CN104245952A - 血液样品中的物质的测定法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过简便的操作来回避胆红素和血红蛋白这两者的影响的血液样品中的物质的测定法。该血液样品中的物质的测定法是基于使用了被氧化性显色试剂的酶法进行的血液样品中的物质的测定法，其特征在于，(1)使非离子性表面活性剂与血液样品接触，接着(2)使甜菜碱型两性表面活性剂与该样品接触，在接触的同时或接触后进行酶反应和利用被氧化性显色试剂的显色反应。

Description

血液样品中的物质的测定法
技术领域
本发明涉及基于使用了被氧化性显色试剂的酶法进行的血液样品中的物质的测定法。
背景技术
测定血液样品中的各种物质的浓度对各种疾病的诊断、治疗进展的判定是重要的。例如，血液中的胆固醇、尿酸、血糖、甘油三酯、磷脂、胆碱、肌酸、肌酐、游离胆固醇、胆固醇酯等物质的测定是重要的，作为其测定法，广泛采用如下方法：使氧化酶与这些成分或这些成分的衍生物作用，使由该酶反应直接或间接产生的过氧化氢与作为其发色试剂的被氧化性显色试剂作用并对该显色定量的方法(使用了被氧化性显色试剂的酶法)。
然而，血液样品中存在胆红素、血红蛋白、抗坏血酸等还原物质，由于这些物质的存在使上述血液样品中的物质的测定值受很大影响，有时测定值产生误差。另外，已知胆红素、血红蛋白等也作为色素发挥作用，因此根据测定波长而成为误差的原因，因光和测定试剂中的成分等使这些色素自身的吸收在测定中经时变化，对测定结果造成影响。
作为回避这些成分中的胆红素的影响的方法，已知有向测定试剂中添加两性表面活性剂的方法。例如，专利文献1中，记载了出于回避胆红素的影响的目的向第1试剂中添加两性表面活性剂。专利文献2中，记载了在用过氧化物酶和被氧化性发色剂检测由酶反应生成的过氧化氢的生物体成分测定法中，使两性表面活性剂和亚铁氰化物存在于第一试剂或第一试剂和第二试剂两者中的生物体成分测定方法。
另外，专利文献3中，记载了出于回避体液中存在的血红蛋白和/或胆红素的影响的目的，在测定体系中使两性表面活性剂(作为实施例，仅为烷基甜菜碱氧化物(产品名AMPHITOL 20N))与第一试剂或第二试剂共存的体液中的底物或酶活性的测定方法。但是，专利文献3中，没有在两性表面活性剂的存在下，同时研究试剂中的总血红蛋白和胆红素这两者的影响的实施例。另外，专利文献4中，记载了作为回避血红蛋白和胆红素两者的影响的方法，使用过氧化物以及非离子表面活性剂和/或两性离子表面活性剂的方法。但是，专利文献4中，需要对表面活性剂进行光照射等处理，或者需要调整过氧化物浓度使其达到一定量等，试剂调整繁琐。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平7-039394号公报
专利文献2：日本特开平7-155196号公报
专利文献3：日本特开平3-010696号公报
专利文献4：日本特开2006-081471号公报
发明内容
本发明人等发现出于回避胆红素的影响的目的像专利文献1、2那样在测定用试剂中使用两性表面活性剂时，有时在溶血检体中测定值与期待值偏离。对该机制进行研究，结果发现两性表面活性剂使血红蛋白的吸收光谱变化。
因此，本发明的课题在于提供通过简便的操作而同时回避胆红素和血红蛋白这两者的影响的血液样品中的物质的测定法。
为了解决上述课题对各种表面活性剂的添加效果进行了研究，结果发现胆红素和血红蛋白的影响回避效果根据表面活性剂的种类而有很大不同，并且根据在测定体系添加表面活性剂的时期也有很大不同。基于上述见解进一步进行了研究，结果发现首先使非离子性表面活性剂与血液样品接触，接着在酶反应时使甜菜碱型两性表面活性剂接触，此时能够同时回避胆红素和血红蛋白这两者的影响，从而完成了本发明。
即，本发明提供血液样品中的物质的测定法，其特征在于，是基于使用了被氧化性显色试剂的酶法进行的血液样品中的物质的测定法，(1)使非离子性表面活性剂与血液样品接触，接着(2)使甜菜碱型两性表面活性剂与该样品接触，在接触的同时或接触后进行酶反应和利用被氧化性显色试剂的显色反应。
另外，本发明提供酶法测定试剂，包含(A)含有非离子性表面活性剂的第1试剂、(B)甜菜碱型两性表面活性剂、(C)对测定对象物或其衍生物具有特异性的氧化酶和(D)被氧化性显色试剂。
根据本发明的测定法，仅分别添加2种表面活性剂，就能够同时回避血液样品中广泛存在的胆红素和血红蛋白的影响，能够准确地测定血液样品中的各种物质。
附图说明
图1表示向添加有血红蛋白的血清中添加不含表面活性剂的缓冲液，在37℃反应5分钟后，添加含有两性表面活性剂的缓冲液，在37℃反应5分钟时的血红蛋白的吸收光谱的经时变化。
图2表示向添加有血红蛋白的血清中添加含有两性表面活性剂的缓冲液，在37℃反应5分钟后，添加不含表面活性剂的缓冲液，在37℃反应5分钟时的血红蛋白的吸收光谱的经时变化。
图3表示向添加有血红蛋白的血清中添加含有两性表面活性剂的缓冲液，在37℃反应5分钟后，再添加含有两性表面活性剂的缓冲液，在37℃反应5分钟时的血红蛋白的吸收光谱的经时变化。
图4表示向添加有血红蛋白的血清中添加含有非离子性表面活性剂的缓冲液，在37℃反应5分钟后，添加含有两性表面活性剂的缓冲液，在37℃反应5分钟时的血红蛋白的吸收光谱的经时变化。
具体实施方式
本发明的血液样品中的物质的测定法的特征在于，(1)使非离子性表面活性剂与血液样品接触(第1工序)，接着(2)使甜菜碱型两性表面活性剂与该样品接触，在接触的同时或接触后进行酶反应和利用被氧化性显色试剂的显色反应(第2工序)，除该操作以外，是基于通常的使用了被氧化性显色试剂的酶法进行的血液样品的物质的测定法。
作为第1工序中使用的血液样品，可举出血浆、血清、尿等，其中，更优选血红蛋白和胆红素对测定值产生影响的可能性高的血浆、血清。
作为被测定对象的血液样品中的物质(被检物质)，可举出血红蛋白和胆红素以外的血液样品中的物质，例如尿酸、肌酐、胆固醇、甘油三酯、多胺、胆汁酸、1,5-脱水葡萄糖醇、丙酮酸、乳酸、磷脂、尿素、血糖、胆碱、肌酸、游离脂肪酸等，不特别限定于这些物质，通过对由酶反应生成的过氧化氢定量而能够测定的体液成分全部都可测定。
本发明的第1工序是使非离子性表面活性剂与对被检物质进行氧化酶反应前的血液样品接触的工序。本发明中，第1工序中使用非离子性表面活性剂是重要的，在第1工序使用甜菜碱型两性表面活性剂的情况、第1工序和第2工序这两者使用甜菜碱型两性表面活性剂的情况下，无法回避血红蛋白和胆红素两者的影响。作为非离子性表面活性剂与血液样品的接触方式，可以向血液样品中添加非离子性表面活性剂，可以使血液样品的稀释液中含有非离子性表面活性剂，可以使用含有非离子性表面活性剂的液体作为血液样品的前处理液。作为血液样品的前处理液(也称为第1试剂)，优选使用含有非离子性表面活性剂的液体。
作为本发明中使用的非离子性表面活性剂，优选聚氧乙烯聚氧丙烯缩合物(POE·POP缩合物)类、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯多元醇脂肪酸酯。
作为POE·POP缩合物类，可举出下述式(1)～(5)表示的缩合物。(a)下述式(1)表示的POE·POP缩合物。
式(1)中，l和n表示环氧乙烷的平均加成摩尔数，另外m表示环氧丙烷的平均加成摩尔数，l和n为0～250的数，l+n为1以上，m为1～250的数。l+n优选为10～300，m优选为10～100。l和n可以相同或不同。R2表示氢原子或碳原子数2～20的烷基。
(b)下述式(2)～(5)表示的聚氧乙烯聚氧丙烯烷基胺缩合物或聚氧乙烯聚氧丙烯二胺缩合物。
(式中，R1表示碳原子数2～20的烷基，l表示1～150的数，m表示1～100的数)
作为式(1)的POE·POP缩合物的市售品，可优选使用Pluronic(注册商标，以下相同)F-108(EO300·PO50)、Pluronic P-85(EO54·PO39)。
作为式(2)或式(3)的POE·POP烷基胺缩合物或POE·POP二胺缩合物，可优选使用Pluronic TR-704(分子量5000，EO含量40质量％)、Pluronic TR-702(分子量3500，EO含量20质量％)。
上述l、m和n表示通常具有某种程度的分布的数据的平均值，其分布优选为±20％以内，更优选为±10％以内，进一步优选为±5％以内的分布。
作为聚氧乙烯烷基醚，可举出POE加成摩尔数5～80的聚氧乙烯C10-C24烷基醚。作为聚氧乙烯烷基醚的市售品，可优选使用NIKKOL(注册商标，以下相同)BL-25(Nikko Chemicals公司制，POE(25)十二烷基(C12)醚)、EMULGEN(注册商标，以下相同)220(花王公司制，POE(13)十六烷基(C16)醚)、NIKKOL BT-9(Nikko Chemicals公司制，POE(9)油烯基(C18)醚，C15H31O(CH2CH2O)9H)、EMULGEN420(花王公司制，POE(13)油烯基(C18)醚)。POE加成摩尔数的更优选的范围为8～30。
作为聚氧乙烯烷基苯基醚，可举出POE加成摩尔数5～80的C6-C18烷基苯基醚。作为聚氧乙烯烷基苯基醚的市售品，可优选使用NIKKOLNP-10(Nikko Chemicals公司制，POE(10)壬基(C10)苯基醚)、NIKKOL NP-15(Nikko Chemicals公司制，POE(15)壬基(C10)苯基醚)、NIKKOL NP-20(Nikko Chemicals公司制，POE(20)壬基(C10)苯基醚)、NOIGEN EA-143(第一工业制药公司制，POE(8)十二烷基(C12)苯基醚)、TritonX-100(Sigma公司制，POE(9.5)辛基(C8)苯基醚)。
作为聚氧乙烯多元醇脂肪酸酯，可举出聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯季戊四醇脂肪酸酯等。其中，优选POE加成摩尔数30～60的聚氧乙烯多元醇脂肪酸酯，更优选POE加成摩尔数3～60的聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯，进一步优选POE加成摩尔数3～60的聚氧乙烯失水山梨糖醇C8-C24脂肪酸酯。
作为聚氧乙烯多元醇脂肪酸酯的市售品，可优选使用Tween20(注册商标)(聚氧乙烯失水山梨糖醇单月桂酸酯(C12))。
这些非离子性表面活性剂中，更优选聚氧乙烯聚氧丙烯缩合物(POE·POP缩合物)类，进一步优选POE·POP缩合物、POE·POP烷基胺缩合物或POE·POP二胺缩合物。
从回避血红蛋白和胆红素两者的影响这点考虑，非离子性表面活性剂优选按照与血液样品接触后的浓度为0.1～10w/v％，更优选为0.5～10w/v％，进一步优选为0.5～1.0w/v％的方式使用。在本发明的方法适用的临床检查的领域，本发明的试剂适用于生物化学自动分析装置。在生物化学自动分析装置中，血液样品/第1试剂/第2试剂的容量比通常在1～10μL/50～300μL/20～200μL的范围，第1试剂与第2试剂的容量比通常为1:1～5:1。因此，与血液样品接触后的非离子性表面活性剂的浓度与第1试剂中的非离子性表面活性剂的浓度的因稀释产生的差别小，但由于第2试剂是进一步添加到血液样品和第1试剂的混合物中的，所以想要用反应体系的浓度表示两性表面活性剂的浓度是繁琐的。由此本说明书中用含有两性表面活性剂的试剂中的浓度表示两性表面活性剂的浓度。只要是本领域技术人员，就能够根据该记载设定适合于所希望的样品·试剂容量比的测定体系的两性表面活性剂的浓度。
血液样品与非离子性表面活性剂的接触优选例如在向血液样品添加含有非离子性表面活性剂的液体后，在30～40℃静置或培育1分钟～10分钟，进一步在37℃静置或培育5分钟。
本发明的第2工序是使与非离子性表面活性剂接触的血液样品与甜菜碱型两性表面活性剂接触，在接触的同时或接触后进行酶反应和利用被氧化性显色试剂的显色反应。
第2工序中使用的表面活性剂是甜菜碱型两性表面活性剂。该第2工序中使用专利文献2的实施例3记载的月桂基二甲基氧化胺等氧化胺型两性表面活性剂时，能够回避胆红素的影响，但无法回避血红蛋白的影响。作为使用的甜菜碱型两性表面活性剂，可举出烷基甜菜碱(R3N+(CH3)2CH2COO-)、酰胺烷基甜菜碱(R3CONH(CH2)3N(CH3)2CH2COO-)、磺基甜菜碱(R3CONH(CH2)3N+(CH3)2CH2CH(OH)CH2SO3 -)、2-烷基-N-羧甲基-N-羟乙基咪唑啉甜菜碱(R3C3H4N2(C2H4OH)CH2COO-)等(在此，R3表示C8～C24烷基)。其中，更优选烷基甜菜碱和酰胺烷基甜菜碱。
作为甜菜碱型两性表面活性剂的市售品，例如作为烷基甜菜碱衍生物，可举出AMPHITOL 24B(花王公司制，月桂基甜菜碱，CASNo.683-10-3)等，作为酰胺烷基甜菜碱衍生物，可举出ENAGICOLC-30B(LION公司制，椰子油脂肪酸酰胺烷基甜菜碱，CASNo.61789-40-0)等。
如上所述用含有甜菜碱型两性表面活性剂的试剂中的浓度例示甜菜碱型两性表面活性剂的优选的浓度。从回避血红蛋白和胆红素两者的影响这点考虑，甜菜碱型两性表面活性剂按照以试剂中的浓度计优选为0.5～10w/v％，进一步优选为2.0～10w/v％的方式使用。另外，根据非离子性表面活性剂的浓度也有时优选0.5～2.0w/v％的情况。
甜菜碱型两性表面活性剂与血液样品的接触只要向与非离子性表面活性剂接触后的血液样品中添加甜菜碱型两性表面活性剂即可。酶反应可以在血液样品与甜菜碱型两性表面活性剂接触的同时或者接触后进行。因此，甜菜碱型两性表面活性剂也可以添加到含有酶的样品(第2试剂)中。
作为本发明的一个实施方式的、以由第1试剂和第2试剂形成的双试剂体系构成测定体系(试剂体系)时，优选如下设定处方：使第1试剂含有非离子性表面活性剂，第2试剂含有甜菜碱型两性表面活性剂，与血液样品接触后的非离子性表面活性剂的浓度为0.5～1.0w/v％，试剂中的甜菜碱型两性表面活性剂的浓度为2.0～10w/v％。
作为适用本发明体系的血液样品中的被测定物质的测定中使用的酶类，可举出对测定对象物或其衍生物具有特异性的氧化酶，例如尿酸(尿酸酶、过氧化物酶)、肌酐(肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化物酶)、胆固醇(胆固醇氧化酶、过氧化物酶)、甘油三酯(脂蛋白脂肪酶、甘油激酶、甘油-3-磷酸氧化酶、过氧化物酶)、多胺(多胺酰胺水解酶、多胺氧化酶、腐胺氧化酶、过氧化物酶)、胆汁酸(3-α-羟基类固醇脱氢酶、黄递酶、过氧化物酶)、1,5-脱水葡萄糖醇(1,5-脱水葡萄糖醇氧化酶、吡喃糖氧化酶、过氧化物酶)、丙酮酸(丙酮酸氧化酶、过氧化物酶)、乳酸(乳酸氧化酶、过氧化物酶)、磷脂(磷脂酶D、胆碱氧化酶、过氧化物酶)、尿素(脲酰胺脂肪酶、丙酮酸激酶、丙酮酸氧化酶、过氧化物酶)等。
作为被氧化性显色试剂，只要是与过氧化氢反应显色的1种或2种以上的成分即可，例如，可举出4-氨基安替比林与苯酚系、萘酚系或苯胺系化合物的组合，3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙与苯胺系化合物的组合，三苯甲烷系无色色素、二苯胺衍生物、联苯胺衍生物、三烯丙基咪唑衍生物、无色亚甲蓝衍生物或邻苯二胺衍生物。
第2工序通常在30～40℃进行1分钟～10分钟，优选在37℃进行5分钟。pH的调节可使用磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐、碳酸盐、Tris缓冲剂、Good’s缓冲剂等。第2工序中的显色的测定是通过对显色试剂的发色进行光学定量而进行的。
根据本发明方法，能够回避血液样品中所含的血红蛋白和胆红素对测定值的影响，能够进行准确的被检物质的定量。
用于实施本发明方法的测定试剂优选是包含(A)含有非离子性表面活性剂的第1试剂、(B)甜菜碱型两性表面活性剂、(C)对测定对象物或其衍生物具有特异性的氧化酶和(D)被氧化性显色试剂的酶法测定试剂。
以下示出本发明的优选的实施方式。
[1]一种血液样品中的物质的测定法，其特征在于，是基于使用了被氧化性显色试剂的酶法进行的血液样品中的物质的测定法，(1)使非离子性表面活性剂与血液样品接触，接着(2)使甜菜碱型两性表面活性剂与该样品接触，在接触的同时或接触后进行酶反应和利用被氧化性显色试剂的显色反应。
[2]根据[1]的测定法，血液样品是血红蛋白和胆红素对测定值产生影响的可能性高的血浆或血清。
[3]根据[1]或[2]的测定法，血液样品中的物质是通过对由酶反应生成的过氧化氢定量而能够测定的、血红蛋白和胆红素以外的血液样品中的物质，更优选为选自尿酸、肌酐、胆固醇、甘油三酯、多胺、胆汁酸、1,5-脱水葡萄糖醇、丙酮酸、乳酸、磷脂、尿素、血糖、胆碱、肌酸以及游离脂肪酸中的物质。
[4]根据[1]～[3]中任一项的测定法，非离子性表面活性剂是选自聚氧乙烯聚氧丙烯缩合物(POE·POP缩合物)类、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚以及聚氧乙烯多元醇脂肪酸酯中的1种或2种以上，更优选为选自POE·POP缩合物、POE·POP烷基胺缩合物或POE·POP二胺缩合物中的1种或2种以上。
[5]根据[1]～[4]中任一项的测定法，非离子性表面活性剂的使用量是与血液样品接触后的浓度为0.1～10w/v％、更优选为0.5～10w/v％的量。
[6]根据[1]～[5]中任一项的测定法，甜菜碱型两性表面活性剂是选自烷基甜菜碱、酰胺烷基甜菜碱、磺基甜菜碱以及2-烷基-N-羧甲基-N-羟乙基咪唑啉甜菜碱中的1种或2种以上，更优选为选自烷基甜菜碱和酰胺烷基甜菜碱中的1种或2种以上。
[7]根据[1]～[6]中任一项的测定法，甜菜碱型表面活性剂的使用量以试剂中浓度计为0.5～10w/v％的量。
[8]根据[1]～[7]中任一项的测定法，酶是对测定对象物或其衍生物具有特异性的氧化酶。
[9]根据[1]～[8]中任一项的测定法，被氧化性显色试剂是与过氧化氢反应而显色的1种或2种以上的成分。
[10]根据[1]～[9]中任一项记载的测定法，是用于回避血液样品中的血红蛋白和胆红素对测定值的影响的测定法。
[11]一种酶法测定试剂，其特征在于，包含(A)含有非离子性表面活性剂的第1试剂、(B)甜菜碱型两性表面活性剂、(C)对测定对象物或其衍生物具有特异性的氧化酶和(D)含有被氧化性显色试剂的第2试剂。
实施例1
接下来举出实施例进一步对本发明进行详细说明。
〔试验例1〕
使用下述表1的组成的第1试剂、第2试剂，对测定用样品中的血红蛋白的吸收光谱进行测定。
表1
(测定用样品)
向混合血清中添加血红蛋白(来自血细胞)使其达到500mg/dL，制备添加有血红蛋白的血清。
(测定方法)
使用日立U3310型分光光度计(日立制作所制)，按照测定用样品45μL、第1试剂1.8mL、第2试剂0.9mL的液量比，将第1反应、第2反应分别在37℃进行5分钟，测定血红蛋白的吸收光谱。应予说明，第2反应以后(7分钟，10分钟)考虑稀释比进行液量修正。
(结果)
血红蛋白在540nm、575nm附近具有特有的峰，如果血红蛋白的性状变化则峰的形状也变化。例1中，在第1反应中峰的形状没有变化，但第2反应开始后峰瓦解开始变化成平缓的形状。例2和例3中第1反应开始1分钟后观察到血红蛋白特有的峰，但3分钟后峰瓦解，在第2反应中光谱也没有大的变化。由这些结果可知AMPHITOL 24B具有使血红蛋白的光谱变化的作用(图1～图3)。
〔实施例1〕
使用下述表2的组成的第1试剂、第2试剂，测定测定用样品中的血红蛋白的吸收光谱。
表2
(测定用样品)
向混合血清中添加血红蛋白(来自血细胞)使其达到500mg/dL，制备添加有血红蛋白的血清。
(测定方法)
使用日立U3310型分光光度计(日立制作所制)，按照测定用样品45μL、第1试剂1.8mL、第2试剂0.9mL的液量比，将第1反应、第2反应分别在37℃进行5分钟，测定血红蛋白的吸收光谱。应予说明，第2反应以后(7分钟，10分钟)考虑稀释比进行液量修正。
(结果)
实施例1中，在第1反应、第2反应中血红蛋白特有的540、575附近的峰的形状均没有发生变化(图4)。
〔实施例2〕
使用尿酸测定体系确认本发明的效果。
使第1试剂和第2试剂中配合的表面活性剂成为表3记载的组合，制备实施例2和比较例1～4的测定试剂。
(第1试剂)
MES缓冲液                           75mmol/L(pH7.0)
TOOS(制造商：同仁化学，分类编号：OC13)0.75mmol/L
POD(制造商：东洋纺织，分类编号：PEO-301)3U/mL
表面活性剂                          2.0w/v％
Pluronic TR-704(制造商：ADEKA，CAS No.11111-34-5)
或者AMPHITOL 24B(制造商：花王，CAS No.683-10-3)
(第2试剂)
MES缓冲液                           75mmol/L(pH7.0)
亚铁氰化钾(制造商：Kishida Chemical，分类编号：63532)0.05mmol/L
4-氨基安替比林(4-AAP)(制造商：东京化成工业，分类编号：6694)0.75mmol/L
尿酸酶(制造商：Kikkoman，分类编号：60199)0.7U/mL
表面活性剂                            2.0w/v％
Pluronic TR-704(制造商：ADEKA，CAS No.11111-34-5)
或者AMPHITOL 24B(制造商：花王，CAS No.683-10-3)
(测定用血液样品)
向混合血清中添加二牛磺酸胆红素(制造商：Promega)使其达到50mg/dL，或者添加血红蛋白(来自血细胞)使其达到500mg/dL，制备添加有胆红素的血清和添加有血红蛋白的血清。
(测定方法)
使用日立7170型自动分析装置，按照检体5.0μL、第1试剂200μL、第2试剂100μL的液量比，将第1反应、第2反应分别在37℃进行5分钟，利用终点法测定主波长600nm/副波长800nm的吸光度。
各血液样品中的尿酸浓度是与浓度已知的标准液(Anaserum(アナセラム)UA-E标准液，以下相同)(制造商：Sekisui Medical，分类编号：154966)对比而求得的。
(效果的确认方法)
将各测定用血液样品的尿酸浓度测定值换算成对照用血液样品的尿酸浓度测定值为100时的比率，将胆红素和血红蛋白的影响回避程度相对值化。
(结果)
第1试剂中配合有AMPHITOL 24B的比较例2和比较例4的情况下，无论第2试剂的表面活性剂的种类如何均不受胆红素的影响，但受血红蛋白的影响很大。这种情况的相对值比第1试剂和第2试剂中不含表面活性剂的比较例1的相对值还低。
第1试剂和第2试剂中配合有Pluronic TR-704的比较例3的情况下，不受血红蛋白的影响，但受胆红素的影响很大。
与这些比较例1～4相对，第1试剂中配合有Pluronic TR-704、第2试剂中配合有AMPHITOL 24B的实施例2的情况下，确认了不受胆红素和血红蛋白的影响，能够同时回避胆红素和血红蛋白这两者的影响。
表3
表中，TR-704表示Pluronic TR-704，
24B表示AMPHITOL 24B，数值表示百分比。
对照用血液样品的尿酸浓度测定值为4.3mg/dL。
[实施例3]
使用尿酸测定体系，确认各表面活性剂的最佳浓度范围。
(第l试剂)
MES缓冲液                           75mmol/L(pH7.0)
TOOS(制造商：同仁化学，分类编号：OCl3)0.75mmol/L
POD(制造商：东洋纺织，分类编号：PEO-301)3U/mL
表面活性剂                          2.0w/v％
Pluronic TR-704(制造商：ADEKA，CAS No.11111-34-5)
(第2试剂)
MES缓冲液                           75mmol/L(pH7.0)
亚铁氰化钾(制造商：Kishida Chemical，分类编号：63532)0.05mmol/L
4-氨基安替比林(制造商：东京化成工业，分类编号：6694)0.75mmol/L
尿酸酶(制造商：Kikkoman，分类编号：60199)0.7U/mL
表面活性剂                          2.0w/v％
AMPHITOL 24B(制造商：花王，CAS No.683-10-3)
(测定用血液样品)
向混合血清中添加二牛磺酸胆红素(制造商：Promega)使其达到40mg/dL，或者添加血红蛋白(来自血细胞)使其达到400mg/dL，制备添加有胆红素的血清和添加有血红蛋白的血清。
(对照用血液样品)
向上述混合血清中添加与上述测定用血液样品制备时的二牛磺酸胆红素和血红蛋白添加容量相当的生理盐水来使用。
(测定方法)
使用日立7170型自动分析装置，按照检体5.0μL、第1试剂200μL、第2试剂100μL的液量比，将第1反应、第2反应分别在37℃进行5分钟，利用终点法测定主波长600nm/副波长800nm的吸光度。
各血液样品中的尿酸浓度是与浓度已知的标准液对比而求得的。
(效果的确认方法)
将各测定用血液样品的尿酸浓度测定值换算成对照用血液样品的尿酸浓度测定值为100时的比率，将胆红素和血红蛋白的影响回避程度相对值化(回收率(％))。将回收率为±10％以内判断为有效果。
(结果)
对各表面活性剂的最佳浓度范围进行研究，结果发现作为非离子性表面活性剂的Pluronic为0.1％～10％，作为两性表面活性剂的AMPHITOL为0.5％～10％时具有本发明的效果。特别是作为非离子性表面活性剂的Pluronic为0.5～1.0％，作为两性表面活性剂的AMPHITOL为2.0～10％时其效果明显。
表4
〔实施例4〕
使用尿酸测定体系确认可用于本发明的表面活性剂。
使第1试剂和第2试剂中配合的表面活性剂的种类和浓度如表5记载，制备测定试剂。
(第1试剂)
MES缓冲液                           75mmol/L(pH7.0)
TOOS(制造商：同仁化学，分类编号：OC-13)0.75mmol/L
POD(制造商：Kikkoman，分类编号：PEO-301)3U/mL
表面活性剂
(第2试剂)
MES缓冲液                           75mmol/L(pH7.0)
亚铁氰化钾(制造商：Kishida Chemical，分类编号：63532)0.05mmol/L
4-氨基安替比林(制造商：东京化成工业，分类编号：6694)0.75mmol/L
尿酸酶(制造商：Kikkoman，分类编号：60199)0.7U/mL
表面活性剂
(测定用血液样品)
向混合血清中添加二牛磺酸胆红素(制造商：Promega)使其达到50mg/dL，或者添加血红蛋白(来自血细胞)使其达到500mg/dL，制备添加有胆红素的血清和添加有血红蛋白的血清。
(测定方法)
使用日立7170型自动分析装置，按照检体5.0μL、第1试剂200μL、第2试剂100μL的液量比，将第1反应、第2反应分别在37℃进行5分钟，利用终点法测定主波长600nm/副波长800nm的吸光度。
各血液样品中的尿酸浓度是与浓度已知的标准液对比而求得的。
(效果的确认方法)
将各测定用血液样品的尿酸浓度测定值换算成对照用血液样品的尿酸浓度测定值为100时的比率，将胆红素和血红蛋白的影响回避程度相对值化(回收率(％))。将回收率为±10％以内判断为有效果。
(结果)
如表5所示，发现即便使用Pluronic TR-704以外的非离子性表面活性剂的情况下也能够同时回避胆红素和血红蛋白的影响。确认了使用N-氧化物型的AMPHITOL 20N代替甜菜碱型的AMPHITOL 24B作为两性表面活性剂时，受血红蛋白的影响很大。以往认为AMPHITOL 20N能够分别回避血红蛋白或胆红素的影响，但根据本发明人等的研究发现其效果达不到实用的水平。另一方面，对于作为酰胺烷基甜菜碱的椰油酰胺丙基甜菜碱、作为2-烷基-N-羧甲基-N-羟乙基咪唑啉甜菜碱的椰油酰两性基乙酸钠、作为磺基甜菜碱的3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸内盐，确认了与酰胺甜菜碱相同的效果。
表5
〔实施例5〕
(第1试剂)
MES缓冲液                           75mmol/L(pH7.0)
TOOS(同仁化学：分类编号：OC-13)0.75mmol/L
各表面活性剂                        2.0w/v％
(第2试剂)
MES缓冲液                           75mmol/L(pH7.0)
尿酸酶(制造商：Kikkoman，分类编号：60199)2.3U/mL
(第3试剂)
MES缓冲液                           75mmol/L(pH7.0)
POD(制造商：东洋纺织，分类编号：PEO-301)8.6U/mL
亚铁氰化钾(制造商：Kishida Chemical，分类编号：63532)0.05mmol/L
4-氨基安替比林(制造商：东京化成工业，分类编号：6694)0.75mmol/L
各表面活性剂                         2.0w/v％
(测定方法)
使用日立7170型自动分析装置，按照检体5.0μL、第1试剂200μL、第2试剂30μL、第3试剂70μL的液量比，将第1反应、第2反应、第3反应分别在37℃进行5分钟(总计反应15分钟)，利用终点法测定主波长600nm/副波长800nm的吸光度。
各血液样品中的尿酸浓度是与浓度已知的标准液对比而求得的。
表6
表中，TR-704表示Pluronic TR-704，
24B表示AMPHITOL 24B，数值表示百分比。
对照用血液样品的尿酸浓度测定值为4.4mg/dL。
(结果)
实施例5、比较例5～8的步骤可以分成如下三个工序：使含有血红蛋白的检体液与表面活性剂、发色剂接触的第一工序，使尿酸酶与第一工序中得到的检体液反应而生成过氧化氢的第二工序，向第二工序中得到的检体液添加POD，过氧化氢将发色剂氧化缩合而显色的第三工序。本发明中，认为是由于如下原因而回避胆红素和血红蛋白的影响，所述原因是第一工序中非离子性表面活性剂使检体液中的血红蛋白的色调不发生变化，并且第三工序中两性表面活性剂使胆红素不易变成POD的底物。即，认为不受对检体液所含的底物、第二工序中使用的底物有特异性的酶限制，使用尿酸以外的底物、尿酸酶以外的酶的情况下也发挥效果。

Claims (10)

1.一种血液样品中的物质的测定法，其特征在于，是基于使用了被氧化性显色试剂的酶法进行的血液样品中的物质的测定法，(1)使非离子性表面活性剂与血液样品接触，接着(2)使甜菜碱型两性表面活性剂与该样品接触，在接触的同时或接触后进行酶反应和利用被氧化性显色试剂的显色反应。
2.根据权利要求1所述的测定法，其中，血液样品是血红蛋白和胆红素对测定值产生影响的可能性高的血浆或血清。
3.根据权利要求1或2所述的测定法，其中，血液样品中的物质是通过对由酶反应生成的过氧化氢进行定量而能够测定的除血红蛋白和胆红素以外的血液样品中的物质。
4.根据权利要求1～3中任1项所述的测定法，其中，非离子性表面活性剂是选自聚氧乙烯聚氧丙烯缩合物、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基胺缩合物、聚氧乙烯聚氧丙烯二胺缩合物、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚以及聚氧乙烯多元醇脂肪酸酯中的1种或2种以上。
5.根据权利要求1～4中任1项所述的测定法，其中，非离子性表面活性剂的使用量是与血液样品接触后的浓度成为0.1～10w/v％的量。
6.根据权利要求1～5中任1项所述的测定法，其中，甜菜碱型两性表面活性剂是选自烷基甜菜碱、酰胺烷基甜菜碱、磺基甜菜碱以及2-烷基-N-羧甲基-N-羟乙基咪唑啉甜菜碱中的1种或2种以上。
7.根据权利要求1～6中任1项所述的测定法，其中，酶是对测定对象物或其衍生物具有特异性的氧化酶。
8.根据权利要求1～7中任1项所述的测定法，其中，被氧化性显色试剂是与过氧化氢反应而显色的1种或2种以上的成分。
9.根据权利要求1～8中任1项所述的测定法，是用于回避血液样品中的血红蛋白和胆红素对测定值的影响的测定法。
10.一种酶法测定试剂，其特征在于，包含：(A)含有非离子性表面活性剂的第1试剂，(B)甜菜碱型两性表面活性剂，(C)对测定对象物或其衍生物具有特异性的氧化酶，和(D)含有被氧化性显色试剂的第2试剂。
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