JPS6363400A - 尿酸の酵素的定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、尿酸含量のエンザイムアッセイに関し、更に
詳細には、生物学的液体、例えば血中や尿中に含まれる
尿酸を分析する方法に関するものである。

（従来の技術） 尿中又は血清中の尿酸の定量は、心不全又は、代謝異常
性疾患等各種疾病の診断において非常に有用になってき
ている。

従来の尿酸の定量法は、一般に化学的定量法と酵素法と
に大別される。化学的定量法としてはリンタングステン
酸を用いる方法、酵素法としてはカタラーゼ又はウリカ
ーゼ・ペルオキシダーゼを利用する方法が専ら行われて
いる。

しかしながら、本発明のように、ウリカーゼを用いる酵
素法において、ウリカーゼ拮抗阻害剤を存在せしめるこ
とは従来未知の全く新規な技術である。

（発明が解決しようとする問題点） 尿酸の定量法のうち、先ず、化学的定量法は、尿酸がア
ルカリ溶液中でリンタングステン酸を還元し、青色のタ
ングステンブルーを生成することを利用する方法である
が、この方法は、長時間の加熱操作があり、放置時間も
長く、作業能率が低いだけでなく、検体中の種々の還元
物質の影響を強く受ける欠点がある。

一方酵素法としては、ウリカーゼ・カタラーゼ法、ウリ
カーゼ・パーオキシダーゼ法があり、どちらもウリカー
ゼの基質特異性が高いため、共存物質の影響は他方より
少ないという利点はあるが、尿酸の定量がエンドポイン
ト法にによるため、バックグランド補正のための盲検を
必要とするという致命的欠点は避けられない。

又、尿中の尿酸を分析する場合は、いずれの方法も希釈
が必要であり、操作が煩雑である。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、上記した欠点のない全く新規な尿酸分析方法
を開発するためになされたものであるが、検体を希釈す
ることなく、簡単にしがも正確に自動分析装置で測定で
きる方法が望まれているという業界の要望に応えるには
、酵素法が最適であるとの観点にたち、新規なエンザイ
ムアッセイを開発するためになされたものである。

上記目的を達成するために、酵素分析、酵素学、生化学
、分析化学等の各分野に亘って鋭意研究した結果、本発
明が完成されたものである。すなわち、本発明は、ウリ
カーゼ拮抗阻害剤共存下で検体にウリカーゼを作用させ
、生成する過酸化水素を連続的に測定することによって
、又は、直接尿酸に由来する吸光度を連続的に測定する
ことによって検体中の尿酸を定量することを重要なポイ
ントとする方法である。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明の方法において基本となる反応は、次の式（１）
で示される第１反応である。

第１反応は、検体中の尿酸を酸素の存在下でウリカーゼ
によって、二酸化炭素、アラントイン、水素イオン、過
酸化水素を生成する反応である。

本発明の第１の特徴は、式（１）の反応によって減少す
る尿酸の量を、紫外部での吸光度で直接連続的に測定し
て尿酸を定量することにある。そして本発明の第２の特
徴は、式（１）の反応を基本反応として、拮抗阻害剤の
存在下でウリカーゼを作用せしめて過酸化水素を生成せ
しめ、このようにして生成した過酸化水素を後記する式
（ＩＴ）又は式（ｍ）にしたがってペルオキシダーゼ又
はカタラーゼを用いて連続的に測定し、もって尿酸を定
量することにある。

すなわち、本発明の特徴は、拮抗阻害剤共存下でウリカ
ーゼの酵素反応で生成する過酸化水素を連続的に測定す
るか、又は、紫外部での吸光度を直接連続的に測定する
ことによって尿酸を測定することにある。

本発明で用いられるウリカーゼ拮抗阻害剤とは、オキソ
ン酸、ビオルル酸、キサンチン、バルビトン、２，６．
８−トリクロロプリン、ヒポキサンチン。

アランドキサイジン、２−ヒドロキシ−６，８−ジチオ
プリン、ブトバルビトン、スルフアメリジン、スルファ
ピリジン、スルフアメリジン、スルファダイヤジン、ア
ミロバルビトン、チオフィリン、テオブロミン、カフェ
イン、２，８−ジヒドロキシ−６−チオプリン、６−ク
ロロ−２，８−ジヒドロキシプリン、４．６−ヒドロキ
シピリミジン、バルビッル酸、スルファミン、スルファ
グアジン、キナルバルビトン、２−メルカプトピリミジ
ン、アロキサン、２，６−シクロロ−８−ヒドロキシプ
リン、２−ヒドロキシ−６，８−ジアミノプリン、フェ
トバルビトン、２，６−ヒトロキシー８−アミノプリン
、２−クロロ−６−アミノ−８−ヒドロキシプリン、２
，８−ジヒドロキシ−６−アミノプリン、フェノバルビ
トン、２，６−ジアミノ−８−ヒドロキシプリン及び２
，６−ジ・ヒドロキシ−８−チオプリン等であるが、こ
れらを単独もしくは混合して使用してもよい。

本発明の第２の特徴にしたがって、第１反応に引き続き
過酸化水素を連続的に測定する場合は、次に示す第２反
応が必要である。第２反応としてパーオキシダーゼを使
用する場合は、式（ＩＩ）で示される。

パーオキシダーゼ すなわち、ウリカーゼ拮抗阻害剤共存下でのウリカーゼ
反応によって生成した過酸化水素を、連続的に酸素パー
オキシダーゼの存在下で水素供与体とカップラーとで酸
化縮合反応を生成せしめ、その結果生成する酸化呈色体
の量を比色することによって検体中の尿酸を定量するの
である。

酸化縮合反応における、カップラーとしては、４−アミ
ノアンチピリンや３−メチル−２−ベンゾチアゾリン等
が使用できる。又、水素供与体としては次のものが例示
される：フェノール、４−クロロフェノール、２，４−
ジクロロフェノール、２，４．６−　トリプロ１１フエ
ノール、３，５−シクロロ−２−ヒドロヤシベンゼンス
ルホン酸、３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨード安
息香酸、２，４−ジブロムフェノール、２．６−ジクロ
ロフェノール、０−クレゾール、ｍ−クレゾール、ｐ−
クレゾール、３，５−ジメチルフェノール、チモール、
０−ヒドロキシアセトフェノン、ｐ−ヒドロキシアセト
フェノン、２−クロロ−５−ヒドロキシトルエン、０−
クロロフェノール、どブロムフェノール、２，６−ジブ
ロムフェノール、０−メトキシフェノール、ｍ−メトキ
シフェノール、Ｐ−メトキシフェノール、２−ヒドロキ
シ−３−メトキシベンゼンスルホン酸、０−ヒドロキシ
ベンゼンスルホン酸、Ｐ−ヒドロキシベンゼンスルホン
酸、サリチル酸、ｍ−ヒドロキシ安息香酸、Ｐ−ヒドロ
キシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、サリチ
ル酸メチル、サリチルアミド、３，５−ジブロム−４−
ヒドロキシ安息香酸、０−ニトロフェノール、ｍ−二ト
ロフェノール、Ｐ−ニトロフェノール、などのフェノー
ル系水素供与体。

Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒ
ドロキシエチル）−ｍ−）−ルイジン、Ｎ−エチルート
（３−メチルフェニル）−Ｎ’−アセチルエチレンジア
ミン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｍ−アニシジン、Ｎ−スルホ
プロピルアニリン、Ｎ−メチル−Ｎ−スルホプロピルア
ニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ
−ブチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン、Ｎ−エチル−
スルホプロピル−ｏ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−ス
ルホプロピル−ｍ−）−ルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−ス
ルホプロピル−ｐ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スル
ホプロピル−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホ
プロピル−３，５−ジメチルアニリン、＼−スルホプロ
ピルー３，５−ジメ１−キアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−
スルホピロピル−３，５−ジメチルアニリン等のアニリ
ン系水素供与体。

Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホプロピル）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エ
チル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）　
−３，５−ジメトキシアニリン、Ｎ−（２−ヒドロキシ
−３−スルホプロピル）−３゜５−ジメトキシアニリン
、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロ
ピル）−３，５−ジメチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３〜スルホプロピル）−ｍ−トルイ
ジン等のスルホキシスルホプロピル誘導体系水素供与体
。

本発明において、酸化縮合反応における、カップラーと
水素供与体の組み合わせはいずれでもよいし、また、上
記カップラーと水素供与体のみに制限されるものでもな
い。

第２反応としてカタラーゼを使用する場合は。

式（ＩＩＩ）で示される。

、ＨＣ％１ 資　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　型先ず、
第１反応で示したように、ウリカーゼ拮抗阻害剤共存下
でのウリカーゼ反応によって、生成した過酸化水素を、
連続的にアルコール存在下にカタラーゼ作用によって、
アルデヒドに変換する。そして、アルコールがエタノー
ルの場合、ついでアルコール脱水素酵素の触媒作用でＮ
ＡＤＨからＮ　Ａ　Ｄ＋の生成速度でもって、又、アル
デヒド脱水素酵素の触媒作用でＮＡＤ＋からＮ　Ａ　Ｄ
　Ｈの生成速度でもって検体中の尿酸は定量される。

一方アルコールがメタノールの場合、ついでホルムアル
デヒド脱水素酵素の触媒作用でＮＡＤ”からのＮＡＤＨ
の生成速度でもって、また、生成したホルムアルデヒド
にアセチルアセトンを添加することによって検体中の尿
酸は定量されるのである。

実施例１ １００ｍＭリン酸カリ緩衝液　ρ）１８．０２５ｍＭ　
４−アミノアンチピリン ２ｍＭフ　ェ　ノール ｌｕ／ｍｌｌ！パーオキシターゼ 約０．０３ｕ／ｎｉｌウリカーゼ ０．０１〜０．１ｍＭ尿酸を含む反応液にウリカーゼの
阻害剤を下記に示す濃度になるように加え、３７℃、５
００止ｍの１分間当りの吸光度の変化量を測定した。

そして、各阻害剤の阻害形式を調べた。

各阻害剤の使用濃度は、 オキソン酸　　　３．ＯＸｌｏ−６Ｍ ヒオ／Ｌ／／Ｎ！ｔ　　　　１．３Ｘ１０−ｓＭキサン
チン　　　５．ＯＸ　１０−’Ｍ　　　である。

図１．２．３に示すようにいずれの阻害剤も尿酸に対し
て拮抗的にウリカーゼ活性を阻害したことが判る。

実施例２ ホウ酸−水酸化ナトリウム、ＰＨ８，５５０ｍＭオキソ
ン酸　　　　　　　　　　　０．１５ｍＭウリカーゼ　
　　　　　　　　　　０．１ｕ／ｍｕを含む反応液３−
に検体として尿酸１２０ｍｇ／ｄＱを順次希釈して作成
した。希釈系列のサンプル７５μΩ注入し、３７°Ｃで
２９３止の吸光度の減少を２分間測定した。直線関係の
良い部分を読みとり、１分間当りの吸光度の変化（ΔＡ
２９３ｎｍＺ分）を算出した。結果を次の表にまとめた
。

検体　　１２３４５６ 尿酸（ｍｇ／ｄＱ）　　　０　　　２４　　　４８　　
　７２　　　９６　　１２０ΔＡ２，３ｒｌｌ、１７分
　０．０００　０．０４４　０．０８５　０．１２５　
０．］、６６　０．２０３表に示した通り、試薬比１：
４０で尿酸１２０ｍｇ／ｄｆｌまで直線性が得られた。

実施例３ ０．１ｍＭリン酸カリ緩衝液、ｐＨ７，０２５ｍＭ　４
−アミノアンチピリン ２２ｍＭ　フ　ェ　ノ　−ル ０．３ｍＭオキソン酸 １、Ｏｕ／Ｉｆｆパーオキシダーゼ を含む反応液１　、０ｍＱに、尿酸２００ｍｇ／ｄＱを
順次希釈して作成した希釈系列のサンプル又は尿酸１０
０ｍｇ／ｄＱの標準液５０μΩ入れ、３７℃約２分間保
温した後、あらかじめ３７℃に保温した１ｍＱ、ウリカ
ーゼ９ｕ／ｍＱ含まれるリン酸カリ緩衝液、ｐＨ７，０
を注入し、３７℃で波長５００ｎｍでの吸光度の増加を
２分間測定し、反応開始後、３０秒から１分３０秒間の
吸光度の、差（ΔＡ５ｏｏｒ＋＋＋＋／ｍ１ｎ）を求め
た。尿酸標準液のΔＡ３００工／分を１００ｍｇ／ｄΩ
として、それぞれのサンプルの尿酸の濃度を求め、次表
の結果を得た。

検体　０　１　２　３　４５　６　７　８　９　１０上
表かられかるように理論値に一致した測定値を得た。

実施例４ ０．１ｍＭリン酸カリ緩衝液 １０００ｕ／ｍ（ｌカタラーゼ ２Ｎエタノール ０．２ｍＭＮ　Ａ　Ｄ　Ｈ ３ｕ／ｍＱアルコール脱水素酵素 ０．３ｍＭオキソン酸 ３ｕ／ＩＩＩΩウリカーゼ を含む反応液３ｍＱに、従来法（ウリカーゼ−ＰＯＤ法
）で測定された患者尿検体Ａ　６ｍｇ／ｄＱ　　Ｂ　３
０ｍｇ／ｄＱ　Ｃ５５ｍｇ／ｄＲＤ　２８ｍｇ／ｄＱＥ
　１００ｍｇ／ｄｆｌを５０μΩ注入し、３７℃でＮＡ
Ｄ＋の３４０ｎｍでの１分間あたりの吸光度の変化量を
測定した。３４０ｎｍでの１分間当りの変化量から尿酸
量を検量線より求め。

次表の結果を得た。

検体　　ＡＢＣＤＥ 従来法（ｍｇ／ｄＵ）　　　６　　３０　　５５　　２
８　　１００本法（ｍｇ／ｄＱ）　　４　　３０　　５
２　　２３　　９９上表かられかるように、従来法と一
致した測定値を得た。

（発明の効果） 本発明は、ウリカーゼとウリカーゼ拮抗阻害剤とを併用
するという新規な構成を採用したことによって、既知の
方法に優る次のような卓越した利点を有する。すなわち
１本発明は尿酸を測定する際、レートアッセイ法である
ため、温室範囲が広いために検体の希釈を必要としない
だけでなく、盲検も必要なく、短時間に、正確、かつ容
易に、尿酸を測定できるのである。

【図面の簡単な説明】

図１は、オキソン酸による阻害反応のラインウェーバ−
・パークの逆数プロット、図２は、ビオルル酸による阻
害反応のラインウェーバ−・パークの逆数プロット、そ
して図３は、キサンチンによる阻害反応のラインウェー
バ−・パークの逆数プロットをそれぞれ図示したもので
ある。 代理人　弁理士　戸　１）親　男 ＋／ｒオキゾレ依、ｍＭ］ 第　　２　　図　　　　　　１５０「 ＋／（ビオル）冒ｉｆ、ｍＭコ 第　　３　　図 １５ｏ［ １／［キザ５千シ、ｍＭ］

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ウリカーゼ及びウリカーゼの拮抗阻害剤を含有せし
   めることを特徴とする尿酸の酵素的定量方法。 ２、尿酸の吸収に由来する紫外部での吸光度の減少を連
   続的に測定することを特徴とする特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ３、生成する過酸化水素を連続的に測定することを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、ウリカーゼ拮抗阻害剤がオキソン酸、ビオルル酸、
   キサンチン、２，６，８−トリクロロプリン、ヒポキサ
   ンチン、アラントキサイジン、２−ヒドロキシ−６，８
   −ジチオプリン、２，６−ジヒドロキシ−８−チオプリ
   ン、２，８−ジヒドロキシ−６−チオプリン、６−クロ
   ロ−２，８−ジヒドロキシプリン、４，６−ヒドロキシ
   ピリミジン、２−メルカプトピリミジン、アロキサン、
   ２，６−シクロロ−８−ヒドロキシプリン、２−ヒドロ
   キシ−６，８−ジアミノプリン、２，６−ジヒドロキシ
   −８−アミノプリン、２−クロロ−６−アミノ−８−ヒ
   ドロキシプリン、２，８−ジヒドロキシ−６−アミノプ
   リン、２，６−ジアミノ−８−ヒドロキシプリン、バル
   ビツル酸、バルビトン、ブトバルビトン、フェトバルビ
   トン、フェノバルビトン、キナルバルビトン、アミロバ
   ルビトン、チオフィリン、テオブロミン、カフェイン、
   スルファミン、スルファグアジン、スルファメリジン、
   スルファピリジン、スルファメラジン、スルファダイア
   ジンからなる群から選ばれるものである特許請求の範囲
   第２項又は第３項記載の方法。