JPH0418840B2

JPH0418840B2 -

Info

Publication number: JPH0418840B2
Application number: JP8249383A
Authority: JP
Inventors: Kunio Matsumoto; Hideo Misaki; Akira Ootsuka; Seiji Takahashi
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1983-05-13
Filing date: 1983-05-13
Publication date: 1992-03-27
Also published as: JPS6047697A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、式一般式（式中、R₁はＬ−ロイシル基またはγ−Ｌ−グ
ルタミル基を示し、R₂、R₃、R₄、R₅およびR₆は
各々水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、
低級アルコキシ基、アミノ基、置換アミノ基、水
酸基、カルボキシル基またはスルホン酸基を示
す）で表わされるアミド化合物またはその水溶性
塩を合成基質とする被験中のペプチダーゼの新規
な活性測定法に関する。

ペプチダーゼは一般的にはペプチドのペプチド
結合に作用してアミノ末端から切断してアミノ酸
またはより低級のペプチドを遊離させる酵素の総
称として古くから知られている。例えばロイシン
アミノペプチダーゼ（臨床化学においてTrue
LAPともいう）やアリルアミダーゼ（臨床化学
においてClinical LAPともいう、以下時として
AAと称する）などのアミノペプチダーゼ（以下
True LAPとClinical LAPを併せて単にLAPと
称する）シスチンアミノペプチダーゼ、プロリン
アミノペプチダーゼ、アルギニンアミノペプチダ
ーゼ、アラニンアミノペプチダーゼ、γ−グルタ
ミルトランスペプチダーゼ（γ−GTP）などが
知られている。

上記酵素のうち、特にロイシンアミノペプチダ
ーゼ（LAP）やγ−グルタミルトランスペプチ
ダーゼ（γ−GTP）は、生体内のあらゆる組織
に広く分布し、血清中にも存在しており、病的条
件によつて増加することが知られており、臨床検
査上重要な酵素活性測定項目の対称となつている
酵素であり、そのLAP活性測定法、γ−GTP活
性測定法も種々報告されている。

例えば、それらの大部分は合成基質よりLAP
によつて遊離されるアミン化合物を比色定量する
ことによりLAP活性値を求める方法であつて、
これに用いる合成基質としてＬ−ロイシル−ｐ−
ニトロアニリドを用い、LAPの酵素作用により
生成するｐ−ニトロアニリンの黄色を比色定量す
る方法が挙げられるが、この比色定量の際、その
合成基質の呈色波長がオーバー・ラツプする欠点
があり、また血清成分、特にビリルビン形色素に
よる測定の影響も免れることが出来ない欠点があ
つた。さらに、合成基質としてＬ−ロイシル−β
−ナフチルアミドを用いる方法が挙げられるが、
この方法では生成するβ−ナフチルアミンに５−
ニトロ−２−アミノメトキシベンゼンアゾテート
などをカツプリングさせて色素を形成させるかあ
るいは生成するβ−ナフチルアミンを亜硝酸ナト
リウムでジアゾ化し、Ｎ−（１−ナフチル）−エチ
レンシアミンにカツプリングさせるか、もしくは
ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドまたはｐ−
ジメチルアミノシンナムアルデヒドを縮合させて
色素を形成せしめ、次いでこれを比色定量する方
法であるが、反応過程が複雑で、かつ厳密な操作
を必要とするため、検査法として尚不便であるば
かりでなく、標準物質たるβ−ナフチルアミンの
毒性が著しく、近年膀胱の腫瘍や癌を発生するこ
とが明らかとなつたゝめ、発癌物質として、その
使用に特に厳密な注意を用いるなどの欠点があつ
た。

又、Ｌ−ロイシル−ｐ−アミノアニリド誘導体
あるいは、Ｌ−ロイシル−４−ヒドロキシアニド
誘導体を合成基質として用い、LAPによつて遊
離されるアミン化合物を、カプラーを共存させ、
化学的酸化剤を用いて酸化縮合して生成する色素
を比色定量して測定する方法（特公昭54−32359
号公報）も報告された又実用化されているが、こ
れまでの方法はすべて二段反応である為、操作が
煩雑で測定に長時間を要するなどの点で自動分析
におけるレイトアツセイ法としては実用性に欠け
ていた。

また、γ−GTP活性の測定法も多数報告され
ているが、それらの大部分は合成基質よりγ−
GTPによつて遊離されるアミン化合物を比色定
量することによりγ−GTP活性値を求める方法
であつて、それを用いる合成基質としてγ−Ｌ−
グルタミル−ｐ−ニトロアニリドを用い、γ−
GTPの酵素作用により生成するｐ−ニトロアニ
リンの黄色を410nｍで比色定量する方法が挙げ
られるが、血清成分、特にビリルビン系色素など
の影響を避けるため、各検体に対して検体ブラン
クを厳密に測定しなければならず、正確な測定値
を得ることが困難であるという欠点があつた。ま
た生成するｐ−ニトロアニリンをｐ−ジメチルア
ミノシンナムアルデヒド、ｐ−ジメチルアミノベ
ンズアルデヒドなどのアルデヒド化合物と縮合さ
せて長波長側の赤色で測定する方法も挙げられる
が、発色感度に対する温度の影響が大きく、測定
値の再現性に問題があつた。また生成するｐ−ニ
トロアニリンをジアゾ化し、３，５−キシレノー
ルと縮合させて生ずる赤色を測定する方法が提案
されたが反応操作段階で多く簡便性に欠けるとい
う欠点があつた。さらに合成基質としてγ−Ｌ−
グルタミル−β−ナフチルアミドを用いれ方法が
挙げられるが、これらの方法としてγGTPにより
遊離したβ−ナフチルアミンをジアゾニウム塩と
して比色定量する方法、３−メチル−２−ベンゾ
チアゾリノンヒドラゾンと酸化剤で発色させて比
色定量する方法、または前記アルデヒド化合物を
発色剤として縮合させて比色定量する方法がある
が、前記と同様β−ナフチルアミンの発癌性が一
般に指摘されているところであり、操作が煩雑で
測定に長時間を要するなどの点で実用性に欠けて
いる。又、Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−アミノアニ
リド誘導体やＬ−γ−グルタミル−４−ヒドロキ
シアニリド誘導体を合成基質として用い、γ−
GTPによつて遊離されるアミン化合物を、カプ
ラーを共存させ、化学的酸化剤を用いて酸化縮合
して生成する色素を比色定量して測定する方法も
報告され実用化されているが、これまでの方法は
すべて二段反応である為、操作が煩雑で測定に長
時間を要するなどの点で、自動分析におけるレイ
トアツセイ法としては実用性に欠けている。

本発明者らは、かゝる欠点を有する従来の
LAPやγ−GTP活性測定法を改良すべく鋭意研
究を続けた結果、LAPやγ−GTP活性測定にお
いて、化学的酸化剤の代りに、酸化縮合を行なわ
せる酵素、例えば、アスコルビン酸オキシダーゼ
やラツカーゼなどを用いる方法を見い出し、一段
階反応で簡便にLAPやγ−GTP活性測定が行な
える。すなわち、レイトアツセイ法をなし得るこ
とを完成した（特願昭57−198862号）。

更に、本発明者らは、酸化縮合反応を詳細に検
討した結果、通常、過ヨウ素酸ナトリウム、次亜
塩素酸ナトリウム、過マンガン酸カリウムなどの
化学的酸化剤は酵素活性を失なわせる作用を有し
ているが、全く意外にも、化学的酸化剤のうち、
フエリシアン化カリウムのみがLAP、γ−GTP
を阻害しない事を見い出した。しかも、フエリシ
アン化カリウムとカプラー共存下で、１段階で
LAP、γ−GTPが測定できる、すなわち、レイ
トアツセイ法が行なえる事を見い出し、本発明を
完成したものである。

フエリシアン化カリウムの様な酸化剤は、通
常、酵素活性を失なわせる作用を有しているの
で、フエリシアン化カリウム存在下での酵素反応
は考えられない事であつた。

フエリシアン化カリウムの濃度は、LAP活性
測定の場合、0.1〜２ｍＭが良好で、特に0.25〜
１ｍＭが好適であるが、又、γ−GTP活性測定
の場合、0.1〜２ｍＭが良好で、特に、0.5〜１ｍ
Ｍが好適であることを見い出した。

本発明はアミド化合物〔〕またはその塩に、
被験液に含有されているペプチダーゼを、（式中、R₁はＬ−ロイシル基またはγ−Ｌ−グ
ルタミル基を示し、R₂、R₃、R₄、R₅およびR₆は
各々水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、
低級アルコキシ基、アミノ基、置換アミノ基、水
酸基カルボキシル基またはスルホン酸基を示す）
フエリシアン化カリウムとカプラー共存下で、一
段反応を行い、生成する発色化合物を比色定量す
る事を特徴とする測定法である。

本発明においてペプチダーゼの合成基質として
用いられるアミド化合物〔〕は、ペプチド合成
の常法によつて製造することができる。即ち、Ｌ
−ロイシンのα−カルボキシル基やＬ−グルタミ
ン散のγ−カルボキシル基とアニリン誘導体
〔〕との縮合反応により得られる。

上記の縮合反応に際しては、予め反応に関与し
てはならない官能基、即ちＬ−ロイシンのα−ア
ミノ基やＬ−グルタミン酸のα−アミノ基および
α−カルボキシル基を保護するのがよい。α−ア
ミノ基の保護基としては通常ペプチド合成に用い
られるα−アミノ保護基が用いられる。例えばｔ
−ブチルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカ
ルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニト
ロベンジルオキシカルボニル、アダマンタチルオ
キシカルボニル、ｏ−ニトロフエニルチオ基など
が挙げられる。Ｌ−グルタミン酸のα−カルボキ
シル基はメチルエステル、エチルエステル、ｔ−
ブチルエステル、ベンジルエステル、ｐ−ニトロ
ベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステ
ルなどで保護するのが好ましいが、脱離の際α−
アミノ基の保護基と共に一段階で脱離される条件
で脱離されるような保護基で保護するのが特に好
ましい。例えばα−アミノ基をベンジルオキシカ
ルボニル基、α−カルボキシル基をベンジルエス
テルで保護するのがその一例である。

上記縮合反応に用いるアニリン誘導体〔〕の（式中、R₂、R₃、R₄、R₅およびR₆は前記と同じ
意味を有する）例としては、３，５−ジブロモ−４−ヒドロキ
シアニリン、３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシ
アニリン、３−クロロ−５−ブロモ−４−ヒドロ
キシアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−フエニレ
ンジアミレ、２−メチル−４−ジエチルアミノア
ニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−フエニレンジア
ミン、Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−プロピル−ｐ−フエニレ
ンジアミン、５−アミノサリチル酸、３−スルホ
−４−ヒドロキシアニリンなどが挙げられる。

上記の縮合反応は、α−アミノ基が保護された
Ｌ−ロイシンのα−カルボキシル基またはα−ア
ミノ基およびα−カルボキシル基が保護されたＬ
−グルタミン酸のγ−カルボキシル基を酸ハライ
ド、酸無水物、酸アジド、酸イミダゾリド、活性
エステル、例えばシアノメチルエステル、ｐ−ニ
トロフエニルエステル、２，４−ジニトロフエニ
ルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル、Ｎ−ヒドロキシフタルイミドエステルなど
の活性化アシル誘導体に変換してアニリン誘導体
〔〕と反応させるか、あるいはカルボジイミド、
例えばＮ，N′−ジシクロヘキシルカルボジイミ
ド、Ｎ，N′−カルボニルイミダゾール、イソオ
キサゾリウム塩、例えばウツドワード試薬などの
縮合剤の存在下上記の保護されたＬ−ロイシンま
たはＬ−グルタミン酸とアチリン誘導体〔〕を
反応させることにより行われる。

上記の縮合反応においては、通常不活性有機溶
媒、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルアセ
トイアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒド
ロフラン、ジオキサン、ベンゼン、クロロホル
ム、ジクロロメタン、ジクロロエタンなどの溶媒
中、両者ほぼ等量を加え、室温またはそれ以下の
温度で反応させることにより行われる。上記の反
応経過はシリカゲルなどの薄層クロマトグラフイ
ー（TLC）、高速液体クロマトグラフイー
（HPLC）などにより追跡できるので、出発物質
のいずれかの消失を待つて適宜反応を終了すれば
よい。

このようにして得られた反応生成物は、反応溶
媒を留去するかまたは留去することなく、非親水
性有機溶媒、例えばクロロホルム、ジクロロメタ
ン、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルイソブチル
ケトン、ベンゼン、ジエチルエーテルなどに溶か
し、酸性水およびアルカリ性水で洗浄した後、溶
媒を留去することにより採取できる。さらに精製
する必要がある場合には、適当な再結溶媒で再結
晶化するか、あるいはシリカゲル、活性アルミ
ナ、吸着樹脂などの吸着剤を用いるカラムクロマ
トグラフイーにより精製することができる。

次いで得られた反応生成物の保護基を脱離する
のであるが、この脱離化はペプチド化学における
保護基の脱離法を用いて行われる。例えばα−ア
ミノ保護基がｔ−ブチルオキシカルボニル基であ
る場合には、2N塩化水素の酢酸溶液、トリフル
オロ酢酸、ギ酸などを用いる方法、ベンジルオキ
シカルボニル基である場合には、パラジウム−炭
素触媒を用いる接触還元により方法、臭化水素酸
の酢酸溶液を用いる方法により行えばよい。Ｌ−
グルタミン酸のα−カルボキシル基の保護基がベ
ンジルエステルである場合には、パラジウム−炭
素触媒を用いる接触還元による方法で行えばよ
い。

このようにして得られたアミド化合物〔〕を
反応液から採取するには、先ず保護基の脱離化が
酸分解による場合には、中和し、接触還元による
場合には触媒を除去した後、非親水性有機溶媒、
例えばクロロホルム、ジクロロメタン、ジクロロ
エタン、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルイソブ
チルケトン、ベンゼン、ジエチルエーテルなどの
溶媒中、酸性水およびアルカリ性水で洗浄した
後、溶媒を留去することにより採取できる。さら
に精製する必要がある場合には、適当な再結溶媒
で再結晶化するか、あるいはシリカゲル、活性ア
ルミナ、吸着樹脂などの吸着剤を用いるカラムク
ロマトグラフイーにより精製することができる。

このようにして得られたアミド化合物〔〕の
好ましい化合物を例示すれば、Ｌ−ロイシル−
３，５−ジハロゲノ−４−ヒドロキシアニリド、
例えばＬ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒ
ドロキシアニリド、Ｌ−ロイシル−３，５−ジク
ロロ−４−ヒドコキシアニリドなどが挙げられ、
また下記一般式（式中R₇、R₈は低級アルキル基を示し、R₉は水
素原子または低級アルキル基を示す）で表わされ
るＬ−ロイシル−ｐ−アミノアニリド誘導体、例
えばＬ−ロイシル−４−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ
アニリド、Ｌ−ロイシル−２−メチル−４−Ｎ，
Ｎ−ジエチルアミノアニリド、Ｌ−ロイシル−４
−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアニリド、Ｌ−ロイシ
ル−４−ジ−ｎ−プロピルアミノアニリドなどが
挙げられ、さらに下記一般式（式中、R₁₀はカルボキシル基またはスルホン酸
基を示す）で表わされるＬ−ロイシル−４−ヒド
ロキシアニリド誘導体、例えばＬ−ロイシル−３
−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリド、Ｌ−ロ
イシル−３−スルホ−４−ヒドロキシアニリドな
どが挙げられ、また、γ−Ｌ−グルタミル−３，
５−ジハロゲノ−４−ヒドロキシアニリド、例え
ばγ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４−
ヒドロキシアニリド、γ−Ｌ−グルタミル−３，
５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリドなどが挙
げられ、さらに下記一般式（式中、R₁₁、R₁₂は水酸基を有してもよい低級
アルキル基を示し、R₁₃は水素原子、低級アルキ
ル基、カルボキシル基またはスルホン酸基を示
す）で表されるγ−Ｌ−グルタミル−ｐ−アミノ
アニリド誘導体、例えばγ−Ｌ−グルタミル−４
−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアニリド、γ−Ｌ−グ
ルタミル−４−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノアニリ
ド、γ−Ｌ−グルタミル−４−Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−
プロピルアミノアニリド、γ−Ｌ−グルタミル−
ｏ−メチル−４−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノアニリ
ド、γ−Ｌ−グルタミル−４−Ｎ−エチル−Ｎ−
ヒドロキシエチルアミノアニリドなどが挙げら
れ、またγ−Ｌ−グルタミル−４−ヒドロキシア
ニリド誘導体、例えばγ−Ｌ−グルタミル−３−
カルボキシ−４−ヒドロキシアニリドが挙げられ
る。

本アミド化合物〔〕は必要に応じ、塩酸、硫
酸、硝酸、リン酸などの無機酸との塩、ギ酸、酢
酸、プロピオン酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石
酸、シユウ酸などの有機酸との塩を形成すること
ができる。

次に、本アミド化合物〔〕を用いるペプチダ
ーゼ活性測定法について述べる。本測定法におい
ては、上記アミド化合物〔〕またはその塩に被
験液に含有されているペプチザーゼ、特にLAP
またはγ−GTPを、フエリシアン化カリウムと
カプラー共存下で、一段反応を行い、生成する発
色化合物を比色定量するものである。使用するカ
プラーとしては、アニリン誘導体〔〕と酸化縮
合して発色化合物を形成する芳香族化合物であれ
ば、どのような化合物でもよいが、これらのうち
代表的な芳香族化合物としてはフエノール系化合
物、アミノフエノール系化合物、アニリン系化合
物またはナフトール系化合物が挙げられる。フエ
ノール系化合物の例としては、フエノール、サリ
チル酸、ｍ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキ
シ安息香酸、２，６−ジヒドロキシ安息香酸、サ
リチル酸メチル、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾー
ル、ｐ−クレゾール、ｏ−エチルフエノール、ｍ
−エチルフエノール、２，３−キシレノール、
２，４−キシレノール、２，５−キシレノール、
３，５−キシレノール、２，６−キシレノール、
ｏ−メトキシフエノール、ｍ−メトキシフエノー
ル、ｐ−メトキシフエノール、２，６−ジメトキ
シフエノール、ｏ−クロロフエノール、ｍ−クロ
ロフエノール、ｐ−クロロフエノール、２，４−
ジクロロフエノール、２，６−ジクロロフエノー
ル、ｐ−ブロモフエノール、ｍ−ブロモフエノー
ル、ｐ−グロモフエノール、２，４−ジブロモフ
エノール、２，６−ジブロモフエノール、２−メ
チル−６−クロロフエノール、２−クロロ−５−
メチルフエノール、ｏ−カルボキシメチルフエノ
ール、２−ヒドロキシ−４−アミノエチルフエノ
ールなどが挙げられ、アミノフエノール系化合物
の例としては、４−クロロ−２−アミノフエノー
ル、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｍ−アミノフエノール、
４−メチル−２−アミノフエノール、５−アミノ
−２−ヒドロキシ安息香酸、２−アミノ−３−ヒ
ドロキシ安息香酸、ｏ−アミノフエノール、ｍ−
アミノフエノール、ｐ−アミノフエノールなどが
挙げられ、アニリン系化合物の例としては、アニ
リン、ｏ−トルイジン、ｍ−トルイジン、ｐ−ト
ルイジン、Ｎ−メチルアニリン、Ｎ−エチルアニ
リン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジエ
チルアニリン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｏ−トルイジ
ン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−ｐ−トルイジン、Ｎ，Ｎ
−ジエチル−ｏ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル
−ｍ−トルイジン、Ｎ，Ｎ−ジエチル−ｐ−トル
イジン、ｏ−クロロアニリン、ｍ−クロロアニリ
ン、ｍ−ブロモアニリン、アントラニン酸、３−
アミノ安息香酸、ｐ−ジメチルアミノ安息香酸、
ｐ−クロロ−ｏ−トルイジン、３−アミノ−４−
メチル安息香酸、ｍ−フエニレンジアミン、Ｎ，
Ｎ−ジメチル−ｍ−フエニレンジアミン、２−メ
チル−ｍ−フエニレンジアミン、４−メチル−ｏ
−フエニレンジアミン、４−メチル−ｍ−フエニ
レンジアミン、２−クロロ−ｍ−フエニレンジア
ミン、３−クロロ−ｏ−トルイジン、２−メトキ
シ−５−クロロアニリン、ｏ−エチルアニリン、
２，５−ジエトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−
ヒドロキシエチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−ヒ
ドロキシエチル−ｍ−トルイジンなどが挙げら
れ、ナフトール系化合物の例としてはα−ナフト
ール、β−ナフトール、２−カルボキシ−１−ナ
フトール、４−クロロ−１−ナフトール、１−ヒ
ドロキシ−２−ナフトエ酸、１−ナフトール−２
−スルホン酸、１−ナフトール−３−スルホン
酸、１−ナフトール−４−スルホン酸、２−ナフ
トール−６−スルホン酸、２−ナフトール−３，
６−ジスルホン酸などが挙げられる。

上記の酵素反応及び酸化縮合反応は、この反応
の至適PHは6.5〜8.0の範囲にあるから、この範囲
内で適宜PHを設定すればよい。PHを保持するため
の緩衝液としては、リン酸塩、バルビタール、ホ
ウ酸塩、トリスヒドロキシメチルアミノメタンな
どの緩衝液が用いられる。

アニリン誘導体〔〕と上記カプラーとの酸化
縮合により生成する発色化合物は、カプラーの種
類により極大吸収波長が約550−770nｍに巾広く
分布するが、通常は殆んど570〜680nｍに極大吸
収を有する有色系色素であり、呈色も極めて高感
度で安定性も良く、しかも温度による変動も殆ん
どなく、生体試料中のビリルビンなどの夾雑物に
よる影響も受けにくいため、正の誤差も殆んど受
けることがないので、LAPやγ−GTPなどのペ
プチダーゼ活性測定に極めて好結果を与える。

次に、LAPの活性測定について更に詳しく説
明する。LAPの活性測定を行うに当つては、先
ずLAPの合成基質であるＬ−ロイシル−３，５
−ジハロゲノ−４−ヒドロキシアニリドに被験液
中のLAPを、フエリシアン化カリウムとカプラ
ー共存下で一段反応（酵素反応）を行い、生成す
る発色化合物を比色定量すればよい。被験液とし
ては血清を0.01〜５mlの範囲内で用いられる。上
記酵素反応は通常37℃付近で５分以上反応させれ
ばよい。この反応の至適PHは6.5〜8.0の範囲にあ
るから、この範囲内で適宜PHを設定すればよい。
PHを保持するための緩衝液としては、リン酸塩、
バルビタール、ホウ酸塩、トリスヒドロキシメチ
ルアミノメタンなどの緩衝液が用いられる。カプ
ラーとしては、例えば、ｐ−キシレノールや１−
ナフトール−２−スルホン酸などが用いられる。

又、フエリシアン化カリウムの濃度は、通常
0.1ｍＭ〜２ｍＭの範囲、好適量としては0.25〜
１ｍＭであり、此の範囲で使用すれば充分であ
る。

次にγ−GTPの活性測定について更に詳しく
説明する。γ−GTPの活性測定を行うに当つて
は、先ずγ−GTPの合成基質であるγ−Ｌ−グ
ルタミル−３，５−ジハロゲノ−４−ヒドロキシ
アニリドに被検液中のγ−GTPを、フエリシア
ン化カリウムとカプラー共存下で、一段反応（酵
素反応）を行い、生成する発色化合物を比色定量
すればよい。被験液としては血清を0.01〜５mlの
範囲内で用いられる。上記酵素反応は通常37℃付
近で５分以上反応させればよい。この反応の至適
PHは7.5〜9.0の範囲にあるから、この範囲内で適
宜PHを設定すればよい。反応に際しては受容体と
してアミノ酸やペプチド、例えばグリシルグリシ
ンの適当量を含むPH7.5〜9.0の緩衝液中で反応さ
せればよい。PHを保持するための緩衝液として
は、リン酸塩、バルビタール、ホウ酸塩、炭酸
塩、トリエタノールアミン、グリシン、トリスヒ
ドロキシメチルアミノメタンなどの緩衝液が用い
られる。カプラーとしては、例えば、ｐ−キシレ
ノールや１−ナフトール−２−スルホン酸などが
用いられる。

又、フエリシアン化カリウムの濃度は、通常
0.1ｍＭ〜２ｍＭの範囲、好適量としては、0.5〜
１ｍＭであり、此の範囲で使用すれば充分であ
る。

前記したように本発明の合成基質を用いる測定
法は、各反応工程が簡便なため、速やかに且つ正
確なLAP、γ−GTPなどのペプチダーデ活性値
を測定することができるばかりでなく、生成する
発色化合物が通常550〜750nｍ附近に極大吸収を
有するため、生体試料中の夾雑物による影響を受
けにくく、ペプチダーゼ活性測定が精度の高い方
法である。

又、フエリシアン化カリウムの様な酸化剤は、
通常酵素活性を失なわせる作用を有している。そ
こで、フエリシアン化カリウム存在下での酵素反
応は考えられない事であつた。

本発明方法は、酸化縮合剤として用いるフエリ
シアン化カリウムが、以外にも、LAPやγ−
GTPを阻害しないことを見い出して完成したも
のであり、しかも一段反応で簡便にLAPやγ−
GTPの酵素活性測定がなし得るものである上に、
測定の自動化が容易になし得るものであつて、従
来の化学的発色法の二段反応では不可能であつた
レイト・アツセウを可能にしたものである。

次に参考例および実施例を挙げて本発明を具体
的に説明するが、これにより本発明を限定するも
のではなく、また参考例は特願昭57−150701号に
記載されているものである。

尚、参考例中に記載の略記号は次の意味を有す
る。

Leu；Ｌ−ロイシルｒ−Vlu；γ−Ｌ−グルタミル BOC；ｔ−ブチルオキシカルボニル OSu；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル AcOH；酢酸参考例１Ｌ−ロイシル−３，５−ジクロロ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩２，６−ジクロロ−４−アミノフエノール1.78
ｇ（10ミリモル）および炭酸水素ナトリウム1.26
ｇ（15ミリモル）を水25mlに溶かし、これに０〜
５℃に冷却しつゝBOC−Leu−OSu3.28ｇ（10ミ
リモル）のジオキサン（25ml）溶液を攪拌下滴下
した。室温で一夜攪拌した後、30℃以下でジオキ
サンを減圧下留去した。残渣を酢酸エチル200ml
に溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、水、
1N塩酸、飽和食塩水の順で各50mlで３回づつ洗
浄した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムで
乾燥した後、減圧濃縮してBOC−Ｌ−ロイシル
−３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド
2.96ｇを得た。次いで、これを2N−HCl／
AcOH1 ５mlに溶かし、室温で２時間攪拌した
後、乾燥ジエチルエーテル100mlを加えて結晶化
し、乾燥エーテルで２回デカンテーシヨンした。
得られた結晶を減圧乾燥してＬ−ロイシル−３，
５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド・塩酸塩
を得た。

収量 1.89ｇ（収率57.7％）分子式 C₁₂H₁₆N₂O₂Cl₂・HCl 融点；127〜133℃（分解）シリカゲル薄層クロマトグラフイ（TLC）；Rf＝
0.63〔ｎ−ブタノール−酢酸−水（４：１：
１）〕参考例２Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩２，６−ジブロモ−４−アミノフエノール4.90
ｇ（13.3ミリモル）および炭酸水素ナトリウム
1.68ｇ（20ミリモル）を水70mlに溶かし、これに
０〜５℃に冷却しつつBOC−Leu−OSu6.01ｇ
（18.3ミリモル）のジオキサン（70ml）溶液を攪
拌下滴下した。室温で一夜攪拌した後、30℃以下
でジオキサンを減圧下留去した。残渣を酢酸エチ
ル400mlに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム水溶
液、水、1N塩酸、飽和食塩水の順で各100mlで３
回づつ洗浄した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネ
シウムで乾燥した後、減圧濃縮してBOC−Ｌ−
ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシア
ニリド5.8ｇを得た。次いでこれを2N−HCl／
AcOH30mlに溶かし、室温で２時間攪拌した後、
乾燥エーテルを加えて結晶化させてＬ−ロイシル
−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド・
塩酸塩を得た。

収量 2.50ｇ（収率32.8％）分子式 C₁₂H₁₆N₂O₂Br₂・HCl（416.54）シリカゲル薄層クロマトグラフイ（TLC）；Rf＝
0.65〔ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：１〕融点；131〜134℃（分解）参考例３ γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジクロロ−４−
ヒドロキシアニリドＮ，Ｎ−フタロイル−Ｌ−グルタミン酸無水物
5.16ｇ（20ミリモル）および４−アミノ−２，６
−ジクロロフエノール3.56ｇ（20ミリモル）をジ
オキサン50mlに溶かし、60℃で２時間攪拌した。
ジオキサンを減圧下留去し、残渣にヒドラジン・
ヒドラート1.5mlのメタノール（50ml）溶液を加
え、室温で２日間放置した。メタノールを減圧下
留去し、残渣に水を加えた後、0.5N−HClでPH
３に調節して析出したγ−Ｌ−グルタミル−３，
５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド3.96ｇを
得た。

収量 3.96ｇ（収率64.5％）分子式 C₁₁H₁₂O₄Cl₂ 融点；214〜217℃（分解）シリカゲルTLC；Rf＝0.49（ｎ−ブタノール：酢
酸：水＝４：１：１）参考例４ γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４−
ヒドロキシアニリドＮ，Ｎ−フタロイル−Ｌ−グルタミン酸無水物
2.18ｇ（8.4ミリモル）および４−アミノ−２，
６−ジブロモフエノール2.26ｇ（8.4ミリモル）
をジオキサン20mlに溶かし、60℃で1.5時間攪拌
した。ジオキサンを減圧下留去し、残渣にヒドラ
ジン・ヒドラート0.7mlのメタノール（20ml）溶
液を加え、室温で２日間放置した。メタノールを
減圧下留去し、残渣に水を加てた後、0.5N−
HClでPH３に調節して析出したγ−Ｌ−グルタミ
ル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド
2.13ｇを得た。

収量 2.13ｇ（収率64.0％）分子式 C₁₁H₁₂N₂O₄Br₂ 融点；191〜194℃（分離）〔日本薬局方一般試験
法融点測定の項に準じて測定した結果は199〜
200℃に（分解）であつた。〕シリカゲルTLC；Rf0.53（ｎ−ブタノール：酢
酸：水＝４：１：１）実施例１Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩、ｐ−キシレノール、フ
エリシアン化カリウムを用いるLAP活性測定
法Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩１ｍＭ、ｐ−キシレノール
５ｍＭおよびフエリシアン化カリウム0.5ｍＭを
含有する0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を調製して
基質溶液とした。此の基質溶液２mlに、LAPを
含有する患者血清（515G−Ｒ単位）20μを加え
て37℃で反応させた。又、此の反応時間ごとに反
応によつて発色する色素を585nｍの波長にて吸
光度を測定した。

その結果を第１図に示した。

又、比較の為、フエリシアン化カリウムの代り
に、化学的方法で通常使用されている酸化剤、過
ヨウ素酸カリウム0.5ｍＭを使用する以外は同様
な反応を行なつたが、第１図に示した様に、過ヨ
ウ素酸カリウムがLAP反応を阻害する為、LAP
活性測定が測定不可能であつた。

すなわち、本発明に使用した酸化剤、フエリシ
アン化カリウムは、LAP反応を阻害せず、LAP
反応が始まると同時に呈色が起る為、レイトアツ
セイが行なえる特色を有するものであつた。

実施例２Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩、１−ナフトール−２−
スルホン酸、フエリシアン化カリウムを用いる
LAP活性測定法Ｌ−ロイシル−３，５−ジブロモ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩１ｍＭ、１−ナフトール−
２−スルホン酸0.5ｍＭ、フエリシアン化カリウ
ム0.5ｍＭを含有する0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）
を調製して基質溶液とした。此の基質溶液２ml
に、LAPを含有する患者血清（515G−Ｒ単位）
20μを加えて37℃で反応させた。又、此の反応
時間ごとに反応によつて発色する色素を630nｍ
の波長にて吸光度を測定した。その結果を、第２
図に示した。此の第２図に示す通り、本発明の測
定法は、LAP活性を良好に測定する事が出来、
しかも、従来の化学発色法と異なり、反応液の呈
色がLAPの反応が始まると同時に生ずる為、レ
イトアツセイが行なえる特色を有するものであつ
た。

実施例３Ｌ−ロイシル−３，５−ジクロロ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩、ｐ−キシレノール、フ
エリシアン化カリウムを用いるLAP活性測定
法実施例１のＬ−ロイシル−３，５−ジブロモ−
４−ヒドロキシアニリド・塩酸塩の代りにＬ−ロ
イシン−３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニ
リド・塩酸塩を用いる以外は同様な方法で実施し
た。その結果を第３図に示した。此の第３図に示
す通り、本発明の測定法は、LAP活性を良好に
測定する事が出来、しかも、従来の化学発色法と
異なり、反応液の呈色がLAPの反応が始まると
同時に生ずる為、レイトアツセイが行なえる特色
を有するものであつた。

実施例４Ｌ−ロイシル−３，５−ジクロロ−４−ヒドロ
キシアニリド・塩酸塩、１−ナフトール−２−
スルホン酸、フエリシアン化カリウムを用いる
LAP活性測定法実施例２のＬ−ロイシル−３，５−ジブロモ−
４−ヒドロキシアニリド・塩酸塩の代りに、Ｌ−
ロイシル−３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシア
ニリド塩酸塩を用いる以外は、同様な方法で実施
した。

その結果を第４図に示した。此の第４図に示す
通り、本発明の測定法は、LAP活性を良好に測
定する事が出来、しかも、従来の化学発色法と異
なり、反応液の呈色がLAPの反応が始まると同
時に生ずる為、レイトアツセイが行なえる特色を
有するものであつた。

実施例５ γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４−
ヒドロキシアニリド、ｐ−キシレノール、フエ
リシアン化カリウムを用いるγ−GTP活性測
定法。

γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４−
ヒドロキシアニリド7.5ｍＭ、グリシルグリシン
100ｍＭ、ｐ−キシレノール２ｍＭ、および、フ
エリシアン化カリウム１ｍＭを含有する50ｍＭト
リスー塩酸緩衝液（PH7.9）を調製して基質溶液
とした。此の基質溶液２mlにγ−GTPを含有す
る患者血清（278ｍＵ／ml）20μを加えて37℃
で反応させた。又、此の反応時願ことに反応によ
つて発色する色素を585nｍの波長にて吸光度を
測定した。

その結果を第５図に示した。

又、比較の為、フエリシアン化カリウムの代り
に、化学的方法で通常使用されている酸化剤、過
ヨウ素酸カリウム１ｍＭを使用する以外は同様な
反応を行なつたが、第５図に示した様に、過ヨウ
素カリウムがγ−GTP反応を阻害する為、γ−
GTP活性側が測定不可能であつた。

すなわち、本発明に使用した酸化剤、フエリシ
アン化カリウム、γ−GTP反応を阻害せず、γ
−GTP反応が始まると同時に呈色が起る為、レ
イトアツセイが行なえる特色を有するものであつ
た。

実施例６ γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４−
ヒドロキシアニリド、１−ナフトール−２−ス
ルホン酸、フエリシアン化カリウムを用いるγ
−GTP活性測定法。

γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジブロモ−４−
ヒドロキシアニリド7.5ｍＭ、グリシルグリシン
10ｍＭ、１−ナフトール−２−スルホン酸0.5ｍ
Ｍ、およびフエリシアン化カリウム１ｍＭを含有
する50ｍMTris−HCl緩衝液（PH7.9）を調整し
て基質溶液とした。此の基質溶液２mlにγ−
GTPを含有する患者血清（275ｍＵ／ml）20μ
を加えて37℃で反応させた。又、此の反応時間ご
とに反応によつて発色する色素を630nｍの波長
にて吸光度を測定した。

その結果を、第６図に示した。此の第６図に示
す通り、本発明の測定法は、γ−GTP活性を良
好に測定する事が出来、しかも、従来の化学発色
法と異なり、反応液の呈色が、γ−GTPの反応
が始まると同時に生ずる為、レイトアツセイが行
なえる特色を有するものであつた。

実施例７ γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジクロロ−４−
ヒドロキシアニリド、Ｐ−キシレノール、フエ
リシアン化カリウムを用いるγ−GTP活性測
定法。

実施例５のγ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジブ
ロモ−４−ヒドロキシアニリドの代りにγ−Ｌ−
グルタミル−３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシ
アニリドを用いる以外は同様な方法で実施した。
その結果を第７図に示した。此の第７図に示す通
り、本発明の測定方法は、γ−GTP活性を良好
に測定する事が出来、しかも、従来の化学発色法
と異なり、反応液の呈色がγ−GTPの反応が始
まると同時に生ずる為、レイトアツセイが行なえ
る特色を有するものであつた。

実施例８ γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジクロロ−４−
ヒドロキシアニリド、１−ナフトール−２−ス
ルホン酸、フエリシアン化カリウムを用いるγ
−GTP活性測定法実施例６のγ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジブ
ロモ−４−ヒドロキシアニリドの代りに、γ−Ｌ
−グルタミル−３，５−ジクロロ−４−ヒドロキ
シアニリドを用いる以外は同様な方法で実施し
た。その結果を第８図に示した。此の第８図に示
す通り、本発明の測定方法は、γ−GTP活性を
良好に測定する事が出来、しかも、従来の化学発
色法と異なり、反応液の呈色がγ−GTPの反応
が始まると同時に生ずる為、レイトアツセイが行
なえる特色を有するものであつた。

実施例９Ｌ−ロイシル−４−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノア
ニリド二塩酸塩、１−ナフトール−２−スルホ
ン酸、フエリシアン化カリウムを用いるLAP
活性測定法Ｌ−ロイシル−４−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノア
ニリド二塩酸塩２ｍＭ、１−ナフトール−２−ス
ルホン酸塩0.5ｍＭ、フエリシアン化カリウム塩
0.5ｍＭを含有する0.1Mリン酸緩衝液（PH7.0）を
調製して基質溶液とした。此の基質溶液２mlに、
LAPを含有する患者血清（515G−Ｒ単位）20μ
を加えて37℃で反応させた。又、此の反応時間ご
とに反応によつて発色する色素を655nｍの波長
にて吸光度を測定した。

その結果を第９図に示した。此の第９図に示す
通り、本発明の測定方法は、LAP活性を良好に
測定する事が出来、しかも、従来の化学発色法と
異なり、反応液の呈色がLAPの反応が始まると
同時に生ずる為、レイトアツセイが行なえる特色
を有するものであつた。

実施例 10 Ｌ−ロイシル−３−カルボキシ−４−ヒドロキ
シアニリド、ｐ−キシレノール、フエリシアン
化カリウムを用いるLAP活性測定法Ｌ−ロイシル−３−カルボキシ−４−ヒドロキ
シアニリド２ｍＭ、ｐ−キシレノール５ｍＭ、フ
エリシアン化カリウム0.5ｍＭを含有する0.1Mリ
ン酸緩衝液（PH7.0）を調製して基質溶液とした。
此の基質溶液２mlに、LAPを含有する患者血清
（515G−Ｒ単位）20μを加えて37℃で反応させ
た。又、此の反応時間ごとに反応によつて発色す
る色素を575nｍの波長にて吸光度を測定した。

その結果を第１０図に示した。此の第１０図に
示す通り本発明の測定方法は、LAP活性を良好
に測定する事が出来、しかも、従来の化学発色法
と異なり、反応液の呈色がLAPの反応が始まる
と同時に生ずる為、レイトアツセイが行なえる特
色を有するものであつた。

実施例 11 γ−Ｌ−グルタミル−Ｐ−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒ
ドロキシエチルアミノアニリド、１−ナフトー
ル−２−スルホン酸、フエリシアン化カリウム
を用いるγ−GTP活性測定法 γ−Ｌ−グルタミル−Ｐ−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒ
ドロキシエチルアミノアニリド7.5ｍＭ、グリシ
ルグリシン100ｍＭ、１−ナフトール−２−スル
ホン酸0.5ｍＭおよびフエリシアン化カリウム１
ｍＭを含有する50ｍＭ Tris−HCl緩衝液（PH
7.9）を調製して基質溶液とした。此の基質溶液
２mlにγ−GTPを含有する患者血清（275ｍＵ／
ml）20μを加えて37℃で反応させた。又、此の
反応時間ごとに反応によつて発色する色素を
670nｍの波長にて吸光度を測定した。その結果
を第１１図に示した。此の第１１図に示す通り、
本発明の測定法は、γ−GTP活性を良好に測定
する事が出来、しかも、従来の化学発色法と異な
り反応液の呈色が、γ−GTPの反応が始まると
同時に生ずる為に、レイトアツセイが行なえる特
色を有するものであつた。

実施例 12 γ−Ｌ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ヒ
ドロキシアニリド、ｐ−キシレノール、フエリ
シアン化カリウムを用いるγ−GTP活性測定
法 γ−Ｌ−グルタミル−３−カルボキシ−４−ヒ
ドロキシアニリド7.5ｍＭ、グリシルグリシン100
ｍＭ、ｐ−キシレノール0.5ｍＭおよびフエリシ
ア化カリウム１ｍＭを含有する50ｍＭ Tris−
HCl緩衝液（PH7.9）を調製して基質溶液とした。
此の基質溶液２mlにγ−GTPを含有する患者血
清（275ｍＵ／ml）20μを加えて37℃で反応さ
せた。又、此の反応時間ごとに反応によつて発色
する色素を615nｍの波長にて吸光度を測定した。
その結果を第１２図に示した。此の第１２図に示
す通り、本発明の測定法は、γ−GTP活性を良
好に測定する事が出来、しかも、従来の化学発色
法と異なり、反応液の呈色が、γ−GTPの反応
が始まると同時に生ずる為に、レイトアツセイが
行なれる特色を有するものであつた。

【図面の簡単な説明】

第１図はＬ−ロイシル−３、５−ジブロモ−４
−ヒドロキシアニリド、ｐ−キシレノール、フエ
リシアン化カリウムを用いるLAP測定法と従来
法による酸化剤を用いた場合の比較、第２図はＬ
−ロイシル−３、５−ジブロモ−４−ヒドロキシ
アニリド、１−ナフトール−２−スルホン酸、フ
エリシアン化カリウムを用いるLAP活性測定法、
第３図はＬ−ロイシル−３、５−ジクロロ−４−
ヒドロキシアニリド、ｐ−キシレノール、フエリ
シアン化カリウムを用いるLAP活性測定法、第
４図はＬ−ロイシル−３、５−ジクロロ−４−ヒ
ドロキシアニリド、１−ナトール−２−スルホン
酸、フエリシアン化カリウムを用いるLAP活性
測定法、第５図はγ−Ｌ−グルタミル−３、５−
ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド、ｐ−キシノ
レール、フエリシアン化カリウムを用いるγ−
GTP活性測定法と従来法による酸化剤を用いた
場合の比較、第６図はγ−Ｌ−グルタミル−３、
５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリド、１−ナ
フトール−２−スルホン酸、フエリシアン化カリ
ウムを用いるγ−GTP活性測定法、第７図はγ
−Ｌ−グルタミル−３、５−ジクロロ−４−ヒド
ロキシアニリド、Ｐ−キシレノール、フエリシア
ン化カリウムを用いるγ−GTP活性測定法、第
８図はγ−Ｌ−グルタミル−３、５−ジクロロ−
４−ヒドロキシアニリド、１−ナフトール−２−
スルホン酸、フエリシアン化カリウムを用いるγ
−GTP活性測定法、第９図はＬ−ロイシル−４
−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノアニリド、１−ナフト
ール−２−スルホン酸、フエリシアン化カリウム
を用いるLAP活性測定法、第１０図はＬ−ロイ
シル−３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリ
ド、Ｐ−キシレノール、フエリシアン化カリウム
を用いるLAP活性測定法、第１１図はγ−Ｌ−
グルタミル−Ｐ−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエ
チルアミノアニリド、１−ナフトール−２−スル
ホン酸、フエリシアン化カリウムを用いるγ−
GTP活性測定法、第１２図はγ−Ｌ−グルタミ
ル−３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリド、
ｐ−キシレノール、フエリシアン化カリウムを用
いるγ−GTP活性測定法である。

Claims

【特許請求の範囲】１ロイシンアミノペプチダーゼまたはγ−グル
タミルトランスペプチダーゼを含有する被検液中
のロイシンアミノペプチダーゼまたはγ−グルタ
ミルトランスペプチダーゼの酵素活性の測定にお
いて、一般式（式中、R₁はＬ−ロイシル基またはγ−Ｌ−グ
ルタミル基を示し、R₂、R₃、R₄、R₅およびR₆は
各々水素原子、ハロゲン原子、低級アルキル基、
低級アルコキシ基、アミノ基、置換アミノ基、水
酸基カルボキシル基またはスルホン酸基を示す）
で表わされるアミド化合物またはその水溶性塩に
該被検液、フエリシアン化カリウム、およびカプ
ラーを共存させて酸化縮合を一段で行い、生成す
る発色化合物を比色定量することを特徴とする酵
素活性の測定法。２アミド化合物がＬ−ロイシル−３，５−ジハ
ロゲノ−４−ヒドロキシアニリドである特許請求
の範囲第１項記載の測定法。３Ｌ−ロイシル−３，５−ジハロゲノ−４−ヒ
ドロキシアニリドがＬ−ロイシル−３，５−ジブ
ロモ−４−ヒドロキシアニリドまたはＬ−ロイシ
ル−３，５−ジクロロ−４−ヒドロキシアニリド
である特許請求の範囲第２項記載の測定法。４アミド化合物が一般式（式中R₇、R₈は低級アルキル基を示し、R₉は水
素原子または又は低級アルキル基を示す）で表わ
されるＬ−ロイシル−ｐ−アミノアニリド誘導体
である特許請求の範囲第１項記載の測定法。５Ｌ−ロイシル−ｐ−アミノアニリド誘導体
が、Ｌ−ロイシル−４−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ
アニリド、Ｌ−ロイシル−２−メチル−４−Ｎ，
Ｎ−ジエチルアミノアニリド、Ｌ−ロイシル−４
−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアニリドまたはＬ−ロ
イシル−４−ジ−ｎ−プロピルアミノアニリドで
ある特許請求の範囲第４項記載の測定法。６アミド化合物が一般式（式中、R₁₀はカルボキシル基またはスルホン酸
基を示す）で表わされるＬ−ロイシル−４−ヒド
ロキシアニリド誘導体である特許請求の範囲第１
項記載の測定法。７Ｌ−ロイシル−４−ヒドロキシアニリド誘導
体が、Ｌ−ロイシル−３−カルボキシ−４−ヒド
ロキシアニリドまたは、Ｌ−ロイシル−３−スル
ホ−４−ヒドロキシアニリドである特許請求の範
囲第６項記載の測定法。８アミド化合物がγ−Ｌ−グルタミル−３，５
−ジハロゲノ−４−ヒドロキシアニリドである特
許請求の範囲第１項記載の測定法。９ γ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジハロゲノ−
４−ヒドロキシアニリドがγ−Ｌ−グルタミル−
３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシアニリドまた
はγ−Ｌ−グルタミル−３，５−ジクロロ−４−
ヒドロキシアニリドである特許請求の範囲第８項
記載の測定法。１０アミド化合物が一般式：（式中、R₁₁、R₁₂は水酸基を有してもよい低級
アルキル基を示し、R₁₃は水素原子、低級アルキ
ル基、カルボキシル基またはスルホン酸基を示
す）で表されるγ−Ｌ−グルタミル−ｐ−アミノ
アニリド誘導体である特許請求の範囲第１項記載
の測定法。１１ γ−Ｌ−グルタミル−ｐ−アミノアニリド
誘導体がγ−Ｌ−グルタミル−４−Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアミノアニリド、γ−Ｌ−グルタミル−４−
Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノアニリド、γ−Ｌ−グル
タミル−４−Ｎ，Ｎ−ジ−ｎ−プロピルアミノア
ニリド、γ−Ｌ−グルタミル−ｏ−メチル−４−
Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノアニリドまたは、γ−Ｌ
−グルタミル−４−Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシ
ジエチルアミノアニリドである特許請求の範囲第
１０項記載の測定法。１２アミド化合物が、γ−Ｌ−グルタミル−４
−ヒドロキシアニリド誘導体である特許請求の範
囲第１項記載の測定法。１３ γ−Ｌ−グルタル−４−ヒドロキシアニリ
ド誘導体が、γ−Ｌ−グルタミル−３−カルボキ
シ−４−ヒドロキシアニリドである特許請求の範
囲第１２項記載の測定法。