DK160948B - Middel, testmateriale og fremgangsmaade til bestemmelse af tilstedevaerelsen af leukocyter, esterase eller protease - Google Patents

Description

i

DK 160948 B

o

Den foreliggende opfindelse angår et nyt middel, et nyt testmateriale og en fremgangsmåde til analyse af en testprøve for nærværelsen af analytter, såsom leukocyt--celler, esterase og protease. Opfindelsen er af særlig 5 værdi til detektering af leukocyt-niveauer i legemsvæsker, f.eks. urin, og reducerer laboratorieproceduren for en sådan bestemmelse fra en besværlig optællingsmetode, der kræver mikroskopisk iagttagelse, til en hurtig og let dyp- og aflæsningsprocedure.

10 Tilstedeværelsen af et unormalt højt niveau af leukocyter i en patients urin er en mulig indikation på sådanne patologiske tilstande som nyre-infektion eller infektion i urogenitalområdet eller anden uønsket funktion.

En nøjagtig urin-leukocytinformation kan således være et 15 uvurderligt værktøj for lægen ved diagnose og behandling af sådanne patologiske tilstande.

Traditionelt har man i den medicinske profession forladt sig på visuelle bestemmelsesmetoder til optælling af leukocyt-populationer i urinsediment eller ucentrifuge-20 ret urin, en fremgangsmåde, der kræver dyrt udstyr, f.eks. en centrifuge og et mikroskop, samt et uforholdsmæssigt højt tidsforbrug for klinikeren. Endvidere lider de traditionelle metoder af den ulempe, at der derved kun bestemmes intakte celler. Leukocyter, der forekommer i urin-25 systemet, er udsat for betingelser, der kan favorisere en udstrakt cellelyse. Det er f.eks. kendt, at leukocyt-halveringslevetiden i urin med unormalt høj pH-værdi kan være så lille som 60 minutter. Eftersom lyserede celler unddra-ger sig detektering ved visuelle undersøgelsesmetoder, kan 30 resultatet blive fejlagtigt lave bestemmelser og falske negative resultater.

Af de to metoder til mikroskopisk leukocyt-ana-lyse - urinsediment og ikke-centrifugeret, homogeniseret urin - er den førstnævnte klart den mest ønskelige. Omend 35 der kan opnås pålidelige resultater ved den sidstnævnte me-

O

DK 160948B

2 tode, anvendes iagttagelse af urinsediment i det overvældende flertal af tilfælde. Dette kræver, at urinprøven centrifugeres, og at sedimentet isoleres og underkastes mikroskopisk undersøgelse. Den, der foretager analysen, 5 optæller derpå antallet af leukocyter, der findes i synsfeltet. Dette arbejde kompliceres yderligere ved nærværelsen af andre urinbestanddele i sedimentet, f.eks. epitel-celler og saltpartikler. Det varierende indhold af sedi-mentbestanddele, set i sammenhæng med andre komplicerende 10 faktorer, herunder ikke-homogenitet af prøven og afvigende optiske styrker af det mikroskopiske udstyr, kan føre til særdeles store fejl ved den endelige bestemmelse.

Det er således åbenbart, at en hurtig og let metode til leukocyt-bestemmelse, en metode, der kan elimi-15 nere behovet for tidsrøvende metoder, samt kostbart udstyr, og som vil tilvejebringe nøjagtig respons på esterase, protease eller leukocyt-celler, hvadenten cellerne er intakte eller lyserede, ville udgøre et særdeles væsentligt fremskridt i forhold til teknikkens stade. Med den fore-20 liggende opfindelse tilvejebringes der et sådant fremskridt. Opfindelsen er endvidere baseret ikke på evnen til at se leukocyter, men på den enzymatiske aktivitet, som de udviser, og opfindelsen er derfor i det væsentlige fri for de ovenfor beskrevne unøjagtigheder.

25 Forud for den foreliggende opfindelse omfattede metoder til bestemmelse af hydrolytiske analytter anvendelsen af chromogene estere, som, når de hydrolyseres af esterase eller protease, danner et farvet alkoholisk produkt, idet den intakte ester har en farve, der afviger fra far-30 ven af den frie alkohol. Mange af disse systemer indeholder acceleratorforbindelser og diazoniumsalt-koblingsmid-ler.

35 3

DK 160948 B

O

Chromogene estere

Der eksisterer således i den kendte teknik en række referencer, der beskriver anvendelsen af visse estere, som, når de spaltes på grund af enzymatisk akti-5 vitet, resulterer i dannelsen af farve eller et andet de-tekterbart respons. I britisk patentskrift nr. 1.128.371 beskrives anvendelsen af indoxyl- og thioindoxyl-estere som nyttige chromogener til detektering af hydrolytiske enzymer i legemsvæsker. Enzymerne spalter esteren til 10 dannelse af frit indoxyl, som derpå oxideres til dannelse af det dimere produkt indigo, der er et let iagttageligt blåt farvestof. En sådan aktivitet antages at skyldes cholinesterase blandt andre enzymer. Dette patentskrift beskriver også, at udover indoxyldelen af estersubstratet 15 vælges syreradikalet med særlig reference til det enzym, der skal detekteres. Det angives f.eks., at syreradikalet kan være acetat, laurat eller stearat til detektering af henholdsvis esterase eller lipase. Til detektering af enzymer såsom phosphatase eller sulfatase kan acylradikalet 20 være uorganisk. I det britiske patentskrift bekrives således anvendelsen af chromogene estere som substrater til bestemmelse af esterolytiske enzymer, idet sådanne estere indeholder indoxyl eller thioindoxyl som den alkoholiske del af esteren, idet acyIdelen er afpasset efter det be-25 stemte enzym, der skal bestemmes.

Virkningen af omhyggelig udvælgelse af acylradi-kal er intetsteds eksemplificeret mere tydeligt end i to referencer, der viser esterase-specificitet for estere, i hvilke acylradikalet indeholder en N-beskyttet aminosyre 30 elleret N-beskyttet peptid. Det angives således af Janoff et al., Proc. Soc. Exper. Biol. Med., 136, 1045-1049 (1971), at alaninestere er specifikke substrater for esterase, der fås fra humane leukocyter. Specifikt angives det i denne reference, at en ekstrakt af humane leukocyt-granuler er 35 i stand til at hydrolysere N-acetyl-L-alanyl-L-alanyl-L- 4

DK 160948 B

0 -alanin-methylester. Endvidere hydrolyseres L-alanin-p--nitrophenylester på lignende måde til dannelse af den gule p-nitrophenol-farveform.

På lignende måde beskriver Sweetman et al., Jour.

5 Hist. Soc., 22, 327-339, anvendelsen af 1-naphthyl-N-ace-tyl-DL-alanin, 1-naphthyl-N-acetyl-L-alany1-L-alany1-L--alanin og 1-naphthyl-butyrat til påvisning af tilstedeværelsen af esterase.

I USA-patentskrift nr. 4.278.863, der er overdra-10 get til Boehringer Mannheim GmbH, kombineres disse referencer, hvorved man kommer frem til indoxyl- eller thio-indoxylesterne af aminosyrer eller peptider som et yderligere eksempel på et traditionelt colorogent substrat for leukocytisk esteraseaktivitet. I lighed med Janoff og 15 Sweetman-referencerne beskriver Boehringer-patentskriftet ækvivalensen af protease og esterase med hensyn til deres esterolytiske tilbøjeligheder.

Acceleratorer 20 Det er kendt, at esterhydrolysereaktioner kan ak tiveres ved nærværelsen af mange nucleofile midler, derunder et overmåde stort antal alkoholer. Hydrolysehastigheden af phenylacetat og p-nitrophenylacetat ved påvirkning med esterase forøges således fra 2,5 til 5,5 gange ved tilsæt-25 ning af methanol eller butanol, jfr. Greenzaid og Jencks, Biochemistry, 10(7), 1210-1222 (1971). Endvidere forøges virkningen med længden af n-alkylgruppen, jfr. Wynne og Shalatin, Eur. J. Biochem., 31, 554-560 (1972).

I særdeleshed er denne aktiveringseffekt for al-30 koholer blevet iagttaget med estere af aminosyrer. p-Nitro-phenyl-N-acetyl-L-alaninat-hydrolyse aktiveres eller accelereres ved tilstedeværelsen af methanol, jfr. Fastrez og Fersht, Biochemistry, 12(11), 2025-2034 (1973). Alkoholer med høj molekylvægt forøger hastigheden af esterase-indu-35 ceret hydrolyse af p-nitrophenyl-tert.BOC-L-tyrosinat, jfr.

5

DK 160948 B

O

Ashe og Zimmer, Biochem. and Biophys. Res. Comm., 75(1), 194-199 (1977). I USA-patentskrift nr. 4.299.917 beskrives der andre kendte ester-hydrolyse-aktivatorer, f.eks. visse metalkomplekser, pyridinderivater og imidazoler.

5

Diazoniumsalt-koblingsmidler

Anvendelsen af visse diazoniumsalte til kobling med phenoler og pseudophenoler til dannelse af azofarve-stoffer er også kendt, jfr. Martinet og Dornier, Compt.

10 Rend., 170, 592 (1920). En sådan teknik anvendes ved en esterase-analyse, ved hvilken indoxylestere hydrolyseres via esterase til dannelse af indoxyl, som derpå kobles med et diazoniumsalt til dannelse af det tilsvarende azo-farvestof, jfr. Holt og Hicks, J. Cell. Biol., 29, 261-15 -366 (1966), Gossrau, Histochemistry, 57, 323-342 (1978) samt vesttysk offentliggørelsesskrift nr. 3.017.721 (indleveringsdato 9. maj 1980).

Til sammenfatning af den baggrund af teknologiske udviklinger, der fører frem til den foreliggende op-20 findelse, kan det nævnes, at der kendes adskillige metoder til bestemmelse af hydrolytiske enzymer og leokocyt-celler i opløsning. Til måling af leukocyt-polylationer i f.eks. urin har mikroskopi længe været den foretrukne metode. Teknikeren har således måttet fremstille et mi-25 kroskoppræparat af en urinprøve og optælle antallet af leukocytceller i mikroskopets synsfelt, en procedure, der kræver et uforholdsmæssigt stort forbrug af tid og et dyrt udstyr, f.eks. et mikroskop og en centrifuge.

Kemiske og biokemiske metoder afløser hurtigt 30 mikroskopet til bestemmelse af leukocyter ved diagnostiske metoder og er tidsbesparende værktøjer i research-laboratoriet. Chromogene estere, der har udgjort hjørnestenen af kemiske tests, omfatter de følgende alkoholiske og acyIdele.

35

w DK 160948B

β Ο

Alkoholiske (phenoliske) dele Acylgrupper indoxyl acetat thioindoxyl butyrat p-nitrophenyl laurat 5 α-naphthol stearat aminosyre peptid

Kemiske metoder, ved hvilke der anvendes sådanne 10 estere, er blevet understøttet af forskellige hydrolyseacceleratorer samt diazoniumsalt-koblingsmidler. Som acceleratorer er der blevet anvendt mange alkanoler, og dette gælder ligeledes visse metalkomplekser, pyridinderivater og imidazoler. Diazoniumkationer med egnede anioner, der er 15 bundet ionisk eller forbundet dermed, er velkendte som koblingsmidler til sådanne kemiske metoder, hvor alkoholen (phenolen), der dannes ved hydrolyse af esteren, kobles med diazoniumsaltet til dannelse af et azofarvestof.

Det er opfindelsens formål at tilvejebringe et mid-20 del, et testmateriale og en fremgangsmåde, der let og hurtigt giver et nøjagtigt respons på esterase, protease eller leukocyt-celler, hvadenten cellerne er intakt eller lyserede.

Dette opnås med den foreliggende opfindelse, hvor 25 der tilvejebringes et nyt testmiddel, et nyt testmateriale og en fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af leukocyter, esterase eller protease i en testprøve. Midlet indeholder en ester med strukturformlen

30 _X)—A

XT α) i hvilken A betegner en N-blokeret aminosyrerest eller en 35 N-blokeret peptidsyrerest, X betyder 0, S eller NR', R be- 7

O

DK 160948 B

tegner aryl eller lavere alkyl, Rx betegner hydrogen eller lavere alkyl, og R' betyder hydrogen, lavere alkyl eller aryl. Desuden omfatter midlet et egnet pufferstof. Midlet kan også omfatte en accelerator, f.eks. en alkanol med 1-15 5 carbonatomer, og/eller et diazoniumsalt-koblingsmiddel.

Testmaterialet indeholder en bærematrix inkorporeret med esteren og puffer og kan yderligere omfatte acceleratoren og/eller koblingsmiddel.

Fremgangsmåden til anvendelse af midlet eller ma-10 terialet omfatter tilvejebringelse af kontakt mellem en testprøve, der antages at indeholde leukocytceller, esterase eller protease, med midlet eller testmaterialet, hvorpå der iagttages et detekterbart respons.

Visse udtryk, der anvendes i den foreliggende be-15 skrivelse, bør nævnes her til sikring af, at læseren vil være klar over deres respektive betydninger. Der skal således angives de følgende definitioner til klarlæggelse af opfindelsens omfang og til muliggørelse af dens formulering og anvendelse.

20 Udtrykkene "N-blokeret aminosyrerest" og "N-bloke ret peptidrest" kræver definition i to henseender. "N-blokeret" referer til de kemiske forhold for amingruppen i en aminosyre eller i et peptid, hvor et hydrogenatom bundet til nitrogenatomet er erstattet med en beskyttende gruppe såsom 25 acetyl, p-toluensulfonyl (tosyl), tert.butyloxycarbonyl (tert.BOC) og andre N-beskyttende grupper, der kendes i teknikken.

Ved udtrykkene "aminosyrerest" og "peptidrest" skal der forstås et aminosyre- eller peptid-molekyle uden 30 OH-gruppen i carboxylgruppen.

Ved udtrykket "aryl" skal der forstås ethvert ringsystem indeholdende aromaticitet. Omfattet af udtrykket er sådanne 5- og 6-leddede ringe som pyrrol, phenyl og pyridyl samt kondenserede ringsystemer såsom naphthyl.

35 Det aromatiske ringsystem kan således være heterocyclisk

DK 160948 B

8

O

eller homocyclisk, eller det kan være substitueret eller usubstitueret, forudsat at substituentgruppen eller -grupperne ikke interfererer med midlets evne til at hydrolysere i nærværelse af leukocytceller, esterase eller protea-5 se. Udvælgelsen af sådanne substituenter er en rutinemæssig laboratoriebestemmelse på basis af den foreliggende beskrivelse.

Det her anvendte udtryk "lavere alkyl" betegner en alkyldel indeholdende fra ca. 1 til ca, 6 carbonatomer.

10 Omfattet af betydningen af lavere alkyl er methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, sek.butyl, tert.butyl og alle isomere af pentyl og hexyl. Disse kan være usubstitue-rede, eller de kan være substituerede, forudsat at de ikke interfererer med midlets eller testmaterialets evne 15 til detektering af leukocytceller, esterase eller protease.

Udtrykket "egnet pufferstof" betegner en puffer, der, når den bringes i kontakt med en vandig testprøve, vil tilvejebringe en resulterende pH-værdi på mindst ca. 7.

20 Pufferen er fortrinsvis en sådan, der er i stand til at tilvejebringe en pH-værdi i området fra ca. 7 til ca. 10, optimalt fra 8,5 til 9,0. Borsyre-NaOH, bicin (N,N-bis--[2-hydroxyethyl]-glycin eller CHES (2-[N-cyclohexylami-no]ethansulfonsyre) er eksempler på egnede pufferstoffer.

25 Udtrykket "accelerator" refererer til enhver for bindelse, der tjener til at forøge hastigheden af hydrolyse af de her beskrevne chromogene estere. Omfattet af udtrykket er sådanne kemisk forskellige substanser som py-ridin, imidazol og deres derivater, metalkomplekser med 30 formlen D- [B(CN) (N0)1 , hvor D betegner et alkalimetal-m n p atom, B betegner en tungmetalion, p betegner 0 eller 1, m betyder 2-5, n betyder 4-8, og m er summen af n og valensen af B, samt alkoholer. Egnede alkoholer indeholder fra 1 til ca. 15 carbonatomer. Lineære alkoholer foretræk-35 kes i forhold til forgrenede alkoholer, omend de sidstnævnte omfattes af opfindelsen.

9

DK 160948 B

O

Betegnelsen "kondenseret ringsystem" betyder to eller flere aromatiske ringe, der deler et par carbonato-mer. Eksempelvis i strukturen N2 +

. I Θ-Κ (IIJ

kan begge substituenterne G tilsammen danne det kondense-10 rede ringsystem med formlen

K

(OIOj ciii) S03- i hvilken begge substituenterne G tilsammen betegner .

Et yderligere eksempel er 20 N2 + 25 SOj hvor begge substituenterne G tilsammen betegner -fCI^CH-CENN)·.

Det kondenserede ringsystem er således polynucleært, aromatisk og kan være heterocyclisk eller homocyclisk.

Udtrykket "detekterbart respons" skal her betegne 30 en ændring i eller fremkomsten af en parameter i et testmaterialesystem, der kan opfattes, enten ved direkte iagttagelse eller ved hjælp af et instrument, og som er en funktion af tilstedeværelsen af en specifik analyt i en vandig testprøve. Nogle detekterbare respons-former er ændringer i 35 eller forekomsten af farve, fluorescens, reflektans, pH-vær-di, kemiluminescens og infrarøde spektre.

DK 160948 B

10 o

Midlet ifølge den foreliggende opfindelse omfatter en ester og en puffer. Omend der er store valgmuligheder ved udvælgelse af disse bestanddele, findes der foretrukne udførelsesf omer for hver, der giver de maksimale 5 resultater, dvs. en høj grad af detekterbart respons udviklet i løbet af kort tid. Denne optimering kan yderligere fremmes ved indførelse af en accelerator og/eller et diazoniumsalt i midlet.

10 Esteren Såvel midlet som testmaterialet ifølge opfindelsen indeholder en ester med formel I og en egnet puffer.

Den foretrukne ester er en sådan, i hvilken X betegner NR', og hvor den foretrukne R1-substituent er hydrogen.

15 En anden foretrukken udførelsesform er det tilfælde, hvor acyIdelen, A, er en N-blokeret aminosyrerest, især N-blo-keret L-alaninat. Det foretrækkes især at anvende forbindelsen ϋ 20 _ n—C — CH-CH3 - ΠΓ X tv) ©rr h ts 25 som ester, idet i denne formel Ts betyder p-toluensulfonat, dvs. forbindelsen I, i hvilken A betyder N-Ts-L-alaninat,

Rx betyder H, R betyder phenyl, og X betyder NH.

Pufferen 30 Som angivet ovenfor omfatter pufferstoffet en lang række forskellige forbindelser. Det foretrukne pH-område, der skal frembringes af pufferen, ligger fra ca. 7 til ca.

10, idet det optimale pH-område ligger fra 8,5 til 9,0.

Til opnåelse af dette optimale pH-område foretrækkes det i 35 øjeblikket at anvende borsyre-NaOH, bicin (N,N-bis-[2-hy-

DK 160948B

11 o droxyethyl]glycin) eller CHES (2-[N-cyclohexylamino]-ethan-sulfonsyre) som puffer.

Acceleratoren 5 Midlet ifølge opfindelsen kan udover esteren og pufferen omfatte forskellige acceleratorer som nævnt ovenfor. Alkoholer har vist sig at være særligt anvendelige i til forøgelse af esterase- og protease-katalyseret hydrolyse af de her omhandlede estere. Alkoholer med 8-15 carbon-10 atomer foretrækkes til dette formål, medens decanol, unde-canol og dodecanol foretrækkes til anvendelse sammen med testmaterialet, primært på grund af deres lave flygtighed sammenlignet med alkoholer med lavere molekylvægt.

i 15 Diazoniumsaltet

Midlet kan også omfatte et diazoniumsalt som et koblingsmiddel. Deltagelsen af diazoniumsaltet i den totale reaktion kan illustreres ved hjælp af følgende reaktionsskema: 20 VT R ΓΤ 1 H01 rAx> h2) r'M"'

R1 ^0 Itf_^0H

+ Ar"N+ - N —^ ΊΓ1 (VI) 25 rAx/ R^N^N-N-Ar 35

41 X

hvor ArN SN betegner diazoniumsaltet, og A, R, R og X har den ovenfor angivne betydning. Reaktionsproduktet VI er et azofarvestof, der kan udvise en dyb, distinktiv farve.

JL

30 Saltet ArN =N kan have en lang række betydninger.

Generisk er der tale om et aromatisk diazoniumsalt, og det har den følgende generiske struktur.

O

DK 160948 B

12 P R" ' + R"j[OTR" D- tvII) 5 RM ^ R" hvor R", der er ens eller forskellige, betyder hydrogen, lavere alkyl eller aryl, eller hvor to tilstødende sub-10 stituenter R" tilsammen danner et kondenseret ringsystem, idet dog én af substituenterne R" betyder -N =N, dvs. dia-zonium. Y betegner N eller CR". D er en anion, f.eks. chlo-rid eller bromid eller en anden passende modion til diazoni-um-delen.

15 Et diazoniumsalt, der er selvstændigt, dvs. en zwit- terion, tjener som et fortrinligt koblingsmiddel. Sådanne forbindelser har strukturformlen 20 ^TøYLd- mm i hvilken B betyder hydrogen, lavere alkyl eller OH, D~ er en covalent bundet anion, substituenterne G, der er ens el-25 ler forskellige, betegner hydrogen, lavere alkyl eller aryl, eller begge substituenterne G tilsammen danner et kondenseret ringsystem.

Zwitterionen er således en type diazoniumsalt, hvor modionen til diazoniumgruppen er covalent bundet til ring-30 systemet. Eksempler på sådanne anioner omfatter sulfonat (SO^ ), carbonat (CO2 ), phosphonat (P03 ) og andre. Det har vist sig at være mest fordelagtigt at anvende 1-diazo--2-naphthol-4-sulfonat.

Det ovenfor beskrevne middel kan anvendes som så-35 dant til bestemmelse af leukocyter, esterase eller protease, 13

DK 160948 B

O

eller det kan inkorporeres i en bærematrix til dannelse af et testmateriale, hvorved der tilvejebringes et værktøj til hurtig og pålidelig bestemmelse af tilstedeværelsen af analytten. Bærematrixen er almindeligvis, men ikke 5 nødvendigvis et porøst stof såsom filtrerpapir. Andre i teknikken anerkendte former for bærematrixmaterialer er filt, porøse keramiske strimler og vævede eller matterede glasfibre, jfr. USA-patentskrift nr. 3.846.247. Anvendelsen af træ, stof, svampemateriale og leragtige materialer 10 er også blevet foreslået, jfr. USA-patentskrift nr.

3.552.928. Alternativt kan bærematrixen være ikke-porøs, f.eks. forskellige polymere film og glas. Alle sådanne bærematrixmaterialer er egnede til anvendelse i forbindelse med opfindelsen ligesom andre materialer. Det har vist sig, 15 at filtrerpapir er særlig egnet.

Ved en foretrukken fremgangsmåde til fremstilling af materialet fugtes et stykke filtrerpapir med en vandig opløsning af pufferen. Denne første neddypningsopløsning kan også indeholde forskellige behandlings-strækkemidler, 20 f.eks. et detergent, et siettemiddel såsom polyvinylpyrro-lidon og andre indifferente bestanddele. Det imprægnerede

Det imprægnerede filtrerpapir tørres derpå og fugtes med en anden neddypningsopløsning, i acetone eller et andet ikke-vandigt opløsningsmiddel, der indeholder esteren 25 og om ønsket tillige acceleratoren og/eller diazoniumsaltet.

Det to gange imprægnerede papir tørres dernæst en yderligere gang, hvorved der fås et testmateriale, der er følsomt over for nærværelsen af leukocyter eller andre analytter.

Den tørrede, reagensbærende bærematrix kan om øn-30 sket monteres på et bagklædningsmateriale. I en foretrukken udførelsesform for testmaterialet er en filtrerpapir-bære-matrix inkorporeret med midlet som beskrevet ovenfor, idet matrixen er fastgjort til den ene side af et aflangt stykke transparent polystyrenfilm. Matrixen er fastgjort til 35 filmen på en vilkårlig egnet måde, f.eks. ved hjælp af et

O

DK 160948 B

14 dobbeltsidet, adhæsivt stykke tape (Double Stick®fra 3M Company), idet den anden ende af polystyrenfilmen tjener som et håndgreb. Ved anvendelsen holdes et sådant materiale i den frie ende af polystyrenfilm-bagklædningsmateria-5 let, og matrix-enden nedsænkes i testprøven, f.eks. urin, og fjernes hurtigt igen. Enhver farvedannelse eller andet detekterbart respons iagttages efter et forud bestemt tidsrum og sammenlignes med en referencestandard, der svarer til respons på kendte koncentrationer af leukocytter eller 10 andre analytter med esterase- eller proteaseaktivitet. Det har vist sig, at en inkuberingstid på fra ca. 1 til ca. 3 minutter sædvanligvis er tilstrækkelig til at opnå, at der fremkommer farveudvikling i det reagensholdige filtrerpapir.

De følgende eksempler tjener til yderligere assi-15 stance ved fremstilling og udøvelse af opfindelsen. Der beskrives således foretrukne udførelsesformer i eksperimentelle detaljer, og der foretages analyse af resultater. Eksemplerne er kun tænkt som illustrerende, og de skal på ingen måde opfattes som begrænsende for omfanget af den her 20 omhandlede opfindelse.

Generelle oplysninger

Infrarøde (ir) spektre optages med et Perkin-El-mer model 710B eller 237 infrarødt spektrofotometer som op-25 løsninger i CHC13, medmindre andet er anført. 1602 cm ^-bån-det af polystyrenfilm anvendes som en ekstern kalibreringsstandard. Signaler angives som cm \

Kernemagnetiske resonansspektre (½ NMR) optages ved 89,55 MHz under anvendelse af et JEOL FX-900-spektrome-30 ter eller ved 60 MHz under anvendelse af et Varian T-60- -spektrometer. Spektre optages i CDC13-opløsning, medmindre andet er anført. Kemiske ombytninger er angivet i dele pr.

million i nedadgående retning fra den interne standard tetramethylsilan.

13

Carbon-13-magnetiske resonansspektre ( C 35 NMR) optages ved 22,5 MHz under anvendelse af et JEOL

15

O

DK 160948 B

FX90Q-spektrometer med Fourier-transformation og med fuld proton-bredbånds-støjafkobling. Spektre optages i CDClg--opløsning, medmindre andet er anført. Carbon-skift angives i dele pr. million i nedadgående retning fra den interne 5 standard tetramethylsilan.

Massespektre (MS) optages på et Hewlett-Packard 5985A spektrometer, der anvendes enten ved "electron impact" -(El) eller ved "fast atom bombardment?' (FAB)-metoden. Højopløsningsmassespektre optages på et AEI MS-902-spek-10 trometer.

Organiske reagenser fås fra Aldrich Chemical Company og anvendes uden rensning, medmindre andet er anført. Uorganiske reagenser er af ACS-reagenskvalitet fra Fisher Scientific Company eller en anden hovedleverandør.

15 Reaktionsopløsningsmidler er af ACS-reagenskvalitet. Tetra-hydrofuran (THF) er af HPLC-kvalitet fra J.T. Baker Chemical Company. Brine henviser til en mættet vandig natriumchlo-ridopløsning.

Tyndtlagschromatografi (TLC) udføres under an-20 vendelse af silicagel 6OF-254-plader fra E. Merck. Søjle-chromatografi udføres under anvendelse af E. Merck silicagel 60 (70-230 mesh). Alle angivne smeltepunkter og kogepunkter er ukorrigerede.

25 Fremstilling af esteren

De følgende forsøg udføres til illustration af syntesen af den her omhandlede ester. Omend disse forsøg vedrører specifikke udgangsmaterialer og slutprodukter, må det antages, at metoderne kan anvendes i forbindelse 30 med et bredt område af forbindelser, der er omfattet af den generiske gruppe estere, der her er tale om.

35

16 DK 160948 B

O

Eksempel 1

Syntese af 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-5-phenylpyrrol (4)

Syntesen af 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-5-phenylpyrrol er illustreret i det følgende reaktionsskema

5 . COOH .COOH

Γ KHSO,, H;0,. Η« A\cetone, NaHCO^ 10

KOH/EtOH

15 /COOV

ΗΠ + Glycin CM

v-Of"* J- Or '— \hch2coo‘k+ ioæc;5 20 Ac20

Pyridin

12CPG

ψ

°H

nr°'AC · _rT

JL , il 1) Na0H,Me0H/H70 ' ίΤΛΓ N -Ϊ \( )T h C«) IL·/) I 0°C C3)

Ac 2) H30+ 30 + 35

O

DK 160948 B

17

O

II O

_^O-C-CH-CIL || li il l s TiiF Cl -C-CH-CH, C^) ,JJ N\ ^-~- 1 ύ t Is Pyridin · TFA /^\ K/J Π 0eC H Ts N-Tosyl-L-alanin 10 100 g (1/11 mol) L-alanin opløses i 2,25 liter 1 N vandig natriumhydroxidopløsning, afkøles til 5°C og omrøres, medens der langsomt tilsættes en opløsning af 218 g (1/11 mol) p-toluensulfonylchlorid opløst i 450 ml toluen. Blandingen omrøres ved omgivelsernes temperatur 15 i 20 timer. Lagene adskilles, og det kraftigt afkølede vandige lag syrnes til en pH-værdi på 1 med koncentreret saltsyre. Det hvide faste stof, der er angivet i overskriften, opsamles ved filtrering, vaskes med vand og tørres. Udbytte 178,5 g (66%) med smp. 134-135°C. IR (CHCl^) 20 cm*"1 1726, 1340, 1165, 1095; XH NMR (DMSO-Dg) 61,20 (d, J=7,3H), 2,40 (s, 3H), 3,85 (p, J=8, IH), 6,4 (br s, IH) (C02H), 7,41 (d,|jAB|=8, 2H) og 7,75 (d, |jab|=8, 2H) [center for mønster: 7,58; AV,.=20, 49Hz], 8,03 (br d, J=8, IH) (NH).

25

N-Tosyl-L-alaninylchlorid Metode A

En blanding af 12,4 g (0,05 mol) N-tosyl-L-ala-nin og 25 ml thionylchlorid opvarmes i 90 minutter til 30 55°C og koncentreres dernæst på en rotationsfordamper ved 40°C. Den røde faste remanens opløses i 200 ml kogende CCI4, affarves med 20 g ovntørret Norit ®211 (American Norit Company, Inc.), filtreres og afkøles kraftigt. Det cremefarvede faste produkt, der er angivet i overskrif-35 ten, opsamles ved filtrering, vaskes med hexan og tørres.

DK 160948 B

18 o

Udbytte 8,48 g (65%) med smp. 101-101,5°C. IR (CHC13) cm 3360, 3260, 3025, 1775, 1606, 1350, 1170, 910; 1H NMR (CDC13) 1,48 (d, J=7, 3H), 2,43 (s, 3H), 4,33 (p, J=8, IH), 5,93 (br d, J=8, IH) (NH), 7,31 (d, |jab|=8, 2H) 5 og 7,76 (d, |jab|=8, 2H) (center for mønster: 7,53; &VAB= 26,83 Hz].

Analyse, beregnet for C10H12C1N03S: C = 45,89%, H = 4,62%, N = 5,35% fundet: C = 46,63%, H = 4,90%, N = 5,19%.

10

Metode B

En blanding af 3,1 g (13 mmol) N-tosyl-L-alanin og 6 ml thionylchlorid opvarmes i 90 minutter til 50°C, hvorefter der fortyndes med 50 ml tør hexan. Blandingen 15 omrøres hurtigt, afkøles kraftigt, og det faste produkt skilles fra ved filtrering. Udbyttet udgør 3,15 g (93%) med smp. 99-100°C. IR-spektret er identisk med IR-spek-tret for det omkrystalliserede materiale, der fremstilles ved hjælp af metode A.

20 2-Hydroxy-3-(carboxymethylamino)-hydrokanelsyre-dikalium-salt-dihydrat (1)

En omrørt opslæmning af 1,0 kg (6,75 mol) trans--kanelsyre i 4,5 liter acetone behandles først med 2,47 kg 25 (29,4 mol eller 4,36 ækvivalenter) NaHC03 og dernæst om hyggeligt med 4,5 liter vand. Den fremkomne tykke blanding behandles dråbevis i løbet af 1,5 til 2,0 timer med en opløsning af 0Χ0ΝΕ ®(du Pont Co.) monosulfatforbindelse (3,78 kg, der indeholder 1,825 ækvivalenter KHSO^) i 30 0,4 mM vandig dinatriumethylendiamin-tetraeddikesyre (EDTA) (14,5 liter, fremstillet ved opløsning af 2,17 g dinatrium-EDTA-dihydrat i 14,5 1 destilleret vand), jfr.

J.O. Edwards et al., Photochem. Photobiol., 30, 63 (1979) og R. Corel et al., J. Org. Chem., 45, 4758 (1980). Under 35 denne tilsætning holdes reaktionstemperaturen ved 24-27°C

DK 160948B

19

O

under anvendelse af et vandbad. Reaktionsblandingens pH--værdi iagttages til ca. 7,4. Efter at tilsætningen er afsluttet, omrøres blandingen i yderligere 1/2 time, hvorpå den afkøles til ca. 10°C. Reaktionsblandingen syrnes med 5 ca. 1,2 liter koncentreret saltsyre til pH-værdi på 2, idet temperaturen opretholdes ved ca. 10°C, hvorpå der behandles med 5,05 liter CH2CI2 og cmrøres kraftigt i 10 minutter.

Efter at blandingen har fået lov at sætte sig, af-dekanteres det vandige lag, og det organiske lag, der in-10 deholder uopløselige salte, filtreres gennem papir under sugning. De frafiltrerede faste stoffer vaskes med 1,9 liter CH2CI2, og det vandige lag ekstraheres med dette filtrat. De frafiltrerede faste stoffer vaskes igen med 3,15 liter CE^C^, og det vandige lag ekstraheres med det-15 te filtrat. De kombinerede Cl^C^-lag ekstraheres med en opløsning af 593,3 g KOH i 6,31 liter vand, idet forsigtig opvarmning til ca. 40°C ofte kræves til opløsning af et fast stof, der kan udskilles under baseekstraktionen. Cl^Clj-laget ekstraheres derpå med en opløsning af 99 g 20 KOH i 1,5 liter vand, og de kombinerede baseekstrakter behandles med 481,7 g glycin (6,416 mol eller 0,95 ækvivalenter) , og det organiske lag bortkastes.

Opløsningens pH-værdi indstilles på 11,5 med 25%'s vandig KOH-opløsning, hvorpå der opvarmes til kog-25 ning. Der afdestilleres ca. 900 ml lavtkogende væske (acetone og vand), indtil damptemperaturen når 99°C, hvorefter blandingen tilbagesvales i 2 timer. Efter afkøling ekstraheres reaktionsblandingen med 3,5 liter C^C^, hvorefter C^C^-fasen kasseres, og den vandige fase ind-30 dampes til tørhed under formindsket tryk ved hjælp af et 70°C varmt bad. Remanensen koges i 8,83 liter 95%'s ethanol i 30 minutter, hvorpå der afkøles langsomt under omrøring, hvorved produktet udskilles i form af fine krystaller. Disse skilles fra ved filtrering, vaskes med 35 1,26 liter frisk 95%'s ethanol og tørres i en ovn ved

O

DK 160948 B

20 50-60°C, hvorved der fås den i overskriften angivne forbindelse i en mængde på 1,77 kg (74,6%) i form af hvide krystaller med smp. 120-122°C (ukorrigeret).

IR (KBr) cm ^ 3420 (br.), 1590 (br.), 1410, 1130, 5 710; 1H NMR (D20-TSP) 63,1 (s, 2H) , 3,89 (d, |jABj=4, IH) og 4,52 (d, |jABj=4, IH) (center for mønster: 4,21; Avab= 18,83 Hz.), 4,68 (s, 6H, udskiftelige protoner), 7,4 (s, 5H); TLC R^ = 0,59 (EtOHrlM triethylammonium-bicarbonat, 7:3) .

10 Analyse, beregnet for chh;l5N07K2 : C = 37,59%, H = 4,30%, N = 3,99% fundet: C = 37,22%, H = 4,24%, N = 3,96%.

N-Acetyl-3-acetoxy-5-phenylpyrrol (2) 15 En suspension af 1,0 kg (2,84 mol) 2-hydroxy-3- -(carboxymethylamino)-hydrokanelsyre-dikaliumsalt-dihy-drat (1) i 3,0 liter pyridin behandles med 4,0 liter eddike syreanhydr id ved omgivelsernes temperatur under en indifferent gasatmosfære. Der foregår en mild eksoterm 20 reaktion, og reaktionstemperaturen stiger eksponentielt til 60-70°C i et tidsrum på 1,5-2,5 timer. Når reaktionsblandingen begynder at køle af, opvarmes blandingen til 120-123°C i 15 minutter, hvorpå den får lov at afkøle til omgivelsernes temperatur i løbet af 1 time, i hvilket 25 tidsrum pyridinium-acetat udskilles i form af krystaller. Blandingen filtreres gennem papir under sugning, og saltene vaskes med EtOAc, indtil de er farveløse. Filtratet inddampes til tørhed i vakuum.

Den mørkerøde remanens opløses i 3,0 liter EtOAc, 30 vaskes tre gange med 1,0 liter vand pr. gang, tørres over MgSO^ og behandles med 300 g Darco ^G60 (ICI Americas,

Inc.). Efter omrøring i 30 minutter filtreres blandingen gennem Celite ^(Johns-Manville) og inddampes til tørhed i vakuum, hvorved der fås en rødlig-orange olie. Denne 35 olie opløses i 1,2 liter varm 2-propanol, hvorpå opløsnin- 21

DK 160948 B

O

gen får lov at afkøle langsomt til omgivelsernes temperatur natten over, hvorefter der udskilles et fast stof. Det krystallinske produkt skilles fra ved filtrering, vaskes med 50%'s vandig 2-propanol og tørres i vakuum, hvorved der 5 fås 417 g (60%) af den i overskriften angivne forbindelse med smp. 58-60°C (ukorrigeret). En portion optages i di-ethylether, behandles med Norit 211, filtreres og koncentreres under formindsket tryk. Ved henstand ved 0°C udskilles der farveløse smånåle. Disse skilles fra ved fil-10 trering, vaskes med en blanding af diethylether og hexan i forholdet 1:1 og vakuumtørres, hvorved der fås en analytisk prøve med smp. 60-62,5°C (ukorrigeret).

IR (CHC13) cm-1 3020, 1760, 1730, 1595, 1378, 1320, 1220 (br.), 1030, 960, 903? 1H NMR (CDC13) 82,23 (s, 15 3H), 2,27 (s, 3H), 6,18 (d, J=2, IH), 7,35 (s, 5H), 7,42 (d, J=2, IH); TLC = 0,56 (toluensdioxan, 4:1).

Analyse, beregnet for C^H-^NOg: C = 69,12%, H = 5,38%, N = 5,76% fundet: C = 68,88%, H = 5,25%, N = 5,53%.

20 3-Hydroxy-5-phenylpyrrol (3)

En findelt portion på 36,8 g (0,15 mol) N-acetyl--3-acetoxy-5-phenylpyrrol (2) befries for oxygen ved omrøring i en løbende argonstrøm i 10 minutter, hvorpå der 25 suspenderes i 379 ml deoxygeneret MeOH, afkøles til -6°C

(i et bad af -15°C kold methanol (MeOH) og tøris) under en indifferent gasatmosfære og behandles hurtigt med iskold deoxygeneret opløsning af 300 ml 2 N NaOH. Reaktionstemperaturen stiger umiddelbart ved tilsætning af base til 18°C, 30 og efter 3 timers forløb bliver reaktionsblandingen homogen. Efterhånden som reaktionsblandingen køler af, udskilles forbindelsen (3) i form af fine krystaller. Efter 15 minutter tilsættes der en opløsning af kold deoxygeneret 2 m citronsyre (150 ml), og den fremkomne blanding omrøres i 35 lo minutter og filtreres dernæst. Det faste stof vaskes

DK 160948B

O

22 grundigt med 200 ml deoxygeneret vand, idet der drages omsorg for at nedsætte udsættelsen af produktet for luften til et minimum, hvorpå der tørres under vakuum natten over, hvorved der fås den i overskriften angivne forbindelse i 5 en mængde på 22,3 g (93,6%) i form af lyst lyserøde smånåle.

IR (KBr) cm-1 3400, 3110, 2900, 1600, 1580, 1555, 1480, 1268, 1180, 742, 640·, ΧΗ NMR (DMSO-D6) S 6,1 (m, IH), 6,3 (m, IH), 7,0-7,7 (m, 5H), 8,0 (s, IH), 10,4 (br s, IH); TLC Rf = 0,20-0,28 (EtOH:CHCl3, 1:9).

10 Analyse, beregnet for C^qH^NO: C = 75,45%, H = 5,70%, N = 8,80% fundet: C = 75,30%, H = 5,69%, N = 8,67%.

3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-5-phenylpyrrol (4) 15 En opløsning af 450 ml vandfri tetrahydrofuran (THF), 43,8 ml (0,542 mol eller 1,2 ækvivalenter) pyridin og 85,0 ml (1,10 mol eller 2,4 askvi valenter) trif luoreddi-kesyre, der holdes ved 0°C under en indifferent gasatmosfære, behandles i én portion med 71,5 g (0,45 mol eller 0,1 20 ækvivalent) 3-hydroxy-5-phenylpyrrol (3), umiddelbart efterfulgt af dråbevis tilsætning i løbet af 5-10 minutter af en opløsning af 141,0 g (0,54 mol eller 1,2 ækvivalenter) frisk fremstillet N-tosyl-L-alaninyl-chlorid i 450 ml vandfri THF. Den fremkomne blanding omrøres i 15 minutter ved 25 0°C. Reaktionen standses derpå ved tilsætning af 315 ml af en opløsning af 1,0 M vandig citronsyre og 1,35 liter EtOAc. Efter kortvarig blanding skilles faserne, og det organiske lag vaskes med en opløsning af 360 ml vandig NaCl (0,18 g NaCl pr. ml vand). Det organiske lag ekstraheres derpå to 30 gange med en opløsning af 5%*s vandig NaHC02 (1,35 liter pr. gang), og vaskes derpå med en yderligere portion vandig NaCl (360 ml indeholdende 0,18 g NaCl pr. ml vand). Det rød-ligt-brune organiske lag omrøres ved omgivelsernes temperatur i 15 minutter med 101 g MgSO^ og 143 g Darco-G60, hvor-35 på der filtreres gennem Celite og inddampes til tørhed i

O

DK 160948 B

23 vakuum fra et bad med en temperatur på 37°C, hvorved forbindelsen (4) fås i form af et lyserødt-hvidt, fast stof.

Det rå produkt formales til et pulver og opløses i 250 ml varm (50°C) THF, omrøres kraftigt og fortyndes med 250 ml 5 n-hexan. Omrøringen fortsættes i 1 time ved omgivelsernes temperatur, idet produktet krystalliserer. Det faste stof skilles fra ved filtrering, vaskes med ca. 1,0 liter toluen, indtil filtratet er farveløst, og tørres derpå i vakuum natten over, hvorved der fås 112 g (65%) af den i over-10 skriften angivne forbindelse i form af et hvidt pulver med smp. 154,5-155°C.

IR (KC1) cm"1 3350, 3325, 1760, 1508, 1320, 1155, 770? 1H NMR (DMS0-d6) S 1,33 (d, J=7, 3H), 2,36 (s, 3H), 4,13 (p, J=8, IH), 6,25 (m, IH), 6,73 (m, IH), 7,05-7,50 15 (m, 5H), 7,5-7,85 (m, 4H), 8,42 (d, J=8, IH), 11,18 (br s, IH); 13C NMR (DMSO-d6) dpm 18,335, 21,001, 51,370, 98,061, 108,336, 123,423, 126,024, 126,610, 128,560, 128,756, 129,601, 132,397, 137,600, 138,380, 142,737, 169,919; [a]D = -70° (c=l,ll, MeOH); TLC R^ = 0,45 (EtOAc: hexan, 20 1:1); TLC R^. = 0,40 (toluenrdioxan, 4:1).

Analyse, beregnet for : C = 62,48%, H = 5,24%, N = 7,29% fundet: C = 62,62%, H = 5,27%, N = 7,30%.

25 Eksempel 2

Syntese af 3-(N-tosylalaninyloxy)-5-phenylthiophen (9)

Der udføres en række forsøg til fremstilling af 3-hydroxy-5-phenylthiophen ved mindre modifikationer af de i litteraturen rapporterede metoder, jfr. P. Friedlander 30 og S. Kielbasinski, Chem. Ber., 45, 3389 (1912) og A.I. Kosak, R.J.F. Palchak, W.A. Steele og C.M. Selwitz, J. Amer.

Chem. Soc., 76, 4450 (1954). Den fremkomne hydroxythiophen acyleres derpå med N-tosyl-L-alaninyl-chlorid, hvorved der fås den tilsvarende N-tosyl-L-alaninat-ester i 46%'s udbyt-35 te (ikke-optimeret procedure).

24

DK 160948B

0

^ cooc2h5 _O

1 OΓ -£r 0°

a. Na2S

10 b. BrClt2COniI

pH=8,7 ” -ssr- Ø17^ »

NaOH

H?0 20 2

Me OH

O

II

C1-C-CH-CH3 ._.OH Λ ^°-C-CH-CH3 25 ^JTT H TS ^JUJ1 /N- K j\ (5) CH2C12 tfyridiil· (5) 30 35

O

25 DK 160948B

3-Phenyl-l,2-dithia-3-cyclopenten-5-on (5)

En suspension af 10 g ethylcinnamat (56,82 irrmol) og 10 g svovl opvarmes til 250°C i 4 timer i en 50 ml kolbe, der er udstyret med et destillationshoved og modtage-5 beholder til fjernelse af ethanol, der er dannet under reaktionen. Reaktionsblandingen får dernæst lov at afkøle til 100°C og sættes til 500 ml tilbagesvalende ethanol. Den fremkomne fældning skilles fra ved filtrering og tritureres i rækkefølge med 500 ml kogende acetone og to gange med 10 ethanol i portioner på hver 500 ml. De kombinerede ovenstående væsker koncentreres til et sort, fast stof, der krystalliseres fra methanol, hvorved der fås mørkebrune nåle.

En anden omkrystallisation fra methanol under anvendelse af Norit og filtrering gennem Celite giver 2,023 g lyse-15 gule nåle med smp. 113-115°C.

IR (IBr) cm-1 1650, 1550, 1390, 1350, 1130, 770; 1H NMR (60m Hz, CDCI3) 6 6,92 (s, IH) , 7,58 (m, 5H) ; TLC R^ = 0,5 (dichlormethan).

Analyse, beregnet for CgHg02S: 20 C = 55,64%, H = 3,11% fundet: C = 55,53%, H = 3,47%.

Cis-4-Keto-6-phenyl-3,7-dithla-5-nonendicarboxylsyre (6)

En smeltet opløsning af 35,48 g (148 mmol) na-25 triumsulfid-nonahydrat ved 94°C behandles med 6,65 g (34,23 mmol) 3-phenyl-l,2-dithia-3-cyclopenten-3-on (5), der tilsættes portionsvis i løbet af 5 minutter. Efter 15 minutters forløb sættes blandingen til en iskold opløsning indeholdende 43,6 g (314 mmol) bromeddikesyre i 60 ml 30 vand, der er indstillet på en pH-værdi på 8,7 med natrium-carbonat. Den fremkomne opløsning holdes ved 0°C og en pH-værdi på 8,7 i 45 minutter, hvorefter der filtreres.

Den ovenstående væske holdes ved 0°C og syrnes ved en pH-værdi på 3,7 med en 5 N saltsyreopløsning. Den frem-35 komne blanding omrøres natten over ved 5°C, og den oven-

O

,, DK 160948B

26 stående væske dekanteres dernæst, og den fremkomne olie tritureres med ether. Olien fordampes med toluen, indtil der fås 6,98 g af et farveløst skum (65%). Dette materiale anvendes uden yderligere rensning.

5 En analytisk prøve fås fra den ovenstående ether- væske, som ved koncentrering, successiv fordampning med eddikesyre og toluen og triturering med ether giver brungule krystaller med smp. 142,5-150°C.

IR(KBr) cm-1 1705, 1655; ΧΗ NMR (60 MHz, DMSO-Dg) 10 å 2,06 (s, CH3C02H-urenhed) 3,30 (s, 2H), 3,77 (s, 2H), 5,67 (m, 2H) (OH), 6,37 (s, IH), 7,43 (m, 5H); TLC Rf = 0,85 (chloroform:methanol:eddikesyre, 5:5:1).

Analyse, beregnet for ci3Hi2S2°5: C = 50,00%, H = 3,88% 15 fundet: C = 50,26%, H = 3,98%.

3-Hydroxy-5-phenylthiophen-acetat (7)

En kraftigt omrørt suspension af 3,40 g (10,9 mmol) rå cis-4-keto-6-phenyl-3,7-dithia-5-nonendicarboxylsyre (6), 20 3,40 g (41,5 mmol) natriumacetat og 30 ml eddikesyreanhydrid opvarmes til tilbagesvaling i 1 time. Blandingen får lov at afkøle og filtreres derpå og inddampes, hvorved der fås en sort olie. Denne remanens opløses i 75 ml ethylacetat og ekstrahere s tre gange med 50 ml portioner af iskold, mættet natrium-25 bicarbonatopløsning. Det organiske lag vaskes dernæst med brine, tørres over natriumsulfat, filtreres og inddampes, hvorved der fås 2,826 g af et sort, fast stof. Det rå produkt renses ved fordampningsdestillation ved 120-140°C og 0,1 mm Hg, hvorved der fås 1,235 g af en lysorange olie, 30 der størkner ved henstand (52%).

IR cm"1 1700, 1745; XH NMR (60 MHz, CDCl3) S 2,23 (s, 3H), 7,03 (d, J=2Hz, IH), 7,13 (d, J=2Hz, IH); 7,23--7,73 (m, 5H); MS (El, DIP) m/e 218 (M+, 12,6%); TLC Rf = 0,48 (hexan:ethylacetat, 5:1).

35 27

DK 160948 B

O

Analyse, beregnet for C-^H^qSC^'1/2 H20: C = 63,41%, H = 4,88% fundet: C - 63,78%, H = 4,86%.

5 3-Hydroxy-5-phenylthiophen (8)

En blanding af 2,126 g (9,74 mmol) 3-hydroxy-5--phenylthiophen-acetat (7) og 80 ml methanol under en argonatmosfære behandles med 11 ml 1 N natriumhydroxid. Efter 20- minutter standses reaktionen ved tilsætning af 10 11 ml 1 N saltsyre, og der inddampes ved 25°C og 12 mm Hg til et rumfang på ca. 50 ml, hvorpå der behandles med 100 ml ethylacetat. Det organiske lag skilles fra, vaskes med mættet saltopløsning, tørres over natriumsulfat, filtreres og inddampes, hvorved der fås et sort, fast stof.

15 Denne remanens opløses i 75 ml ethylacetat og tørres over MgSO^. Ved filtrering og inddampning fås der et sort, fast stof, der tritureres fire gange med varm hexan, hvorpå der ved afkøling fås i alt 837 mg af et gult, fast stof med smp. 74-75°C (49%). De kombinerede moderludsvæsker koncen-20 treres, hvorved der fås 0,87 g af et fast stof, der chro-matograferes over 100 g Si02 elueret med en blanding af hexan og ethylacetat i forholdet 7:1. Efter omkrystallisation fås der yderligere 380 mg produkt med smp. 73,5-74°C.

Det samlede udbytte er således 1,217 g (71%) med smp.

25 74,5-75°C (litteraturværdier ifølge litteraturstederne nr.

3 og 4: 75°C og 78°C.

IR cm”1 3380, 1635; 1H NMR (90 MHz, CDCI3) £ 3,81 (s, 2H), 6,57 (s, IH), 7,2-7,7 (m, 5H); MS (El) m/e 176,0 (70,7%); TLC R^ = 0,23 (hexan:ethylacetat, 1:5).

30 Analyse, beregnet for C^0Hg0S: C = 68,15%, H = 4,57% fundet: C = 68,05%, H = 4,70%.

35

O

DK 160948 B

28 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-5-phenylthiophen (9)

En opløsning indeholdende 440 mg (2,5 mmol) 3-hy-droxy-5-phenylthiophen (8) i 20 ml dichlormethan og 0,61 ml (7,5 mmol) pyridin ved 0°C under en argonatmosfære behand-5 les med en opløsning indeholdende 1,314 g N-tosyl-L-ala-ninyl-chlorid (5 mmol) i 10 ml dichlormethan, der tilsættes dråbevis over et tidsrum på 5 minutter. Reaktionsblandingen omrøres i 1/2 time ved 0°C og udhældes dernæst i 100 ml chloroform. Blandingen ekstraheres dernæst i ræk-10 kefølge med 50 ml portioner af 1 N citronsyre, vand, iskold natriumbicarbonatopløsning, vand og mættet saltopløsning. Blandingen tørres dernæst over natriumsulfat, filtreres og inddampes, hvorved der fås 1,78 g af en brun olie.

Forsøg på krystallisation fra toluen efter behandling med 15 1,78 g Norit mislykkes. Remanensen chromatograferes der næst på en 200 g kolonne S1O2/ elueret med dichlormethan med en strømningshastighed på 10 ml pr. minut. Fraktioner indeholdende produktet slås sammen og koncentreres, hvorved der fås 951 mg af en rødlig olie. Produktet krystalli-20 seres fra toluen. Successive omkrystallisationer fra toluen giver i alt 463 mg produkt i form af et lysegult, fast stof, (46%) med smp. 85-87°C.

IR (KC1) cm"1 1735, 1330, 1150; 1H NMR (90 MHz, CDCI3) S1/53 (d, J=7 Hz, 3H), 1,62 (s, 3H), 4,23 (m, IH), 25 5,32 (d, J=9Hz, IH), 6,84 (d, J=l,4 Hz, IH), 6,88 (d, J=l,4 Hz, IH), 7,23-7,83 (m, 9H); MS (FAB) m/e 402 (M + 1, 15%); TLC R^ = 0,20 (hexan:ethylacetat, 4:1).

Analyse, beregnet for C2oHl9N04S: C = 59,83%, H = 4,77%, N = 3,59% 30 fundet: C = 59,60%, H = 4,77%, N = 5,43%.

35

DK 160948B

O

29

Eksempel 3

Syntese af 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-l-methyl-5-phenyl-pyrrol (13)

Der udføres en række forsøg til fremstilling af 5 den ovennævnte ester svarende til forbindelsen med formlen I, i hvilken A betegner N-tosyl-L-alaninyl, R betegner phenyl, RX betegner hydrogen, X betegner NR', og R' betegner CH3· Reaktionsrækkefølgen er som følger: , coo'k* io hck^ coo'k T (.10)

fOj NH(CH^)CH2COOH r^i^N^COoV

ΚΟΗ/Η,Ο I

2 ^ CH3 15 ^c2°

Et3N

Y

20 ΓΊΓ°η r—r° vCH: “θ' Ί On? <"« 3 n5 25 i? · CF7C00H Cl-C-CH-CH, 3 . I 3

Pyridm / \ THF H Ts ^ 0 30 || _^o-c-ch-ch7

_ ΓΤ i 3 (W

ΟΓ, " " CH, 35 0

DK 160948 B

30 2- Hydroxy-3-(N-methylcarboxymethylamino)-hydrokanelsyre--dikaliumsalt (10)

En blanding af 30 g (0,15 mol) β-phenylglycidin-syre-kaliumsalt 13,2 g (0,15 mol) N-methylglycin, 119 ml 5 destilleret vand og 22,3 ml 9 N KOH-opløsning opvarmes til tilbagesvaling i 3 timer, hvorved der fås en lysegul opløsning. Reaktionsblandingen inddampes til tørhed under formindsket tryk ved 70°C. Remanensen krystalliseres derpå fra 100 ml 95%'s ethanol, hvorved der fås et hvidt, fast stof, 10 som efter tørring natten over under formindsket tryk ved 110°C giver 30,8 g hvidt, fast stof (10) i et udbytte på 63%.

IR (KC1) cm"1 3360 (br), 1580, 1405, 705; ΧΗ NMR (CD30D) S 2,30 (s, 3H), 2,98 (s, 2H), 3,70 (d, J=3 Hz, IH),

15 4,48 (d, J=3 Hz, IH), 4,92 (s, IH), 7,40 (s, 5H); TLC

R^ = 0,51 (Et0H:l M triethylammoniumbicarbonat, 7:3). (Produktet har intet smeltepunkt lavere end 270°C).

3- Acetoxy-l-methyl-5-phenylpyrrol (11) 20 En blanding af 15,2 g (46 mmol) 2-hydroxy-3-(N- -methylcarboxymethylamino)-hydrokanelsyre-dikaliumsalt (10) , 173 ml eddikesyreanhydrid og 308 ml triethylamin opvarmes til 90°C i 19 timer. Reaktionsblandingen, der bliver dybbrun i farve, filtreres, og det faste stof va- 25 skes med ether. Filtratet inddampes under formindsket tryk, hvorved der fås en dybbrun remanens, der optages i 300 ml ether og 200 ml vand. Lagene adskilles, og ether-laget vaske.s med en yderligere portion vand på 200 ml.

Etheropløsningen tørres derpå over MgSO^, filtreres og 30 koncentreres under formindsket tryk, hvorved der fås 10,7 g af en brun remanens, der renses ved fordampningsdestillation (120-135°C og 0,03 mm Hg) og krystallisation fra ether, hvorved der fås 3,0 g hvide krystaller (11) i et udbytte på 30% og med smp. 64-65°C.

35

O

31

DK 160948 B

IR (CHC13) cm"1 2990, 1750, 1570, 1518, 1482, 1375, 1230 (br), 1024, 910, 700; 1H NMR (CDCl3) & 2,20 (s, 3H), 3,58 (s, 3H), 6,10 (d, J=2 Hz, IH), 6,75 (d, J=2 Hz, IH), 7,35 (s, 5H); TLC = 0,58 (hexan:EtOAc, 5 7:3).

Analyse, beregnet for C13H13N02: C = 72,54%, H = 6,10%, N = 6,44% fundet: C = 72,57%, H = 6,09%, N = 6,51%.

10 3-(N-Tosyl-L-alaninyloxy)-l-methyl-5-phenylpyrrol (13)

Til en blanding af 15,5 ml deoxygeneret methanol og 1,3 g (6,2 mmol) 3-acetoxy-l-methyl-5-phenylpyr-rol (11) under argon sættes der deoxygeneret NaOH (2 N, 12,5 ml). Reaktionsblandingen omrøres i et isbad i 15 mi-15 nutter. Der tilsættes dernæst 7 ml 2 M deoxygeneret citronsyre, og den fremkomne blanding omrøres i et isbad i 8 minutter. Reaktionsblandingen koncentreres under formindsket tryk, og der tilsættes dernæst 20 ml vand og ekstraheres to gange med 50 ml ethylacetat (EtOAc). EtOAc-20 -lagene kombineres, tørres over MgSO^, filtreres og koncentreres under formindsket tryk, hvorved der fås 3-hy-droxy-1-methyl-5-phenylpyrrol (12) i form af en orange remanens. Under argon sættes der en kold opløsning af 12,4 ml vandfri THF, 0,6 ml (7,4 mmol eller 1/2 ækviva- 25 lenter) pyridin og 1,2 ml (15 mmol eller 2,4 ækvivalenter) trifluoreddikesyre til den orange remanens, umiddelbart efterfulgt af tilsætning af en opløsning af frisk fremstillet N-tosyl-L-alaninyl-chlorid (1,2 g, 7,4 mmol eller 1,2 ækvivalenter) i 12,4 ml vandfri THF. Den frem-30 komne blanding omrøres i 1 time ved 0°C. Reaktionen standses dernæst ved tilsætning af 5 ml 1 M citronsyre og 30 ml EtOAc. Efter en kortvarig blanding adskilles lagene, og det organiske lag vaskes i rækkefølge med mættet NaCl-opløsning, to gange med 5%'s NaHC03-opløsning og 35 igen med mættet NaCl-opløsning. EtOAc-ekstrakten tørres

32 DK 160948B

o dernæst over MgSO^, behandles med Norit 211, filtreres og koncentreres under formindsket tryk, hvorved der fås det rå produkt (13) i form af en orange remanens. Denne opløses i 5 ml af en blanding af hexan og EtOAc i forholdet 5 1:1 og chromatograferes på en søjle af SiC^ (100 g) ved eluering med en blanding af hexan og EtOAc i forholdet 7:3, hvorved der fås 1 g af forbindelsen (13) i form af en tyk, lysorange olie. En portion af dette rå produkt renses yderligere ved semipræparativ HPLC (søjle, IBM-si- 10 lica, 1 cm x 25 cm, mobil fase, hexan:EtOAc = 8:2, strøm- 2 ningshastighed 4,0 ml/minut, tryk ca. 0,014 kg/cm ), hvor-véd der fås en honningfarvet, tyk olie (13).

IR (film) cm"1 3260, 2950, 1760, 1520, 1350, 1170, 770; XH NMR (DMS0-dg) 8 1,28 (d, J=7 Hz, 3H) , 2,36 (s, 3H), 15 3,58 (s, 3H), 5,85 (d, J=2 Hz, IH), 6,15 (m, IH), 6,74 (d, J=2 Hz, IH), 7,30-7,80 (m, 9H), 8,37 (d, J=8 Hz, IH); 13C NMR (DMSO-dg) 18,205, 20,936, 34,917, 51,240, 100,598, 113,148, 126,544, 127,000, 128,105, 128,560, 129,601, 130,901, 132,202, 135,714, 138,315, 142,672, 169,724; TLC 20 Rj = 0,52 (toluen:dioxan, 4:1); højopløsnings-massespektrum, ^21H22N2°4® dræver m/e 398,1300, fundet m/e 398,1297.

Eksempel 4

Syntese af 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-5-(p-chlorphenyl)-25 -pyrrol (18)

Der udføres en række forsøg til fremstilling af den nævnte esterforbindelse svarende til forbindelsen med formlen I, i hvilken A betyder N-tosyl-L-alaninyl, R betyder p-chlorphenyl, Rx betyder Η, X betyder NR', og R' be-30 tyder hydrogen. Reaktionsrækkefølgen er som følger: 35

O

DK 160948 B

33

✓ COQH ^-COOH

KHSOs, H-20 HC1 (14)

Cl Acetone, NaHCOj

Glycin> kch/h2o pH = 11,5 10 Ψ _. HOv^COO'K+

_>-0Ac J

^ JL J \c O ^^y^N^COoV · 2H?0

„ jf5rr JQT I

cr^ Ac 121-2·« ci^ H

(26) (35)

NaOH

ch3oh 20 H70 ψ o >UTT C1'CT2'CH3 ^ - - jøn * H Ts

CF-COOH

U7) Pyridin (!f° ΤΗΓ 30 35

DK 160948B

O

34 trans-β-(p-chlorphenyl)-glycidinsyre (14)

Til en omrørt opslæmning af 68,5 g (0,375 mol) p-chlorkanelsyre i 260 ml acetone sættes der 137 g (1,63 mol) NaHCOg, efterfulgt af langsom tilsætning af 260 ml 5 vand. Til denne blanding sættes der i løbet af 2 1/2 time ved 22-27°C en blanding af 211 g (0,343 mol) OXONE 120 mg dinatrium-EDTA og 805 ml vand. Efter 5 timers forløb syrnes blandingen med 70 ml kold 12 N saltsyre, hvorved pH-værdien bringes ned på ca. 2,5, og blandingen eks-10 traheres derefter med 700 ml ethylacetat. Ekstrakten vaskes med brine, tørres med MgSO^ og filtreres, og filtratet inddampes til tørhed under vakuum. De hvide, faste stoffer krystalliseres fra ethylacetat, og der fås 72,2 g (udbytte 97%) med smp. 121-125°C. 1H NMR (CDC13/DMS0-D6) 15 $7,3 (m, 4H), 4,05 (d, J=2, IH) og 3,4 (d, J=2, IH).

Analyse, beregnet for CgH-^ClO^: C = 54,43%, H = 3,55%, Cl = 17,85% fundet: C = 54,53%, H = 3,80%, Cl = 17,91%.

20 2-Hydroxy-3-(carboxymethylamino)-p-chlorhydrokanelsyre--dikaliumsalt-dihydrat (15)

Til en opløsning af KOH (85%) (46,7 g eller 0,709 mol) og 400 ml vand sættes der 25,9 g (0,345 mol) glycin, efterfulgt af 72,2 g (0,3635 mol) trans-Ø-p-chlorphenyl-25 glycidinsyre (14). Denne blanding opvarmes til 100°C i 2 timer, afkøles til stuetemperatur, og der tilsættes en tilstrækkelig mængde KOH til forøgelse af pH-værdien til 12. Den uklare opløsning ekstraheres tre gange med ethylacetat, og ekstrakten kasseres derefter. Den klare vandi-30 ge opløsning (ca. 500 ml) inddampes under vakuum til tørhed under anvendelse af et vandbad med en temperatur på 70°C. De faste stoffer opløses derpå i ca. 350 ml varm ethanol, der filtreres, og filtratet afkøles kraftigt i isbad i flere timer. De krystalliserede faste stoffer op-35 samles ved filtrering og vaskes med noget kold ethanol.

DK 160948B

O

35

Der fås et stof med snip. 93-95°C med decarboxylering ved 185°C og et udbytte på 57,2 g eller 41%.

1H NMR (D20-TSP) h 7,4 (s, 4H), 4,7 (s, 6H, udskiftelige protoner), 4,4 (d, J=4, IH), 4,05 (d, J=4, IH) og 5 3,1 (s, 2H).

Analyse, beregnet for C11H10C1N05K2*2H20: C = 34,24%, H = 3,66%, N = 3,63% fundet: C = 34,40%, H = 4,03%, N = 3,42%.

10 N-Acetyl-3-acetoxy-5-(p-chlorphenyl)-pyrrol (16)

Til 10 g (0,02591 mol) 2-hydroxy-3-(carboxyme-thylamino)-p-chlorhydrokanelsyre-dikaliumsalt-dihydrat (15) sættes der 40 ml eddikesyreanhydrid og 30 ml pyridin.

Denne blanding opvarmes forsigtigt til 35°C, ved hvilken 15 temperatur opløsningen reagerer exotermt til 67°C, hvorpå temperaturen begynder at falde, hvorefter opvarmningen atter genoptages. Blandingen opvarmes til 121-122°C (indre temperatur) i 1 time, hvorpå der. afkøles. Til reaktionsblandingen sættes der 30 ml ethylacetat, hvorved der 20 udfældes det meste af pyridiniumacetat-saltet. Dette salt opsamles ved filtrering og vaskes med en lille mængde ethylacetat. Filtratet inddampes dernæst under vakuum til en olie, og der tilsættes isvand. Produktet ekstraheres med ether, og etherekstrakterne vaskes i rækkefølge to 25 gange med kold fortyndet vandig citronsyre, koldt vand, tre gange med kold fortyndet vandig NaHC02-opløsning, koldt vand og mættet saltopløsning, efterfulgt af tørring over MgS04 og filtrering. Filtratet behandles med 10 g Darco, omrøres i 20 minutter og filtreres dernæst. Filtra-30 tet inddampes under vakuum til en olie, og der sættes 25 ml 2-propanol til olien. Den fremkomne opløsning giver under kraftig afkøling og skrabning bleggule krystaller med smp. 69-71°C og med et udbytte på 3,4 g eller 47%.

TLC: Rf = 0,61 (toluenrdioxan, 95:5). En analytisk prøve 35 omkrystalliseres fra 2-propanol, men der iagttages ingen

DK 160948B

O

36 ændring i smeltepunktet.

IR (KC1) cm”1 1755 (C=0, ester) og 1730 (C=0f amid); XH NMR (CDC13) S 7,4 (m, 5H), 6,2 (d, J=2, IH), 2,4 (s, 3H) og 2,3 (s, 3H) .

5 Analyse, beregnet for C^H^CINO^: C = 60,55%, H = 4,36%, N = 5,04% fundet: C = 60,65%, H = 4,55%, N = 5,07%.

3-Hydroxy-5-(p-chlorphenyl)-pyrrol (17) 10 En prøve af 2,8 g (0,01 mol) N-acetyl-3-acetoxy- -5-p-chlorphenylpyrrol (16) deoxygeneres i 10 minutter med en strøm af nitrogen. De faste stoffer opløses derpå i 30 ml deoxygeneret methanol, som dernæst afkøles kraftigt til -8°C. Der tilsættes på én gang en kold deoxygeneret 15 opløsning af NaOH (1,6 g eller 0,04 mol) i 20 ml vand, og denne opløsning opvarmes dernæst kortvarigt til 15°C og afkøles derpå øjeblikkelig til -5°C. Efter 25 minutters forløb behandles den klare opløsning med en kold, deoxygeneret opløsning af citronsyre (4,2 g eller 0,02 mol) i 20 15 ml vand, og temperaturen stiger kortvarigt til 5°C. Ef ter 1/2 times omrøring ved -5°C opsamles de faste stoffer ved filtrering og vaskes med kold, deoxygeneret E^O. Det bleggrønne produkt tørres under vakuum ved stuetemperatur over P2O5 i adskillige dage (1,3 g eller 68%). TLC R^ = 25 0,19 (CHClg:EtOH, 9:1); IR (KC1) viser ingen tegn på C=0- -absorption.

Analyse, beregnet for C^0HgClN0^1/6^0: C = 61,08%, H = 4,27%, N = 7,12% fundet: C = 61,36%, H = 4,44%, N = 6,85%.

30 3- (N-Tosyl-Ii-alaninyloxy) -5- (p-chlorphenyl) -pyrrol (18)

Til 15 ml med nitrogen deoxygeneret THF sættes der 0,65 ml (0,008 mol) pyridin, 1,27 ml (0,0164 mol) tri-fluoreddikesyre og 1,3 g (0,0065 mol) 3-hydroxy-5-p-chlor-35 phenylpyrrol (17). Opløsningen afkøles til en temperatur

DK 160948B

O

37 på 0°C til -4°C, og en med nitrogen deoxygeneret og afkølet (0°C til -4°C) opløsning af 2,1 g (0,008 mol) N-tosyl--L-alaninylchlorid i 15 ml THP tilsættes i løbet af 10 minutter. Efter at blandingen har været holdt ved 0°C i 1 ti-5 me, tilsættes der en blanding af is og 100 ml 1 N citronsyre. Denne blanding ekstraheres med ethylacetat, og ekstrakten vaskes én gang med kold mættet saltopløsning, to gange med kold fortyndet NaHC03-opløsning og igen med kold mættet saltopløsning, hvorefter der tørres over MgSO^ og fil-10 treres. Filtratet behandles med 2 g Darco og omrøres i 10 minutter og filtreres, og filtratet koncentreres under vakuum til en rødligbrun olie. En yderligere behandling med 1,3 g Darco giver en lyst rødlig olie. Olien opløses i en blanding af toluen og cyclohexan i forholdet 4:1 og anbrin-15 ges i køleskab natten over. Der fås lyst laksefarvede krystaller i en mængde på 1,45 g (53%) og med smp. 113-115°C.

TLC Rf = 0,47 (Et20); IR (KC1) cm-1 1740 (C=0, ester); XH NMR (CDCI3) 8 8,4 (br s, IH), 7,8-7,2 (m, 8H), 6,7 (m, IH), 6,2 (m, IH), 5,5 (d, 3=9, IH), 4,2 (p, J=8, IH), 2,4 (s, 20 3H), 1,4 (d, 3H); MS (El, DIP) m/e 418 (M+, 2,3%) og 420 (M+, 0,8%).

Analyse, beregnet for C20H19C1N2°4S·' C = 57,34%, H = 4,57%, N = 6,69% fundet: C = 57,53%, H = 4,58%, N = 6,67%.

25

Fremstilling og anvendelse af forskellige testmaterialer Der udføres en række forsøg til fremstilling af testmaterialer ifølge den foreliggende opfindelse, hvor estersubstraterne som ovenfor angivet afprøves med hensyn 30 til respons på leokocyter i urin. Testmaterialerne omfatter et lille kvadrat af filtrerpapir indeholdende bestemmelsesreagenserne, idet papiret er anbragt ved den ene ende af en polystyrenfilmstrimmel. Filtrerpapiret er imprægneret med puffer, esteren, en accelerator og et diazonium-35 salt-koblingsmiddel. Hvert af de afprøvede testmaterialer

DK 160948B

O

38 viser sig at udvise en positiv test for leukocyter i urin.

Testmateriale/ hvori esteren er 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)--5-phenylpyrrol (4) 5 Der fremstilles et testmateriale/ der er følsomt over for tilstedeværelsen af leukocyter i urin. Materialet omfatter et lille kvadrat af filtrerpapir, der er anbragt ved den ene ende af en aflang strimmel af polystyrenfilm. Papiret imprægneres med forskellige bestanddele, herunder 10 en chromogen ester, en accelerator og et diazoniumsalt. En ca. 5 cm bred strimmel af Eaton og Dickman nr. 205 filtrerpapir neddyppes i en vandig opløsning indeholdende følgende bestanddele: 0,4 M borat-NaOH-puffer, pH = 8,6 15 2,0% (v;/v) polyvinylpyrrolidon K-30 0,2% (w/v) Bioterge AS-40 ® 0,25 M NaCl.

Papiret tørres dernæst i 7 minutter i en Overly Air Foil-papirtørrer ved en temperatur fra ca. 80 til ca.

20 93°C ved et luftstrømstryk på ca. 25 mm vandsøjle. Dernæst neddyppes det tørrede papir i en acetoneopløsning indeholdende følgende bestanddele: 2,0% (v/v) n-decanol 0,75 mM 2-methoxy-4-morpholinobenzen-diazonium-25 chlorid 0,5 mM 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-5-phenylpyrrol.

Efter denne imprægnering tørres papiret i 10 minutter i en ventileret Hotpack ®-ovn ved ca. 55°C. Der fås et grålig-hvidt testpapir.

30 Et stykke af det tørrede, imprægnerede papir ud skæres til et kvadrat med en sidelængde på ca. 5 mm og anbringes ved den ene ende af en aksialt orienteret polystyrenstrimmel med dimensionerne ca. 100 mm x ca. 5 mm. Anbringelsen af papiret på strimlen opnås under anvendelse 35 af Double Stick-dobbeltsidet adhæsiv (fra 3M Company).

DK 160948 B

O

39

Testmateriale, hvori esteren er 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)--5-phenylthiophen (9)

Der fremstilles et testmateriale, der er følsomt over for tilstedeværelsen af leukocyter i urin, idet der 5 i materialet anvendes 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-5-phenyl-thiophen som indikator. Et stykke filtrerpapir (Eaton og Dikeman nr. 205) nedsænkes i en vandig første opløsning indeholdende følgende bestanddele: 0,4 M borat-NaOH-puffer (pH = 8,5) 10 0,4 M NaCl 1,5% (w/v) polyvinylpyrrolidon (K-30).

Det imprægnerede papir tørres i en ovn med forceret luftgennemgang i 30 minutter ved 70°C, hvorpå det får lov at afkøle til stuetemperatur og imprægneres med en an-15 den neddypningsopløsning indeholdende en acetoneopløsning, der indeholder følgende bestanddele: 0,75 ml 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-5-phenylthiophen 0,75 mM 2-methoxy-4-morpholinobenzen-diazonium-chlorid-zinkchlorid-dobbeltsalt 20 0,5% (v/v) n-decanol.

Det dobbelt-imprægnerede papir tørres derpå i en ovn med forceret luftgennemgang i 5 minutter ved 50°C.

Det tørrede papir udskæres i kvadrater, der måler ca. 5 mm på hver side, og anbringes ved enden af en poly-25 styrenfilm, der måler ca. 5 mm x ca. 82 mm. Monteringen udføres under anvendelse af Double Stick, et dobbeltsidet adhæsiv fra 3M Company. Testmaterialet opbevares i flasker med 100 i hver sammen med silicagel og molekylsigter til tilvejebringelse af tørring.

30

Testmateriale, hvori esteren er 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)--l-methyl-5-phenylpyrrol (13)

Der fremstilles testmaterialer under anvendelse af den ovenfor beskrevne procedure, idet esterindikatoren 35 er 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-l-methyl-5-phenylpyrrol, og

DK 160948B

O

40 koblingsmidlet er l-diazonaphthalen-4-sulfonat. Den vandige første neddypningsopløsning indeholder følgende bestanddele : 0/4 M borsyre 5 2/0% (w/v) polyvinylpyrrolidon (K-30) 0,2% (v/v) Bioterge AS-40 0/25 M NaCl.

Inden imprægneringen af filtrerpapiret titreres opløsningen med NaOH til en pH-værdi på 9,0.

10 Den anden neddypningsopløsning i acetone inde holder følgende bestanddele: 0,75 mM l-diazonaphthalen-2-sulfonat 1/3 mM l-methyl-3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)-5-phe-nylpyrrol 15 1,5% (v/v) dodecanol.

Efter imprægnering ved den første vandige neddyp-ning tørres papiret i ca. 5 minutter ved ca. 80°C og i ca.

5 minutter ved 70°C efter imprægnering ved den anden ned-dypning i acetoneopløsning.

20 Det tørrede papir monteres som ovenfor beskrevet.

Testmateriale, hvori esteren er 3-(N-tosyl-L-alaninyloxy)--5-(p-chlorphenyl)-pyrrol (18)

Der fremstilles testmaterialer som ovenfor beskre-25 vet, men med den undtagelse, at acetoneopløsningen i stedet for phenylpyrrolen indeholder 1,3 mM 3-(N-tosyl-L-alaninyl-oxy)-5-(p-chlorphenyl)-pyrrol.

Bedømmelse af testmaterialet 30 De testmaterialer, der fremstilles i overensstem melse med de ovenfor beskrevne forsøg, underkastes bedømmelse af deres evne til detektering af leukocyter, der er til stede i urin.

Der fremstilles prøver ud fra en normal human ·<· 35 urinpool. En prøve tjener som blindprøve, og leukocyter,

DK 160948 B

O

41 der er isoleret fra frisk aftappet blod, sættes til to yderligere urinprøver til opnåelse af koncentrationer på henholdsvis O, 10 og 75 leukocyter pr. pi.

Testmaterialer neddyppes hurtigt i og fjernes fra 5 en testprøve. 2 Minutter senere iagttages materialerne under anvendelse af et spektrofotometer til måling af procent reflektans ved forskellige bølgelængder fra 400 til 700 nm.

De opnåede data viser, at alle testmaterialerne 10 giver klart skelnelige forskelle i lysreflektans svarende til forskellige leukocytniveauer i prøverne. De opnåede data fremgår af den følgende tabel:

Leukocyt- -koncentration % Reflektans 15 Forsøg nr._(celler/pl)_ved 555 nm

Eksempel 1K 0 10-12

Eksempel 20 65 20 10 60 65 42

Eksempel 3 0 67 10 64 25 7 5 60

Eksempel 4 0 61 10 51 75 42 30 _ X Visuel iagttagelse: purpur farve dannes ved 10-12 celler/pl; blindprøver giver ingen farveændring.

35

Claims (12)

1. Middel til bestemmelse af tilstedeværelsen af leukocyter, esterase eller protease i en testprøve, k e n- 5 detegnet ved, at midlet indeholder en ester med strukturformlen R-i_ X*

2. Middel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at X betegner NR'. 20

3. Middel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at A betegner N-blokeret aminosyre.

4. Middel ifølge krav 1, kendetegnet 25 ved, at A betyder N-blokeret L-alaninat.

5. Middel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at A betyder N-blokeret L-alaninat, R betyder phe- u nyl, X betyder NR1, og såvel R' som R betegner hydrogen. 30

6. Middel ifølge ethvert af kravene 1-5, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter en accelerator . 35 DK 160948 B O

7. Middel ifølge krav 6, kendetegnet ved, at acceleratoren er alkohol med 1-15 carbonatomer.

8. Middel ifølge ethvert af kravene 1-7, k e n- 5 detegnet ved, at det yderligere indeholder et dia-zoniumsalt-koblingsmiddel.

9. Middel ifølge krav 8, kendetegnet ved, at diazoniumsaltet er en zwitterion med strukturen 10 + 15 i hvilken D betegner en anion, substituenterne G, der er ens eller forskellige, betegner hydrogen, lavere alkyl eller aryl, eller hvor begge substituenterne G tilsammen danner et kondenseret ringsystem, og hvori B betegner hy-20 drogen eller OH.

10. Middel ifølge krav 8, kendetegnet ved, at saltet er l-diazo-2-naphthol-4-sulfonat.

10 K Λ i hvilken A betegner en N-blokeret aminosyrerest eller en N-blokeret peptidsyrerest, X betyder 0, S eller NR', R be-tyder aryl eller lavere alkyl, R betegner hydrogen eller 15 lavere alkyl, og R' betegner hydrogen, lavere alkyl eller aryl, samt et egnet pufferstof.

11. Testmateriale til bestemmelse af tilstedevæ relsen af leukocuter, esterase eller protease i en testprøve, kendetegnet ved, at materialet omfatter en bærematrix, der er inkorporeret med et middel ifølge ethvert af kravene 1-10. 30

12. Fremgangsmåde til bestemmelse af tilstedeværelsen af leukocyter, esterase eller protease i en testprøve, kendetegnet ved, at fremgangsmåden omfatter kontakt mellem prøven og testmaterialet ifølge krav 11 35 samt iagttagelse af et detekterbart respons.