JPH0141318B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

セルロプラスミンは血漿α₂グロブリンに属する
銅結合性糖蛋白体であり、増血因子の一つと考え
られている。血清セルロプラスミンは血清銅の95
％を占めるといわれウイルソン病に於て著しい減
少を示し肝硬変、再生不良性貧血で増加するため
これら疾患の診断や予後の指標に利用されてい
る。このセルロプラスミンの測定法は原理的に免
疫学的測定法とジアミンオキシターゼ活性を利用
した酵素的測定法に大別される。現在は免疫学的
な一元平板免疫拡散法が簡便さもあつて日常検査
に広く用いられているが、肉眼判定による測定精
度に難点があり、また反応時間の長いことさらに
自動化が不可能で検体処理能力にも限界がある。
一方ジアミンオキシターゼ活性を利用した測定方
法としては基質にＰ−フエニレンジアミンを用い
て生じた赤紫色々素を比色定量する方法（ロビン
法）やＯ−ジアニシジンを用いて還元型を酸化型
に移行させ、硫酸酸性下でその黄色を測定する方
法が発表されている。しかるにこれらの基質は労
働安全衛生上極めて不都合な物質であるばかりか
基質溶液が極めて不安定で溶解後数時間で著しく
着色したり又強酸性下での発色や妨害物質の影響
を受け易い黄色（410nm）での比色等数々の問題
点をもつものである。 本発明者らは安定で且つセルロプラスミンに対
して高活性な基質を求め鋭意研究した結果本発明
を完成するに至つた。 すなわち、本発明は、一般式［］ （R₁，R₂は低級アルキル基、炭素数１乃至５の
ヒドロキシアルキル基、炭素数１乃至３のアセト
アミドアルキル基、又は炭素数１乃至３のメタン
スルホンアミドアルキル基を示す。R₃，R₄は水
素、低級アルキル基、低級アルコキシ基、又はア
セチル基を示す。）で示されるＮ−置換アニリン
化合物と４−アミノアンチピリン（以下、4AA
と略称する。）又は３−メチル−２−ベンゾチア
ゾリノンヒドラゾン（以下、MBTHと略称す
る。）を基質として使用することを特徴とするセ
ルロプラスミン測定方法である。 本発明で使用される基質は従来過酸化水素等の
検出、定量に用いられてきたものであるが、使用
時の濃度、PHを調整するとセルロプラスミンはジ
アミンオキシターゼ活性ばかりでなく、4AAと
Ｎ−置換アニリンとを、又MBTHとＮ−置換ア
ニリンとを酸化縮合させる特性をも発揮し、本発
明の基質がセルロプラスミンの測定において優れ
た基質になることは全く驚くべきことであつた。 一般式で示されるＮ−置換アニリン化合物の若
干の例について化合物名を具体的に示すと次の通
りであるが、好しくはＮ−置換−３−アルキルア
ニリンが使用される。Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロキ
シメチル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ
−ヒドロキシエチル−３−メチルアニリン、Ｎ−
エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−３−エチルアニ
リン、Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−３−
メチルアニリン、Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロキシプ
ロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−
ヒドロキシプロピル−３−メチルアニリン、Ｎ−
メチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−３−エチルアニ
リン、Ｎ−プロピル−Ｎ−ヒドロキエチル−３−
メチルアニリン、Ｎ−メチル−Ｎ−ヒドロキシエ
チル−３−プロピルアニリン、Ｎ，Ｎ−ビス（β
−ヒドロキシエチル）−３−メチルアニリン、Ｎ，
Ｎ−ビス（β−ヒドロキシプロピル）−３−メチ
ルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−メチルアニ
リン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−エチルアニリン、
Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−プロピルアニリン、Ｎ，
Ｎ−ジエチル−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ―ジ
ユチル―３―エチルアニリン、Ｎ，Ｎ―ジプロピ
ル―３―メチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β
−メタンスルホンアミドエチル）−３−メチルア
ニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β−アセトアミドエ
チル．−３−メチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル
アニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ，Ｎ−
ジイロプロピルアニリン、Ｎ−メチル−Ｎ−ヒド
ロキシエチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロ
キシエチルアニリン等が使用される。 ４−AAとＮ−置換アニリンを基質とした場合
その活性至適PHは図−に示す通りPH５付近であ
りMBTHとＮ−置換アニリンを基質とした場合
その活性至適PHは図−に示す通りPH６付近であ
る。これはセルロプラスミンの至適活性PHと発色
至適PHとのかね合より生じる異差と思われる。表
−は４−AAに各Ｎ−置換アニリン表−は
MBTHにＮ−置換アニリン表−はフエニレン
ジアミン誘導体のセルロプラスミンに対する感度
を比較したものである。フエニレンジアミン誘導
体を基質溶液として使用した場合は本発明の基質
と比較して優れた感度を有しているが、基質溶液
が極めて不安定であるため着色し、試薬盲検値が
上がり測定精度が悪い点、又セルロプラスミンの
測定において還元性物質の存在が測定に悪影響を
及ぼすことが知られているが、本発明者が先に特
許出願（特願昭55−011204号）している技術で還
元性物質をヨウ素酸処理をするのが好ましいが、
フエニレンジアミン誘導体を用いる場合は残留ヨ
ウ素酸がフエニレンジアミン誘導体を着色させる
等の問題点がある。本発明で基質として使用され
る４−AAとＮ−置換アニリン、MBTHとＮ−
置換アニリンは別々の試液としても又混合溶液と
して添加してもよい。又、その使用量は測定液中
で0.1〜1.5％に調整される。さらに好ましくは置
換アニリンが測定液中で0.3〜1.0％に調整され
る。本発明に使用しうる緩衝剤はPH4.5〜6.0付近
に緩衝能力を有するものでセルロプラスミンの活
性を大幅に阻害しないものであれば良く酢酸、ク
エン酸、酒石酸、コハク酸、フタール酸、グリシ
ン等で緩衝剤が使用出来る。又本酵素測定の至適
PHである4.5〜6.0は蛋白類の等電点に近く濁りが
生じる場合がある。これらは界面活性剤例えばポ
リオキシエチレンラウリルエーテル、ソルビタン
モノステアレートなどの非イオン系ラウリル硫酸
ナトリウムなどの陰イオン系臭化セチルトリナチ
ルアンモニウム等の陽イオン等界面活性剤を添加
すれば防ぐことが出来る。又試料をあらがじめヨ
ウ素酸などのハロゲン系酸化剤で処理した後これ
ら基質類を添加すれば血清中に存在する還元性物
質例えばアスコルビン酸システイン、グルタチオ
ンに起因する負誤差を回避することができる。又
本発明の基質は酵素活性と同時に発色反応が進行
する為反応速度測定法としての使用出来るが従来
この測定法の反応停止剤に利用されてきたアジ化
ナトリウムを添加すればエンドポイント法として
も利用出来る特に４−AAとＮ−置換アニリンの
組合せ試薬は呈色安定性が良く少なくとも３時間
は吸光度変化がなく極大吸光波長も妨害物質の影
響の少ない545mmにあり呈色安定性の悪いＰ−
フエニレンジアミン、極大吸収波長が410nmであ
るＯ−ジアニシジン基質法に比べ定量精度は大幅
に向上した優れたセルロプラスミン測定方法であ
る。次に実施例を示す。 実施例 １ 試液 Ａ 酢酸6.0g、ポリオキシエチレンラウリルエーテ
ル1g、ヨウ素酸5g、蒸留水900mlに溶解し水酸化
ナトリウムでPH5.0とし全量を水で１とする。 試液 Ｂ 酢酸6.0g，Ｎ，Ｎジエチルｍ−トルイジン5g，
４−アミノアンチピリン1g、蒸留水900mlに溶解
し水酸化ナトリウムでPH5.0とし全量を水で１
とする。 血清100μlに試薬A1.0mlを加え37℃に５分放置
後試薬Ｂを2.0mlを加え37℃に１分間放置後
545nmの吸光増加を測定しあらかじめ作成した検
量数よりセルロプラスミン活性値を求める。 実施例 ２ 試液 Ａ 酢酸6.0g、ポリオキシエチレンイソオクチルエ
ーテル1g、ヨウ素酸カリウム5g蒸留水900mlに溶
解後水酸化ナトリウムでPH5.0とし全量を水で１
とする。 試液 Ｂ 酢酸6.0g，MBTH350mg，Ｎ−エチルＮヒド
ロキシエチルｍ−トルイジン5g、蒸留水900mlに
溶解し水酸化ナトリウムでPH5.0とし全量を水で
１とする。血清50μlに試液A1.0mlを加え37℃に
５分放置後試薬B2.0mlを加え590nmの吸光度増加
を測定しあらかじめ作成した検量線よりセルロプ
ラスミン濃度を算出する。

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】 【図面の簡単な説明】

図−１は実施例１に従いPHのみ水酸化ナトリウ
ムの添加量を変化させて処定のPHに調製し人の血
清より抽出精製したセルロプラスミンの活性度を
545nmに於る20分間の吸光度変化を測定した図で
ある。図−２は実施例２に従いPHのみ水酸化ナト
リウムの添加量を変化させて処定のPHに調製し人
の血清より抽出精製したセルロプラスミンの活性
度を545nmに於る20分間吸光度変化を測定した図
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式［］ （R₁，R₂は低級アルキル基、炭素数１乃至５
   のヒドロキシアルキル基、炭素数１乃至３のアセ
   トアミドアルキル基、又は炭素数１乃至３のメタ
   ンスルホンアミドアルキル基を示す。R₃，R₄は
   水素、低級アルキル基、低級アルコキシ基、又は
   アセチル基を示す。）で示されるＮ−置換アニリ
   ン化合物と４−アミノアンチピリン又は３−メチ
   ル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンを基質と
   して使用することを特徴とするセルロプラスミン
   測定方法。