JP2823901B2 - セルロプラスミン活性の測定法 - Google Patents
セルロプラスミン活性の測定法Info
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- JP2823901B2 JP2823901B2 JP27836489A JP27836489A JP2823901B2 JP 2823901 B2 JP2823901 B2 JP 2823901B2 JP 27836489 A JP27836489 A JP 27836489A JP 27836489 A JP27836489 A JP 27836489A JP 2823901 B2 JP2823901 B2 JP 2823901B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はセルロプラスミン活性の測定法に関する。
（従来の技術） セルロプラスミンは、α２−グロブリン分画に存在す
る血漿蛋白質の一種であり、銅を含有する糖蛋白質であ
って、健常人の血清中には、20−50mg/dlの濃度で存在
し、２価の鉄を酸化して３価のものとする作用があり、
鉄代謝において重要な意義を有している。血清中のセル
ロプラスミン量は肝疾患、ウィルソン病、癌、感染症、
妊娠等により変動するため、その活性測定はこれらの診
断に際して有用な指標をもたらす。
る血漿蛋白質の一種であり、銅を含有する糖蛋白質であ
って、健常人の血清中には、20−50mg/dlの濃度で存在
し、２価の鉄を酸化して３価のものとする作用があり、
鉄代謝において重要な意義を有している。血清中のセル
ロプラスミン量は肝疾患、ウィルソン病、癌、感染症、
妊娠等により変動するため、その活性測定はこれらの診
断に際して有用な指標をもたらす。
従来、セルロプラスミン量の測定法としては、抗原抗
体反応を利用した免疫学的測定法である一元免疫拡散法
（以下、「SRID法」と称する）、アミンオキシダーゼ活
性を利用した比色法（以下、「アミンオキシダーゼ法」
と称する）が知られていた。これらの従来法の内でSRID
法は反応所要時間が長く、測定値を得るまでに通常24時
間以上要し、従って自動分析に適用し難い等の欠点を有
し、また測定者により誤差の程度が大きく変化するので
精度的にも問題があった。また、アミンオキシダーゼ法
は測定感度が低いため必要とされる検体量が多くなり、
また検体ブランクを測定する必要があり、しかも試薬が
不安定であり、反応中に試薬盲検が着色してくると云う
問題点を有していた。
体反応を利用した免疫学的測定法である一元免疫拡散法
（以下、「SRID法」と称する）、アミンオキシダーゼ活
性を利用した比色法（以下、「アミンオキシダーゼ法」
と称する）が知られていた。これらの従来法の内でSRID
法は反応所要時間が長く、測定値を得るまでに通常24時
間以上要し、従って自動分析に適用し難い等の欠点を有
し、また測定者により誤差の程度が大きく変化するので
精度的にも問題があった。また、アミンオキシダーゼ法
は測定感度が低いため必要とされる検体量が多くなり、
また検体ブランクを測定する必要があり、しかも試薬が
不安定であり、反応中に試薬盲検が着色してくると云う
問題点を有していた。
そこで、これらの問題点を解決するために最近ではセ
ルロプラスミン活性の新しい測定方法として、セルロプ
ラスミンの有しているフェロオキシダーゼ活性を利用す
る比色法、すなわち発色剤の存在下にフェロセン若しく
はその誘導体、メタロセン又は鉄或は銅を含有する金属
キレートにセルロプラスミンを作用させて生成する色素
の生成速度から測定する方法（以下、「フェロオキシダ
ーゼ法」と称する、例えば特開昭60−162957公報参照）
や、４−アミノアンチピリン等の４−アミノピラゾロン
誘導体と、アニリンやソディウムＮ−エチル−Ｎ−（２
−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｎ−トルイジン
（以下、「TOOS」と称する）等のアニリン誘導体とを発
色剤として使用し、該発色剤にセルロプラスミンをpH4.
0−5.8の領域において作用させて発生する色素の生成速
度を測定する方法（以下、「４−AA＋TOOS法」と称す
る、例えば特開昭61−129571公報参照）が開発されるに
至っている。
ルロプラスミン活性の新しい測定方法として、セルロプ
ラスミンの有しているフェロオキシダーゼ活性を利用す
る比色法、すなわち発色剤の存在下にフェロセン若しく
はその誘導体、メタロセン又は鉄或は銅を含有する金属
キレートにセルロプラスミンを作用させて生成する色素
の生成速度から測定する方法（以下、「フェロオキシダ
ーゼ法」と称する、例えば特開昭60−162957公報参照）
や、４−アミノアンチピリン等の４−アミノピラゾロン
誘導体と、アニリンやソディウムＮ−エチル−Ｎ−（２
−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｎ−トルイジン
（以下、「TOOS」と称する）等のアニリン誘導体とを発
色剤として使用し、該発色剤にセルロプラスミンをpH4.
0−5.8の領域において作用させて発生する色素の生成速
度を測定する方法（以下、「４−AA＋TOOS法」と称す
る、例えば特開昭61−129571公報参照）が開発されるに
至っている。
（発明が解決しようとする課題） しかしながら、上記の特開昭60−162957公報に開示さ
れているフェロオキシダーゼ法は、検体の吸光度が低い
ために測定感度が低くなる点に問題を有していた。一
方、上記の特開昭61−129571公報に開示されている４−
AA＋TOOS法は、試薬盲検の着色を防止するため反応試液
中にエチレンジアミン四酢酸（以下、「EDTA」と称す
る）を添加しているが、該反応試液中にEDTAが存在する
とセルロプラスミン活性が阻害されると云う点に課題を
有していた。
れているフェロオキシダーゼ法は、検体の吸光度が低い
ために測定感度が低くなる点に問題を有していた。一
方、上記の特開昭61−129571公報に開示されている４−
AA＋TOOS法は、試薬盲検の着色を防止するため反応試液
中にエチレンジアミン四酢酸（以下、「EDTA」と称す
る）を添加しているが、該反応試液中にEDTAが存在する
とセルロプラスミン活性が阻害されると云う点に課題を
有していた。
本発明は、従来技術における上記の課題に鑑み、これ
を解消しようとするものであり、測定感度を高くなすと
ともに、反応試液中にEDTAが共存してもセルロプラスミ
ンの活性測定に影響を与えない新規なセルロプラスミン
活性の測定法を提供することを目的とするものである。
を解消しようとするものであり、測定感度を高くなすと
ともに、反応試液中にEDTAが共存してもセルロプラスミ
ンの活性測定に影響を与えない新規なセルロプラスミン
活性の測定法を提供することを目的とするものである。
（課題を解決するための手段及び作用） そこで、本発明者等はセルロプラスミン活性を測定す
る方法に関して種々検討を行った結果、4,4′−ビス
（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンをセルロプラスミ
ンのアミンオキシダーゼ作用の基質として使用すれば、
前記課題が解決されることを見出し、本発明を完成する
に至った。
る方法に関して種々検討を行った結果、4,4′−ビス
（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンをセルロプラスミ
ンのアミンオキシダーゼ作用の基質として使用すれば、
前記課題が解決されることを見出し、本発明を完成する
に至った。
即ち、本発明は、4,4′−ビス（ジメチルアミノ）ジ
フェニルアミンを緩衝液に溶解させて反応試液とし、こ
れに検体血清を添加して検体血清中のセルロプラスミン
を作用させることにより生成する色素の生成速度を測定
することを特徴とする、セルロプラスミン活性の測定法
を提供するものである。
フェニルアミンを緩衝液に溶解させて反応試液とし、こ
れに検体血清を添加して検体血清中のセルロプラスミン
を作用させることにより生成する色素の生成速度を測定
することを特徴とする、セルロプラスミン活性の測定法
を提供するものである。
本発明方法において使用する4,4′−ビス（ジメチル
アミノ）ジフェニルアミンは、下記の構造式で示される
化合物であり、その使用濃度は発色感度の点から反応試
液濃度で10μＭ−2mMの濃度が適当である。
アミノ）ジフェニルアミンは、下記の構造式で示される
化合物であり、その使用濃度は発色感度の点から反応試
液濃度で10μＭ−2mMの濃度が適当である。
尚、適切な反応条件を求めて検討を行った結果、反応
試液の電気伝導度を に調整することにより発色感度の向上することが見い出
された。セルロプラスミンのアミンオキシダーゼ作用の
基質として4,4′−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニル
アミンを用いる場合の至適pHは4.8であるので、反応試
液調製用の緩衝液としては、pH4.0−6.0程度の範囲内で
緩衝作用を有し且つセルロプラスミンのアミンオキシダ
ーゼ活性に対して阻害作用を示さないものであれば、そ
の種類は問わず、例えば酢酸緩衝液、フタル酸緩衝液、
グッド緩衝液等を例示することができ、グッド緩衝液と
してはADA、MES、Bis−Tris等を利用することができ
る。これらの緩衝液は、水酸化ナトリウム及び酢酸によ
りpHを調整した上で使用に供せられるが、セルロプラス
ミンのアミンオキシダーゼ作用の至適pHである上記の4.
8に調整する場合に、当該溶液の電気伝導度は、緩衝液
の種類に依存して著しく異なる。電気伝導度は緩衝液の
濃度に比例するが、緩衝液の濃度を低下させると緩衝作
用も低下するので、緩衝液の濃度により電気伝導度を調
整するのは好ましくない。そこで種々の緩衝液を用い
て、セルロプラスミンのアミンオキシダーゼ活性につ
き、4,4′−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン
を基質として測定した処、反応試液の電気伝導度を上記
の値範囲、即ち に調整することにより良好な発色感度の得られることが
判明したのである。
試液の電気伝導度を に調整することにより発色感度の向上することが見い出
された。セルロプラスミンのアミンオキシダーゼ作用の
基質として4,4′−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニル
アミンを用いる場合の至適pHは4.8であるので、反応試
液調製用の緩衝液としては、pH4.0−6.0程度の範囲内で
緩衝作用を有し且つセルロプラスミンのアミンオキシダ
ーゼ活性に対して阻害作用を示さないものであれば、そ
の種類は問わず、例えば酢酸緩衝液、フタル酸緩衝液、
グッド緩衝液等を例示することができ、グッド緩衝液と
してはADA、MES、Bis−Tris等を利用することができ
る。これらの緩衝液は、水酸化ナトリウム及び酢酸によ
りpHを調整した上で使用に供せられるが、セルロプラス
ミンのアミンオキシダーゼ作用の至適pHである上記の4.
8に調整する場合に、当該溶液の電気伝導度は、緩衝液
の種類に依存して著しく異なる。電気伝導度は緩衝液の
濃度に比例するが、緩衝液の濃度を低下させると緩衝作
用も低下するので、緩衝液の濃度により電気伝導度を調
整するのは好ましくない。そこで種々の緩衝液を用い
て、セルロプラスミンのアミンオキシダーゼ活性につ
き、4,4′−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン
を基質として測定した処、反応試液の電気伝導度を上記
の値範囲、即ち に調整することにより良好な発色感度の得られることが
判明したのである。
更に、検討を進めた結果、反応試液中に臭素イオンを
存在させると、発色感度が10％程度上昇することも見い
出された。臭素イオンは反応試液に臭化ナトリウム、臭
化カリウム等として添加することによりもたらされ、そ
の添加濃度としては0.1−2.5mM程度が好ましい。
存在させると、発色感度が10％程度上昇することも見い
出された。臭素イオンは反応試液に臭化ナトリウム、臭
化カリウム等として添加することによりもたらされ、そ
の添加濃度としては0.1−2.5mM程度が好ましい。
検体量は、反応試液量として150−750倍の稀釈に耐え
る量であれば充分であり、例えば反応試液量が3mlの場
合に、10−20μｌで充分である。
る量であれば充分であり、例えば反応試液量が3mlの場
合に、10−20μｌで充分である。
セルロプラスミンの差用により生成される色素は下記
反応式により生成されるものと推定される。この色素の
吸収曲線は第１図に示されている。
反応式により生成されるものと推定される。この色素の
吸収曲線は第１図に示されている。
上記の反応により生成される色素の吸光度測定は、反
応試液に検体を加えて反応を開始させた後の数分間にお
ける吸光度の変化を吸収極大値附近である600−800nmで
連続的に測定するか、又は反応開始後、一定時間経た後
にアジ化ナトリウム溶液等の反応停止液を加え、次いで
測定しても差し支えない。また、乳糜血清による混濁を
解消するために、反応試液又は反応停止液中に適当な界
面活性剤、例えばポリオキシエチレンオクチルフェニル
エーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテ
ル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ラウリル硫
酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、オクチルグルコシ
ド等を添加することもできる。
応試液に検体を加えて反応を開始させた後の数分間にお
ける吸光度の変化を吸収極大値附近である600−800nmで
連続的に測定するか、又は反応開始後、一定時間経た後
にアジ化ナトリウム溶液等の反応停止液を加え、次いで
測定しても差し支えない。また、乳糜血清による混濁を
解消するために、反応試液又は反応停止液中に適当な界
面活性剤、例えばポリオキシエチレンオクチルフェニル
エーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテ
ル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ラウリル硫
酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、オクチルグルコシ
ド等を添加することもできる。
更に、本発明方法はキレート剤による阻害を受けない
ので、試薬盲検の着色を防止するため、反応試液に適当
なキレート剤例えばEDTAを0.01−0.2mMの濃度で添加す
ることができる。
ので、試薬盲検の着色を防止するため、反応試液に適当
なキレート剤例えばEDTAを0.01−0.2mMの濃度で添加す
ることができる。
検体中のセルロプラスミンの活性値又は濃度は、セル
ロプラスミン活性または濃度が既知の標準品を、検体と
同様に操作したときの吸光度より計算して求めるか、ま
たは生成する色素のモル吸光係数から求めることができ
る。
ロプラスミン活性または濃度が既知の標準品を、検体と
同様に操作したときの吸光度より計算して求めるか、ま
たは生成する色素のモル吸光係数から求めることができ
る。
（実施例等） 次に、実施例、比較例及び試験例を挙げ、本発明を更
に詳細に且つ具体的に説明する。
に詳細に且つ具体的に説明する。
実施例１ ａ）反応試液： 0.15M酢酸緩衝液（pH4.8） 0.01mM 4,4′−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルア
ミン溶液 ｂ）反応停止液： ４％アジ化ナトリウム溶液 ｃ）操作 検体20μｌに上記の反応試液3mlを添加し、37℃にお
いて正確に10分間反応させた後、上記の反応停止液1ml
を添加して反応を停止させ、波長725nmで吸光度を測定
した。試薬盲検は検体の代わりに精製水20μｌを用い
て、検体と同様の操作を行った。セルロプラスミン活性
値は次式により計算することができる。
ミン溶液 ｂ）反応停止液： ４％アジ化ナトリウム溶液 ｃ）操作 検体20μｌに上記の反応試液3mlを添加し、37℃にお
いて正確に10分間反応させた後、上記の反応停止液1ml
を添加して反応を停止させ、波長725nmで吸光度を測定
した。試薬盲検は検体の代わりに精製水20μｌを用い
て、検体と同様の操作を行った。セルロプラスミン活性
値は次式により計算することができる。
活性値（U/l）＝（吸光度/10）ｘ（1/69）ｘ （4.02/0.02）x1000 式中において、 10 ：反応時間（分） 69 ：吸光係数 4.02:全液量（ml） 0.02:検体量（ml） 上記の方法により、ヒト血清を45検体測定し、更にこ
の45検体について従来のSRID法（ヘキスト社製、NORパ
ルチゲンセルロプラスミン）で測定し、両者の相関を調
べた処、第２図に示される通りの結果が得られた。両者
は、相関係数γ＝0.9829、回帰式ｙ＝4.04x−7.9であり
良好な相関を有することが判明した。このことは、本発
明方法を用いれば、微量の検体で、短時間の内にセルロ
プラスミン活性を測定し得ることを示している。
の45検体について従来のSRID法（ヘキスト社製、NORパ
ルチゲンセルロプラスミン）で測定し、両者の相関を調
べた処、第２図に示される通りの結果が得られた。両者
は、相関係数γ＝0.9829、回帰式ｙ＝4.04x−7.9であり
良好な相関を有することが判明した。このことは、本発
明方法を用いれば、微量の検体で、短時間の内にセルロ
プラスミン活性を測定し得ることを示している。
実施例２ 上記の実施例１と同様に調製した反応試液に、EDTA2
ナトリウム塩をそれぞれ0.0,0.05,0.1,0.2,0.5,1.0,2.0
mMとなるように添加し、実施例１と同様にヒト血清を検
体としてセルロプラスミンの活性値を調べた処、第３図
に示される通りの結果が得られた。この図から、EDTA濃
度が0.2mMであっても、EDTAが無添加の場合に対して93
％の相対活性を示すことが判る。このことは、本発明方
法においては、EDTAがセルロプラスミンの活性値に及ぼ
す影響が殆どなく、従って、検体中に場合により存在し
試薬盲検に着色をもたらす金属イオンの影響を排除する
ためにEDTAを反応試液に添加することが可能であること
を示している。
ナトリウム塩をそれぞれ0.0,0.05,0.1,0.2,0.5,1.0,2.0
mMとなるように添加し、実施例１と同様にヒト血清を検
体としてセルロプラスミンの活性値を調べた処、第３図
に示される通りの結果が得られた。この図から、EDTA濃
度が0.2mMであっても、EDTAが無添加の場合に対して93
％の相対活性を示すことが判る。このことは、本発明方
法においては、EDTAがセルロプラスミンの活性値に及ぼ
す影響が殆どなく、従って、検体中に場合により存在し
試薬盲検に着色をもたらす金属イオンの影響を排除する
ためにEDTAを反応試液に添加することが可能であること
を示している。
比較例１ 本発明方法と従来のフェロオキシダーゼ法（特開昭60
−1612957公報参照）とを比較するために、同一の検体
を使用して検体中のセルロプラスミン活性を下記の条件
で測定した。
−1612957公報参照）とを比較するために、同一の検体
を使用して検体中のセルロプラスミン活性を下記の条件
で測定した。
（１）本発明方法 検体血清20μｌに上記の実施例１に記載の反応試液を
3ml添加し、37℃で正確に10分間反応させた後に、実施
例１に記載の反応停止液を1ml添加して反応を停止さ
せ、波長725nmで吸光度を測定した。
3ml添加し、37℃で正確に10分間反応させた後に、実施
例１に記載の反応停止液を1ml添加して反応を停止さ
せ、波長725nmで吸光度を測定した。
（２）フェロオキシダーゼ法 ａ） 前処理液 0.1M 酢酸緩衝液（pH5.0） 0.23M ヨウ素酸カリ溶液 25mM 硫酸アンモニウム溶液 0.1％ 界面活性剤 ｂ） 発色剤 BCMA、即ちビス［３−ビス（４−クロロフェニル）メチ
ル−４−ジメチル−アミノフェニル］アミン 5.9μmol/
バイアル ｃ） 発色剤溶解液 1mM グッド緩衝液（pH7.0） 0.16mM フェロセン １％ 界面活性剤 ｄ） 反応停止液 60mM トリス緩衝液（pH9.4） 62mM アジ化ナトリウム 2.2mM キレート剤 ｅ） 操作 検体血清30μｌに上記の前処理液を1.5ml添加し、次
いで上記の発色剤を上記の発色剤溶解液で溶解させた試
液1.5mlを添加し、37℃で正確に10分間反応させた後
に、上記の反応停止液を1ml添加して反応を停止させ、
波長750nmで吸光度を測定した。
ル−４−ジメチル−アミノフェニル］アミン 5.9μmol/
バイアル ｃ） 発色剤溶解液 1mM グッド緩衝液（pH7.0） 0.16mM フェロセン １％ 界面活性剤 ｄ） 反応停止液 60mM トリス緩衝液（pH9.4） 62mM アジ化ナトリウム 2.2mM キレート剤 ｅ） 操作 検体血清30μｌに上記の前処理液を1.5ml添加し、次
いで上記の発色剤を上記の発色剤溶解液で溶解させた試
液1.5mlを添加し、37℃で正確に10分間反応させた後
に、上記の反応停止液を1ml添加して反応を停止させ、
波長750nmで吸光度を測定した。
（３）結果 本発明方法とフェロオキシダーゼ法とを用いて且つ上
記のようにして行われた吸光度測定結果は下記の表２に
示される通りであった。
記のようにして行われた吸光度測定結果は下記の表２に
示される通りであった。
上記の表２から明らかなように、使用検体量が少ない
にも拘らず、本発明方法により測定した場合の吸光度値
は、従来法であるフェロオキシダーゼ法による値の3.3
−3.6倍であり、従って本発明方法の方が感度において
著しく優れていることが判明した。
にも拘らず、本発明方法により測定した場合の吸光度値
は、従来法であるフェロオキシダーゼ法による値の3.3
−3.6倍であり、従って本発明方法の方が感度において
著しく優れていることが判明した。
比較例２ 本発明による測定方法と、特開昭61−129571公報に開
示されている従来法である４−AA＋TOOS法とにより検体
血清中のセルロプラスミン活性を測定し、EDTAが活性値
に及ぼす影響について調べた。
示されている従来法である４−AA＋TOOS法とにより検体
血清中のセルロプラスミン活性を測定し、EDTAが活性値
に及ぼす影響について調べた。
（１）本発明方法 実施例２に準じて行った。
（２）４−AA＋TOOS法 ａ） 反応試薬１ 0.3M 酢酸緩衝液（pH4.8） 4mM TOOS即ちソディウム・Ｎ−エチルＮ−（２−ヒド
ロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン ｂ） 反応試薬２ 0.3M 酢酸緩衝液（pH4.8） 4mM ４−AA即ち４−アミノアンチピリン ｃ） 反応停止液 0.5M クエン酸緩衝液（pH6.5） 30mM アジ化ナトリウム ｄ） 操作 検体血清20μｌに上記の反応試薬１を1ml添加し、37
℃で５分間予備加温し、次いで反応試薬２を1ml添加
し、更にEDTA2ナトリウム塩をそれぞれそれぞれ0.0,0.0
5,0.1,0.2,0.5,1.0,2.0mMとなるように添加し、37℃で
正確に15分間反応させた後に、上記の反応停止1mlを添
加して反応を停止させ、波長555nmで吸光度を測定し
た。
ロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン ｂ） 反応試薬２ 0.3M 酢酸緩衝液（pH4.8） 4mM ４−AA即ち４−アミノアンチピリン ｃ） 反応停止液 0.5M クエン酸緩衝液（pH6.5） 30mM アジ化ナトリウム ｄ） 操作 検体血清20μｌに上記の反応試薬１を1ml添加し、37
℃で５分間予備加温し、次いで反応試薬２を1ml添加
し、更にEDTA2ナトリウム塩をそれぞれそれぞれ0.0,0.0
5,0.1,0.2,0.5,1.0,2.0mMとなるように添加し、37℃で
正確に15分間反応させた後に、上記の反応停止1mlを添
加して反応を停止させ、波長555nmで吸光度を測定し
た。
（３）効果 各量のEDTAの存在下で、本発明方法と、上記の特開昭
61−129571公報に開示されている４−AA＋TOOS法とによ
り測定したセルロプラスミンの活性値を調べたところ第
４図に示される通りの結果が得られた。
61−129571公報に開示されている４−AA＋TOOS法とによ
り測定したセルロプラスミンの活性値を調べたところ第
４図に示される通りの結果が得られた。
この第４図から明らかなように、従来法においてはED
TAが微量でも存在すると測定されるセルロプラスミン活
性値が著しく低下してしまうが、本発明方法においては
セルロプラスミン活性値に殆んど変動が生じず、EDTA濃
度が2mMであってもセルロプラスミン活性値の低下は２
割弱であった。
TAが微量でも存在すると測定されるセルロプラスミン活
性値が著しく低下してしまうが、本発明方法においては
セルロプラスミン活性値に殆んど変動が生じず、EDTA濃
度が2mMであってもセルロプラスミン活性値の低下は２
割弱であった。
実施例３ １）反応試液 下記の各種緩衝液（pHは全て4.8）を用い且つ0.1mMと
なるように4,4′−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニル
アミンを添加し溶解させて、それぞれ反応試液（Ａ−
Ｉ）を調製した。
なるように4,4′−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニル
アミンを添加し溶解させて、それぞれ反応試液（Ａ−
Ｉ）を調製した。
２）反応停止液 ４％アジ化ナトリウム溶液 ３）操作 検体血清20μｌに上記の反応理液を3ml添加し、37℃
において正確に10分間反応させた後に、反応停止液を1m
l添加して反応を停止させ、波長725nmで吸光度を測定し
た。試薬盲検については検体に代えて精製水20μｌを用
いて且つ上記と同様の操作を行った。
において正確に10分間反応させた後に、反応停止液を1m
l添加して反応を停止させ、波長725nmで吸光度を測定し
た。試薬盲検については検体に代えて精製水20μｌを用
いて且つ上記と同様の操作を行った。
４）効果 測定の結果得られた吸光度は下記の表３に示される通
りであり、この表から明らかのように、反応試液の電気
伝導度が に調整されている場合に良好な発色感度をもたらし得る
ことが判明した。
りであり、この表から明らかのように、反応試液の電気
伝導度が に調整されている場合に良好な発色感度をもたらし得る
ことが判明した。
実施例４ １） 反応試液 30mM Bis−Tris緩衝液（pH4.8） 0.03mM EDTA・2Na 0.1mM 4,4′−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルア
ミン 上記の反応試液に臭化カリウムを０−10mMの濃度とな
るように添加し、溶解させた。
ミン 上記の反応試液に臭化カリウムを０−10mMの濃度とな
るように添加し、溶解させた。
２） 反応停止液 ４％アジ化ナトリウム溶液 ３） 操作 上記の臭化カリウム添加反応試液及び反応停止液を用
いて且つ実施例３と同様にして検体（ヒト血清）を処理
して吸光度を波長725nmで測定した。
いて且つ実施例３と同様にして検体（ヒト血清）を処理
して吸光度を波長725nmで測定した。
４） 結果 結果は下記の表４に示される通りであり、臭素イオン
を若干量共存させることにより発色感度を向上せしめ得
ることが判明した。
を若干量共存させることにより発色感度を向上せしめ得
ることが判明した。
実施例５ １） 第１試液 30mM Bis−Tris緩衝液（pH5.5） 0.03mM EDTA・2Na 0.5mM 臭化カリウム ２） 第２試液 45mM 酢酸溶液 0.3M 4,4′−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミ
ン ３） 操作及び結果 上記の両試液を用い且つ株式会社 日立製作所製の自
動分析装置（日立7050型）に下記のパラメータを設定す
ることにより検体としてのヒト血清におけるセルロプラ
スミン活性を測定した。
ン ３） 操作及び結果 上記の両試液を用い且つ株式会社 日立製作所製の自
動分析装置（日立7050型）に下記のパラメータを設定す
ることにより検体としてのヒト血清におけるセルロプラ
スミン活性を測定した。
Assay Code ：［Rate−Ａ］：［25］−［32］ Sample Volume:［４］ R1 Volume ：［400］ R2 Volume ：［200］ Wave Length ：［600］［700］ 即ち、先ずセルロプラスミンが高値（450U/l）の血清
を生理食塩水で10段階に稀釈し、この標準検体について
測定した処、第５図に示される通りの良好な直線的関係
が得られた。従って、第５図のグラフは検量線として用
いることができる。
を生理食塩水で10段階に稀釈し、この標準検体について
測定した処、第５図に示される通りの良好な直線的関係
が得られた。従って、第５図のグラフは検量線として用
いることができる。
次に、上記と同様にして、但しセルロプラスミン活性
が未知のヒト血清45検体についてセルロプラスミン活性
を測定し、一方これらの検体について市販のネフェロメ
ータ試薬（ヘキスト社製）を用いて測定し、両測定方法
による測定結果の相関性を調べた処、第６図に示される
ように、相関係数ｒ＝0.9620、回帰式ｙ＝5.78x−33.2
の良好な相関が得られた。
が未知のヒト血清45検体についてセルロプラスミン活性
を測定し、一方これらの検体について市販のネフェロメ
ータ試薬（ヘキスト社製）を用いて測定し、両測定方法
による測定結果の相関性を調べた処、第６図に示される
ように、相関係数ｒ＝0.9620、回帰式ｙ＝5.78x−33.2
の良好な相関が得られた。
尚、同時再現性を調べた結果は下記位の表５に示され
る通りであり、極めて良好であった。
る通りであり、極めて良好であった。
試験例（試液の安定性） セルロプラスミン活性において異なる４種類の標準血
清を検体とし、実施例５において言及した試液であって
冷暗所に保存しておいた第１及び第２試液を定期的に採
取して用いることにより上記標準血清のセルロプラスミ
ン活性を経時的に測定した結果は第７図に示される通り
であり、両試液は10日程度であれば充分に安定性を保持
しており、保存性に優れていることが判明した。
清を検体とし、実施例５において言及した試液であって
冷暗所に保存しておいた第１及び第２試液を定期的に採
取して用いることにより上記標準血清のセルロプラスミ
ン活性を経時的に測定した結果は第７図に示される通り
であり、両試液は10日程度であれば充分に安定性を保持
しており、保存性に優れていることが判明した。
（発明の効果） 本発明方法によれば、短時間でかつ少量の検体により
セルロプラスミン活性を測定できるものであり、従来法
よりも測定感度が極めて高く、又試験盲検に着色をもた
らす金属イオンの影響を排除するために反応試薬中にED
TAを共存させる場合にもセルロプラスミン活性値の変動
が殆どなく、しかも操作が容易であり、安定性に優れて
いる。
セルロプラスミン活性を測定できるものであり、従来法
よりも測定感度が極めて高く、又試験盲検に着色をもた
らす金属イオンの影響を排除するために反応試薬中にED
TAを共存させる場合にもセルロプラスミン活性値の変動
が殆どなく、しかも操作が容易であり、安定性に優れて
いる。
尚、反応試液の電気伝導度を調整し、又臭素イオンを
共存させれば感度は更に向上し、従って本発明方法は自
動分析機への適用が可能となり、臨床検査上極めて有利
である。
共存させれば感度は更に向上し、従って本発明方法は自
動分析機への適用が可能となり、臨床検査上極めて有利
である。
第１図は、本発明方法における、測定波長と吸光度との
関係を示す図面、第２図は、本発明方法と従来法である
SRID法との相関を示す図面、第３図は、本発明方法に対
するEDTA添加の影響を示す図面、第４図は、本発明方法
と従来法である４−AA＋TOOS法とにおいて、EDTA添加の
影響を示す図面、第５図は本発明方法を実施する場合の
検量線を示す図面、第６図は本発明方法と従来のネフェ
ロメータ法との相関を示す図面、第７図は本発明方法に
おいて使用される試薬の安定性を経時的に測定した結果
を示す図面である。
関係を示す図面、第２図は、本発明方法と従来法である
SRID法との相関を示す図面、第３図は、本発明方法に対
するEDTA添加の影響を示す図面、第４図は、本発明方法
と従来法である４−AA＋TOOS法とにおいて、EDTA添加の
影響を示す図面、第５図は本発明方法を実施する場合の
検量線を示す図面、第６図は本発明方法と従来のネフェ
ロメータ法との相関を示す図面、第７図は本発明方法に
おいて使用される試薬の安定性を経時的に測定した結果
を示す図面である。
Claims (3)
- 【請求項１】4,4′−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニ
ルアミンを緩衝液に溶解させて反応試液とし、これに検
体血清を添加して検体血清中のセルロプラスミンを作用
させることにより生成する色素の生成速度を測定するこ
とを特徴とする、セルロプラスミン活性の測定法。 - 【請求項２】反応試液の電気伝導度を に調整することを特徴とする、請求項（１）に記載のセ
ルロプラスミン活性の測定法。 - 【請求項３】反応試液中に臭素イオンを存在させること
を特徴とする、請求項（１）又は（２）に記載のセルロ
プラスミン活性の測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP27836489A JP2823901B2 (ja) | 1988-12-23 | 1989-10-27 | セルロプラスミン活性の測定法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63-323414 | 1988-12-23 | ||
| JP32341488 | 1988-12-23 | ||
| JP27836489A JP2823901B2 (ja) | 1988-12-23 | 1989-10-27 | セルロプラスミン活性の測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02257896A JPH02257896A (ja) | 1990-10-18 |
| JP2823901B2 true JP2823901B2 (ja) | 1998-11-11 |
Family
ID=26552837
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27836489A Expired - Lifetime JP2823901B2 (ja) | 1988-12-23 | 1989-10-27 | セルロプラスミン活性の測定法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2823901B2 (ja) |
-
1989
- 1989-10-27 JP JP27836489A patent/JP2823901B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02257896A (ja) | 1990-10-18 |
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