JPS58172354A - ペプチド誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なペプチドに関する。

本発明の化合物は、一般式 （式中Ｒ，−は低級アルキル基を表わす。）で示される
Ｉ）−パリルート−ロイシル−し一リジルー８−カルボ
キシー４−Ｎ、Ｎ−ジアルキルアミノアニリド（以下Ｄ
−Ｖａ　Ｉ　−Ｌｅ　ｕ−Ｌｙ　ｓ　−ＣＡＡと略す）
及びその塩であり９文献未載の新規化合物である。

本発明の化合物は、血漿成分であるプラスミノーゲン、
プラスミンアンチプラスミン、プラスミノーゲンアクチ
ベーターを定量的に測定する際の基質として利用できる
有用な化合物であり、これ等酵素又は蛋白質等を測定す
ることによって臨床上有意義な診断並びに治療に対する
知見を得ることができる。例えばプラスミノーゲンは各
種血液疾、轡、悪性腫瘍、異常妊娠並びに流産で減少す
ることが知られている。このように、これら血漿酸かを
正確に測定することは重要なことである。

従来プラスミ／、プラスミノーゲン、アンチプラスミン
等を測定する基質としてＤ−バリル−Ｌ−ロイシル−Ｌ
−ＩＪ　シルーＰニトロアニリド及びＤ−バリル−Ｌ−
ロイシル−Ｌ　　ＩＪジル−５−アミドイソフタル酸等
が提案されている。

しかしＤ−バリル−Ｌ−口インルーＬ−リジルーＰニト
ロアニリドを基質として用いる方法は、プラスミン等の
酵素により遊離生成する発色物質、即ちＰ−ニトロアニ
リンの発色強度を測定する方法であるがＰ−ニトロアニ
リンは黄色である為測定波長が４００ｎｍ附近であり、
比色定量時血漿成分の影響を免れることはできない。

一方、Ｄ−バリルーし一ロイ／ルーＬ−リジルー５−ア
ミドインフタル酸を基質とする方法は、酵素により生成
する螢光物質、即ち５−アミノイソフタル酸の螢光強度
を測定する方法であるが、煩雑な操作を必要とす・る上
に測定機器として、一般的には普及していない螢九々度
計を必要とするなどの欠点を有し、満足し難い。

本発明者等はこれ等の欠点を解決すべく鋭意研究を行っ
た結果、上述の欠点を全面的に解決出来た基質を見出し
本発明を完成した。

本発明の基質の特徴を列挙すると次の通りである。　　
　　　　　　、、°１：・１′能である。

２）標準物質として用いるアミノ安息香酸誘導体の水溶
液が安定である。

３）酵素作用を受けて生成するアミン安息香酸誘導体は
、フェノール類とのインドフェノール反応により、イン
ドフェノール色素を生成するが生成する色素の極太吸収
波長は６０００ｍ以上である為血漿中のビリルビン、ヘ
モクロビン等の影響を殆んど受けない。

４）発色の感度及び呈色の温度９時間による変動が少な
いので再現性よい測定が可能である。

本発明に係る新規ペプチド誘導体はペプチド化学に於い
て一般的によく知られている方法により製造することが
出来る。

アミノ酸のアミノ基保護基としてはベンジルオキシカル
ボニル基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基等種々の保護
基が使用出来る。カルボキシル基の活性化法としては、
混合酸無水物法。

酸アジド法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸エステル法、ＤＣ
Ｃ法等種々の活性化法を使用するととが出来る。

具体的には一例として次の様な方法で合成することが出
来る。

文献既知のＮ’　−ｔ−ブチルオキ７カルボニルーＮ−
カルボベンゾキシ−Ｌ−リジンをクロロホルム等の有機
溶媒中ピリンン、Ｎ−エチルピペリジン等の塩基の存在
下に塩化ピバロイルを低温下に反応させ混合酸無水物と
してＮ　’ｌ　Ｎ　ｅ−保護リジンのカルボキシル基を
活性化した後。

低温で８−カルボキシ−４−Ｎ、Ｎ−ジアルキルアミノ
アニリンとカップリング反応を行わせることによってＮ
″−１−ブチルオキ７カルボニルーＮｅ−カルボベンゾ
キシ−し−リジル−（３−カルボキン−４−Ｎ、Ｎ−ジ
アルキルアミノ）−アニリドとする。

次に例えば塩化水素−酢酸エチルエステル溶液中室温で
反応を行い、　Ｎ　’（７）　ｔ−メチルオキン力ルボ
ニル基だけの保護基の脱離を行い、ＮＥ−カルボベンゾ
キシ−し−リジル−（３−カルボキシ−４Ｎ、Ｎ＝ニジ
アルキルアミノアニリド塩酸塩とする。

同様の方法で順次Ｎ−ｔ−ブチルオキ７カルボニルーＬ
−ロイ／ン、Ｎ−カルボベンツキ７−Ｄ−バリンを縮合
し得られるＮ−カルボベンゾキシ−Ｄ−バリル−Ｌ−口
イシル−Ｎ−カルボベンゾキシ−し−リジル−（３−カ
ルボキシ−４−Ｎ、Ｎ−ジアルキルアミノ）アニリドを
メタノール等有機溶媒に溶解し常法によりパラジウム炭
素触媒の存在下に接触還元を行い、全保護基を脱離し目
的とするＤ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ　−ＣＡＡとする
ことが出来る。

目的ペプチドである反応生成物を単離並びに精製する方
法としては、遊離の形又は酸付加塩として実施すること
が出来る。酸付加塩の例としては塩酸塩、硫酸塩、リン
酸塩、酢酸塩、シ、つ酸ｔｍ、Ｐ−トルエンスルホン酸
ｋＬ　ｆＤ石石基塩がある。

不肖製法として（喧メタノール、アセトン、酢酸エチル
、ｎ−へキサン等、一般的有機溶媒及びこれ等溶媒の組
み合せによる混合溶媒を用いて再結晶精製することが出
来る。又／リカゲル等を用いたカラムクロマトグラフィ
ーにより精製することも出来る。

尚中間体については各工程ごとに精製することなく次工
程に使用することも可能であるが。

最終工程での精製の容易さ等を考慮し中間工程で精製を
行い９次工程に進める万が得策である。

本発明ペプチドの用途は前述の通り酵素活性測定用の基
質であるが、使用法の一例としてプラスミン測定法を示
すと次の通りである。

本基質を中性から弱アルカリ性の緩衝液中でプラスミン
と作用せしめ遊離生成するアミン安息香酸誘導体を適当
なカップラーと酸化縮合により発色させ比色定量するこ
とにより、プラスミン酵素活性を測定することができる
。

この場合カップラーとしては、■−ナフトールー２−ス
ルホン酸、２．＋−；クロロナフトール、フェノール、
Ｐ−キシレノール、チモール等が使用出来る。

酸化剤としてはメタ過・ヨ沙素酸ナトリウム。

過硫酸塩等が使用できる。

カップラーと酸化縮合して生成する色素の極大波長は基
質によって幾分変動するがほぼ６２０ｎｍ附近である。

これを化学式で示すと次の通りである。

（発色化合物） 尚本発明基質に於ける賜鴇に係る低級アルキル基として
はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、
イソブチル等であり、ＲＩ−は同じでもよく文具なった
アルキル基の組み合せにすることもできる。

以下実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例Ｉ Ｎ“−１−ブチルオキシカルボニル−Ｎ６−カル）１１
１ ボペンゾキシーＬ−リジル−（８−？カルボキシー４−
Ｎ、Ｎ−ジーｎ−プロピルアミノ）アニリドの合成 Ｎａ−ｔ　−フーＦ−ルオキ／カルボニル−Ｎ６−カル
ポペンゾキシーＬ−リジン１５．２ｇ（４０ミリモル）
にピリジンａ、ｚｍｌ（４０ミリモル）Ｎ−エチルピペ
リジン５．５　ｍｅ　（４０ミリモル）クロロホルム８
０’ｍｉを加え攪拌溶解し一１０℃に冷却する。、この
溶液に塩化ピバロイル４．９　ｍｌ　（４０ミリモル）
をクロロホルム２０ｍ１に溶解した溶液を一１０°Ｃで
滴下する。次に５°Ｃに５分間保った後−１０℃に冷却
し８−カルボキシ−４−Ｎ、Ｎ−ジ−ｎ−プロピルアミ
ノアニリン９５．９　（４０ミ！Ｊモル）を加え同温で
１時間反応後。

室温にて更に１夜攪拌反応する。

反応終了後クロロホルム５００ｍＪを加え、１０％クエ
ン酸水溶液１００ｍ１で２回、水１００ｍＪで１回。

飽和１ソウ水溶液ｌｏｏｍ／で２回、飼料食塩水１００
ｍＪで２回洗滌し、無水硫酸ナトリウムで乾燥する。溶
媒を減圧留去し、粗結晶を得る。粗結晶を１１エチルエ
ステル・ｎ−へキサン混合溶媒より再結晶を行い目的物
を得る。収量２０３ｇ、収率８５％。

実施例２ Ｎａ−ｔ−メチルオキン力ルボニルーＬ−ロイフルーＮ
５−カルボベンゾキ７−Ｌ−リジル−（３−カルホキ／
　４　　Ｎ、Ｎ−ジ−ロープロピルアミン）−アニリド
の合成 Ｎａ−ｔ−ブチルオキ７カルポニルー＼−カルポベンゾ
キ／−Ｌ−（３−カルボキ／−蛋−Ｎ。

Ｎ−ジ−ｎ−プロピルアミン）−アニリド１４６ｇ（２
４，４ミＩＪモル）を２０％塩化水素−酢酸エチル溶Ｐ
２Ｌ９０　ｍｌに溶解し、室温で２時間攪拌する。

反応終了後減圧下に溶媒を留去する。残留物をクロロホ
ルム６０ｍ１に溶解しピリジン１．９５　ｍｅ（２４４
ミリモル）、Ｎ−エチルピペリジン６．７　ｍｌ（４８
８ミリモル）、塩化ピバロイル３．　Ｑ　ｍｌ’　（２
４，４ミリモル）、Ｎ−１−ブチルオキ／カルボニル−
し−ロイ７ンー水和物６Ｂ（４＋、＋ミリモル）を用い
実施例１と同様に縮合反応及び後処理を行い、得られた
粗生成物を酢酸エチルーｎ−ヘキサン混合溶媒より再結
晶精製を行い目的物を得る。収量１５．０，９．収率８
７％、融点；９８〜１００’Ｃ０実施例３ Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｄ−パリルート−ロイシル−Ｎ
−カルボベンゾキシ−Ｌ−リジル−（３−カルボキシ−
４−Ｎ’、Ｎ−ジ−ｎ−プロピルアミノ）−アニリドの
合成 Ｎ−ｔ−ブチルオキシカルボニル−し−口イシル−Ｎ−
カルボベンゾキシ−Ｌ−リジル−（３−カルボキン−４
−Ｎ、Ｎ−ジ−ｎ−プロピルアミン）−アニリド３．６
．９　（５，１ミリモル）を２０係塩化水素酢酸工チル
溶液８’Ｏｍｌに溶解し。

室温で１時間攪拌反応する。反応終了後溶媒を留去し残
留物をクロロホルム３５ｍ１に溶解する。

次にピリジン０．４　ｍｉ　（５，１ミリモル）ｔ　　
Ｎ−エチルピペリジン１．４　ｍｌ　（１０，２ミリモ
ル）、塩化ピバｏ　Ａ、　’Ｑ　ｍｌ　（’　５．１ミ
リモル）、Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｄ−バリン１．３．
？（５，２ミリモル）を用いて実施例１゛と同様に゛縮
合反応、及び後処理を行い粗結晶を得る。酢酸エチル−
ｎ−ヘキサン混合溶媒より再結晶精製を行い目的物を得
る。収量３５ｇ、収率８３％、融点；１５５〜１５７℃
。

実施例４ Ｄ−バリル−し−ロイシル−Ｌ−リジル−（３−カルホ
キツー４−Ｎ、Ｎ−ジーｎ−プロピルアミン）−アニリ
ドニ塩酸塩の合成Ｎ−カルポペンゾキ５−Ｄ−バリル−
Ｌ−口イシル−Ｎ−カルボベンゾキン−Ｌ−リジル−（
３−カルホキ７−４−　ｒＮ、　Ｎ−ジ−ｎ−プロピル
アミン）−アニリド１．５　ｌ　（１，８ミリモル）に
メタノール８０ｍ１を加え溶解し、塩化水素メタノール
溶液（６，３６Ｎ、　０．６ｍｌ　）を加え５％パラジ
ウムカーボン０．２．９を触媒として６時間接触還元を
行う。

反応終了後、触媒を濾過し、メタノール溶液よりメタノ
ールを減圧留去し粗品を得る。メタノール−アセトン混
合溶媒より再結晶を行い目的物を得る。収量１．０，９
．収率８７％、一点；１９８〜２０１’Ｃ（分、讐）、
〔α）％　　−６６，７°（Ｃ＝１　１ｔ２０）元素分
析（Ｃ３ｏＨ，Ｎ６０．−２Ｈｃ１．＋−Ｈ２０）とし
て計算値（％）　Ｃ：４９．９２　　Ｈ：８．６６　　
Ｎ：１１．６４実測値（％）　Ｃ：５０．１７　　Ｈ：
８．７９　　Ｎ：１１５５参考例１　プラスミン活性測
定法 ５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）　−１００ミ
リモル塩化ナトリウム４００μｅ、ヒトプラスミン（カ
ビ社発売、スウェーデン）１００μｅ及びＤ−パリルー
Ｌ−ロイ／ルーＬ−リジル−（３−ミリモル１００μｌ
を混和し、試験管内で３７℃ｌＯ分間反応させる。その
後チモール（６９ミリモル）、メタ過ヨウ素酸ナトリウ
ム（１５ミリモル）の混液％　２　ｍｉ加えて反応を停
止し同時に遊離した３−カルボキシ−４−Ｎ、Ｎ−ジ−
ｎ−プロピルアミノアニリン（以下ＣＡＡと略す）を発
色させ６２０ｎｍの吸光度を測定し、検量線よりプラス
ミン活性値を算出する。

Ｋｍ値５Ｘ１０４モ／Ｌ／　／　ｌ　＋’　Ｖｍａｘ　
ｌ　ＩＸＩ　（ｒ７モル／ｍｉｎ、　　　Ｃｕ 参考例２　血漿中プラスミノーゲン活性測定法ヒト正常
血漿を５０ミリモルリン酸緩衝液（ｐｌ（７，４）　−
１２ミリモル塩化ナトリウム液で稀釈し、４１倍稀釈値
を１００％とし２５〜１５０％の稀釈血漿を調製した。

稀釈液２００μｌにストレプトキナーゼ（カビ社発売、
スウエーデ：ｙ　）　５０００１ＬＪ／ｍ／を２００ｐ
ｌ加え。

μｌ加え３７　”Ｃ５分間反応させた。次いでチモール
（６９ミリモル）、メタ過ヨウ素酸ナトリウム（１５ミ
ｌ）モル）の混液を２ｍｌ加え反応を停止させると同時
にＣＡＡを発色させ６２０ｎｍの吸光度を測定した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 一般式 （式中Ｒ，Ｒ，は低級アルキル基を表わす。）で示され
   る。Ｄ−バリル−Ｌ−ロイシル−し−リジルー８−カル
   ボキシ−４−Ｎ、Ｎ−ジアルキルアミノアニリド又はそ
   の酸付加塩