JPS6047697A - 新規な酵素活性の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、式　一般式 に？−６Ｒ５ （式中、Ｒ１ばＬ−ロイシル基またはγ−Ｌ−グルタミ
ル基を示し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６１ｄ各
々水素原子、・・ロゲン原子、低級アルキル基、低級ア
ルコキシ基、アミン基、置換アミン基、水酸基、カルボ
キシル基またけスルホ基を示し、Ｒ５およびＲ６は一緒
にて炭素環を形成し７てもよい）で表わ゛されるアミド
化合物またはその水溶性塩を合成基質とする被験中のペ
プチダーゼの新規な活性測定法に関する。

ペプチダーゼは一般的にはペプチドのペプチド結合に作
用してアミン末端から切断して一アミノ酸またはより低
級のペプチドを遊離させる酵素の総称と（７て古くから
知られている。例えばロイシンアミノペプチダーゼ（臨
床化学において　ＴｒｕｅＬＡＰ　ともいう）やアリル
アミダーゼ（臨床化学においてＣ１１ｎｉｃａｌ　ＬＡ
Ｐともいう、以下時と１７．てＡＡと称する）などのア
ミノペプチダーゼ（以下Ｔｒｕｅ　ＬＡＰとＣｌ１ｎｉ
ｃａｌ　ＬＡＰ　を併せて単にＩ、ＡＰと称する）シス
チンアミノペプチダーゼ、グロリンアミノペプチダーゼ
、アルギニンアミノベプチダーゼ、アラニンアミノペプ
チダーゼ、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−
〇ＴＰ）などが知ら力、でいる。

上記酵素のうち、特にロイシンアミノペプチダーゼ（Ｌ
ＡＰ’）やｒ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−
Ｇ　Ｔ　Ｐ　）は、生体内のあらゆる組織に広く分布し
１、血清中にも存在しており、病的条件によって増加す
ることが知られてンリ、臨床検査上重要な酵素活性−］
定項目の対称となっている酵素であり、そのＬＡＰ活性
測定法、γ−ＧＴＰ活性測定法も種々報告されている。

例えば、それらの大部分は合成基質よ１１）ＬＡＰによ
って遊離されるアミン化合物を比色定量することにより
ＬＡＰ活性値をめる方法であって、それに用する合成基
質としてＬ−ロイシル−ｐ　−ニトロアニリドを用い、
ＬＡＰの酵素作用により生成するｐ−ニトロアニリンの
黄色を比色定量する方法が挙げられるが、この比色定量
の際、その合成基質の呈色波長がオーバー・ラップする
欠点があり、また血清成分、特にビリルビン系色素によ
る測定の影響も免れることが出来ない欠点があった。さ
らに、合成基質としてＬ−ロイシル−β−ナフチルアミ
ドを用因る方法が挙げらり、るが、この方法では生成す
るβ−ナフチルアミンに５−二トロー２−アミノメトキ
シベンゼン／アゾテートなどをカップリングさせて色素
を形成させるかあるいは生成するβ−ナフチルアミンを
亜硝酸ナトリウムでジアゾ化し、Ｎ−（１−ナフチル）
−エチレンシアミンにカップリングさせるか、もしく　
ｌｄ　ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドまたはｐ−
ジメチルアミノシンナムアルデヒドを縮合させて色素を
形成せしめ、次いでこれを１し色定叶する方法であるが
、反応過程が複雑で、かつ厳密な操作を必要とするため
、検査法として尚不便であるばかりでなく、標準物質た
るＩ−ナフチルアミンの毒性か著しく、近年膀胱の腫瘍
やツ′所を発生することが明らかとなった＼め、発癌物
質として、その使用に詩に厳密な注意を用するなどの欠
点があった。

又、Ｌ−ロイシル−ｐ−アミノアニリド誘２．・７体あ
るいは、Ｌ−ロイシル−４−ヒドロキシアニド誘導体を
合成基質として用い、ＬＡＰによって遊離されるアミン
化合物を、カプラーを共存させ、化学的酸化剤を用いて
酸化縮合して生成する色素を比色定量して測定する方法
（特公昭５４−３２３５９号公報）も報告され又実用化
されているが、これ捷での方法はすべて二段反応である
為、操作が煩雑で測定に長時間を要するなどの点で自動
分析におけるレイトアッセイ法としては実用性に欠けて
いた。

また、γ−ＧＴＰ活性の測定法も多数報告されているが
、それらの大部分は合成基質よりγ−ＧＴＰによって遊
離されるアミン化合物を比色定量するこ稈によりγ−Ｇ
ＴＰ活性値をめる方法であって、それを用いる合成基質
としてγ−Ｌ−グルタミルーｐ−ニトロアニリドを用い
、γ−ＧＴＰＯ酵素作用により生成するｐ−ニトロアニ
リンの黄色を４１０ｎｍで比色定量する方法が挙げられ
るが、血清成分、特にビリルビン系色素などの影響を避
けるため、各検体に対して検体ブランクを厳密に測定し
２なければならず、正確な測定値を得ることが困離であ
るという欠点があった。また生成するｐ−ニトロアニリ
ンをｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒド、ｐ−ジメ
チルアミノベンズアルデヒドなどのアルデヒド化合物と
縮合させて長波長側の赤色で測定する方法も挙げられる
が、発色感度に対する温度の影響が大きく、測定値の再
現性に問題があった。また生成するｐ−ニトロアニリン
をジアゾ化し、３．５−キンレノールと縮合させて生ず
る赤色を測定する方法が提案されたが反応操作段階が多
く簡便性に欠けるという欠点があった。さらに合成基質
としてγ−Ｌ〜グルタミル〜β−ナフチルアミドを用い
る方法が挙げられるが、これらの方法としてｒ−ＧＴＰ
により遊離シタβ−ナフチルアミンをジアゾニウム塩と
して比色定−辰する方法、３−メチル−２−ベンゾチア
ゾリノンヒドラゾンと酸化剤で発色させて比色定量する
方法、または前記アルデヒド化合物全発色剤として縮合
させて比色定量する方法があるが、前記と同様β−ナフ
チルアミンの発癌性が一般に指摘されているところであ
り、操作が煩雑で測定に長時間を要するなどの点で実用
性に欠けている。

又、Ｌ−γ−グルタミルーｐ−アミノアニリド誘導体や
Ｌ−γ−グルタミルー４−ヒドロキシアニリド誘導体を
合成基質として用い、γ−ＧＴＰによって遊離されるア
ミン化合物を、カプラーを共存させ、化学的酸化剤を用
すて酸化縮合して生成する色素を比色定量して測定する
方法も報告され実用化されているが、これまでの方法は
すべて二段反応である為、操作が煩雑で測定に長時間を
要するなどの点で、自動分析におけるレイトアッセイ法
としては実用性に欠けてｂた。

本発明者らは、か＼る欠点を有する従来のＬＡＰやγ−
ＧＴＰ活性測定法を改良すべく鋭意研究を続けた結果、
ＬＡＰやｒ−ＧＴＰ活性測定において、化学的酸化剤の
代りに、酸化縮合を行なわセル酵素、例工ば、アスコル
ビン酸オキシダーゼやラッカーゼなどを用いる方法を見
い出し、一段階反応で簡便にＬ’ＡＰやγ−ＧＴＰ活性
測定が行なえる、すなわち、レイトアッセイ法をなし得
ることを完成し、た（特願昭５７−１９８８６２号）。

更に、本発明者らは、酸化縮合反応を祥細に検討した結
果、通常、過ヨウ素酸す）　Ｕラム、次亜塩素酸ナトリ
ウム、過マンガン酸カリウムなどの化学的酸化剤は酵素
活性を失なわせる作用を有しているが、全く意外にも、
化学的ｉ浚化パ１１のうち、フェリシアン化カリウムの
みがＬＡＰ、γ−Ｇ　Ｔ■）を阻害しな（６事を見い出
した。しかも、フェリシアン化カリウムとカプラー共存
下で、１段１昔でＬＡＰ、γ−ＧＴＰが…り定できる、
すなわち、レイトアッセイ法が行なえる皐を見い出し、
本発明を完成したものである。

フェリシアン化カリウムの様な酸化剤は、ＪＱｉ常、酵
素活性を失なわせる作用を有しているり）で、７エリシ
アン化カリウム存在下での酵素反応区り考えら力、なＬ
／１事であった。

フェリシアン化カリウムの濃度は、ＬＡＰ活性測定の場
合、０．１〜２ｍＭが良好で、特に０．２５〜１ｍＭが
好適である、父、γ−Ｇ　’ｒ　ｐ活性測定の場合、０
．１〜２ｍＭが良好で、特に、０．５〜ｌ　ｒｎ（ｖＩ
が好適であることを見い出した。

本発明（７１ニアミド化合物ＣＩ）ｔたはその塩に、被
験液に含有されているペプチダーゼを、（式中、ＲＩは
Ｌ−ロイシル基またはγ−Ｌ−グルタミル基を示（７、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ５およびＲ６は各々水素原子、ハ
ロゲン原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミ
７基、置候アミノ基、水酸基、カルボキシル丞またけス
ルホ基を示し、Ｒ５およびＲ６け一緒にて炭素環を形成
し、でもよい）フェリシアン化カリウムとカプラー共存
下で、一段反応を行い、生成する発色化合１男を比色定
量する事を特徴とする測定法である。

本発明にお（八てペプチダーゼの合成基質として用いら
几るアミド化合物ＣＩ）は、ベグチド合成の常法によっ
て製造することができる。即し、Ｌ−ロイシンのα−カ
ルボキシル基やＬ−グルタミン酸のγ−カルボキシル基
とアニリンｉａｌ［１，Ｉ）との縮合反応により得られ
る。

上記の縮合反応１（際し７ては、予め反応に関ヵしてけ
ならなり官ａＦ：基、即ちＬ−ロイシンのα−アミン基
やＬ−グルタミン酸のα−アミノ基およびα−カルボキ
シル基を保護するのがよ込。α−アミノ基の保護基とし
ては通常ペプチド合成に用いられるα−アミン保護基が
用いられる。例えばＬ−ブチルオキシカルボニル、ｔ−
アミルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、
ｐ−ニトロペンジルオキシ力ルボニル、アタマンタチル
オキシ力ルボニル、０−ニトロフェニルチオ基ナトが誉
げられる。Ｌ−グルタミン酸のα−カルボキシル基はメ
チルエステル、エチルエステル、ｔ　−メチルエステル
、ベンジルエステル、ρ−ニトロベンジルエステル、ｐ
−メトキンベンジルエステルなどで保バφするのが好ま
しｂが、脱離の際α−アミノ基の保さ基と共に一段階で
脱離される粂件で脱離されるような保畿基で保誦するの
が特に好ましい。例えばα−アミン基をベンジルオキ７
カルポニル基、ａ−カルボキシル基ヲペンジルエステル
で保Ｊφするのがその一例である。

上記縮合反応に用いるアニリン誘導体［［）の（式中、
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびｊ七。は＾ＩＪ記と同じ
意味を有する） 例としては、３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシア＝ｌ
Ｊ７．３．５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリン、３
−クロロ−５−ブロモ−４−ヒドロキシアニリン、Ｎ、
Ｎ−ジエチル−ｐ−フェニレンジアミ１／、２−＃ｆシ
ル−−ジエチルアミノアニリン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｐ
−フェニレンジアミン、Ｎ、Ｎ−シー　ｎ　−フロピル
ーｐ−フェニレンジアミン、５−アミンサリチル酸、３
−スルホ−４−ヒドロキシアニリンなどが挙げられる。

上記の縮合反応は、α−アミン基が保護されたＬ−ロイ
シンのα−カルボキシル基またはα−アミノ基およびα
−カルボキシル基が保護されたＬ−グルタミン酸のγ−
カルボキシル基を酸ノ・ライド、酸無水物、酸アジド、
酸イミダゾリド、活性エステル、例、ｔばシアノメチル
エステル、ｐ−二トロフ、エニルエステル、２．４−ジ
ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドエステルなど
の活性化アシル誘導体に変換してアニリン誘導体〔旧と
反応させるか、あるいけカルボジイミド、例え＋ｄＮ、
Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド　Ｎ　。

Ｎ′−カルボニルイミダゾール、イソオキサゾリウム塩
、例えばウッドワード試薬などの縮合剤の存在下り記の
保護されたＬ−ロイシンまたはし一グルタミン酸とアニ
リン誘導体〔１１〕を反応させることにより行われる。

上記の縮合反応においては、通濱不活性有機溶媒、例え
ばジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメ
チルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、
ベンゼン、クロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロエ
タンなどの溶媒中、両者はぼ等瀘を加え、室温またはそ
れ以下の温度で反応させることにより行われる。上記の
反応経過はシリカゲルなどの薄層クロマトグラフィー（
ＴＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（Ｉ（ＰＬＣ）
など１（より追跡できるので、出発物質の−ずれかの消
失を待って適宜反応を終了すればよい。

このよう（（シて得られた反応生成物は、反応溶媒を留
去するかまたは留去することなく、非親水性有機溶媒、
例えばクロロホルム、ジクロロメタン、酢酸エチル、酢
酸ブチル、メチルイソブチルケトン、ベンゼン、ジエチ
ルエーテルなどに溶かし、酸性水およびアルカリ性水で
洗浄し、た後、溶媒を留去すること１（より採取できる
。さらに精製する必要がある場合には、適当な再結溶媒
で再結晶化するか、あるいはシリカゲル、活性アルミナ
、吸着樹脂などの吸着剤を用いるカラムクロマトグラフ
ィーにより精製することができる。

次いで得られた反応生成物の保護基を脱離するのである
が、この脱離化はペプチド化学における保護基の脱離化
法を用−て行われる。例えばα−アミノ保Ｍ”ＪＡがｔ
−ブチルオキシカルボニル基である場合には’１　２Ｎ
塩化水素の酢酸溶液、トリフルオロ酢酸、ギ酸などを用
いる方法、ベンジルオキシカルボニル基である場合Ｖこ
は、パラジウム−炭素触媒を用いる接触還元による方法
、臭化水素酸の酢酸溶液を用いる方法により行えばよい
。■Ｊ−グルタミン酸のα−カルボキシル基の保睡基が
ベンジルエステルである場合には、パラジウム−炭素触
媒を用いる接触還元による方法で行えばよい。

このようにして得られたアミド化合物〔■〕を反応液か
ら採取するには、先ず保枠基の脱離化が酸分解による場
合には、中和し、接触硝元による場合には触媒を除去し
た後、非親水性有機溶媒、例ｔ　ハクロロホルム、ジク
ロロメタン、ジクロロエタン、酢酸エチル、酢酸ブチル
、メチルイソブチルケトン、ベンゼン、ジエチルエーテ
ルなどの溶媒中、酸性水およびアルカリ性水で洗浄シ２
フこ後、溶媒を留去することにより採取できる。さらに
イＨ製する必要がある場合には、適当な杓結溶媒で４’
ｊ結晶化するか、あるいはシリカゲル、活性アルミす、
吸着樹脂などの吸着剤を用いるカラムクロマトグラフィ
ーによりオ青製することができる。

本アミド化合物〔■〕は必要に応じ、塩酸、硫酸、硝酸
、リン酸などの無機酸との塩、ギ酸、酢酸、プロピオン
酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、シュウ酸などの有機
酸との塩を形成することができる。

次に、本アミド化合物〔■〕を用（八るペプチダーゼ活
性測定法について述べる。本測定法においては、上記了
ミド化合物〔■〕またはその塩に被験液に含有されてい
るペプチダーゼ、特にＬ　ＡＰまたけγ−ＧＴＰを、フ
ェリシアン化カリウムとカプラー共存下で、一段′反応
を行−１生成する発色化合物を比色定量するものである
。使用するカプラーとしては、アニリン誘導体［’［］
と酸酸化金して発色化合物を形成する芳香化合物であれ
ば、どのような化合物でもよいが、これらのうち代表的
な芳香化合物としてはフェノール系化合物、アミンフェ
ノール系化合物、アニリン系化合物またはナフトール系
化合物が挙げられる。フェノール系化合物の例としては
、フェノール、サリチル酸、ｍ−ヒドロキシ安息香酸、
ｐ−ヒドロキシ安息香酸、２．６−シヒドロキシ安息者
酸、サリチル［ウメチル、０−クレゾール、Ｉｎ−クレ
ゾール、ｐ〜クレゾール、０−エチルフェノール、ｍ−
エチルフェノール、２，３−キシレノール、２，４−キ
シレノール、２，５−キシレノール、３．５−キルノー
ル、２．６−キシレノール、０−メトキンフェノール、
ｎｌ−メトキシフェノール、ｐ−メトキンフェノール、
２．６−シメ＋−キシフェノール、０−クロロフェノー
ル、ｍ−クロロフェノール、ｐ−クロロフェノール、２
，４−ジクロロフェノール、２，６−ジクロロフェノー
ル、Ｏ−ブロモフェノール、ｍ−ブロモフェノール、ｐ
−ブロモフェノール、２．４−ジブロモフェノール、２
，６−２ブロモフエノール、２−メチル−６−クロロフ
ェノール、２−クロロ−５−メチルフェノール、０−カ
ルボキンメチルフェノール、２−ヒドロキシ−４−アミ
ンエチルフェノールなどが挙げられ、アミンフェノール
系化合物の例とり、ては、４−クロロ−２−アミノフェ
ノール、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｍ−アミンフェノール、４
−メチル−２−アミンフェノール、５−アミノ−２−ヒ
ドロキシ安息香酸、２−アミノ−３−ヒドロキシ安息香
酸、ｏ−アミンフェノール、ｍ−アミノフェノール、ｐ
−アミンフェノールなどが挙げられ、アニリン系化合物
の例としては、アニリン、０−トルイジン、ｍ−）ルイ
ジン、ｐ−トルイジン、Ｎ−メチルアニリン、Ｎ−エチ
ルアニリン、’Ｎ、Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ。

Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−〇−トルイ
ジン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｐ−トルイジン、Ｎ、Ｎ−ジ
エチル−ｏ−）ルイジン、Ｎ　、　Ｎ−ジエチル−ｍ−
）ルイジン、Ｎ、Ｎ−ジエチル−ｐ−トルイシン、０−
クロロアニリン、ｍ−クロロアニリン、ｍ−ブロモアニ
リン、アントラニル酸、３−アミノ安は香ＣＩＲ１ｐ−
ジメチルアミノ安息香酸、ｐ−クロロ−〇　−）ルイジ
ン、３−アミノ−４−メチル安息香Ｃ７Ｊ、ｍ−フェニ
レンジアミン、Ｎ、Ｎ−ジメチル−ｍ−フェニレンジア
ミン、２−メチル−ｍ−フェニレンジアミン、４−メチ
ル−０−フェニレンジアミン、４−メチル−ｍ−フェニ
レンジアミン、２−クロロ−ｍ−フェニレンジアミン、
３−クロロ−〇−トルイジン、２−メトキシ−５−クロ
ロアニリン、０−エチルアニリン、２．５−ジェトキシ
アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアニリン
、Ｎ−エチル−Ｎ　−ヒドロキシエチル−ｍ−トルイジ
ンなどがＭげらり１、ナフトール系化合物の例とし２て
はα−ナフトール、β−ナフトール、２−カルボキシ−
１−ナフト−ル、４−クロロ−１−ナフトール、■−ヒ
ドロキシー２−ナフトエ酸、１−ナフトール−２〜スル
ホン酸、■−ナフトールー３−スルポン酸、■−ナフト
ールー４−スルホン酸、２−ナフト−ル−６−スルホン
酸、２−ナフトール−；３，６−ジスルホン酸などが挙
げられる。

上記の（１１Ｗ素反応及び酸化縮合反応は、この反応の
至適ｐｆＮｄ６．５〜８．０の範囲にあるから、この範
囲内で４．、ｒｆ　ｐＨを設定すればよい。ｐ　Ｉ−１
を保持するための緩衝液としては、リン酸塩、バルビタ
ール、ホウ酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタン
などの緩衝液が用いられる。

アニリン訪導体［ｎ）と上記カプラーとの醗化縮合によ
り生成する発色化合物は、カブ２−の種類により極大吸
収波長が約５５０−７７０　ｎｒｎ　に巾広く分布する
が、通常は殆んど５７０〜６８０ｎｍ　に極大吸収に有
する有色系色素であり、呈色も極めて高感度で安定性も
良く、しかも温度による変動も殆んどなく、生体試料中
のビリルビンなどの夾雑物による影響も受けて〈−ため
、正の誤走も殆んど受けることがないので、ＬＡＰやγ
−ＧＴＰなどのペプチダーゼ活性測定に極めて好結果を
与える。

次に、ＬＡＰの活性測定につめて更に詳しく説明する。

ＬＡＰの活性測定を行うに当って（ま、先ずＬＡＰの合
成基質であるし一ロイシルー３，５−ジハロゲノー４−
ヒドロキシアニリドに被験液中のＬＡＰを、フェリシア
ン化カリウムとカプラー共存下で一段反応（酵素反応）
を行い、生成する発色化合物を比色定量ｔｈ、ばよい。

被（い）液としては血清を０．Ｏ１〜５ｍｌの脱囲内で
用いられる。上記酵素反応は通常３７℃付近で５分以上
反応させればよめ。この反応の至適ｐ　Ｈは６．５〜８
．０の範囲にあるから、この範囲内で適宜ｐＨを設定す
ればよ−。ｐ　Ｈを保持するための緩衝液としては、リ
ン酸塩、ハルビタール、ホウ酸塩、トリスヒドロキシメ
チルアミノメタンなどの緩衝液が用いられる。カプラー
としては、例えば、ｐ−キシレノールやニーナフトール
−２−スルホンＩｐなどが用いら力、る。

又、フェリシアン化カリウムの濃度ケ、通常０、ＬｍＭ
−２ｍＭの範囲、好適量とし、では０．２５−ＬｍＭで
あり、此の範囲で使用すれ１ば充分である。

次にγ−ＧＴＰＯ活性測定について更に詳しく説明する
。γ−ＧＴＰＯ活性測定を行うに当っては、先ずγ−Ｇ
ＴＰＯ合成基質であるγ−し−グルタミルー３，５−ジ
ハロゲノ−４−ヒドロキシアニリドに被検液中のｒ　−
Ｇ　Ｔ　Ｐを、フェリシアン化カリウムとカプラー共存
下で、一段反応（酵素反応）を行い、生成する発色化合
物を比色定ｌｉ１すればよ−。被験液とし、では血清を
ｏ、ｏｉ〜５ｍｌの範囲内で用いられる。上記酵素反応
は通常３７℃付近で５分以上反応させればよい。この反
応の至適ｐ　Ｈは７．５〜９．０の範囲にあるから、こ
の範囲内で適宜ｐＨを設定すればよい。反応に際しては
受容体としてアミノ酸やペプチド、例えばグリシルグリ
シンの適当量を含むｐ　Ｈ７，５〜９．０の緩衝液中で
反応させればよい。ｐＦＩを保持するための緩衝液と１
７では、リン酸塩、バルピタール、ホウ酸塩、炭酸塩、
トリエタノールアミン、グリシン、トリスヒドロキシメ
チルアミノメタンなどの緩衝液が用因られる。カプラー
としては、例えば、ｐ−キシレノールや１−ナフトール
−２−スルホン酸などが用いられる。

又、フェリシアン化カリウムの濃度は、通常０．１　ｔ
ｎ、　Ｍ　〜２　ｍ　Ｍの範囲、好適量としては、０．
５〜１ｍＭであり、此の範囲で使用すれば充分である。

Ｍ＋Ｊ記したように本発明の合成基質を用いる測定法は
、各反応工程がｍ１便なため、速やかに且つ正確なＬＡ
Ｐ、γ−ＧＴＰなどのペプチダーゼ活性値を測定するこ
とができるばかりでなく、生成する発色化合物が通常５
５０〜７５０ｎｍ附近にイ垣大吸収を有するため、生体
試料中の夾雑物による影響を受けに＜＜、ペプチダーゼ
活性測定が鞘ＩＷの高い方法である。

又、フェリシアン化カリウムの様な［ソ化剤は、通常酵
素活性を失なわせる作用を有して因る。そこで、フェリ
ンアン化カリウム存在下での酵素反応（１考えられなり
事であった。

本発明方法は、酸化縮合剤として用いるフェリンアン化
カリウムが、以外にも、ＬＡＰやγ−ＧＴ　Ｉ）を阻害
しなりことを見い出［７て光成１−．たものであり、し
かも一段反応で１７１１便にＬ　Ａ　Ｐやγ−ＧＴＰの
酵素活性測定がなし得るものである北に、測定の自動化
が容易になし得るものであって、従来の化学的発色法の
二段反応では不可能であったレイト・アッセイを可能に
したものである。

次に参考例および実施例を誉げて本発明を具体的妃説明
するが、これにより本発明を限定するものではなく、ま
た参考例は特願昭５７−１５０７０１号１で記載されて
いるものである。

尚、参考例中に記載の略記号は次の意味を有する。

Ｌｅｕ；Ｌ−ロイシル ｒ　Ｇｌｕ；γ−Ｌ−グルタミル ＢＯＣ；　ｔ−ブチルオキシカルボニルＯ８ｕ　；Ｎ−
ヒドロキシスクシンイミドエステルＡｃＯＨ；酢酸 参考例　Ｉ Ｌ−ロイシル−３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニ
リド・塩酸塩 ２．６−ジクロロ−４−アミンフェノール１．７８９（
ｌＯミリモル）および炭酸水素ナトリウム０．９２〃（
１５ミリモル）を水２５ｍ１に溶かし、これに０〜５℃
に冷却しつ＼Ｂ　ＯＣ−Ｌｅｕ　−Ｏ８ｕ　３．２８Ｎ
（１０ミリモル）のジオキサン（２５ｍｌ）ｙＷ液を撹
拌下部した。室温で一夜撹拌した後、３０℃以下でジオ
キサンを減圧上留去した。残渣を酢酸エチル２００ｍ１
に溶かし、飽和炭酸水素す）ｌラム水溶液、水、ＩＮ塩
酸、飽和食塩水の順で谷５０ｍ１で３回づつ昨浄した。

！）：酸エチル層を外水ｍ酸マグネシウムで乾燥した後
、減Ｅ濃縮して１３０　Ｃ−Ｌ　−ｂインルー３，５−
ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド２．９６ｐを得た。

次いで、これを２Ｎ−ＨＣｌ／Ａｃ０Ｈ１５ｍｌに溶か
ｔ７、室温で２時間ｑｌ　４４ミした後、乾燥ジエチル
エーテルｒｏｏｍｅを加えて結晶化（２、乾燥エーテル
で２回デカンテーンヨンし。

た。得られた結晶を減圧乾燥してＬ−ロイシル−３，５
−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド・塩酸塩を得た。

収　量　１．８９．９（収率８３．６％）分子式　Ｃ，
［（，６Ｎ２０２ＣＩ！２−、　ＨＣｌ融　点　；１２
７−１３３℃（分ｗＩ）シリカゲル薄層クロマトグラフ
ィ（ＴＬＣ）；Ｒｆ　＝　０．６３［：ブタノールー酢
酸−水（４：１：Ｉ）：１参考例　２ Ｌ−ロインルー３．５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニ
リド・塩酸塩 ２．６へジブロモ−４−アミンフェノール４．９υｇ（
１３，３ミリモル）および炭酸水素ナトリウム１．６８
．９　（２０ミリモル）を水７０ｄに溶かし、これに０
〜５℃に冷却しつつＢＯＣ−Ｌｅ　ｕ−ＯＳ　ｕ　６Ｊ
）１．９（１８，３ミリモル）のジオキサ７（７０ｍｌ
）溶液を撹拌下滴下した。室温で一夜撹拌した後、３０
℃以下でジオキサンを減圧上留去した。残渣を酢酸エチ
ル４００　ｍ１ｌｃｆ４Ｗかし、飽和炭酸水素ナトリウ
ム水溶液、水、ＩＮ塩酸、飽和食塩水の順で各ｒｏｏｍ
ｌで３回つつ洗浄した。酢酸エチル層を無水硫［没マグ
ネシウムで乾燥した後、減圧濃縮し、てＢＯＣ−Ｌ−ロ
イシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド５
．８ｇを得た。次いでこれを２Ｎ−ＨＣｌ／ＡｃＯＨ３
０ｍ１に溶かし、室温で２時間撹拌Ｌ７た後、乾燥エー
テルと加えて結晶化させてＬ−ロイシル３，５−ジブロ
モ−４−ヒドロキシアニリド・塩酸塩を得た。

収　ｉｉｔ　２−５０　ｇ（収率４９．７％）分子式　
Ｃ１□Ｈ１６Ｎ２０２Ｂｒ２（４１６，５４）シリカゲ
ル薄層クロマトグラフィ　（ＴＬＣ）；Ｒｆ　＝　０．
６５　Ｃｎ−ブタ／−ル：６酸：水＝参考例　３ γ−Ｌ−グルタミルー３．５−ジクロロ−４−ヒドロキ
シアニリド Ｎ、Ｎ−７タロイルーＬ−グルタミル酸無水物５．１６
＃　（２０ミリモル）および４−アミノ−２，６−シク
ロロフエノール３．５６．９（２０ミリモル）をジオキ
サン５０ｍ１に溶かし、６０℃で２時間撹拌１〜た。ジ
オキサンを減圧下留宍１７、残渣にヒドラジン・ヒトラ
ード１．５縦のメタノール（５０＃Ｉｌ’）溶液を加え
、室温で２日間放置し７だ。メタノールを滅田下留去（
７、残渣に水を加えた後、０．５１ｉＪ−ＨＣｌでｐＨ
３に調節（２て析出したγ−Ｌ−グルタミルー３，５−
ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド３．９６　ｇを得た
。

収　量　３．９６．９（収率７２．９係）分子式Ｃ１１
Ｈユ２Ｎ２ｏ、ｃｌ 融　点　；２１４〜２１７℃（分解） シリカゲ＃ＴＬ、Ｃ；　Ｒ／＝０．４９　（ブタノール
：酢酸：水＝４：’１：１） 参考例　４ γ−Ｌ−グルタミルー３，５−ジブロモ−４−ヒドロキ
シアニリド Ｎ　、　Ｎ−フタロイル−Ｌ−グルタミン酸無水物２．
１８，１１７　（８，４ミリモル）および４−アミノ−
２，６−ジクロロフェノール２．２６ｐ　（８，４ミＩ
Ｊモル）ヲジオキザン２　Ｑ　ｍ、ｌ　Ｋ高か（−１６
０℃で１．５時間撹拌した。ジオキサンを減圧上留去し
、残渣にヒドラジン句ヒトラード０．７廐のメタノール
（２（Ｈｎｌ）τ容液全加え、室温で２日間放置した。

メタノールを減圧上留去し、残置に水を加えた後、０．
５Ｎ−ＨＣｌでｐＨ３に調節して析出１．たγ−Ｌ−グ
ルタミルー３．５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド
２．１３．’７を得た。

収　量　２．１３．！９（収率６４．０％）分子式　〇
、　、ｆ（、２Ｎ２０．Ｂｒ２融　点　；　ｌ　９１〜
１９４　℃　（分Ｊ弄）シリカゲル’ｒ　ＬＣ；　Ｒｆ
＝０．５３　（ブタノール：酢酸：水＝４：１：ｌ） （実施例−１）　Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４
−ヒドロキシアニリド、ｐ−キシレノール、フェリシア
ン化カリウムを用−るＬＡＰ活性測定法 り一ロイシルー３．５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニ
リド・塩酸塩１ｍＭ、ｐ−キシレノール５η剥およびフ
ェリシア／化カリウム０．５ｍ＃’に含有する０、１　
Ｍ　’）ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を調製して基質溶液
とした。此の基質溶液２ｍｌに、ＬＡＰを含有する患者
血清（５１５Ｇ−Ｒ単位）２０μｌを加えて３７℃で反
応させた。又、此の反応時間ごとに反応によって発色す
る色素を５８　’５　ｎ　ｍの波長にて吸光度を測定し
た。

その結果を第１図に示した。

又、比較の為、フェリシアン化カリウムの代りに、化学
的方法で通常使用されている酸化剤、過ヨウ素酸カリウ
ム０．５ｍＭを使用する以外は同様な反応を行なったが
、第１図に示した様に、過ヨウ累酸カリウムがＬＡＰ反
応を阻害する為、１ヨＡ’Ｐ活性測定が測定不可能であ
った。

すなわち、本発明に使用（７た酸化剤、フェリシアン化
カリウムは、ＬＡＰ反応を阻害せず、ＬＡＰ反応が始ま
ると同時に呈色が起る為、レイトアッセイが行なえる特
色を有するものであった。

（実施例−２）　Ｌ−口イシル−３，５−ジブロモ−４
−ヒドロキシアニリド、ｌ−ナフトール−２−スルホン
酸、フェリシアン化カリウムを用−るＬＡＰ活性測定法 り一ロイシルーａ、ｓ−シフロモ−４−ヒドロキシアニ
リド・塩酸塩１ｍＭ、１−ナフトール−２−スルホン酸
０．５ηＬＭ％　フェリシアン化カリウム０．５ｍＭを
含有する０、１　Ｍリン酸ｉ１ｋ　（ｉ’ｆｉ液（ｐＨ
７，０）を調製して基質溶液とし、た。此の基質溶液２
　ｒｎ　ＩＩに、ＬＡＰを含有する患者血清（５１５Ｇ
−Ｒ単位）２０Ａｌを加えて３７℃で反応させた。父、
此の反応時間ごとに反応によって発色する色素を６３０
　ｎｍの波長にて吸光度を測定した。その結果を、第２
図に示した。此の第２図に示す通り、本発明の測定法は
、Ｌ’ＡＰ活性を良好に測定する事が出来、しかも、従
来の化学発色法と異なり、反し６液の呈色がＬＡＰの反
応が始塘ると同時１（生ずる為に、レイトアッセイが行
なえる特色を有するものであった。

（実施例−３）　Ｌ−口イシル−３，５−ジクロロ−４
−ヒドロキシアニリド、ｐ−キシレノール、フェリシア
ン化カリウムを用いるＬＡＰ活性測定法 実Ｍ例−１のし一ロイシルー３，５−ジブロモー４−ヒ
ドロキシアニリド・塩酸塩の代りにＬ−口イシル−３，
５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド・塩［最塩を用
いる以外は同様な方法で実施（、た。

その結果を第３図に示した。此の第３図に示す通り、本
発明の測定法（は、ＬＡＰ活性金団好に測定する事が出
来、（１，かも、従来の化学発色法と異なり、反応液の
呈色がＬＡＰの反応が始−まると同時に生ずる為、レイ
トアッセイが行なえる特色を有するものであった。

（実施例−４）　Ｌ−ロイシル−３，５−ジクロロ−４
−ヒドロキシアニリド、■−ナフトールー２−スルホン
酸、フェリシアン化カリウムを用いるＬＡＰ活性測定法 実施例−２のし一ロイシルー３，５−ジブロモー４−ヒ
ドロキシアニリド・塩酸塩の代りに、Ｌ　−ロイシル−
３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド塩酸塩を用
する以外は、同様な方法で冥加した。

その結果を第４図に示した。此の第４図に示す通り、本
発明の測定法は、ＬＡＰ活性を良好に測定する事が出来
、しかも、従来の化学発色法と異なり、反応液の呈色が
ＬＡＰの反応が始まると同時に生ずる為、レイトアッセ
イが行なえる特色を有するものであった。

（実施例−５）　γ−グルタミルー３，５−ジブロモ−
４−ヒドロキシアニリド、ｐ−キシレノール、フェリシ
アン化カリウムを用込るγ−ＧＴＰ活性測定法。

γ−グルタミルー３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシア
ニリド７．５ｍＭ、　グリシルグリシン１００ｒ１００
ｒｒキシレノール２　ｍ　Ｍ　％　およヒ、フェリシア
ン化カリウム１７？ＬＭを含有する５０ｍＭト’）スー
塩酸緩衝液（ｐＨ７，９’）を調製して基質溶液とした
。

此の基質溶液２　ｍ　ｌにγ−ＧＴＰを含有する患者血
清（２７５ｍＵ／ｍｌ’）　２０　ｔｈｌｌ’ｃ加えて
３７℃で反応させた。又、此の反応時間ごとに反応に丈
って発色する色素を５８５　ｎｍの波長にて吸光度？ｒ
−訓定１、た。

その結果を第５図に示１．た。

又、比較の為、フェリシアン化カリウムの代りに、化学
的方法で通常使用されてｈる酸化剤、過ヨウ素酸カリウ
ム１ｍ、Ｍを使用する以外ｆｄ同儲な反応を行なったが
、第５図に示した様に、錦）ヨウ素カリウムかγ−ＧＴ
Ｐ反応を阻害する為、γ−ＧＴＰ活性測定が測定不可能
であった。

すなわち、本発明に使用１．た酸化剤、フェリシアン化
カリウムは、γ−ＧＴＰ反応を阻害ぜず、γ−ＧＴＰ反
応が始まると同時に呈色が起る／）、レイトアッセイが
行なえる特色を有するものであつｆＣ，。

（実施例−６）　γ−グルタミルー３，５−ジブロモ−
４−ヒドロキシアニリド、１−ナフトール−２−スルホ
ン酸、フェリシアン化カリウムを用いるγ−ＧＴＰ活性
測定法。

γ−グルタミルー３，５〜ジブロモ−４−ヒドロキシア
ニリド７．５ｍＭ、グリシルグリシン１０　ｔ′ｎＭ。

■−ナフトールー２−スルホン酸０．５ｍＭ、およびフ
ェリシアン化カリウム１　ｍＭを含有する５（ｈａＭＴ
ｒｉｓ　−ＨＣｌ）緩衝ｇ（ｐＨ７、９）ｔ−調Ｍして
基（Ｃ浴液と１．た、此の基質溶液２ｍｌにγ−Ｇ　Ｔ
　Ｐを詮有する患者血清（２７５ｍＵ／ｍＪ）　２０　
ｔｔｌｋ加えて３７℃で反応させた。又、比の反応時間
ごとに反応によって発色する色素を６３０　ｎｍの波長
（ｌこて吸光度を測定した。

その結果を、第６図に示［−た。此の第６図に示す通り
、本発明の測定法は、γ−ＧＴＰ活性を良好に測定する
事が出来、しかも、従来の化学発色法と異なり、反応液
の呈色が、γ−ＧＴＰの反応が始まると同時に生ずる為
に、レイトアッセイが行なえる特色を４１するものであ
った。

（実施例−７）　ｒ−グルタミル−３，５−ジクロロ−
４−ヒドロキシアニリド、Ｐ−キシレノール、フェリシ
アン化カリウムを用（八るγ−Ｇ　’Ｉ’　、Ｐ活１生
測定法。

実施例−５のγ−グルタミルー３，５−ジブロモ−４−
ヒドロキシアニリドの代りにγ−グルタミルー３，５−
ジクロロ−４−ヒドロキシアニリドを用いる以外は同様
な方法で実施し−た。その結果を第７図に示［２，た。

此の第７図に示す通り、本発明の測定方法は、γ−ＧＴ
Ｐ活性を良好に測定する事が出来、し、かも、従来の化
学発色法と異なり、反応７仮の呈色がγ−ＧＴＰの反応
が始まると同時に生ずる為、レイトアッセイが行なえる
特色・と（ｆするものであった。

（実施例−８）　ｒ−グルタミル−３，５−ジクロロ−
４−ヒドロキシアニリド、１−す７トールー２−スルホ
ン酸、フェリシアン化カリウムｆ　ｉｌｌいるγ−ＧＴ
Ｐ活性ｊｌｌｌ定法 実施例−６のｒ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４−
ヒドロキシアニリドの代りに、ｒ−グルタミル−３，５
−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリドを用する以外は同
様な方法で実施し、た。その結果を第８図に示した。此
の第８図に示す通り、本発明の測定方法は、γ−ＧＴＰ
活性を良好に測定する事が出来、しかも、従来の化学発
色法と異なり、反応液の呈色がγ−〇ＴＰの反応が始ま
ると同時に生ずる為、レイトアッセイが行なえる特色を
有するものであった。

（実施例−９）　Ｌ−口イシル−４−Ｎ、Ｎ−ジエチル
アミノアニリド、ｌ−ナフトール−２−スルホン酸、フ
ェリシアン化カリウムを用−るＬＡＰ活性測定法 り一ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノアニリドΦ
二塩酸塩２ｍＭ、■−ナフトー／ｌ−２−スルホン酸塩
０．５ｍ１Ｊフエリシアン化カリウム塩０．５ｍＭを含
有ｔル０．Ｉ　Ｍ　ｊｌ　７ｍ緩’ａＶＨ，（ｐＨ７，
０）　ｋＷＡ製して基質溶液とした。此の基質溶液２ｍ
１ｌに、ＬＡＰを含有する患者血清（５１５Ｇ−Ｒ単位
）２０μｌ　を加えて３７℃で反応させた。又、此の反
応時間ごとに反応によって発色する色素′ｆ：６５５ｎ
ｍの波長にて吸光度を測定した。

その結果を第９図に示した。此の第９図に示す通り、本
発明の測定方法は、ＬＡＰ活性を良好に測定する事が出
来、しかも、従来の化学発色法と異なり、反応液の呈色
がＬＡＰの反応が始まると同時に生ずる為、レイトアッ
セイが行なえル特色を有するものであった。

（実施？ｌＪ　−１０）　Ｊ、−口イシル−３−カルボ
キシ−４−ヒドロキシアニリド、ｐ−キシレノール、フ
ェリシアン化カリウムを用いるＬＡＰ活性測定法り一ロ
イシルー３−カルボキシー４−ヒドロキシアニリド２ｍ
Ｍ、ｐ−キシレノール５ｍＭ、フェリシアン化カリクム
帆５　ｍ　ＩＶｉ葡含有する０、１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）を調製して基質溶液とした。此の基質溶液２
ｒｎｌに、ＬＡＰを含有−４−る患者旧情（５１５Ｇ−
Ｒ単位）２０ノＬｌ　を加えて３７℃で反応させた。又
、此の反応時間ごとに反ムＩＬ、にょって発色する色素
全５７５　ｎｍの波長にて吸光度を測定した。

その結果を第１θ図に示（、た。此の第１０し１に示す
通り本発明の測定方法は、ＬＡＰ活住を良好に測定する
事が出来、しかも、従来の化学発色法と異なシ、反応液
の呈色がＬＡＰの反応が始すると同時に生ずる為、レイ
トアッセイが行なえる特色を有するものであった。

（実施例−１１）　γ−グルタミルーＰ−Ｎ−エチルー
Ｎ−ヒドロキシアミノアニリド、■−ナフトールー２−
スルホン酸、フェリシアン化カリウムを用いるγ−ＧＴ
Ｐ活性測定法 γ−グルタミルーＰ−Ｎ−エチルーＮ−ヒドロキシアミ
ノアニリド７．５ｒｎＭｚグリシルグリシン１００　ｍ
ＭＸｌ−ナフトール−２−スルホン酸０．５ｍＭおよび
フェリシアン化カリウム１７ＦＬＭ　を含有する５　０
　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣ７緩衝液（ｐ）Ｉ　７．９　
）を調製して基質溶液とした。此の基質溶液２　ｍｌに
γ−ＧＴＰｆ、含有する患者血清（２７５ｍＵ／ｍｌ　
＞２０μｌｌを加えて３７℃で反応させた。又、此の反
応時間ごとに反応によって発色する色素を６７０　ｎｍ
の波長にて吸光度を測定した。その結果を第１１図に示
した。此の第１１図に示す通り、本発明の測定法は、γ
−ＧＴＰ活性を良好に測定する事が出来、しかも、従来
の化学発色法と異なり反応液の呈色が、γ−ＧＴＰの反
応が始まると同時に生ずる為に、レイトアッセイが行な
える特色を有するものであった。

（実１ｍ例−ｘ２）　γ−グルタミル〜３−カルボキシ
ー４−ヒドロキシアニリド、ｐ−キシ１７ノール、フェ
リシアン化カリウムを用いるγ−ＧｒＰ活性測定法 γ−グルタミルー３−カルボキシー４−ヒドロキシアニ
リド７．５ｍＭ、グリシルグリシン１００ｍＭ。

ｐ−キシレノール０．５　ｍＭおよびフェリシアン化カ
リウム１ｍＭを含有する５　０　ｔｎＭ　Ｔｒｉｓ　−
ＨＣｌ緩衝液（ｐｆ（７，９）を調製して基質溶液とし
た。此の基質溶液２ｍｌにγ−ＣＴＰを含有する患者血
清（２７５ｙｉＵ／ｍ（り２０　ｐｌ　を加えて３７℃
で反応させた。父、此の反応時間ごとに反応によって発
色する色素を６１５　ｎｍの波長にて吸光度ｒ測定（。

た。その結果を第１２図に示した。此の第１２図に示す
通り、本発明の測定法は、γ−ＧＴＰ活性全良好に測定
する事が出来、しかも、従来の化学発色法と異なり、反
応液の呈色が、γ−Ｇ　Ｔ　１）の反応が始まると同時
に生ずる為に、レイトアツセイが行なえる特色を有する
ものであった。

【図面の簡単な説明】

第１図はＬ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド、Ｐ−キシノール、フェリシアン化カリウ
ムを用いるＬＡＰ測定法と従来法による酸化剤を用いた
場合の比較、第２図はＬ−口イシル−３，５−ジブロモ
−４−ヒドロシアニリド、１−ナフトール−２−スルホ
ン酸、フェリシアン化カリウムを用いるＬＡＰ活性測定
法、第３図はＬ−口イシル−３，５−ジクロロ−４−ヒ
ドロキシアニリド、Ｐ−キシレノール、フェリシアン化
カリウムを用いるＬＡＰ活性測定法、第４図はＬ−口イ
シル−３，５−ジクロ０−４−ヒドロキシアニリド、Ｉ
−ナトールー２−スルホン酸、フェリシアン化カリウム
を用いるＬＡＰ活性測定法、第５図はＴ−グルタミル−
３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド、■〕−キ
シレノール、フェリシアン化カリウムを用いるγ−ＧＴ
Ｐ活性測定法と従来法による酸化剤を用いた場合の比較
、第６図はＴ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４−ヒ
ドロキシアニリド、１−ナフトール−２−スルホン酸、
フェリシアン化カリウムを用いるγ−ＧＴＰ活性測定法
、第７図はγ−グルタミルー３．５−ジクロロ−４−ヒ
ドロキシアニリｌ、Ｐ−キシレノール、フェリシアン化
カリウムを用いるγ−ＧＴＰ活性測定法、第８図はＴ−
グルタミル−３：、５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニ
リ１゛、１−ナフトール−２−スルホン酸、フェリシア
ン化カリウムを用いるγ−ＧＴＰ活性測定法、第９図は
Ｉ。 −口イシル−４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノアニリド、■
−ナフトールー２−スルボン酸、フェリシアン化カリウ
ムを用いるＬＡＰ活性１１Ｊ定法、第１０図はＩ５−ロ
イシル−３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリド、Ｐ
−キシレノール、フェリシアン化カリウムを用いるＬ　
Ａ　Ｉ）活性測定法、第１１図はγ−タルタミルーＰ−
Ｎ−エチルーＮ−ヒドロキソ−７ミノ゛Ｉニリド、■−
ナフトールー２−スルホン酸、フェリシアン化カリウム
を用いるｒ−ＧＴＰ活性δ（り定法、第１２図はＴ−グ
ルタミル−３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリド、
Ｐ−キシレノール、フェリシアン化カリウムを用いるｒ
−ＧＴＰ活性δ１．す定法である。 ＋２３４５ 一一一介 ＋２３４５ −一分 １２３４５ 一一→−スＮ ０、＋　０．２　０．３　０．４　０．５２　４　６　
８　１０ →分 手続補正書 昭和５９年７り／♂口 特許庁長官殿 １、事件の表１ｆ＜ 昭和５８年特許願　第８２４９３号 ２、発明の名称 事件との関係　特許出願人 住　所　静岡県田方郡大仁町三福６３２番地の１名　称
　東洋Ｍ造株式会社（ほか１名）４、代理人 自発道（）正 ６、　補正により増加する発１１１１の数（１）　明細
書中温１９ページ下から５行目、３行目［芳香化合物Ｊ
とあるを［芳香族化合物Ｊと訂正する。 （２）　明細書中筒２７ページ下から８行目［ナトリウ
ム０．９２　Ｊとあるを［ナトリウム１．２６Ｊと訂正
する。 （３）　同ページ中下から４行目「撹拌下部した。」と
あるを「撹拌上滴下した。」と訂正する。 （４）明細書中温２８ページ下からｌＯ行百計（収率８
３．６チ）」とあるを［（収率５７，７％）」と訂正す
る。 （５）　同ページ中下から６行目「〔ブタノール−」と
あるｅｒｃｎ−ブタノール−」と訂正する。 （６）明Ｍ８書中第２９ページ下から７行目［ロイシル
３．５−Ｊとあるを「ロイシル−３，５−Ｊと訂正する
。 （７）　同ページ中下から５行目「（収率４９゜７％）
」とあるを［（収率３２．８％）Ｊと訂正する。 （８）　同ページ中下から４行目［Ｃ１□Ｈ１６Ｎ２０
□Ｂｒ２Ｊ　とあるｋ　ｒ　Ｃｌ２Ｈ５６Ｎ２０□Ｂｒ
２・ＨＣＩＪ　Ｊと訂正する。 （９）　明卸１書中第３０ページ上から５イテ１１グル
タミル酸」とあるを「グルタミン酸」と訂正する。 Ｇ０）同ページ中下から５行目Ｆ（収率７２．１％）Ｊ
とあるを［（収率６４．５％）」と訂正する。 ０υ　同ページ中下から４行目ｒｃ、、Ｈ□２Ｎ２０４
ＣＩＪとあるをＩ　Ｃ，、Ｈ１□０．　ＣＡ！２Ｊと訂
正する。 ０２　同ページ中下から２行目「（ブタノール」とある
ｅｒ（ｎ−ブタノール」と訂正する。 α■　明細書中箱３１ページ上から６行目［−ジクロロ
Ｊとあるを１−ジブロモ」と訂正する。 αａ　同ページ中下から４行目［融点；１９１〜１９４
℃（分解）」とあるを［融点；１９１〜１９４℃（分解
）〔日本薬局方一般試験法融点測定の項に準じて測定し
た結果は１９９〜２００℃（分解）であった。」と訂正
する。 ０５）　同ページ中下から３行目「（ブタノール」とあ
る＆　ｒ　（ｎ−ブタノール」と訂正する。 （Ｉ６）　明細、書中第３２ページ上から１行目「ヒド
ロキシアニリド、」とあるを「ヒドロキシアニリド串塩
酸塩、」と訂正する。 αη　明細書中温３３ページ上から５行目Ｆヒドロキシ
アニリド、」とあるを［ヒドロキシアニリド−塩酸塩」
と訂正する。 Ｕ　明細書中温３４ページ上から４行目「ヒドロキシア
ニリド、」とあるを［ヒドロキシアニリド・塩酸塩］と
訂正する。 四　囲ページ中下から３行目「ヒドロキシアニリド、」
とあるを［ヒドロキシアニリド・塩Ｉ佼塩」と訂正する
。 （２）　明細書中法３５ページ下から９行目［ｒ−グル
タミルＪとあるを［γ−Ｌ−グルタミル」と１１正する
。 シＤ　同ページ中下から５行目「γ−グルタミル」とあ
るを１γ−Ｌ−グルタミル」と訂正する。 ２３　明細書中箱３６ページ下から３行目ｌγ−グルタ
ミル」とあるを「γ−Ｌ−グルタミル」と訂正する。 （ハ）明細、弁中第３７ページ上から２行目「γ−グル
タ（ル」とあるを１γ−Ｌ−グルタミル」と訂ＩＦする
０ １１Ｊ４）　同ページ中下から３行目「γ−グルタミル
」とタミ」とあるを旨−Ｌ−グルタミ］と訂正する。 （７）同ページ中下から９行目「γ−グルタミル」とあ
るを［γ−Ｌ−グルタミル」と訂正する。 ｃ！Ｄ　同ページ中下から５行目「γ−グルタミル」と
あるをＦγ−Ｌ−グルタミル」と訂正する。 シ梯　同ページ中下から４行目「ｒ−グルタ」とあるを
「γ−Ｌ−グルタ」と訂正する。 （２９）明！ｌ’中第３９ページ上から７行目［チルア
ミノアニリド、」とあるを［チルアミノアニリド会二塩
酸塩、」と訂正する。 （至）　明細書中筒４１ページ上から３行目「γ−グル
タミル」とあるを［γ−Ｌ−グルタミル」と訂正する。 ＣＡ１）　四ページ中上から４行目［ヒドロキシアミノ
アニリド、」トあるを［ヒドロキシエチルアミノアニリ
ド、」と訂正する。 １３４　同ページ中上から７行目「γ−グルタミル」と
（至）同ページ中上から８行目［キシアミノアニリド」
トするヲロシシエチルアミノアニリドＪと訂正する。 （至）明細書中筒４２ページ上から３行目「γ−グルタ
ミル」とあるを［γ−Ｌ−グルタミル」と訂正する。 （ト）　同ページ中上から７行目「γ−グルタミル」と
あると「γ−Ｌ−グルタミルＪと訂屯する。 Ｇ１６１　明４＋１１７１中第４３ページ上から４行目
［キシノール」トある全１キシレノール」と訂正する。 ６ｎ　同ページ中下から６行目「γ−グルタミル」とア
ルヲ［γ−Ｌ−グルクミル］と訂正する。 ■　同ページ中下から２行目「γ−グルクミル」とアル
ヲ［γ−Ｌ−多゛ルタミルＪと訂正Ｊる。 １）明細書中＠４４ページ上から２行目［γ−グ刀・タ
ミ］とあるを［γ〜Ｌ−グルタミＩし」と訂正する。 ＋４Ｇ　同ページ中上から５行目［ｒ−グルタミル」を
あるをγ−Ｌ−クルタミル」と訂正する。 を「γ−Ｌ−グルタ」と訂正する。 （Ｑ　同ページ中下から６行目［ヒドロキシアニリドニ
」トするを［ヒドロキシエチルアミノアニ」と訂正する
。 ０騰　同ページ中下から３行目「γ−グルタミル」とあ
るを［γ−Ｌ−グルタミル］と訂正する。 （財）本願の特許請求の範囲を別紙のとおり訂正する。 （Ｉ）　ロイシンアミノペプチダーゼまｆＣけｒ−グル
タミルトランスペプチダーゼを含有する被検液中のロイ
シンアミノペプチダーゼまｆｒ−ｕｒ−グルタミルトラ
ンスペプチダーゼの酵素活性の測定において、一般・式 （式中、Ｒ８はＬ−ロイシ△基またはｒ−Ｌ−グルタミ
ル基を示し、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ，％　Ｒ，およびＲ６は各
々水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、低級アル
コキシ基、アミ７基、置換アミノ基、水酸基、カルボキ
シル基またはスルホ基を示し、ＲｓおよびＲ６は一緒に
て里を形成してもよい）で表わされるアミド化合物また
はその水溶性塩に該被検液、フェリシアン化カリウム、
およびカブｔ−ｔ−共存させて酸化縮合を一段で打込、
生成する発色化合物を比色定力上することｔ−特徴とす
る酵素活性の測定法。 （２）　アミド化合物がＬ−ロイシル−３，５−ジ／Ｓ
ロゲノー４−ヒドロキシアニリドである特許請求の範囲
第１項記載の測定法。 （３）Ｌ−ロイシル−３，５−シバ四ゲノー４−ヒドロ
キシアニリドがＬ−目イシルー３，５−ジブロモー４−
ヒドロキシアニリドまたはＬ−ロイシル−３，５−ジク
ロロ−４−ヒドロキシアニリドである特許請求の範囲第
２項記載の測定法。 （４）　アミド化合物が一般式 （式中Ｒ８，Ｒ２は低級アルキル基を示し、Ｒ，は水素
又は低級アルキル基金示す。）で衣わされるＬ−ロイシ
ル−ｐ−アミノアニリド誘導体である特許請求の範囲第
１項記載の６１１ｊ定法。 （５）Ｌ−ロイシル−ｐ−アミノアニリド誘導体が、Ｌ
−ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノアニリド、Ｌ
−ロイシル−２−メチル−４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノ
アニリド、Ｌ−ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ
アニリドまたはＬ　−ロイシル−４−ジ−ｎ−プロビル
アミノアニリドである特許請求の範囲第４項記載の測定
法。 （６）　アミド化合物が一般式 （Ｒはカルボキシル基又はスルホ基を示す。）で表わさ
れるＬ−ロイシル−４−ヒドロキシアニリド肪導体であ
る特許請求の範囲第１項記載の測定法。 （７）　Ｌ−ロイシル−４−ヒドロキシアニリド誘導（
１（、Ｌ−ロイシル−３−カルボキシ−４−ヒドロキシ
アニリドまたは、Ｌ−ロイシル−３−スルホ−４−ヒド
ロキシアニリドである特許請求の範囲第６項記載の測定
法。 （８）　アミド化合物がｒ−Ｌ−グルタミル−３，５−
ジバログノ−４−ヒドロキシアニリドであるノ１ケ許請
求の範囲第１項記載の測定法。 （９）ｒ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジハロゲノ−４−
ヒドロキシアニリド力（γ−Ｌ−グルタミルー３．５−
ジブロモ−４−ヒドロキシアニリドまたはγ−Ｌ−グル
タミルー３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリドで
ある特許請求の範囲第８項記載の測定法。 θα　アミド化合物が一般式： で示されるγ−Ｌ−グルタミルーｐ−アミノア＝リド誘
導体である特許請求の範囲第１項記ｉ１２の測定法。 αυ　γ−Ｌ−グルタミルーｐ−アミノアニリドーシ導
体が、ｒ一旦−グルタミル−４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミ
ンアニリド、γ−Ｌ−グルタミルー４−　Ｎ、Ｎ−ジエ
チルアミノアニリド、γ−Ｌ−グルタミルー４−　Ｎ、
Ｎ−ジエチルアミノアニリド、ｒ−Ｌ−グルタミル−〇
−メチルー４−Ｎ。 Ｎ−ジエチルアミノアニリドまｆｃは、γ−Ｌ　−グル
タミル−４−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアミノ
アニリドである％ｒｆ請求の範囲第１０項記載の測定法
。 （１２アミド化合物が、γ−Ｌ−グルタミルー４−ヒド
ロキシアニリド誘導体である％＃’Ｆ詩求の範囲第１項
記載の測定法。 （１３１γ−Ｌ−グルタルー４−ヒドロシキアニリド誘
導体が、γ−Ｌ−グルタミルー３−カルボキシ−４−ヒ
ドロキシアニリドであるＩＰ’Ｆ　Ｏ’ｆ　＝ｒｔ　矛
の範囲第１２項記載の測定法。 手続補正書 昭和５９年　９月２７日 特許庁長官　殿 工、事件の表示 昭和５８年　特許願　第　８２４９３号２、発明の名称 新規な酵素活性の測定法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　静岡県田方郡大仁町三福６３２番地の１氏名　東
洋ｍＷ株式会社　（ばか１名）４、代理人　の１７０ 東京都豊島区北大塚２−１６−９ 昭和５９年８月２４日（発送８５９年８月２８日）６、
補正の対象 昭和５９年７月１８日付、提出の手続補正書の差出書。 ７、補正の内容 手続補正書 昭和５９年７月／　ｆ　ｌ：１ 特許庁長官　殿 １、事件の表示 昭和５８年　特許願　第　８２４９３号２、発明の名称 新規な酵素活性の測定法 ３、ネｌＩｉ正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　静岡県田方郡大仁町三福６３２番地の１氏名　東
洋醸造株式会社　（ばか１名）４、代理人　＠１７０ 東京都豊島区北大塚２−１６−９ 自発補正 ６、補正の対象 （１）特許請求の範囲の項。 （２）　発明の詳細な説明の項。 （３）図面の簡単な説明の項。 ７、補正の内容 別紙の通り

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）　ロイシンアミノペプチダーゼまたはγ−グルタ
   ミルトランスペプチダーゼを含有する被検液中のロイシ
   ンアミノペプチダーゼまたはγ−グルタミルトランスペ
   プチダーゼの酵素活性の測定において、一般式 （式中、Ｒ１はＬ−ロイシン基またけγ−Ｌ−グルタミ
   ル基を示［７、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は各
   々水素原子、・・ロゲン原子、低級アルキル基、低級ア
   ルコキシ基、アミン基、置換アミン基、水酸基、カルボ
   キシル基またはスルホ基を示し、Ｒ５およびＲ６は一緒
   にて炭素環を形成してもよい）で表わされるアミド化合
   物またはその水溶性塩に該被検液、フェリシアン化カリ
   ウム、およびカプラーを共存させて酸化縮合を一段で行
   い、生成する発色化合物を比色電縫することを特徴とす
   る酵素活性の測定法。
2. （２）　アミド化合物がＬ−ロイシル−３，５−ジハロ
   ゲノ−４−ヒドロキシアニリドである時訂言青求の範囲
   ＠１項記載の測定法。
3. （３）Ｌ−ロイシル−３，５−ジハロゲノ−４−ヒドロ
   キシアニリドがＬ−口イシル−３，５−シフコモ−４−
   ヒドロキシアニリドまたけＬ−ロイシル−３，５−ジク
   ロロ−４−ヒドロキシアニリドである特許請求の範囲第
   ２項記載の測定法。
4. （４）アミド化合物が一般式 （式中Ｒ，、ｉｔ２け低級アルギル基を示い１え。 け水素又は低級アルギル基を示す。）で表わされるＬ−
   口イシル−ｐ−アミノアニリド誘導体である特許請求の
   範囲第１項記載の測定法。
5. （５）Ｌ−ロイシル−ｐ−アミノアニリド誘導体が、Ｌ
   −ロイシル−４−Ｎ、Ｎ　−ジエチルアミンアニリド、
   し−口イシル−２−メチル−４−Ｎ、Ｎ　−ジエチルア
   ミノアニリド、Ｌ−ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−ジメチルア
   ミノアニリドまたはＬ−ロイシル−４−ジ−ｎ−プロピ
   ルアミノアニリドである特許請求の範囲第４項記載の測
   定法。
6. （６）　アミド化合物が一般式 （Ｒｉ−ｊカルボキシル基又はスルホン酸基を示す。）
   で表わされるし一ロイシルー４−ヒドロキシアニリド誘
   導体である％針請求の範囲第１項記載の測定法。
7. （７）　Ｌ−口イシル−４−ヒドロキシアニリド誘導体
   が、Ｌ−口イシル−３−カルボキシ−４−ヒドロキシア
   ニリドまたは、Ｌ−ロインルー３−スルホ−４−ヒドロ
   キシアニリドであるｑ寺「十「ｈ求の範囲第６項一戦の
   測定法。
8. （８）　アミド化合物が７・−Ｌ−グルタミル−３，５
   −ジハロゲノ−４−ヒドロキシアニリドである特許請求
   の範囲第１項記載の測定法。
9. （９）　γ−Ｌ−グルタミルー３，５−ジハロゲノ−４
   −ヒドロキシアニリドがγ−Ｌ−グルクミルー３．５−
   ジブロモ−４−ヒドロキシアニリドま／こけγ−Ｌ−グ
   ルタミルー３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド
   である特許請求の範囲第８項記載の測定法。
10. （１０）　アミド化合４ジηが一般式：で示されるγ−
    グルタミルーｐ−アミノアニリド誘導体である特許請求
    の範囲第１項記載の測定法。 ａυ　γ−Ｌ−グルタミルーｐ−アミ、ノアニリド誘導
    体が、γ−グルタミルー４　＝Ｎ、Ｎ−ジメチルアミン
    アニリド、γ−Ｌ−グルタミルー４−Ｎ。 Ｎ−ジエチルアミノアニリド、γ−Ｌ−グルタミルー４
    −　Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノアニリド、γ−Ｌ−グルタ
    ミルー〇−メチルー４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノアニリ
    ドまたは、γ−Ｌ−グルタミルー４−Ｎ−エチル−Ｎ−
    ヒドロキシエチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアニリドであ
    る特許請求の範囲第１０項記載の測定法。 （Ｘ２）　アミド化合物が、Ｌ−γ−グルタミルー４−
    ヒドロキシアニリド誘導体である％計請求の範囲第１項
    記載の測定法。 ｏ３＋　Ｌ−γ−グルタルー４−ヒドロシキアニリド誘
    導伝が、Ｌ−γ−グルタミルー３−カルボギシー４−ヒ
    ドロキシアニリドである特許請求の範囲第１２項記載の
    測定法。