JPS6043397A - 酵素活性の定量方法及び定量用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明な、１、反応速度測定法（以下、レイト法と略称
する３、）による酵七活性の定量方法及び定量“用試薬
に関するものである。

従来、反応終結点測定法（」ソ下、エンドポイント法と
略称干る１、）により酵素活性を定量する方法上１ッて
、基質ｒｔｃ酵素酵素４川 質から生成する化合物それ自体、又は該化合物及びこれ
と酸化縮合する化合物、を酸化剤で酸化して生ずる変化
を測定することによって定量するにあたり、過酸化水素
を酸化剤として用いる臨床化学分析が知られている。即
も、エンドポイント法に於ては、合成基質に一定Ｈ３ｆ
間試刺を作用させた後、カプラー（又はデベロッパー）
及び酸化剤を添加し酵素反応を停市させると共に、デベ
ロッパーとカプラーとを酸化縮合させ、生成する色素の
吸光度を測定することにより酵素活性をめる方法が行わ
れている。

一方、レイト法に於て（ｄ、酸化縮合反応を行わない直
接比色法、即ち合成基質から測定対象酵素によって遊離
した色原体（例えば、ｐ−ニトロアニリン、Ｐ−ニトロ
フェノール等）の生成速度を比色によりめ酵素活性を測
定する方法がとられている。このように、レイト法に於
ては、酸化縮合反応を行わないで直接、合成基質から測
定対象酵素によって遊離した色原体の生成度肝をめるの
が、従来、一般的であった。即ち、かかる酵素反応の系
内に酸化剤を共存させること（ｄ酵素阻害を引き起こし
、正確な測定ができなくなる為にタブ−とされていたこ
とであった。

しか１７ながら、本発明者らは、このような従来の一般
常識にもかかわらず、比較的弱い酸化剤のなかには、測
定対象の酵素活性に阻害作用を及ぼさない量を有する酸
化剤もあるのでｆ１７１ないかとの着想を得るに至り、
鋭意研究の結果、過酸化水素がそのような酸化剤として
最も効果的であるとの知見を得、本発明を完成するに至
った。

即ち、本発明（ｄ、基質に酵素を作用させることにより
基質から生成する化合物それ自体、又は該化合物及びこ
れと酸化縮合する化合物を酸化剤で酸化して生ずる変化
を測定することによって酵素活性を定量するにあたり、
酵素活性に阻害作用を及ぼさない量の過酸化水素を酸化
剤としレイト法により基質又は酵素活性を定量すること
を特徴とする、酵素活性の定量方法及び定量用試薬、の
発明である。

本発明の実施態様について述べる。即ち、本発明は測定
対象酵素に９１：リアニ１１ン誘導体、アミンフェノー
ル誘導体、インドリル誘導体等を遊離する合成基質と、
酵素反応により遊離したこれらの一〇− 化合物と酸化縮合し得るカプラーｍ（又はデベロッパー
類）、並びに酵素阻害を生じせしめない程度の量及び強
さの酸化剤とを共存さぜ、酵素反応シー類（又はデベロ
ッパー類）とが、共存する酸化剤により速かに反応し、
逐次色素を生成する速度を吸光度を測定することに」：
す測定することによって実施する，測定対象酵素の活性
に影響を１５えない範囲で酸化剤を反応系中に共存させ
ることが必要であり、又、酵素阻害をより少くするため
には酸化剤は必要量を必要時に供給すると、より効果的
である。使用可能な酸化剤としては過ヨウ素酸、亜塩素
酸、過硫酸塩、過酸化水素、クロラミンＴなどが考えら
れるが、本発明の目的を達成する最も優れた酸化剤は、
過酸化水素である。更に、この過酸化水素は過酸化水素
を発生させ得る酸化酵素と、その基質とを組合せて用い
ることにより供給される形が望ましい。即ち、本発明は
、酸化剤として測定対象酵素への阻害の少ない過酸化水
１　０　− 素を、主反応と並イテして発生させながら同時にその必
２２邦を直ちに反応消費させる事により必要かつ十分量
の酸化剤を必要時に供給するという形で実施するのが好
ましい。

本発明を具体例をあげて更に詳細に説明する。

即１６、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（以下γ
−ＧＴＰと略称する。）測定の場合を例にとると、γ−
ＧＴＰ測定用基質としてＬ−γ−グルタミルーｐ−（Ｎ
−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル））アミノアニ
リドを用い、これを酸化縮合し得るカプラーとしてＩ−
ナフト−ル−２−スルホン酸、酸化剤としての過酸化水
素の発生源としてグルコースオキシダーゼ（以下ＣＯＤ
と略称する。）とグルコース、過酸化水素活性化物質と
してパーオキシダーゼ（以下ＰＯＤと略称する。）を共
存させて用いると測定試料中のγ−ＧＴＰの作Ｉｌｌ　
Ｋよすｐ−（Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル
））アミノアニリンが徐々に遊離するが、これとカプラ
ーである１−ナフトール−２−スルホン酸とが、共存す
るＣＯＤとグルコースとから徐々に発生する過酸化水素
及び共存するｐ。

Ｄにより酸化縮合して極大吸収波長６６０ｎｒｎの色素
を逐次生成する。この色素生成速）現を吸光度を測定す
ることによりめ酵素活性を測定することができる。

酵素阻害の而から好適なグルコース終濃度は０．００５
〜００５チ、」：り好捷しくは００２係付近であり、好
適なＣＯＤ量は１検体当り０８１〜１．０単位、より好
ましくは、０．５単位付近である。

本例について測定原理を化学式で示すと次の通りである
。

ＨＯＯＣＣＩ（２ＮＨＣＯＣＨ，ＮＨ２０ＯＨ （ｐ−（Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）１
アミノアニリン）ＣＯＤ グルコース＋Ｏｔ　＋Ｈ２Ｏ−一一→グルコン酸十Ｈ２
Ｏ２入ｍａＸ　６６０ｎｍ 次に、ロイシンアミノペプチダーゼ（以下ＬＡＰと略称
する。）測定の場合について同様に述べると、ＬＡＰ測
定用基ｒｔとしてし一ロイシルーＰ−Ｎ、Ｎ−ジエチル
アミノアニリドを用い、その他γ−ＧＴＰ測定の場合と
同様に、基質として１−ナフト−ル−２−スルホン酸、
過酸化水素の発生源としてＣＯＤとグルコース及びＰＯ
Ｄを共存させて用いると、試料中のＬ　Ａ　Ｐにより遊
離したｐ　−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノアニリンが生成と
同時に、共存スるＣＯＤとグルコースにより発生した過
酸１３− 化水素及び共存するＰＯＤで１−ナフトール−２−スル
ホン酸と直ちに酸化縮合して極大吸収波長６６０ｎｍの
色素を生成する。この色素生成速度を比色によりめ、酵
素活性を測定することができる。

酵素阻害の面からグルコース終濃度は好適には０．００
５〜０．０５％、より好捷しくは０．０２係付近であり
、好適なＣＯＤ量は１検体当り０．１〜１．０単位、よ
り好ましくは０．５単位付近である。

本例について測定原理を化学式で示すと次の通りである
。

（Ｌ−ロイシル−ｐ−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノアニリド
）（Ｌ＝ロイシン）（Ｐ−：）：ｒ−ｆタレアミノアニ
リン）（１−ナフトール−２−スルホン酸） １４− ５Ｏ３Ｈ 次に、−に記の他に本願発明に於て使用可能な合成基質
及びカプラーの例を列挙すると合成基質と１〜てけ、γ
−ＧＴＰ測定の場合では　Ｌ−γ−グルタミルーｐ−Ｎ
、Ｎ−ジメチルアミンアニリド、■ Ｌ−γ−グルタミルーＰ−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノアニ
リド、−Ｌ−γ−グルタミルーＦ−Ｎ、Ｎ−ジプロピル
アミノア＝リド、■［、−ｒ−グルタミル−ｐ−ｔＮ−
エチル−Ｎ−（β−メタンスルホンアミトエチノリ）ア
ミノアニリド、■Ｌ−γ−グルタミルーＰ−（Ｎ−エチ
ル−Ｎ−スルホプロピル）アミノアニリド、■Ｉ７−・
−グルタミル−ｐ−ヒト・キシアニリド、■Ｌ−γ−グ
ルタミルーｐ−メトキシアニリド、■し一γ−グルタミ
ルーｐ−（Ｎ−エチル−Ｎ−（３０キシアニリド、ＯＬ
−γ−グルタミルー４−ヒト。キシ−７−す、チ２．ア
ミド、０Ｌ−７−グ７、クミル−５−ヒドロキシーフー
スルホ−β−ナフチルアミド、等があり、ＬＡＰ測定の
場合で１ｄＬ−ロイシル−ｐ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ
アニリド、■Ｌ−ロイシルーｐ−（Ｎ−エチル−Ｎ−（
β−ヒドロキシエチル）アミノアニリド、九−ロイシル
−ｐ　−Ｎ　、　Ｎ−ジプロピルアミノアニリド、■Ｌ
−ロイシルーｐ−（Ｎ−エチル−Ｎ−（β−メタンスル
ホンアミドエチノ→）アミノアニリド、■Ｌ−ロイシル
ーｐ−（Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル）アミノアニ
リド、■Ｌ−ロイシルーｐ−（Ｎ−エチル−Ｎ　−（３
−スルホ−２−ヒドロキシプロピノ０ｙアミノアニリド
、■Ｌ−ロイシルーｐ−ヒドロキシアニリド、■Ｌ−ロ
イシルー３−カルボキシー４−ヒドロキシアニリド、■
Ｌ−・インルー３−スルホ−４−ヒト・キシアニＩＪ　
）”、′ｙ）Ｌ−口イシル−４−ヒドロキシ−α−ナフ
チルアミド、＠Ｌ−ロイシルー５−ヒドロキシ−７−ス
ルホ−β−ナフチルアミド等がある。

又、カプラーの例としてｉ　Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリｙ
、−Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン、■Ｎ、Ｎ−ジメチ、レ
ーｍ−トルイジン、■Ｎ、Ｎ−ジエチルーＯ−トルイジ
ン、■フェノール、■２，５−キシｌ／ノール、■２，
６−キシレノール、■２，３−ジメチルフェノ−７し、
■２゜４−ジクロロフェノール、ｆｌｏｏ−クロロフェ
ノール、（ｉｉナフトール、（′匂１−ナフトール−４
−スルホン酸、０１−ナフトール−８−スルホン酸、（
４′１２−ナフトール−８−スルホン酸、（′”’２−
ナフトール−６−ス２．オ、酸、（九−クヮゾー２．．
６瑠−、Ｖシー／ｌ／、”ｍ＝メトキシフェノール等が
ある。

又、基質としてインドリ／ハル誘導体、４−エーテル置
換ナフトール誘導体を使用した場合には、カプラーを使
用せずに酵素反応で遊離したインドリ〃ル類、４−エー
テル置換ナフトール類を共存する酸化剤で二量体にぜし
め、この吸光度変化から測定対象酵素の活性をめる方法
も可能である。

測定対象酵素としては、γ−ＧＴＰ、ＬＡＰの他に、酸
性フォスファターゼ、アルカリ性フォスファターゼ等も
同様に測定可能である。

過酸化水素の発生源として過酸化水素を発生さ１７− せる酸化酵素とその基質の絹合せとしては通常ＣＯＤと
グリコースの組合せを用いるが、その他グリセロールオ
キシダーゼとグリセロールの組合せ、グリセロール−３
−リン酸オキシダーゼとグリセロール−３−リン酸の糸
目台ぜ、コレステロールオキシダーゼとコレステロール
の組合せ、コリンオキシダーゼとコリンの釦合せ、ピル
ビン酸オキシダーゼとピルビン酸の組合せ、ウリカーゼ
と尿酸の絹合せ等も使用可能である。

過酸化水素活性化物質としてはパーオキシダーゼを用い
るのが普通であるが、仙にモリブデン酸、タングステン
酸等も使用できる。

本発明は、比較的弱い酸化剤の外かには、測定対象の酵
素活性に阻害作用を及ぼさない量を有する酸化剤があり
、そのような酸化剤としては過酸化水素が最も好適であ
るとの最初の知見を開示するものであり、斯界に貢献す
る所極めて犬なるものがある。

又、従来、レイト法の重欠点として、基質剤の１８− 溶解性が低い点と４１］１定波ｋが４００　ｎｍ付近で
ある為にビリルビン、ヘモグロビン等血清成分の影響を
受け易く、測定誤差を生じ易いという点が指摘されてお
り、基質の溶解性が良く、遊離した色素の悌犬吸収波長
が肉情成分の影響を受けないようにより長波ｒ　１＋ｔ
１１ｖｃあり、しかも高感度であるような測定法の開発
が切望されていたのが、本発明の好ｔ　Ｌい実施態様の
−によると、即ち、前記エンドポイント法に於て酵素反
応後に行っている酸化縮合反応を４１１１定対象酵素の
作用時に同時に行ない、レイト化を可能にすることによ
り従来のレイト法に於ける上記問題点を一挙に解決（〜
だ点に於て、斯業に貢献する所犬なるものがある。

以下に実施例を示す。

実施例１．（γ−ＧＴＴ’活性測定法）＜　１ｌｌｌｌ
定用試液絹成〉 （１）　基質側溶液 １２５　ｍ　Ｍ　ホウ酸緩衝液 １．２．５ｍＭ　Ｌ−ｒ−グルタミル−ｐ　−（Ｎ−エ
チル−Ｎ　−（β−ヒドロキシエチノ０）アミノアニリ
ド ０．０８係　グルコース　ｐＨ９，００（２）酵素剤溶
液 ２５ｍＭ　ホウ酸緩衝液 １．０ｍＭ　］−］ナフトールー２−スルホン酸カリウ ム５０ｍＭ　グリシルグリシン ５、　Ｏｕ／ｍｅ　Ｇ　ＯＤ ５、Ｏｕ／ｍｅ　ＰＯＩ）　ｐＨ５，５０（３）標準血
清 標準血清の凍結乾燥品を１．５＋ｎＡに溶Ｍ］〜、これ
を扁１５の標準血清とし、扁１〜扁１５を等間隔の希釈
倍率になるようにそれぞれを調製する。

〈測定棟作法〉 ３７℃に予備加温した基質側溶液２．０　ｍｅに試料０
、０５　ｍｌ、酵素剤溶液０．５　ｍｅを添加し、反応
を開始させ、６６０ｎｍにおける吸光度変化を３７℃で
測定した。測定値の標準としてγ−Ｇ　Ｔ　Ｐ活性既知
の標準血清を用い測定を行なった。

〈測定成績〉 （１）直線性 表　１ 表１および第１図に示されるようにγ−ＧＴＰ清性８０
０ｍψｒｒｔ以−に捷で良好な直線関係を示した。

２１− ■再現性 ヒト血清２検体について神り返し測定を行なった結果、
表２に示すように変動係数２〜３係と、良好な再現性が
得られた。

表　２ ■相関 従来法（ｐ−ニトロアニリン誘導体を基質とす２２− 表　３ 表３および第２図に示されるように従来法と極めて良好
な相関が得られた。

ｎ＝］　５　ｙ＝０．９６５６ｘ＋２．０９３ｘ＝９９
．６７　γ＝　０．９９８２ ｙ＝９８．３３ 実施例２．（Ｔ、ＡＰ活性測定法） 〈測定用試液組成〉 （１）基質剤溶液 １２５ｍＭ　ホウ酸緩衝液 １２５５ｍＭ　Ｌ−ロイシル−ｐ−ジエナルアミノアニ
リド ０．０８係　グルコース　ｐＨ９，ｏ。

（２）酸素剤溶液 ２５ｍＭ　リン酸緩衝液 １、０　ｍ　Ｍ　１−ナフトール−２−スルホン酸カリ
ウム ５、Ｏｕ／ｒｎ１．ＧＯＤ ５、Ｏｕ／ｍｇ　ＰＯＤ （３）標準血清 標準血清の凍結乾燥品を１．５　ｔｎｅに溶＋Ｑ＃’　
Ｉ、、これをＡ　１５の標準血清とし、扁１〜扁１５を
等間隔の希釈倍率になるようにそねそれを調製する。

〈測定操作法〉 ３７℃に予備加温した基質剤溶液２．０　ｍｅに試Ｘ・
１０．０５＋＋！！、酵素剤溶液０．５　ｍｌを添加１
〜、反応を開始させ、６６０ｎｍにおける吸光度変化を
３７℃で測定した。測定値の標準としてＬＡＰ活性既知
の標飴血清を用い測定を行なった。

く測定成績〉 （ｊ）直線性　、　４ ２５− 表４および第３図に示されるようにＴ、ＡＰ活性値１８
００Ｇ、Ｒ単位以上まで良好な直線関係を示した。

■再現性 ヒト血清２検体について練り返し１ｌｌ１１定を行なっ
た結果、表５に示すように変動係数１〜２係と、良好な
再現性が得られた。

表　５ ■相関 従来法（ｐ−ニトロアニリン誘導体を基質とするレイト
法）との相関は以下の通りであった。

２６− 表　６ 表６および第４図に示されるように従来法と極めて良好
な相関がａｔられた。

ｎ　＝　１０ ★＝１．６３．２ 父＝　１．６６．４ ｙ　＝　１．、　Ｏ３５ｘ−２，４５３γ＝０．９９８
２ 以上、実施例１．２に示されるように、十分庁直線性を
もち、再現性がよ〈従来法と極めて良好な相関を示すγ
−ＧＴＰおよびＬ　Ａ　Ｐの活性測定法が得られ、る。

なお、本例に於てｔｒｔ吸光度の４１１１定波長がｐ−
ニトロアニリド法の４００　ｎ　ｍ伺近に比較してはる
かに長波長側にある６　６０　ｎ　ｍで測定するためビ
リルビン、ヘモグロビン等の血清成分、あるいは乳ひ゛
血清等の影響をほとんど回避１〜得る。寸だ、従来のレ
イト法に比較１ツて溶＋Ｗ性の高い基質を使用する事が
でき、十分な基ＪＲ濃度をもつ条件下での酵素活性測定
が’Ｔ　ｆｆ’Ｌである。さらに基質剤およびカプラー
（又１１１゛テベＩＪツバ−）を選択する事により従来
の１／イト法以にの測定感度を得ることも可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１に従って得られた、γ−ＧＴＰ活性
測定の検量線を表わし、第２図は、同じ〈実施例１に従
って得られた、従来法との相関を表わし、第３図は、実
施例１に従って得られた、ＬＡＰ活性測定の検量線を表
わし、第４図は、同し〈実施例２に従って得られた、従
来法との相関を表わす。 特許出願人　和光純薬工業株式会社 ２９− 第１図 （Ｎｏ） 第２図 従来法（ｍｕＡｎｌ） ′ａ３　ｚ （Ｎｏ　） 第４図 従来法（Ｇ・Ｒ単位） 手続補正書 昭和ｇ９年／り月／２日 ｌ　事件の表示 ２、発明の名称 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 郵便番号　５４１ 連絡先　特許線（東京）　置　０３−２７０−８５７１
５、　補正によシ減少する発明の数　１６．補正の対象 明細書の発明の名称の欄、特許請求の範囲の欄、発明の
詳細な説明の欄。 ７、　補正の内容 （１、発明の名称の欄に記載の１酵素活性の定量方法及
び定量用試薬」を「酵素活性の定量方法」と補正する。 （２、特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。 （３）明細書９頁１５行目から同頁１６行目にかけて記
載の［酵素活＋１の定量方法及び定量用試薬、の発明で
ある。］を「酵素活性の定量方法の発明である。」と補
正する。 （４）明細１月１８頁２行目に記載の［グリコース］を
「グルコース」と補正する。 以上 別　紙 ２、特許請求の範囲 （１）基質に酵素を作用させることにより基質から生成
する化合物それ自体、又は該化合物及びこれと酸化縮合
する化合物を酸化剤で酸化して生ずる変化を４１１１定
することによって酵素活性を定量するにあたり、酵素活
性にｌ５１１害作用を及ぼさない量の過酸化水素を酸化
剤とし反応速度測定法により定量することを！ＦＦ徴と
する、酵素活性の定量方法。 （２）酵素反応開始と同時に酸化酵素による酵素反応を
開始させることによって生成する過酸化水素を特徴とす
る特許請求の範囲第１項記載の定量方法。 （３）酵素がγ−グルタミルトランスペプチダーゼ又ハ
ロイシンアミノペプチダーセである、特許請求の範囲第
１項又は第２栢記ｌ・し、の定量方法。 （４）　測定対象酵素により、アニリンＩｆ”　”４体
、了ミノフェノール誘導体、アミノナフト−ル誘導体、
インドリル誘導体を遊離する合ＩＡｉ基質と、　２− 酵素反応により遊離したこれらの化合物と酸化縮合し得
るカプラー類（又はデベロッパー類）、及び酸化剤を共
存させ、試料中の測定対象酵素のＩＩきにより遊離して
くる了ニリン類、アミノフェノール類、了ミノナフトー
ル類、インドリル類とカプラー類（又はデベロッパー＠
）とが共存する酸化剤により速やかに反応し、逐次色素
を生成する速度を測定することにより酵素活性をめる反
応速度測定法による酵素活性測定法である、特許請求の
範囲第１項、第２項又は第３項記載の宇彊方法。 （５）基質が下記一般式 〔但し、Ａけγ−グルタミル基又はロイシル基、Ｒ１け
水素、カルボキシル基、スルホン酸基又は低級アルキル
基、Ｘは水酸基、メトキシ基、　１− の低級アルキル基、−ｃ２Ｈ４ｏ［］、−（ｃＨ２）１
１ｓｏ、■■■（ ＳＯ３Ｈ又はその塩（Ｌ＝０〜４　、ｍ＝ｏ〜４　）、
又は−Ｃ２Ｈ４ＮＨ８Ｏ２Ｃ■−■３　を表わす。〕で
表わされる合成基質である、特許請求の範囲第１項、第
２項、第３項又は第４項記載の定量方法。 （６）合成基質がＬ−γ−グルタミルーｐ−［Ｎ−エチ
ル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル））アミノアニリドで
ある、特許請求の範囲第５項記載の定量方法。 （７）合成基質がＬ−口イシル−ｐ−Ｎ、Ｎ−ジエチル
アミノアニリドである、特許請求の範囲第５項記載の定
量方法。 （８）過酸化水素の供給源が過酸化水素を発生させる酸
化酵素とその基質とから成る特許請求の範囲、 第１．２．３．４．５．６又は７項記載、の定量方法。 （９）過酸化水素使用時に鍋酸化水素活性化物質を併Ｊ
’ｌｌする、特許請求の範囲第１．２．３．４．５．６
．７又は８珀記載の定量方法。 ００）過酸化水素活性化物で↑とじてパーオキシダーゼ
を月１いる、！１！１許請求の前）間第９項記載の定量
方法。 以上 　４− ５９７−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 一（１）基質に酵素を作用させることにより基質から生
   成する化合物−それ自体、又は該化合物及びこれと酸化
   縮合する化合物を酸化剤で酸化して生ずる変化を測定す
   ることによって酵素活性を定量するにあたり、酵素活性
   に阻害作用を及ぼさない量の過酸化水素を酸化剤とし反
   応速度測定法により定量することを特徴とする、酵素活
   性の定量方法。 （２）酵素反応開始と同時に酸化酵素による酵素反応を
   開始させることによって生成する過酸化水素を特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載の定量方法。 （３）酵素がγ−グルタミルトランスペプチダーゼ又は
   ロイシンアミノペプチダーゼである、特許請求の範囲第
   １項又は第２項記載の定量方法。 （４）測定対象酵素により、アニリン誘導体、アミノフ
   ェノール誘導体、アミノナフトール誘導体、インドリル
   誘導体を遊離する合成基質と、酵素反応により遊離した
   これらの化合物と酸化縮合し得るカプラー類（又はデベ
   ロッパー類）及び酸化剤を共存させ、試料中の測定対象
   酵素の働きにより遊離してくるアニリン類、アミンフェ
   ノール類、アミノナフトール類、インドリル類とカプラ
   ー類（又はデベロッパー類）とが共存する酸化剤により
   速やかに反応し、逐次色素を生成する速度を測定するこ
   とにより酵素活性をめる反応速度測定法による酵素活性
   測定法である。特許請求の範囲第１項、第２項又は第３
   項記載の定量方法。 （５）基質が下記一般式 〔但し、Ａけγ−グルタミル基又はロイシル基、Ｒ１は
   水素、カルボキシル基、スルホン酸基又は低級アルキル
   基、Ｘは水酸基、メトキシ基、二／Ｒｔ トロ基又は−Ｎ　基（Ｒｔ　、　Ｒ−はＣ３〜Ｃ６の低
   ＼Ｒ８ 級アルキル基、−Ｃ２１Ｔ、ｓ　ＯＴ（、−（ＣＨ２）
   ｎ　ＳＯｓ　Ｈ又Ｈ はその塩（ｎ＝１〜コ（）、−（ＣＨ２）Ａ　−ｂ−（
   ＣＩ（２）ｒｎＨ ８Ｑ、）Ｔ又（ｄその塩（ｔ　＝　１１〜４　ｍ　＝　
   Ｏ〜４　）、又は−Ｃ２Ｈ，Ｎ　ＨＳ　０２Ｃ１１３を
   表わす。〕で表わされる合成基Ｔ↓である、特許請求の
   範囲第１項、第２項、第３項又は第４項記載の定量方法
   。 （６）合成基質がＬ−γ−グルタミルーｐ−（Ｎ−エチ
   ル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）＋７ミノアニリドで
   ある、特許請求の範囲第５項記載の定量方法。 （７）　合成基質がＩ、−ロイシル−ｐ−Ｎ、Ｎ−ジエ
   チルアミノアニリドである、特許請求の範囲第５項記載
   の定ｍ°方法。 （８）過酸化水素の供給源が過酸化水素を発生させる酸
   化酵素とその基質とから成る特許請求の範囲、 第１．２．３、本、５．６又は７項記載の定量方法。 （９）過酸化水素使用時に過酸化水素活性化物質を特徴
   する特許請求の範囲第１．２．３．４．５．６．７又け
   ８項記載の定量方法１．０Ｑ　過酸化水素Ｍｉ性化物質
   としてパーオキシダーゼを用いる、特許請求の範囲第９
   項記１俵の定量方法。 （１１）基質に酵素を作用させることにより基＋７２．
   ｒから生成する化合物それ自体、又は該化合物及びこれ
   と酸化縮合する化合物を酸化剤で酸化して生ずる変化を
   測定することによって酵素活性を定量する１ｃあたり、
   酵素活性に１１１１害作用を及ぼさない量の過酸化水素
   を酸化剤と１７反反応度測定法により定量することを特
   徴とする、ｍ酵素活性の定量用試薬。 （１２）酵素反応開始と同時に酸化酵素による酵素反応
   を開始させることによって生成する過酸化水素を特徴と
   する特許請求の範囲第１１項記載の定量用試薬。 （１３酵素がγ−グルタミルトランスペプチダーゼ又は
   ロイシンアミノペプチダーゼである、特許請求の範囲第
   １１項又は第１２項記載の定−ｍ″用試薬、。 ０→　測定対象酵素により、アニリン誘導体、アミノフ
   ェノール誘導体、アミノナフトール誘導体、インドリル
   誘導体を遊離する合成基質と、酵素反応により遊離した
   これらの化合物と酸化縮合し得るカプラー類（又はデベ
   ロッパー類）、及び酸化剤を共存させ、試料中の測定対
   象酵素の働きにより遊離してくるアニリン類、アミンフ
   ェノール類、アミノナフトール類、インドリル類とカプ
   ラー類（又はデベロッパー類）とが共存する酸化剤によ
   り速やかに反応し、逐次色素を生成する速度を測定する
   ことにより酵素活性をめる反応速度測定法による酵素活
   性測定法である、特許請求の範囲第１１項、第１２項又
   は第１３項記載の定量用試薬。 ０９　基質が下記一般式 〔但し、Ａ　＋ｄγ−グルタミル活又（ｄロイシルＩ糺
   Ｒ１は水素、カルボキシル基、スルホン酸基又（ｒ：Ｉ
   −低級アルキル基、Ｘは水酸基、メトキシ基、ニトロ基
   又は−Ｎ／１２基（Ｒ２，Ｒ，けＣ１〜Ｃ２の低＼Ｒ８ 級アルキル基、−Ｃ２Ｈ４０Ｈ，−（Ｃ，Ｒ２）ｎＳｌ
   Ｏ，Ｈ又聞−その塩（ｎ−１〜３）、−（ＣＨ２）Ａ　
   −Ｃ−（ＣＴ（２）ｍＳＯ，ｌＴ（Ｈ 又はその塩（ｔ−０〜４９ｍ−０〜４）、又は−Ｃ２Ｈ
   ，ＮＨＳ　Ｏ２ＣＨｓを表わす。〕で表わされる合成基
   質である、特許請求の範囲第１１項、第１２項、第１３
   項又は第１４項記載の定量用試薬。 （ｌｉｅ　合成基質がＬ−γ−グルタミルーｐ−（Ｎ−
   エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル））アミノアニリ
   ドである、特許請求の範囲第１５項記載の定量用試薬。 ０η　合成基質がＬ−口イシル−ｐ−Ｎ、Ｎ−ジエチル
   アミノアニリドである特許請求の範囲第１５項記載の定
   量用試薬。 ０→　過酸化水素の供給源が過酸化水素を発生さ６− せる酸化酵素とその基質とから成る特許請求の範囲第１
   １．１２．１３．１４．１５．１６　又は１７項記載の
   定１石川試薬。 １４．１５．１６．１７又は１８項記載の定量用試薬。 （イ）過酸化水素活性化物質としてパーオキシダーゼを
   用いる特７ｆ′Ｉ−請求の範囲第１９項記載の定量用試
   薬。