得た。

ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｌｎ　３４００，３］１０，２９００
，１６００゜１５８０．１５５５．１４８０，１２６８
，１１８０，７４２゜６４０：”ＨＮＭＲ（ＤＭＳ（Ｊ
−Ｄ６）δ６．１（ｍ、ＩＨ）。

６．３　（ｍ、　ＩＨ，）　、　７．０−７．７　（ｍ
、　５ＨＪ　、　８．０　（ｓ　、ＩＨ）。

１０．４　（ｂｒ　ｓ　、　ＩＨＩ　；ＴＬＣＲｆ＝０
．２０−０．２８　（ＥｔＯＨ：ＣＨＣ４ｓ　、　１　
：９）　− 元素分析値（Ｃ１ｏＨｅＮＯとして）：計算値：　Ｃ，
７５，４５；Ｈ，５，７０：Ｎ、　８．８０実測値：　
Ｃ，７５，３０；）１，５．６９；Ｎ、８．６７３−（
Ｎ−トシル−し−アラニニルオキシ）−５−フェニルビ
ロール（４） 不活性ガス雰囲気下０℃に保った、無水テトラヒドロフ
ラン（ＴＨＦ、４５０ｍＬ）、ピリジ７　（４３，８ｍ
Ｌ　；　０．５４２ｍｏｔ；　１．２　ｅｑ　）及びト
リフ　／ｌ／　７１−　ｏ酢酸（８５，０ｍＬ；］、、
１０ｍｏｔ：２．４ｅｑ）の溶液を、一度に、３−ヒ）
’ロキシー５−フェニルビロール（３）（７１，５ｒ　
；　０．４５モル：１．０ｅｑ）で処理し、その山稜に
、新しく製造したＮ−トシル−Ｌ−アラニニルクロリド
（１４１，０ｒ　；　０．５４　ｍｏｔ　；　１．２ｅ
ｑ）の無水ＴＨＦ（４５０ｍＬ）溶液を、５〜１０分か
けて一滴ずつ加えた。得られた混合物を１５分間Ｏ℃で
撹拌した。次に１．０Ｍ水性くえん酸溶液（３１５ｍＬ
ｌとＥｔＯＡＣ（１，３５Ｌ　）とを添加して反応混合
物を急冷した。簡単に混合させた後、各相を分離し、有
機相は、ＮａＣ１水溶液（３６０ｍＬ；水１．ｍＬ当り
Ｎ５Ｃ４Ｏ，１８Ｖ　）で洗浄した。次に有機相を２回
５％ＮａＨＣＯ３水溶液（各々１．３５　Ｌ　）で抽出
し、次にＮａＣ１水溶液の別の少量（３６０ｍＬ；水１
ｍＬ当１）　ＮａＣ４０，１８２）で洗浄した。゛赤褐
色の有機層をＭ、ｇＳＯ４（１０１２）及び「ダに’：
１　（Ｄａｒｃｏ　）　Ｊ−Ｇ６０　（１４３ｔ）と共
に１５分間周囲温度で撹拌した後、［セライト（Ｃｅｌ
ｉｔｅ　）　Ｊによって濾過し、３７℃の浴から真空′
下に蒸発乾個させ、化合物（４）　′ｆ：、ピンク色が
かった白色の固形物として得た。粗生成物を磨砕して粉
末状とし、＠（５０℃）Ｔ、）Ｊ、Ｆ（２５０ｍＬ　）
中に溶鮮させ、強く撹拌し、ｎ−ヘキサノ（２５０ｍＬ
）で希釈した。撹拌は周囲温度で１時間継続し、この間
に生成物が晶出した。固形物を濾過し、Ｆ液が無色とな
るまでトルエン（約ＩＬ）で洗浄し、真空下−晩乾燥さ
せ、融点１５４．５〜１５５℃の白色粉末として表題化
合物（１１２、ｒ；６５％）を得た・ ＩＲ（ＫＣｌ）６ｎ　３３５０，３３２５，１７６０，
１５０８゜１３２０　、１１５５　、７７０　、　ＨＮ
ＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ　）δ１．３３（ｄ、Ｊ−７，３Ｈ
）、２．３６（ｓ、３Ｈ）、４．１３（ｐ　、Ｊ＝８　
、ＩＨ）、６．２５　（ｍ、ＩＨ）、６．７３　（ｍ、
ＩＨ）。

７．０５−７．５０　（ｍ、５Ｈ）、７．５−７．８５
　（’ｍ、４Ｈ）。

８．４２（ｄ、Ｊ＝８．ＩＨ）、１１．１８（ｂｒ　ｓ
、ＩＨ）；１３ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ　）　ｐｐｍ　
１８．３３５　、２１．００１　。

５１．３７０．９８．０６１．１０８．３３６．１２３
，４２３．１２６．０２４　。

１２６．６１０．１２８．５６０．１２８，７５６．１
２９．６０１．１３２．３９７゜１３７．６００．１３
８．３８０．１４２．７３７．１６９．９１９　；　Ｃ
α）ｎ＝−７０°（Ｃ＝１．１１９ＭｅＯＨ）；ＴＬｃ
Ｒｆ−０，４５（′ＥｔＯＡｃ−：ヘキサン、１：１１
）　：ＴＬＣＲｆ−０，４０（トルエＸジオキサン、４
：ＩＬ元素分析値（ＣｚｏＨｚｏＮ＊　０４　Ｓとして
）：計算値：　Ｃ，６２，４８：Ｈ，５，２４：Ｎ、７
．２９実測値：　Ｃ、６２，６２：Ｈ，５，２７：Ｎ、
　７．３０３−（Ｎ−）シＱ　Ｌ−アラニニルオキシ）
−５−フェニルチオフェン（９）の合成 以下の頁に概略を記述する文献に報告された方法（文献
（３）ビー、フリードランダ−（Ｐ、　Ｆｒ１ｅｄｉａ
ｎｄｅｒ　）及びニス、キールバシンスキ−（Ｓ。

Ｋｉｅｌｂａｓｉｎｓｋｉｌ、「ヘミツシエ・ベリヒテ
（Ｃｈｅｍ、　”１３ｅｒ、）　Ｊ、４５．３３８９．
１９１２）；及び文献（４ン（エイ、アイ、コザツク（
Ａ、　１．　Ｋｏｓａｋ’ｌ　。

アール、ジエイ、エフ、パルチャック（Ｌ　Ｊ、　Ｆ。

Ｐａ１Ｃｈａｋ）、ダブリュー、エイ、スチール（Ｗ。

Ａ−５ｔｅｅｌｅ　）及びシー、エム、セルウイツツ（
Ｃ。

Ｍ、　Ｓｅ１ｗ１ｔｚ）、「ジャーナル・オプ拳アメリ
カン・。

ケミカル・ソサイエテイ（Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ
、　Ｓｏｃ、月７６．４４５０．１９５４ンをわずかに
変更して、３−ヒドロキシ−５−フェニルチオフェンを
製造するための、一連の実験を行なった。得られたヒド
ロキシチオフェンを次にＮ−）シル−し一アラニニルク
ロリドでアシル化し、対応するＮ−トシル−し−アラニ
ネートエステルを４６％の収率で得た（最適化されてい
ない方法ン。

Ｃ１−Ｃ−ＣＨ−ＣＨ５Ｏ １１ ３−７エ＝＃−１、２−シｆア〜３−シクロペンテンー
５−オン（５） 桂皮酸エチル１０　ｆ　（５６，８２ｍｍｏｔ）とイオ
ウＩＯＰとの懸濁液を、５０ｍＬフラスコ（反応中に生
成するエタノールを除去するために蒸留ヘッド及び受け
器を備えたもの）中におＩＡて４時間２５０℃に加熱し
た６反応混合物を１００　’Ｃまで冷却させ、還流エタ
ノール５００ｍＬに添加した。

得られた沈澱物を濾過し、沸騰アセトン５００ｍＬで１
回、次にエタノール５００ｍＬの部分で２回次々にすシ
つぶした。１つにした上澄み全濃縮して黒色の固形物と
し、この固形物をメタノールから晶出させ、暗褐色の針
状結晶を得た。「フリット（Ｎｏｒｉｔ　）　Ｊを用い
たメタノールからの２回目の晶出と、［セライ）　（Ｃ
ｅ１ｉｔｅ）　Ｊによる濾過とによって、融点１１３〜
１１５℃の淡黄色の針状結晶２．０２３　ｒ金得た。

ＩＲ（ＫＢｒ）ｃＩｎ　１６５０，１５５０．１３９０
，１３５０゜１１３０　、７７０　、　ＨＮＭＩ尤（６
０４４Ｈｚ、　ＣＤＣ４ａ　）　δ６．９２　（ｓ　、
　ＩＨＩ　、　７．５８　（ｍ、　５Ｈ）　；ＴＬＣＲ
ｆ＝０．５（ジクロロメタン）。

元素分析値（Ｃ９Ｈｅ　Ｏ□Ｓとして）：計算値：　Ｃ
、５５，６４：Ｈ，３，１１実測値：　Ｃ，５５，５３
；Ｈ，３，４７シスー４−ケト−６−フェニル−３，７
−ジチア姶　□ −５−ノネンジオイン酸（６） ９４℃の硫化ナトリウム９水化物（１４８ｍｍｏｔ）３
５．４８　ｙの融解した溶液を、５分間かけて少しずつ
添加した３−フェニル−１，２−ジチア−３−シクロペ
ンテン−５−オン（５）　６．６５　ｆ　（３４，２３
ｍｍｏｔ　）で処理した。炭酸ナトリウムでｐＨ８，７
に調節したＨｚ０６０ｍＬ中のブロモ酢酸４３．６　ｆ
（３１４ｍｍｏＬ　）氷冷溶液に混合物を１５分後に添
加した。得られた溶液を、０℃、ｐＩ−１８，７に４５
分間保った後、濾過した。　Ｆ液を　０℃に保ち５Ｎの
塩酸溶液でｐ）１３．７　の酸性とした。得られた混合
物を一晩５°Ｃで撹拌した。上澄みを次に傾瀉し、得ら
れた油状物をエーテルを用いてすｐつぶした。無色フオ
ーム６．９８　Ｐ　Ｃ６５％）が得られるまで油状物を
トルエンと共に蒸発せしめた。

この物質は更に精製することなく使用した。

分析試料をエーテル上澄みから得た。この上澄みを濃縮
し、酢酸とトルエンとで次々に蒸発させ、エーテルと共
に１つぶして融点］、　４２．５〜１５０℃の淡褐色の
結晶を得た。

ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｒｎ−１１７０５，１６５５；”ＨＮ
ＭＲ（６０ＭＩ−１ｚ。

ＤＭＳ　Ｏ−Ｄｓ　）δ２．０６　（ｓ　、　ＣＨｓＣ
ＯｚＨ不純物）　３．３０（ｓ　、２Ｈ１，３，７７（
ｓ　、２Ｈ）、５．（ｉ７　（ｍ、２Ｈ）（ＯＨ）　、
６．３７　（ｓ　、ＩＨ）　、７．４３　（ｍ、５ＨＪ
　：ＴＬＣＲｆ＝０．８５　（クロロホルム；メタノー
ル：酢酸、５：５：１）、゛ 元素分析値（Ｃ１３Ｈ１２Ｓ２０ｓとして）：計算値：
　Ｃ，５０，００；）１，３．８８実測値：Ｃ１５０，
２６；Ｈ２Ｓ、９８３−ヒドロキシ−５−フェニルチオ
フェンアセテ−）（７） 粗シスー４−ケト〜６−フェニル−３，７−シチアー５
−ノネンジオイン酸（６）　３．４　ｆ　（１０，９ｍ
ｍｏｔ）、酢酸ナトリウム３．４０　ｆ　（４１，５ｍ
ｍｏｔ）及び無水酢酸３０ｍＬの、強く撹拌した懸濁液
を、加熱して１時間還流した。混合物を冷却し、次に濾
過し、蒸発させ、黒色の油状物を得た。

この残留物を酢酸エチル７５ｍＬに溶解させ、水冷飽和
重炭酸ナトリウム溶液５０　ｍＬ　を用いて３回抽出し
た。次に有機層を、プラインで洗浄し、硫酸ナトリウム
上で乾燥させ、濾過、留去し、黒色固形物２．８２６　
Ｆを得た。粗生成物を、１２０〜１４０℃、０　、１１
ＭＥＩｇで蒸発蒸留によシ精製し、淡橙色の油状物１．
２３５　Ｆを得たが、このものは、放置後に固化した（
５２％）。

ＩＲｍ　１７００，１７４５．ＨＮＭＲ（６０ＭＨｚ　
。

ＣＤＣｌ３　）δ２．２３　（ｓ　、　３Ｈ）　、　７
．０３　（ｄ、、　Ｊ＝２Ｈｚ　。

ＩＨＩ　、　７．１３　（ｄ　、　Ｊ＝２Ｈｚ　、　Ｉ
Ｈ）　ニア、２３−７．７３（ｍ、　５Ｉ（）　：ＭＳ
　（ＥＩ　、　ＤＩＰ）ｍ／ｅ　２１８　（Ｍ＋、１２
．６％）　：　ＴＬＣＲｆ＝　０．４８　（ヘキサン：
酢酸エチル、５：１）。

元素分析値（Ｃ１２Ｈ１ｏＳＯ２・］／２Ｈ２０として
じ計算値：　Ｃ，６３，４１；Ｈ，４，８８実測値：　
Ｃ，６３，７８；Ｈ，４，８６３−ヒドロキシ−５−フ
ェニルチオフェン（８１３−ヒドロキシ−５−フェニル
チオフェン酢酸塩（７）　２．１２６　ｆ　（９，７４
ｒｎｒｎｏｌ　）とメタノール８０ｍＬとの混合物欠、
ＩＮのＮａＯＨ１］　ｍｍで処理した。２０分後に反応
混合物を、ＩＮの塩酸１１ｍＬの添加によって急冷し、
２５℃、１２−匈で蒸発させて約５０　ｍＬの容積とし
、酢酸エチル１００ｍＬで処理した。有機Ｎ！４を分離
し、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、
濾過、蒸発させ、黒色の固形物を得た。この残留物を酢
酸エチル７５ｍＬに溶解させ、Ｍｇ５Ｏ＜上で乾燥させ
た。濾過及び゛蒸発によって得た黒色固形物全高温ヘキ
サンと共に４回す９つぶし、冷却後に、融点７４〜７５
℃の黄色の固形物合計８３７２（４９％）を得た。１つ
にした母液を濃縮して固形物０．８７　ｆとし、このも
のに５ｉ０２１００ｒ上で、クロマトグラフィーを行い
ヘキサン：酢酸エチル（７：ＩＪ溶剤混合物を用いて、
溶出した。

再結晶後に、さらに融点７３．５〜７４℃の生成物３８
０ＷＩｇを得た。合計収率は、従って］、、２１７　Ｆ
（７１％）、融点７４．５〜７５℃（文献（３）、（４
）７５℃、７８°Ｃ）。

ＩＲｃｒｎ　３３８０，１６３５．ＨＮＭＲ（９０ＭＨ
ｚ。

ＣＤＣｌ２　）δ３．８１　（ｓ、２Ｈ）、６．５７（
ｓ、ＩＨ）。

７．２−７．７Ｊ　（ｍ、　５Ｈ）　：ＭＳ　（ＥＩ　
）　ｍ／ｅ　１７６．０　（７０，７、）　％）；ＴＬ
ＣＲｆ＝０．２３（ヘキサン：酢酸エチル、１：５１゜ 元素分析値（Ｃ１ｏＨａＯ８として）：計算値：　Ｃ、
６８，１５：）ｌ、　４．５７実測値：　Ｃ，６８，０
５；Ｈ，４，７０３−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオ
キシ）−５−フェニルチオフェン（９） ジクロロメタン２０ｍＬ及びピリジン帆６１ｍＬ（７，
５ｍｍｏｔｌ中の３−ヒドロキシ−５−フェニルチオフ
ェン（８）　４４０ｊｖ（２，５ｍｍｏｔ）溶液を、ジ
クロロメタン１０ｍＬ中のＮ−トシルアラニニルクロリ
ド１．３１４　ｆ　（５ｍｍｏｔ）溶液（５分間かけて
滴下する）によシ０℃、アルゴン雰囲気下に処理した。

反応混合物を、０．５時間０℃で撹拌した後、クロロホ
ルム１００ｍＬ中に注加した。混合物を、５０ｍＬずつ
のＩＮのくえん酸、水、水冷重炭酸す）　ＩＪウム溶液
、水及びプラインを用いて次々に抽出した。

次に混合物を硫酸す）　ＩＪウム上で乾燥させ、濾過し
、蒸発させ、褐色の油状物１．７８５’を得た。「フリ
ット（Ｎｏｒｉｔ）　Ｊ　１．７８　ｆ　ｋ用いて処理
した後、トルエンからの結晶化を試みたが、成功しなか
った。

残留物に５ｉ０２２００タカラム上でクロマトグラフィ
ーを行い、ジクロロメタンを用いて、流速１０ｍＬ／分
　で溶出した。生成物含有分画をプールし、濃縮して、
赤味を帯びた油状物９５１〜を得た。生成物をトルエン
から結晶化させた。トルエンからの再結晶イしを連続し
て行い、全量４６３■（４６％）の生成物を、淡黄色の
固形物として得た（融点、８５〜８７℃）。

ＩＲ（ＫＣｔ）ｃｎｌ−”１７３５，１３３０，１１５
０：”ＨＮＶＩＲ（９０ＭＨｚ　、　ＣＤＣ４３）δ１
．５３　（ｄ　、　Ｊ＝　７　Ｈｚ、　３Ｈ）　。

１．６２（ｓ、３Ｂ）、４．２３（ｍ、ＩＨ）、５．３
２（ｄ、Ｊ＝９Ｈｚ、１　〕ト１）　、６．８４　（ｄ
　、Ｊ＝Ｌ４Ｂ、ｚ　、ＩＨ）　、６．８８（ｄ　、　
Ｊ＝１．４Ｈｚ、　ＩＨ）　、　７．２３−７．８３　
（ｍ、　９Ｈ）　：ＭＳ　（ＦＡＢ）ｍ／ｅ４０２　（
Ｍ＋１．１５％ｌ　；ＴＬＣＲｆ＝０．２０　（ヘキサ
ン：酢酸エチル、４：ＩＪ。

元素分析値（Ｃ２０Ｈ１９ＮＯ４Ｓとしテ）：計算値：
　Ｃ，５９，８３：Ｈ，４，７７；Ｎ、３．５９実測値
：　０．５９．６０：）１，４．７７；Ｎ、３．４３３
−（Ｎ−）シルーＬ−アラニニルオキシ）−１−）ｆル
ー５−フェニルビロール（１３）（Ｄ　合成式（１）に
おいて、ＡがＮ−１シル−Ｌ−アラニニルであり、Ｒが
フェニルであり、ＲがＨであり、ＸがＮＲ’であシ、そ
してＲ′がＣＨｓである化合物に相当する表題のエステ
ルを製造するための、一連の実験を行なった。反応の順
序は次の通シであった。

２−ヒドロキシ−３−（Ｎ−メチルカルボキシメチルア
ミン）−ヒドロ桂皮酸二カリウム塩（１ｏ）β−フェニ
ルグリシド酸のカリウム塩（３０ｆ；０．１．５　ｍｏ
ｌ　）、Ｎ−メチルグリシ７　（１３，２ｆ　；０．１
５　ｍｏｔ）　、蒸留水（１１９ｍＬ）及びＫＯＨ溶液
（９Ｎ　；　２２．３ｍＬ　）の混合物を、加熱して３
時間還流し、淡黄色の溶液とした。反応混合物を７０℃
で減圧下に蒸発乾個した。次に残留物を９５％ＥｔＯＨ
（１００ｍＬ　）から晶出はせ、白色固形物とし、この
ものを１１０℃で減圧下に１晩乾燥させた後、白色固形
物（１０１３０，８Ｆを得た（収率６３％）。

ＩＲ（ＫＣｔ）ｃｎＩ−”　３３６０　（ｂｒ、）　、
　１５８０　、１４０５　。

７０５　、　ＨＮＭＲ（ＣＤ３０Ｄ）δ２．３０　（ｓ
　、　３Ｈ）　、　２．９８（ｓ、２Ｈ）、　３．７０
　（ｄ　、　Ｊ−３Ｈｚ　、　ＩＨＪ　、　４．４８　
（ｄ。

Ｊ＝３Ｈｚ　、　ＩＨ）　、　４．９２　（ｓ　、　Ｉ
ＨＩ　、　７．４０　（ｓ、５Ｍ）：、、　ＴＬＣＲｆ
＝０°５１（ＥｔＯＨｏｌ“：！ｍ１ｌｌ）ＩＪ”″ア
ンモニウム、７：３）、（生成物の融点２７０℃以上）
。

３−アセトキシ−１−メチル−５−フェニルピロール（
１１） ２−ヒドロキシ−３−（Ｎ−メチルカルボキシメチルア
ミン）−ヒドロ桂皮酸二カリウム塩（１０）（１５，２
グ、４６ｍｍｏｔ）、無水酢酸（１７３ｍＬ）　及びト
リエチルアミン（３０８ｍＬ）　の混合物を４０℃で１
９時間加熱した。濃褐色となった反応混合物を、濾過し
、固形物をエーテルで洗浄した。ＰＲを減圧下に蒸発せ
しめ、濃褐色の残留物を得、このものをエーテル（３０
０ｍＬ）　及び水（２００ｍＬ）　に吸収させた。各層
を分離し、ニーデル層は、別の水（２００ｍＬ）　で洗
浄した。

エーテル溶液を、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、減
圧下に濃縮し、褐色の残留物１０．７　Ｆを得た。

このものを蒸発蒸留（１２０〜１３５°Ｃ：　０．０３
ｔｏｒｒ）によシ精製してエーテルから晶出させ、融点
６４〜６５℃の白色結晶（１，１）　３．Ｏｆ　を得た
（収率３０％）。

ＩＲ（ＣＨＣＬ３）ｃｒｎ　２９９０．１７５０，１５
７０゜１５８１．１４８２，１３７５，１２３０（ｂｒ
、）、１０２４゜９１０　、７００　、　ＨＮＭＲ（Ｃ
ＤＣｔ３１　δ２．２０　（ｓ　、３Ｈ）　。

３．５８（ｓ　、３Ｈ）、６．１０（ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ、
ＩＨＩ　。

６．７５（ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ、ＩＨ）、７．３５（ｓ、５
Ｈ）；ＴＬＣＲｆ＝０．５．８　（ヘキサン：　ＥｔＯ
Ａｃ　７　：　３１　。

元素分析値（Ｃｔ−ａＨｓｓＮＯ２として）；計算値：
　Ｃ，７２，５４；Ｈ，６，１０：Ｎ、６．４４実測値
：　Ｃ，７２，５７；Ｈ，６，０９：Ｎ、６．５１３−
（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）−１−メチル−
５−フェニルピロール（１３）脱酸素メタノール（１５
，５ｍＬ）　と３−アセト＃シー　１−メｆルー５−フ
ェニルピロール（１１）（１，３ｆ、６．２　ｍｍｏｔ
）との混合物に脱酸素Ｎａ０Ｈ（２Ｎ、　１２．５　ｍ
Ｌ）　をアルゴン雰囲気下添力りした。反応混合物を水
浴中で１５分間撹拌した。次に脱酸素くえん酸（２Ｍ、
７ｍＬ）　を添加し、得られた混合物を水浴中で８分間
撹拌した。反応混合物を減圧下に濃縮し、次に水２０ｍ
Ｌｔ−加え、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）　５０　ｍＬを
用いて２回抽出した。酢酸エチル層を１つにし、Ｍｇ　
Ｓ　０４上で乾燥させ、濾過し、減圧下に濃縮し、３−
ヒドロキシ−１，−メｆルー５−フェニルピロール（１
２）全橙色の残留物として得た。無水Ｔ　ＨＦ（１２，
４ｍＬ）、ビリジｙ　（０，６ｍＬ　：　７．４　ｍｍ
ｏｔ：　１．２　ｅｑ　）及びトリフルオロ酢酸（１，
２ｍＬ：　１５ｍｍｏｔ；　２．４ｅｑ）の冷溶液をア
ルゴン下に橙色の残留物に添加し、その直後に、新しく
製造したＮ−）シルーＬ−アラニニルクロリド（１，２
ｆ　；　７．４　ｍｍｏｔ：　１．２ｅｑ）の無水ＴＨ
Ｆ　（１２，４ｍＬ）　溶液を添加した。得られた混合
物を１時間０℃で撹拌した。次にくえん酸水溶液（Ｉ　
Ｍ、　５　ｍＬ）　及び酢酸エチル（３０ｍＬｌ　を添
加して反応混合物を急冷した。簡単に混合した後、各層
を分離し、飽和Ｎ　ａ　ＣＬ溶液、５％ＮａＨＣＯａ溶
液（２回ン及び再び飽和ＮａＣｔ溶液によって有機相を
順次洗浄した。次に酢酸エチル抽出物をＭｇ５Ｏ＜上で
乾燥させ、「フリット（Ｎｏｒｉｔ　）　Ｊ　２１１で
処理し、濾過し、減圧下に濃縮し、粗生成物（１３）を
橙色の残留物として得た。

このものを、ヘキサン：酢酸エチル（１：１）（５ｍＬ
）　に溶解させ、５ｉ（ｈ１００Ｐカラム上でクロマト
グラフィーを行い、ヘキサン：酢酸エチル（７：３）を
用いて溶出し、化合物（１３）１　ｙｆ、濃厚な淡橙色
の油状物として得た。この粗生成物の一部を、半調製用
ＨＰＬＣ（カラム、ＩＢＭシリカ、１α×２５ｃｒｎ、
移動相、ヘキサン：酢酸エチル８：２；流速−４，０ｍ
Ｌ／分、圧力０．２　ｐｓｉＪによって更に￥ｌｉ！ｔ
、、蜂蜜色の溌厚な油状物（１３）を得た。

ＩＲ（ｆｉｌｍｌ　ｃｍ−”　３２６０，２９５０．１
７６０．１５２０゜１３５０．１１７０，７７０；’Ｈ
ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−δ６）δ１．２８（ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ
、３Ｈ）、２．３６（ｓ、３Ｈ）、３−５８（ｓ、３Ｈ
１，５，８５（ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ、ＩＨ）、６．１５（ｍ
。

ＩＨ）、６．７４　（ｄ　、Ｊ＝２Ｈｚ、ＩＨ）、７．
３０−７．８０（ｍ、９Ｈ１，８，３７（ｄ、Ｊ＝８Ｈ
ｚ、ＩＨ）＋　ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ−δ６）ＰｐＩｉ１
８．２０５　、２０．９３６　、３４．９１７　。

５１．２４０，１００．５９８，１１３．１４８，１２
６．５４４゜１２７．０００，１２８．１０５，１２８
．５６０，１２９．６０１゜１３０．９０１．１３２．
２０２，１３５，７１４．１３８，３１５゜１４２．６
７２．　１６９．７２４：ＴＬＣＲｆ　＝　０．５２　
（）　ルエン：ジオキサン４　：　１　）　；　Ｃｚｔ
ＨｚｚＮｚ　０４　Ｓの′）　あ、□！Ｘ１−ｘ　＜　
ｉ　ｈ　ｐ−い、。／ｅ　３９８．１３゜。

を喪するが、実測値は３９８．１２９７であった。

３−（Ｎ−）シル−し一アラニニルオキシンー５−（ｐ
−クロロフェニル）ヒロール（１８）（Ｄ　合成式（１
）においてＡがＮ−）シル−ルーアラニニル、Ｒがｐ−
クロロフェニル、ＲｏがＨ，ＸがＮＲ’、Ｒ′がＨをそ
れぞれ表わす化合物に相当する標題のエステル化合物を
製造するための、一連の実験を行なった。反応連鎖は次
の通りであった。

トランス−β−（ｐ−クロロフェニル）グリシド酸（１
４） アセトン２６　ＯｍＬ中のｐ−クロロ桂皮酸（６８，５
ｔ　；　０．３７５ｍｏｔ１の撹拌スラリーに、ＮａＨ
ＣＯｓ（１３７ｆ　；　１．６３ｍｏ７）　ｋ添加した
後、水２６０ｍＬｔ徐々に添加した。この混合物に、「
オキソ７　（０ＸＯＮＥ）　Ｊ　２１１　ｆ’　（０，
３４３ｍｏｌ）、ＥＤＴＡ二ナトリウム１２０ｑ及び水
８５０ｍＬの混合物を２２〜２７℃で２．５時間かけて
冷加した。５時間後に混合物を１２Ｎの冷塩酸７０ｍＬ
を用いて酸性とし、ｐＨを約２．５に降下させ、次に酢
酸エチル７００ｍＬを用いて抽出した。抽出液をブライ
ンを用いて洗浄し、Ｍｇ５Ｏ＜　で乾燥させ、沖過し、
ｐ液を真空下に蒸発乾個させた。白色の固形物を酢酸エ
チルから結晶化させた。融点１２１〜１２５８Ｃ（７２
，２Ｐ　Ｃ収率９７％）。”ＨＮＭＲ（ＣＤＣｔａ　／
ＤＭＳＯＤｅ　）δ７．３　（ｍ　、　４　Ｈ）、４．
０５（ｄ　、Ｊ＝２　、ＩＨ）及び３．４（ｄ、Ｊ＝２
゜ＩＨ）。

元素分析値（Ｃｏ　Ｍｙ　ＣｌＯｓ　として）：、計算
値：　Ｃ，５４，４３：Ｈ，３，５５：Ｃ／、、１７．
８５実測値：　Ｃ，５４，５３；Ｈ，３，８０；Ｃ／、
、１７．９１２−ヒドロキシ−３（カルボキシメチルア
ミノ）−ｐ−クロロヒドロ桂皮酸二カリウム塩工水化物
（１５） ＫＯ）１（８５％＞　（４６，７ｆ　：　０．７０９ｍ
ｏｔ）　と水４００ｍＬとの溶液に、グリシン（２５，
９ｔ　；０．３４５　ｍｏｔ）　ｋ添加し、’ＣＩ　Ｋ
　トラフ　ス−β−ｐ−クロロフェニルグリシド酸（１
４）　（７２，２ｙ　；０．３６３５ｍｏｔ）を添加し
た。この混合物を２時間ｌＯＯ℃に加熱し、室温に冷却
し、ｐＨを１２に上昇させるのに足る量のＫＯＨを添加
した。混濁溶液を酢酸エチルで３回抽出し、抽出液を次
に廃棄した。７０℃水浴を用いて、透明な水溶液（約５
００ｍＬ）を、真空下に蒸発乾個芒ぜた。

次に固形物を熱エタノール約３５０ｍＬに溶解させ、沖
過し、Ｆ液′を水浴中で数時間冷却した。晶出した固形
物を波数し、冷エタノールで洗浄した。

融点９３〜９５℃、脱カルボキシル化温度１８５℃　（
５７，２≦ｔ　：　４１　％　ン　。

１ＨＮＭＲ（Ｄ２０−ＴＳＰ　）δ７．４　（ｓ　、　
４Ｈ）　、ｔ−五ｉ工４．４（ｄ、Ｊ＝４．ＩＨ）４．
０５ （ｄ　、　Ｊ＝４　、　ＩＨ）　、汲び３゜１（ｓ、２
８）。

元素分析値（Ｃ１ｘＨｔｏＣｔＮ０５に２＊　２Ｈ２０
として）：計算値：　Ｃ，３４，２４；Ｈ，３，６６：
Ｎ、３．６３実測値：　Ｃ，３４，４０；）１，４．０
３；Ｎ、３．４２Ｎ−アセチル−３−アセトキシ−５−
（ｐ−クロロフェニル）ビロール（１６） ２−ヒドロキシ−３−（カルボキシメチルアミノＪ−ｐ
−クロロヒドロ桂皮酸二カリウム塩工水１）　化物（１
５）　（１０？　：　０．０２５９１ｍｏｔ）に無水酢
酸（４０ｍＬ）とピリジン（３０ｍＬ）とを添加した。

この混合物を３５℃に徐々に加熱し、この点で溶液は６
７℃まで発熱し、次に温度が下降し始め、この点で加熱
を再開した。混合物ｆ：１２１°〜１２２℃（内部温度
）に１時間加熱し、次に冷却した。反応混合物に酢酸エ
チル約３０ｍＬを添加し、これによシ酢酸ピリジニウム
塩の大部分を沈澱させた。この塩ｔ［’取し、少量の酢
酸エチルで洗浄した。次にＦ液を真空下に蒸発せしめて
油状物とし、これに氷水を添加した。生成物をエーテル
を用いて抽出し、エーテル抽出液を順に希釈くえん酸冷
水溶液と冷水とで２回、更に希釈Ｎ　ａ　ＨＣＯｓ冷水
溶液、冷水及びプラインとで３回それぞれ洗浄し、Ｍｇ
５Ｏｉ上で乾燥させ、濾過した。ν液を「ダルコ（Ｄａ
ｒｃｏ　）　Ｊ　１０　ｆで処理し、２０分゛間撹拌し
、次に濾過した。ν液を真空下に蒸発せしめ油状物とし
た。この油状物に２−グロパノール２５ｍＬを添加した
。得られた溶液から、冷却及びスフラッチング（Ｓｃｒ
ａｔｃｈｉｎｇｌによって、融点６９°〜７１℃の淡黄
色の結晶（３，４ｆ　：　４７％）を得た。ＴＬＣＲｆ
　＝０．６１（）ルエン：ジオキサン、９５：５１゜分
析試料を２−グロパノールから再結晶させたが融点の変
化は見られなかった。

ＩＲ（ＫＣｌ）儒−”１７５５（Ｃ＝０．エステル）及
び１７３０　（Ｃ＝Ｏ、アミド）；　”ＨＮＭＲ（ＣＤ
Ｃｌ２）　δ７，４（ｍ　、　５Ｈ）　、　６．２←ｄ
　、　Ｊ＝２　、１８．）　、　２．４　（ｓ　、　３
Ｈ１及び２．３（ｓ、３Ｈン。

元素分析値（Ｃ１４Ｈｌ　２　ＣｔＮＯ３として）：計
算値：　Ｃ，６０，５５；Ｈ，４，３６；Ｎ、５．０４
実測値：　Ｃ，６０，６５；Ｈ，４，５５；Ｎ、５．０
７３−ヒドロキシ−５−（ｐ−クロロフェニル）ビロー
ル（１７） Ｎ−アセチル−３−アセトキシル−５−ｐ−クロロフェ
ニルビロール（１６）　（２，８ｔ　；　０．０１ｍｏ
ｔ）の試料をＮ２気流によ９１０分間脱酸素化した。次
に固形物を脱酸素メタノール（３０ｍＬ）中に溶解させ
、次に一８℃に冷却した。その直後に、Ｈｚ０２ＯｍＬ
中のＮａＯＨ（１，６？　；　０．０４　ｍｏｌ　）の
脱酸素面溶液を添加した。次にこの溶液を短時間１５℃
に加熱した後、直ちに一５℃に冷却した。

２５分後に透明な溶液をＮ２０１５　ｍ　Ｌ中のくえん
酸（４，２？　：　０．０２ｍｏｔ）の脱酸素面溶液で
処理した。温度は短時間に５℃に上昇した。−５℃で０
．５　ｈｒ　撹拌した後、固形物を波数し、脱酸素面Ｈ
２０で洗浄した。淡緑色の生成物を数日間Ｐｚ　Ｏｓ上
で室温で真空下乾燥させた（　１．３　ｆ　：　６８％
）。

ＴＬＣＲｆ　＝　０．１９　（ＣＨＣ４ｓ　：ＥｔＯＨ
、９：　１　）。

ＩＲ（ＫＣｌ）　は、Ｃ；０吸収の証拠を示さなかった
。

元素分析値（Ｃ１ｏ　Ｈｓ　ＣｔＮＯ＠″／６　Ｎ２と
して）；計算値：　Ｃ，６１，０８：Ｈ，４，２７：Ｎ
、７．１２実測値：　Ｃ，６１，３６；Ｈ，４，４４；
Ｎ、６．８５３−（Ｎ−トシル−し−アラニニルオキシ
）−５−（ｐ−クロロフェニル）ビロール（１８〕Ｎ２
で脱酸素化したＴＨＦ（１５ｍＬ）に、ピリジ：ｙ　（
０，６５ｍＬ　；　０．００８ｍｏｔ）、トリフルオロ
酢酸（１，２７ｍＬ；０．０１６４ｍｏｔ）及び３−ヒ
ドロキシ−５−ｐ−クロロフェニルビロール（１７）（
１，３？　；　０．００６５　ｍｏｔ）を添加した。溶
液を０℃〜−４℃に冷却し、ＴＨＦｌＳｍＬ中のＮ−ト
シル−Ｌ−アラニニルクロリド（２，１Ｐ　；　０．０
０８ｍｏｔ）のＮ２脱酸素冷却溶液（０℃〜−−４℃）
２１０分間かけて添加した。混合物を１時間０℃に保っ
た後、水とＩＮ＜えん酸１００ｍＬの混合物を添加した
。この混合物を酢酸エチルを用いて抽出し、抽出液を、
冷ブラインで１回、希釈冷ＮａＨＣＯ３で２回、そして
冷ブラインで１回それぞれ洗浄した後、ＭｇＳＯ４上で
乾燥させ、濾過した。炉液を「ダルニア　（Ｄａｒｃｏ
　ｌ　Ｊ　２　ｔで処理し、１０分間撹拌し、濾過し、
流液を真空下に濃縮し、赤褐色の油状物とした。「ダ；
　：Ｉ　（Ｄｉｒｃｏ　）　Ｊ　１．３　ｆで再び処理
し、淡赤色の油状物を得た。油状物をトルエン：シクロ
ヘキサン（４：１）に溶解さぞ、冷蔵庫に一晩放置し、
淡鮭肉色の結晶を得た（１．４５２；５３％）。融点１
１３〜１１５℃、ＴＬＣＲｆ−０，４７（Ｅ　ｔ２ｏ　
）　：　ＩＲ（ＫＣｔＩａｎ　”１７４０　（Ｃ＝Ｏ、
エステル）；　’ＨＮＭＲ（ＣＤＣｚ３）　δ８．４（
ｂｒ　ｓ、ＩＨ）　、７．８−７．２（ｍ、８Ｈ１，６
，７（ｍ、ＩＨ）。

６．２（ｍ、ＬＨ）　、５．５（ｄ、Ｊ＝９．ＩＨ）　
、４．２（ｐ　、Ｊ＝８．ＩＨ）　、２．４（ｓ、３Ｈ
Ｊ　、１．４（ｄ、３Ｈ）　；ＭＳ（ＥＩ　、　ＤＩＰ
）　ｍ／ｅ　４１８　（Ｍ　、　２．３％）及び４２０
（Ｍ＋、　０．８％）。

元素分析値（Ｃ２ｏＨｔｓＣ４ＮｚＯ４Ｓとして）：計
算値：　Ｃ，５７，３４；Ｈ，４，５７：Ｎ、６．６９
実測値：　Ｃ，５７，５３；Ｈ，，４，５８；Ｎ、６．
６７様々な試験具の製造と使用 本発明による化合物を含有した試験具を製造し、前記の
エステル基質ヲ尿中白血球に対する反応性について試験
するための、一連の実験を行なった。

この試験具は、分析試薬を含有した小さな正方形の沖紙
を、ポリスチレンフィルム片の一端に取付けたものであ
った。ｐ紙には、緩衝液、エステル、促進剤及びジアゾ
ニウム塩カップリング剤に含＆させた。各試験具は、尿
中白血球について陽性値の分析結果を示した。

エステにカ３−　（Ｎ　−）シルーＬ−アラニニルオキ
シ）−５−フェニルピロール（４）である試験具（実験
（１）） 尿中白血球の存在に対して感受性のある試験具を製造し
た。この試験具は、横長のポリスチレン　：フイルム片
の一端に取付けた小さな正方形のｐ紙から成るものとし
た。Ｆ紙には、色原体エステル、促進剤及びジアゾニウ
ム塩を含む種々の成分を含浸させた。イートン−ディッ
クマン（Ｅａｔｏｎ　ａｎｄＤｉｃｋｍａｎ　）す２０
５の５．１ｃＩｎ（２インチ）偏波紙片を、 ０．４Ｍホウ酸塩−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ８，６，２，０
％（Ｗ／Ｖ）ポリビニルピロリドンに−３０，０，２％
（Ｗ／Ｖ）ｒビオチルシュ（Ｂｉｏｔｅｒｇｅ　）　Ｊ
ＡＳ−４０、及び ０．２５　Ｍ　ＮａＣ６ 全含有する水溶液に浸漬した。

次に水柱２．５４ｃｒ＋＋（１インチ）の空気流圧の下
に８０．４°〜９３．３°Ｇ（１７５〜２００７）で、
オーバーリーエアーフオイｆｉｖ　（０ｖｅｒｌｙ　Ａ
ｉｒ　Ｆｏｉｌ　１紙乾燥機中で７分間済紙を乾燥させ
た。次に乾燥したＦ紙を、 ２．０％（Ｖ／Ｖ）ｎ−デカノール、 ０．７５ｍＭ２−メトキシ−４−モルホリノベンゼンジ
アゾニウムクロリド、及び ０．５ｍＭ３−（Ｎ−トシ／ｌ／−Ｌ−アラニニルオキ
シ）−５−フェニルピロール を含有するアセトン溶液に浸漬した。

この含浸後に１３０下の通風させた「ホラトノくツク（
Ｈｏｔｐａｃｋ　）　Ｊオーブン中で１０分間乾燥させ
た。白色がかった試験紙を得た。

乾燥させた含浸濾紙片を、１辺の長さが帆５１１？Ｆｆ
ｆ（０，２インチ）の正方形に切υ、１０．２ｃｍＸＯ
３５１ｍ（４インチ×帆２インチ）の１軸延伸ポリスチ
レン片の一端に取付けた。濾紙片をポリスチレン片に取
付けるために、「ダブルスティック（ＤＯｕｂｌｅ　５
ｔｉｃｋ）　Ｊ両面接着剤（スリーエム（３Ｍ）社製）
を使用した。

エステルが３−（Ｎ−）シルーＬ−アラニニルオキシ）
−５−フェニルチオフェン　（９）である試験具（実験
（２）） ３−（Ｎ−）シルーＬ−アラニニルオキシ）−５−フェ
ニルチオフェンを指示薬として使用し、尿中白血球の存
在に対して感受性を有する試験共を製造した。濾紙片（
イートン・アンド・ディックマン（Ｅａｔｏｎ　ａｎｄ
　Ｄｉｃｋｍａｎ　＋　２０５　）を、０．４Ｍホウ酸
塩−ＮａＯＨ緩衝ｖｉ、　＜　ｐ）ｌ＝　８．５　）、
０．４　Ｍ　ＮａＣ１、及び １．５％（Ｗ／Ｖ）ポリビニルピロリドン（Ｋ−３０１
を含有する第１水溶液に浸漬した。

このように含浸させたＰ＆片全全３０分間７０℃強制通
風オーブン中において乾燥させた後、室温に冷却し、次
に、 ０−７５　ｍ　Ｍ　３−（Ｎ＝−トシ／ｌ／−Ｉ、−ア
ラニニルオキシ）−５−フェニルチオフェン、 ０．７５ｍＭ２−メトキシ−４−モルホリノベンゼンジ
アゾニウムクロリド−塩化亜鉛複塩、及び０．５％（Ｖ
／Ｖ）ｎ−デカノール を含有するアセトン溶液からなる第２浸漬溶液を含浸さ
せた。

このように２回含浸させた濾紙片を５分間５０℃で強制
通風オープン中において乾燥させた。

乾燥させた濾紙を、１辺の長さが０．５１　ｃｍ　（０
，２インチ）の正方形に切シ、０．５１　ｃｍ　Ｘ　８
．３　備（０，２’　Ｘ　３．２５インチ）のポリスチ
レンフィルム片の一端に取付けた。「ダブルスティック
（ＤｏｕｂｌｅＳｔｉｃｋ　）　Ｊ　（、ｚ、リーエム
（３Ｍ）社製両面接着テープ）を用いて取付けを行なっ
た。試験具は、乾燥用のシリカゲル及びモレキュラーシ
ープ（ｍｏ　ｌ　ｅ　−ｃｕｌａｒ　５ｉｅｖｅｓ　）
と共にｉｏｏ個ずつ複数の壜に収納し貯蔵した。

エステルが３−（Ｎ−）シル−ルーアラニニルオキシ）
−１−メチル−５−フェニルビロール（１３）である試
験具（実験（３）） エステル指示薬として３−（Ｎ−１−’フルーＬ−アラ
ニニルオキシ）−１−メチル−５−フェニルビロールを
、またカップリング剤として１−ジアゾナフタレン−４
−スルホン酸塩をそれぞれ使用し、実験（２）の実験手
順に従って、試験具を製造した。第１浸漬水溶液は、 ０．４Ｍホウ酸、 ２．０％（Ｗ／ＶｌポリビニルピロリドンＩＫ−３０）
及び ０．２％（Ｖ／Ｖ）ｒビオテルジ’−（Ｂｉｏｔｅｒｇ
ｅ）　Ｊ５−４０ ０．２５　Ｍ　ＮａＣｔ を含有していた。

濾紙の含浸前に溶液１ＮａＯＨでｐＨ９，ＯＫ：滴定し
た。

゛アセトン中の第２浸漬溶液は、 ０．７５ｍＭ１−ジアゾづ−ナフト１−ルーキースルホ
ン酸塩 １．３ｍＭ１−メチル−３−（Ｎ−トシル−Ｌ　−アラ
ニニルオキシ１−５−フェニルビロール１．５％（Ｖ／
Ｖ）ドデカノール を含有していた。

第１浸漬溶液である前記水溶液に含浸させた後、約５分
間約８０℃で濾紙を乾燥させ、２浸漬溶液であるアセト
ン溶液に含浸させた後、約５分間７０℃でこの濾紙を乾
燥させた。

乾燥させた濾紙は、実験（２）の実験手順と同様にして
取付けた。

エステルが３−（Ｎ−トシル−し−アラニニルオキシｌ
−５−（ｐ−クロロフェニル）ビロール（１８）である
試験具（実験（４）） ７セトン溶液がフェニルピロールの代シに１．３ｍＭ３
−（Ｎ−トシル−Ｌ−アラニニルオキシ）−５−（ｐ−
クロロフェニル）ビロールを含有スることを除いて、実
験（２）の実験手順と同様にして試験具を製造した。

試験具の評価 様々な試験具の製造と使用の項の実験において製造した
試験具について、尿中に存在する白血球を検出する能力
の評価を行った。

正常な人の尿のプールから試験試料を製造した。

１つの試料はブランクとして使用し、新しく採血した血
液から単離した白血球を、２つの別の尿試料に添加し、
それぞれ１μＬ当シ白血球数０．１０．７５個の＠度と
した。

試験具を試験試料に素早く浸漬させた後、それから取出
した。２分後に分光光度計を用いて試験具を観梨し、４
００〜７００　ｎｍの異った波長で反射率（％）を測定
した。

試験データは、試験具の全てが試験試料中の異なった白
血球レベルに対応した明瞭に識別されうる光反射率の差
異を示すことを示している。試験データを次表に示す。

０　６５ （２１１０６０ ６５４２ ０６７ （３）　１０　６４ ７５　６０ ０　６１ （４）　１０　５１ ７５　４２ 東目視による観察：１０〜１２細胞／μＬにおいて紫色
を呈する；ブランクは色の変化を示さなかった。

手続補正書 昭和６０年７月２日 特許庁長官　志、賀　学　殿 １、事件の表示 昭和６０年特許願第　７１２６５号 ２、発明の名称 試験試料中の白血球、エステラーゼ又はプロテアーゼの
存在を測定するための組成物、試験具及び方法３、補正
をする者 事件との関係　特許出願人 名称　マイルス・ラボラトリーズ・ インコーホレーテッド ４、代理人 （１）明細書第７３頁第２〜３行の「イートン−ディー
／り−ｙ　ン（Ｅａｔｏｎ　ａｎｄ　Ｄｉｃｋｍａｎ）
Ｊを「イートン・アンド・ダイクマン（Ｅａｔｏｎ　ａ
ｎｄ　Ｄｉｋｅ−ｍａｎ）Ｊと補正する。

（２）同第７４頁第１８〜１９行の［イートン・アンド
ープイックマン（Ｅａｔｏｎ　ａｎｄ　Ｄｉｃｋｍａｎ
＃２０５）　Ｊを「イートン・アンド・ダイクマン（Ｅ
ａｔｏｎ　ａｎｄ　Ｄｉｋａｍａｎ）ｌＩ２０５Ｊと補
正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｌ）構造式 （式中、ＡはＮ−ブロックされたアミノ酸残基又はＮ−
   ブロックされたペプチド酸残基を表わし；Ｘは、０、Ｓ
   又はＮＲ’を表わし；Ｒは、アリール又は低級アルキル
   を表わし；Ｒｏは、水素又は低級アルキルを表わし；そ
   して、Ｒ′は、水素、低級アルキル又はアリールを表わ
   す） を有するエステルと、適当な緩衝物質とから成る、試験
   試料中の白血球、エステラーゼ又はプロテアーゼの存在
   を測定するための組成物。 ２）　ＸがＮＲ’である特許請求の範囲第１項記載の組
   成物。 ３）　ＡがＮ−ブロックされたアミノ酸である特許請求
   の範囲第１項記載の組成物。 ４）　ＡがＮ−ブロックされたし一アラニネートである
   特許請求の範囲第１項記載の組成物。 ５）　ＡがＮ−ブロックされたＬ−アラニネートであシ
   ；Ｒがフェニルでらり；ＸがＮ　Ｒ’であシ；そして、
   Ｒ′及びＲ＊が共に水素である特許請求の範囲第１項記
   載の組成物。 ６）促進剤を特徴とする特許請求の範囲第１〜第５項の
   いずれかに記載の組成物。 ７）促進剤が炭素原子数１〜１５のアルコールである特
   許請求の範囲第６項記載の組成物。 ８）ジアゾニウム塩カップリング剤を特徴とする特許請
   求の範囲第１〜第５項のいずれかに記載の組成物。 ９）ジアゾニウム塩が構造式 （式中り一は、アニオンを表わし；Ｇは、同一でも、異
   なっていてもよいが、水素、低級アルキルもしくはアリ
   ールを表わすか、又は、両方のＧが共同して１つの縮合
   環系を形成し；かつＢは水素又はＯＨを表わす） を有する双性イオンである特許請求の範囲第８項記載の
   組成物。 １０ン塩が１−ジアゾ−２−ナフトール−４−スルホネ
   ートである特許請求の範囲第８項記載の組成物。 １１）促進剤とジアゾニウム塩カップリング剤とを特徴
   とする特許請求の範囲第１〜第５項のいずれかに記載の
   組成物。 １２）促進剤が炭素原子数１〜１５のアルコールである
   特許請求の範囲第１１項記載の組成物。 １３）促進剤が炭素原子数約８〜１５を有するアルコー
   ルであシ、ジアゾニウム塩が２−シアシー・）　２−す
   ７　）　Ａｙ　−４−Ｘ　′ｙ　＊ネートである特許請
   求の範囲第１１項記載の組成物。 １４）試験試料中の白血球、エステラーゼ又はプロテア
   ーゼの存在を測定するための試験具であって、構造式 （式中、ＡはＮ−ブロックされたアミノ酸残基又はＮ−
   ブロックされたペプチド残基を表わし；Ｒはアリール又
   は低級アルキルを表わし：ｘｉｔｏ。 Ｓ又はＮＲ’を表わし；Ｒ′は水素、低級アルキル又は
   アリールを表わし；そして、Ｒ＊は水素又は低級アルキ
   ルを表わすｊ を有するエステルと適当な緩衝物質とを含有せしめた担
   体マトリックスからなる試験具。 １５）ＸがＮＲ’である特許請求の範囲第１４項記載の
   試験具。 １６）　ＡがＮ−ブロックされたアミノ酸残基であ　・
   る特許請求の範囲第１４項記載の試験具。 １７）ＡがＮ−ブロックされたＬ−アラニネートである
   特許請求の範囲第１４項記載の試験具。 １８）ＡがＮ−ブロック娘れたＬ−アラニネートを表わ
   し；Ｒがフェニルを表わし；ＸがＲＮ’を表わし；Ｒ３
   及びＲ′は共に水素を表わす特許請求の範囲第１４項記
   載の試験具。 １９）担体マトリックスに更に促進剤を含有せしめた特
   許請求の範囲第１４〜第１８項のいずれかに記載の試験
   具。 ２０）促進剤が炭素原子数１〜１５のアルコールである
   特許請求の範囲第１９項記載の試験具。 ２１）促進剤が炭素原子数８〜１５のアルコールである
   特許請求の範囲第１９項記載の試験具。 ２２）担体マトリックスにジアゾニウム塩カップリング
   剤が更に含有せしめられた特許請求の範囲第１４〜第１
   ８項のいずれかに記載の試験具。 ２３）ジアゾニウム塩が構造式 （式中、Ｂは水素又はＯＲを表わし；Ｄはアニオンを表
   わし；Ｇは、同一でも、異なっていてもよいが、水素、
   低級アルキル又はアリールを表わすか、或いは、両方の
   Ｇが共同して１つの縮合環構造を形成する） を有する双性イオンである特許請求の範囲第２２墳記載
   の試験具。 ２４）塩が１−ジアゾ−２−ナフトール−４−スルホネ
   ートである特許請求の範囲第２２項記載の試験具。 ２５）担体マ）　ＩＪラックス更に促進剤を含有せしめ
   た特許請求の範囲第２３項記載の試験具。 ２６）促進剤が炭素原子数１〜１５のアルコールである
   特許請求の範囲第２５項記載の試験具。 ２７）促進剤が炭素原子数８〜１５のアルコールである
   特許請求の範囲第２５項記載の試験具。 ２、特許請求の範囲第１４〜第１８項のいずれかに記載
   の試験具に試験試料を接触させ、検知可能な応答を観察
   することから成る、試験試料中の白血球、エステラーゼ
   又はプロテアーゼの存在を測定する方法。 ２、特許請求の範囲第１９項記載の試験具に試験試料を
   接触させ、検知可能な応答を観察することから成る、試
   験試料中の白血球、エステラーゼ又はプロテアーゼの存
   在を測定する方法。 ３０）特許請求の範囲第２０項又は第２１項記載の試験
   具に試験試料を接触させ、検知可能な応答を観察するこ
   とから成る、試験試料中の白匍球、エステラーゼ又はプ
   ロテアーゼの存在を測定する方法。 ３１）％許請求の範囲第２２項記載の試験具に試験試料
   を接触させ、検知可能な応答を観察することから成る、
   試験試料中の白血球、エステラーゼ又はプロテアーゼの
   存在を測定する方法。 ３２、特許請求の範囲第２３〜第２６項のいずれかに記
   載の試験具に試験試料を接触させ、検知可能な応答を観
   察することから成る、試験試料中の白血球、エステラー
   ゼ又はプロテアーゼの存在を測定する方法。 ３３）％許請求の範囲第２７項記載の試験具に試験試料
   を接触させ、検知可能な応答を観察するこ１（とから成
   る、試験試料中の白血球、エステラーゼ又はプロテアー
   ゼの存在を測定する方法。