JPH0244519B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕 本発明はγ−グルタミルトランスペプチダーゼ
活性の測定方法とその測定用試薬に関するもので
ある。 〔従来の技術〕 γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（以下γ
−GTPと略す）は、Ｃ末端にγ−グルタミン酸
をもつペプチドや蛋白質に作用し、これを加水分
解してグルタミン酸を生成し、ペプチドやＬ−ア
ミノ酸などの受容体にこれを転移させる酵素であ
り、血清中−γGTP活性の測定は、肝、胆道系疾
患及び心筋梗塞等の診断上不可欠な重要な検査項
目となつている。 現在一般に行なわれているγ−GTP活性測定
法は、ナフチルアミン誘導体あるいはアニリン誘
導体などの芳香族一級アミンのγ−グルタミルア
ミド、即ちγ−グルタミル芳香族アミドを基質と
し、この基質にγ−GTPを作用させ、遊離する
芳香族一級アミンをジアゾカツプリング反応やｐ
−ジメチルアミノケイ皮アルデヒドあるいはイン
ドフエノール反応等により発色させ、その発色を
対応する既知量の芳香族一級アミン標準液と比較
し、測定する方法である。従つて基質として使用
するγ−グルタミル芳香族アミドはγ−GTPと
の反応において基質特異性が臨床的所見とよく相
関し、且つ感度、即ち基質反応性が必要な範囲で
高いことが望ましい。更に正確な測定をおこなう
ためには、γ−GTPの作用によつて遊離される
芳香族一級アミンが安定であること及び発色が血
液中の夾雑物の影響を受けないような条件におい
て再現性よく、安定であることが望ましい。その
他γ−グルタミル芳香族アミドおよび比色標準に
使用する芳香族一級アミンが適度の水溶性を有
し、且つその溶液が安定であることも必要であ
る。 〔発明が解決しようとする問題点〕 しかしながら、従来提供されていた基質には、
それぞれ問題があり、十分に満足のゆくものでは
なかつた。例えば、γ−GTPの測定法として最
も一般化された方法は、基質としてγ−グルタミ
ル−ｐ−ニトロアニリド（以下ｐ−NAと略す）
を用いる方法であるが、基質の溶解性と安定性が
満足し得るものでなく、又、γ−GTPの作用に
より遊離するｐ−ニトロアニリンは黄色であるた
めこのまま比色定量すると血清成分の影響を受け
るという欠点があつた。そこで、この遊離したｐ
−ニトロアニリンにｐ−ジメチルアミノケイ皮ア
ルデヒドを作用させ赤色系色調に呈色させたのち
比色定量しているが、この呈色は測定時の温度に
左右され易いという欠点を有している。又、γ−
グルタミル−β−ナフチルアミドを基質とする方
法は、その原料及び標準物質として使用するβ−
ナフチルアミンが発癌性物質であるので取り扱い
に厳重な注意が必要であり、労働安全衛生上好ま
しくないという欠点があつた。 その他γ−グルタミル−ｐ−ジメチルアミノア
ニド、γ−グルタミル−ｐ−ジエチルアミノアニ
リド、γ−グルタミル−ｐ−ヒドロキシアニリド
等を基質とする方法が誌みられている。しかし、
これらの方法にもナトリウムペンタシアノアミン
フエロエートによる発色やフエノール化合物をカ
ツプラーとするインドフエノール発色が可能なた
め高感度の青色系呈色に導けるという利点のある
反面正確な測定が得にくく、更に基質の溶解性の
面でも満足のゆくものではないという欠点があつ
た。 以上の如くγ−GTP活性測定法は種々あるが、
いずれも一長一短があり、新しいγ−GTP活性
測定方法の開発が望まれていた。 〔問題を解決するための手段〕 本発明者らは、従来のγ−GTP活性測定方法
の有する欠点を解消すべく鋭意研究をおこなつた
結果、次の式（） （式中、R₁はｎ−プロピル基又はアリル基を示
す） で表わされるγ−グルタミル−３−カルボキシ−
４−アミノアニリド誘導体はγ−GTP活性測定
用の基質として優れた性質を有し、該物質を用い
れば容易かつ正確にγ−GTP活性の測定ができ
ることを見出し、本発明を完成した。 すなわち本発明は、被検試料と前記式（）で
表わされるγ−グルタミル−３−カルボキシ−４
−アミノアニリド誘導体とを反応させ、生じたア
ミノ安息香酸誘導体をカツプラーと酸化縮合させ
た後、生成した着色化合物量を比色定量すること
を特徴とするγ−GTP量の測定方法を提供する
ものである。 本発明方法を化学式で示すと下記の通りであ
る。 （式中、R₁は前記と同じ） このγ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ア
ミノアニリド誘導体は、例えばＮ−フタリル−Ｌ
−グルタミン酸無水物をジオキサン等の溶媒中ア
ミノ安息香酸誘導体と室温で縮合させた後、これ
をメタノール等のアルコール系溶媒でヒドラジン
と反応させることによつてフタリル基を脱離す
る。反応終了後、析出するフタリルヒドラジドを
濾去し、次いで溶媒を留去し、エーテル等の溶媒
を加えて結晶化させることにより容易に得ること
ができる（特開昭56−158745号参照）。 本発明におけるγ−グルタミル−３−カルボキ
シ−４−アミノアニリド誘導体（）は、その塩
類もγ−GTP活性値測定時の基質として用いる
ことができる。塩類としては塩酸塩は、硫酸塩あ
るいはトシル酸塩等が使用出来る。 本発明方法は次の如くして実施される。すなわ
ち、まず被検試料である生体試料（例えば血清
等）中に前記一般式（）で示した基質であるγ
−グルタミル−３−カルボキシ−４−アミノアニ
リド誘導体あるいはその塩と、グルタミン酸の好
ましい受容体であるグリシルグリシンを添加し、
緩衝液にてγ−GTP反応至適PHにし、37℃で一
定時間反応させ、アミノ安息香酸誘導体を生成せ
しめる。次いで、この生成物を適当なカツプラー
と酸化縮合させて着色化合物に導き、それを比色
定量することにより生体試料中のγ−GTP活性
を測定することにより実施される。反応至適PHと
しては、7.5〜8.5の範囲が好ましく、この範囲内
であれば任意のPHを用いることが出来る。PHを維
持する為に用いる緩衝剤としては、バルビター
ル、トリエタノールアミン、２−アミノ−２−メ
チルプロパン−１，３−ジオール、トリスヒドロ
キシメチルアミノメタン等を用いることができる
が、基質（化合物（））及びグリシルグリシン
に緩衝能があるため必ずしも緩衝剤を添加しなく
ともよい。基質及びグリシルグリシンは緩衝液中
それぞれ５〜15ｍＭ、50〜250ｍＭの濃度で使用
できる。カツプラーとしては、１−ナフトール−
２−スルホン酸、２，４−ジクロロナフトールの
如きナフトール系化合物、あるいはフエノール、
ｐ−キシレノール、チモールの如きフエノール系
化合物が使用でき、その濃度としては２〜10ｍＭ
の範囲が好ましい。酸化縮合はPH10以上の条件で
行なうが水酸化ナトリウム、水酸化カリウムの如
き通常のアルカリ剤とメタ過ヨウ素酸ナトリウ
ム、過ヨウ素酸カリウム、過硫酸カリウムの如き
通常の酸化剤を用いればよい。酸化剤の濃度とし
ては概ね５〜20ｍＭの範囲が好ましい。カツプラ
ーと酸化縮合して生成する色素の極大吸収波長は
基質、カツプラーの種類によつて変動するがほぼ
600〜630ｍＭにある。 〔発明の効果〕 叙上の本発明方法は以下に記述する如く従来公
知のγ−GTP活性測定法の欠点をとり除いたす
ぐれた方法であり、その特徴を列挙すると次の通
りである。 (1) 基質であるγ−グルタミル−３−カルボキシ
−４−アミノアニリド誘導体（）の水に対す
る溶解性が大きく、基質溶液の調製が容易であ
り、冷蔵庫保存中にも結晶が析出することなく
長期保存が可能である。 (2) γ−GTPに対する基質反応性が高く、従来
最も広く使用されてきたγ−グルタミル−ｐ−
ニトロアニリドに比べ優れている。

【表】 (3) γ−GTPの作用を受けて生成するアミノ安
息香酸誘導体が、インドフエノール反応により
生成する色素の極大吸収が600nｍ以上である
ため、血清中のビリルビン、ヘモグロビン等の
影響を殆んど受けない。 (4) 呈色の温度、時間による変動がほとんどな
く、再現性のよい測定が可能である。このこと
は臨床検査室で行なう日常分析において非常に
重要なことである。すなわち、本基質による測
定値が良好な再現性を得る理由としては、測定
条件、即ちPH7.5〜8.5の緩衝液中において本発
明に係る基質が極めて安定であるだけでなく、
γ−GTPの作用を受けて基質より生成するア
ミノ安息香酸誘導体もまた下表に示す様に極め
て安定であり、且つ濃度に比例した正確な発色
をすることが挙げられる。

〔実施例〕

以下に本発明の実施例を挙げて詳細に説明す
る。 実施例 １ （試薬） 基質緩衝液： γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−Ｎ，Ｎ
−ジ−ｎ−プロピルアミノアニリド10ミリモル
を含有するPH8.2の0.1モルグリシルグリシン緩
衝液 呈色試薬： メタ過ヨウ素酸ナトリウム10ミリモル、チモー
ル５ミリモル及びトリトン Ｘ−100（キシダ化
学発売）0.5％を含有する0.1期定水酸化ナトリ
ウム溶液 （測定操作） 基質緩衝液1.0mlに血清0.02mlを加え混合した
後、37℃恒温槽で20分間加温する。次いで呈色試
薬3.0mlを加えて発色させる。血清の代りに水
0.02mlを用い血清の時と同様に操作して得られる
試薬盲検を対照として620nｍに於ける吸光度を
測定し、検量線よりγ−GTP活性を算出する。 （検量線の作成） 血清の代りに数種類の既知濃度の２−ジ−ｎ−
プロピルアミノ−５−アミノ安息香酸を使用して
測定操作を行なつて各々の吸光度を求め検量線を
作成する。作成した検量線を第１図に示す。 （結果） 本発明方法で求めたγ−GTP活性測定値と、
従来法で求めたγ−GTP活性測定値について、
それらの間の相関図を作成した。これを第２図に
示す。なお図中、縦軸は本発明法で、横軸は従来
法で求めたγ−GTP活性測定値を示す。 実施例 ２ （試薬） 基質剤： γ−グルタミル−３−カルボキシ−４−Ｎ，Ｎ
−ジアリルアミノアニリド3.6ｇ 溶解液： グリシルグリシン13.2ｇ、水酸化ナトリウム１
ｇ及びｐ−キシレノール0.5ｇを秤量し蒸留水
１で溶解する。 呈色試薬： メタ過ヨウ素酸ナトリウム２ｇ、水酸化ナトリ
ウム４ｇ及びトリトン Ｘ−100 ５ｇを秤量
し、蒸留水１で溶解する。 （基質緩衝液の調製） 溶解液を用いて基質剤を溶解し、基質緩衝液と
する。 （測定操作） 上記基質緩衝液及び呈色試薬を使用し、実施例
１と同様に測定操作を行なう。 （検量線の作成） 上記基質緩衝液及び呈色試薬を使用し２−ジ−
ｎ−プロピルアミノ−５−アミノ安息香酸の代り
に２−ジアリルアミノ−５−安息香酸を使用し測
定操作は実施例１と同様に行ない検量線を作成す
る。作成した検量線を第３図に示す。 （結果）

【表】 【図面の簡単な説明】

第１図及び第３図は、それぞれ実施例１及び２
で作成した検量線を示す図面である。第２図は、
実施例１で求めたγ−GTP活性値と従来法で求
めたγ−GTP活性値との相関図を示す図面であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 被検試料と次の式（） （式中、R₁はｎ−プロピル基又はアリル基を示
   す） で表わされるγ−グルタミル−３−カルボキシ−
   ４−アミノアニリド誘導体とを反応させ、生じた
   アミノ安息香酸誘導体をカツプラーと酸化縮合さ
   せた後、生成した着色化合物量を比色定量するこ
   とを特徴とするγ−グルタミルトランスペプチダ
   ーゼ活性値測定方法。 ２ 次の式（） （式中、R₁はｎ−プロピル基又はアリル基を示
   す） で表わされるγ−グルタミル−３−カルボキシ−
   ４−アミノアニリド誘導体を含有する基質液と、
   カツプリング剤及び酸化剤を含有する呈色試薬よ
   りなるγ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性
   測定用試薬。