KR20000057503A - 펩티드, 사람 펩시노오겐 ｉ 또는 사람 펩신 ｉ의 측정 방법,및 측정용 키트 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기 화학식 I로 표시되는 펩티드 또는 그 산 부가염에 관한 것이다.
화학식 I
R-X-ProIleGlu-W-Y-Z
[식 중, R은 수소, 아미노기의 보호기, 또는 D- 또는 L-아미노산을 1개∼2개 가진 잔기를 나타내고, X는 Lys 또는 Arg 잔기를 나타내고, W는 Phe 또는 Phe(NO2) 잔기(식 중, Phe(NO2)은 p-니트로페닐알라닌 잔기를 나타냄)를 나타내고, Y는 Phe, Phe(NO2), Tyr, 3,5-디요오도티로신, 노르류신, Leu, Asp(OBz1) 또는 Met 잔기(식 중, OBz1은 벤질옥시를 나타냄)를 나타내며, Z은 아닐린, 아미노쿠말린 또는 아미노나프탈렌 유도체 잔기를 나타냄]
화학식 I로 표시되는 화합물은, 사람 펩신 I에 특이적인 기질이기 때문에 사람 펩신 I 또는 사람 펩시노오겐 I의 측정에 이용할 수 있고, 위암, 위궤양 등의 위질환의 진단에 유용하다.

Description

펩티드, 사람 펩시노오겐 Ｉ 또는 사람 펩신 Ｉ의 측정 방법, 및 측정용 키트{PEPTIDES, METHODS FOR ASSAYING HUMAN PEPSINOGEN I OR HUMAN PEPSIN I, AND ASSAY KITS}
펩시노오겐의 분비량은 위산 분비량과 거의 병행하고, 또한 사람의 혈중 또는 뇨중의 사람 펩시노오겐도 위 펩시노오겐의 분비량과 병행하는 것으로 알려져 있다. 위액을 제외한 혈액 또는 뇨 등의 체액 속에서는 펩시노오겐의 상태로 존재하는 한편, 위액 속에서는 펩신의 상태로 존재한다. 위축성 위염에서는 사람의 혈중 또는 뇨중의 사람 펩시노오겐 I가 감소하고, 위궤양에서는 사람 펩시노오겐 I 및 사람 펩시노오겐 Ⅱ가 모두 증가한다고 알려져 있다. 또한, 위암에서는 사람 펩시노오겐 I이 감소한다고 알려져 있다(일본 특허 공개 평7-304800호). 따라서, 사람의 혈중 또는 뇨중의 사람 펩시노오겐 I 값의 측정은 위암, 위궤양 등의 위질환의 조기 진단으로 이어지게 된다.
사람 펩시노오겐의 활성화에 의해 얻어지는 사람 펩신의 활성 측정 방법으로는, 뇨 및 혈청에서 사람의 혈청 단백 등을 이용하여 그 분해 활성으로 평가하는 방법이 알려져 있고{문헌[Clin. Chem., 15, l, 42-55(1969)] 참조}, 임상적 의의도 논의되고는 있지만, 그 측정에 소요되는 시간이 매우 길고, 측정 정밀도도 나쁘기 때문에 실용 단계에는 이르지 못하고 있다. 더욱이, 어디까지나 단백의 분해 활성이기 때문에 펩신 I과 펩신 Ⅱ의 전체적인 활성을 반영하고 있으므로, 사람 혈청 중의 펩시노오겐 I를 특이적으로 측정하는 것은 불가능하다.
또한, 최근 내산성 효소의 활성화 펩신에 의한 실활(失活)을 이용하여 사람 펩시노오겐(유로펩신)을 간접적으로 측정하는 기술(일본 특허 공개 평7-155198호)도 고안되었지만, 펩신 I에 특이성을 갖는 기질을 이용한 측정법은 아니다. 또한, 뇨 중에 존재하는 펩시노오겐을 펩시노오겐 I이라고 말하고 있지만, 병의 용태에 따라서는 뇨 중에 펩시노오겐 Ⅱ도 출현하기 때문에 정확한 평가를 하기가 어렵다. 더구나, 사람 혈청 중의 펩시노오겐 I를 특이적으로 측정하는 것은 불가능하다.
펩시노오겐 I를 측정하는 방법으로는, 특이적 항체를 이용하여 그 단백량을 측정하는 방사성 면역 검정법(radioimmunoassay){문헌[Gastroenterology, 66, 494(l974] 참조} 및 효소 면역 분석법(enzymeimmunoassay)(일본 특허 공개 평7-304800호)이 실용화되어 있지만, 방사성 물질의 이용에 따른 측정 시설이나 폐기물에 의한 오염 문제, 나아가 측정에 소요되는 시간이 길거나, 조작이 번잡하거나 하는 여러 가지의 제약을 받는 것이었다.
또한, 합성 기질을 이용하여 측정하는 방법으로서, 예를 들어 문헌[J. Med. Chem., 36, 2614(1993)]에는 하기 화학식 A-1로 표시되는 펩티드를 기질로 이용하여 특정 종류의 화합물의 사람 펩신 I에 대한 효소 저해 실험을 행한 것이 기재되어 있다.
LysProIleGluPhePhe(NO2)ArgLeu
[식 중, Phe(NO2)는 상기와 동일한 의미를 나타냄]
즉, 상기 화학식 A-1로 표시되는 펩티드를 사람 펩신 I에서 절단하여 얻어진 하기 화학식 A-2로 표시되는 펩티드에 대해, 234 nm∼324 nm에서의 흡광도의 변화를 지표하여 효소 저해 활성을 측정하고 있다.
Phe(NO2)ArgLeu
[식 중, Phe(NO2)는 상기와 동일한 의미를 나타냄]
그러나, 이 문헌에는, 화학식 A-1로 표시되는 기질이 사람 펩신 I에 대하여 기질이 될 수 있는가의 여부에 관한 기재가 없고, 이 기질이 사람 펩신 I에 특이적인지 어떤지를 밝히고 있지 않다. 또한, 발색단이 Phe(NO2)이기 때문에, 예를 들어 본 발명에서 사용하는 p-니트로아닐린(이하, pNA라고 함) 등의 아닐린 유도체 등에 비해, 흡광 계수로 볼 때 감도가 1/10 이하라고 생각된다. 또한, 234 nm∼324 nm 에서의 흡광도 측정이기 때문에 자동 분석기로는 측정할 수 없는 결점이 있다.
또한, 체코슬로바키아 특허 제CS-261172호에서는, 하기 화학식 B-1로 표시되는 펩티드를 기질로 이용하여 펩신 I, 펩신 Ⅱ, 키모신의 효소 활성을 측정하는 방법이 기재되어 있다.
X-A-B-Phe-D-pNA
[식 중, X는 수소, C3∼C5의 카르복시알킬카르보닐 또는 C1∼C5의 알킬카르보닐을 나타내고, A는 피로글루타민산(이하, pGlu라고 함), Asp, Glu, Gly 잔기 또는 2-옥소이미다졸리딘-1-일-카르보닐을 나타내고, B는 His, Gly 또는 Pro 잔기를 나타내며, D는 Phe, Leu, Nle, Met 또는 S-C1∼C3알킬-Cys 잔기를 나타내고, pNA는 p-니트로아닐린 잔기를 나타냄]
그러나, 사람 펩신 I에 대한 특이성에 관해서는 기재나 시사한 바가 전혀 없다.
또한, 실시예에서는 하기 화학식 B-2로 표시되는 펩티드를 이용하여 돼지 펩신의 효소 활성을 측정하고 있지만, 이 돼지 펩신은 정제된 것이 아니며, 펩신 I과 펩신 II의 혼합물로 생각된다. 따라서, 이 기질이 사람 펩신 I에 대하여 특이성을 갖고 있다고는 예견할 수 없다.
pGluHisPhePhe-pNA
[식 중, pGlu 및 pNA는 상기와 동일한 의미를 나타냄]
상기 2건의 선행 기술, 즉 문헌[J. Med. Chem., 36, 2614(1993)] 및 체코슬로바키아 특허 제 CS-261172호에 기재되어 있는 기질은 본 발명에서 사용하는 기질과 구조에서 일부 공통되는 부분이 있지만, 구조식 전체로 보면 전혀 다른 화합물이며, 본 발명의 펩티드가 목적으로 하는 것과 같이 사람 펩신 I에 대하여 특이성을 갖는다고 하는 것과 관련해서 이들 선행 기술 중에는 기재나 시시한 바가 전혀 없다.
또한, 문헌[Anal. Biochem., 234, 113(1996)]에는, 하기 화학식 C-1로 표시되는 펩티드, 또는 하기 화학식 C-2로 표시되는 펩티드를 기질로 이용하고, 형광 검출법으로 사람 펩신 I, 사람 펩신 Ⅱ, 사람 카텝신 D 및 HIV 프로테아제의 효소 활성을 측정하는 방법이 기재되어 있다.
Abz-AlaAlaPhePheAlaAla-Ded
Abz-AlaAlaPhePheAlaAla-pNA
[식 중, Abz는 o-아미노벤조일을 나타내고, pNA 및 Ded는 N-2,4-디니트로페닐에틸렌디아민을 나타냄]
본 문헌에서는, 펩티드를 수식함으로써 형광 강도가 어떻게 변화하는지 검토하고 있다. 특히, 화학식 C-1로 표시되는 펩티드가 사람 펩신 I에 대하여 특이성을 갖는다는 것이 실험 결과로부터 시사되어 있다. 그러나, 특이성이 불충분하고, 또한 본 문헌 중의 화학식 C-1로 표시되는 펩티드가 본 발명의 펩티드와 구조식이 전혀 다르기 때문에, 이 펩티드로부터 본 발명의 펩티드가 사람 펩신 I에 대하여 특이성을 갖는 것을 예견할 수는 없다.
또한, 문헌[Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 122, 700(1966)]에서는 하기 화학식 D-1로 표시되는 펩티드를 기질로 이용하여 사람 펩신 I을 분별하여 측정하고 있지만, 측정 시간이 상당히 걸리고, 번잡한 조작이 필요하며, 또한 사람 검체를 측정하기에는 정밀도 및 감도가 모두 낮기 때문에 임상 검체를 측정하는 데 적합하지 않아 실용화에는 미치지 못하고 있다.
Ac-Phe-Dit
[식 중, Ac는 아세틸기를 나타내고, Dit는 3,5-디요오도티로신을 나타냄]
본 문헌 중의 화학식 D-1로 표시되는 펩티드는 본 발명의 펩티드와 구조식이 전혀 다른 것으로, 이 펩티드로부터 본 발명의 펩티드가 사람 펩신 I에 대하여 특이성을 갖는다는 것을 예견할 수는 없다.
본 발명은 위암, 위궤양 등의 위질환의 진단 지표가 되는 사람의 체액(예를 들면, 위액, 혈액, 뇨 등을 들 수 있음) 중에서 사람 펩시노오겐 I 또는 사람 펩신 I의 측정 방법, 및 그 측정을 위한 기질로서 사용되는 펩티드에 관한 것이다.
더욱 자세하게, 본 발명은,
(1) 하기 화학식 I로 표시되는 펩티드 또는 그 산 부가염, 및
(2) 검체 중의 사람 펩시노오겐 I을 활성화하여 얻어지는 사람 펩신 I 또는 검체 중의 사람 펩신 I에 의해, 상기 화학식 I로 표시되는 펩티드 또는 그 산 부가염을 절단하여 얻어지는 하기 화학식 II로 표시되는 아미노산 유도체를 아미노펩티다아제로 소화시켜 얻어지는 화학식 Z-H의 아닐린 유도체, 아미노쿠말린 유도체 또는 아미노나프탈렌 유도체를 검출하는 것을 특징으로 하는 사람 펩시노오겐 I 또는 사람 펩신 I의 측정 방법에 관한 것이다.
R-X-ProIleGlu-W-Y-Z
H-Y-Z
[식 중, R은 수소, 아미노기의 보호기, 또는 D-아미노산 또는 L-아미노산을 1개 또는 2개 가진 잔기를 나타내고, X는 Lys 또는 Arg 잔기를 나타내고, W는 Phe 또는 Phe(NO2) 잔기(식 중, Phe(NO2)는 p-니트로페닐알라닌 잔기를 나타냄)를 나타내고, Y는 Phe, Phe(NO2), Tyr, Dit, Nle, Leu, Asp(OBzl) 또는 Met 잔기(식 중, Dit는 3,5-디요오도티로신 잔기를 나타내고, Nle는 노르류신 잔기를 나타내고, OBzl은 벤질옥시를 나타내며, Phe(NO2)는 상기와 동일한 의미를 나타냄)를 나타내며, Z는 아닐린 유도체 잔기, 아미노쿠말린 유도체 잔기 또는 아미노나프탈렌 유도체 잔기를 나타냄]
도 1은, 시판되는 펩시노오겐 I 측정용 키트(다이나봇트사 제품)를 이용한 혈청 중의 펩시노오겐 I의 측정법(RIA법)과, 본 발명의 측정 방법과의 상관 관계를 도시한 그래프이다.
발명의 개요
본 발명은,
(1) 하기 화학식 I로 표시되는 펩티드 또는 그 산 부가염,
화학식 I
R-X-ProIleGlu-W-Y-Z
[식 중, 모든 기호는 상기와 동일한 의미를 나타냄]
(2) 검체 중의 사람 펩시노오겐 I를 활성화하여 얻어지는 사람 펩신 I 또는 검체중의 사람 펩신 I에 의해, 상기 (1)에 기재된 화학식 I(식 중, 모든 기호는 상기와 동일한 의미를 나타냄)로 표시되는 펩티드 또는 그 산 부가염을 절단하여 얻어지는 화학식 H-Y-Z(식 중, 모든 기호는 상기와 동일한 의미를 나타냄)로 표시되는 아미노산 유도체를 아미노펩티다아제로 소화시켜 얻어지는 화학식 Z-H의 아닐린 유도체, 아미노쿠말린 유도체 또는 아미노나프탈렌 유도체를 검출하는 것을 특징으로 하는 사람 펩시노오겐 I 또는 사람 펩신 I의 측정 방법, 및
(3) 상기 (1)에 기재된 화학식 I로 표시되는 펩티드 또는 그 산 부가염과, 아미노펩티다아제를 기질로서 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 펩시노오겐 I 또는 사람 펩신 I의 측정용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 측정 방법의 대상이 되는 검체는, 사람 펩시노오겐 I의 농도 및 사람 펩신 I의 효소 활성을 측정하고 싶은 것이라면 특별한 제한은 없다. 예를 들면, 사람의 체액(예를 들면, 위액, 혈액 또는 뇨 등을 들 수 있음)이 포함된다. 위액을 제외한 혈액 또는 뇨 등의 체액 중에서는 펩시노오겐 I의 상태로 존재하는 한편 위액 중에서는 펩신 I의 상태로 존재한다.
화학식 I, Ia, Ib, Ic, Id, Ie 또는 If로 표시되는 펩티드 및 종래 기술의 항목에 표기되어 있는 3문자의 기호는 일반적으로 자주 사용되고 있는 아미노산을 나타내는 3문자 표기이며, 그 정의는 다음과 같다.
Pro = 프롤린,
Ile = 이소류신,
Glu = 글루타민산,
Phe = 페닐알라닌,
Lys = 리신,
Arg = 아르기닌,
Tyr = 티로신,
Leu = 류신,
Asp = 아스파라긴산,
Met = 메티오닌,
Gly = 글리신,
His = 히스티딘,
Cys = 시스테인,
Ala = 알라닌.
상기 이외의 3문자 기호에 있어서는, Dit는 3,5-디요오도티로신을 나타내고, Nle는 노르류신(류신의 측쇄의 부틸기가 직쇄인 것)을 나타낸다.
본 발명의 펩티드 중의 아미노산 잔기는, R이 나타내는 D-아미노산 또는 L-아미노산을 제외하고는 특별히 언급하지 않는 한 L체이다.
본 발명의 펩티드는 산 부가물이어도 좋으며, 이러한 산 부가염으로는 수용성인 것이 바람직하다. 예를 들면, 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염, 질산염 등의 무기산염, 및 호박산염, 시트르산염, 젖산염, 말산염, 벤젠술폰산염, 초산염, 트리플루오로초산염 등의 유기산염 등을 들 수 있다. 이 중에서 트리플루오로초산염인 것이 바람직하다.
화학식 Z-H로 표시되는 아닐린 유도체, 아미노쿠말린 유도체, 아미노나프탈렌 유도체란, 각각 비치환된 아닐린, 아미노쿠말린, 아미노나프탈렌 또는 각 기 중의 벤젠 고리, 쿠말린 고리, 나프탈렌 고리가 니트로기, 아미노기, 1개 또는 2개의 C1∼C6의 알킬로 치환된 아미노기, C1∼C6의 히드록시알킬아미노기, 카르복실기, 수산기, 할로겐, C1∼C6의 알킬기, C1∼C6의 알콕시기, 티올기, 술포닐기, C1∼C6의 알킬술포닐기, 또는 화학식 -CH2CH2COOH 또는 -CH=CH-COOH로 표시되는 기로 이루어지는 군 중에서 선택되는 1개∼5개의 치환기로 치환된 아닐린, 아미노쿠말린, 아미노나프탈렌을 의미한다. 이 치환기의 갯수는 1개, 2개 또는 3개인 것이 바람직하다.
Z-H로 표시되는 아닐린 유도체의 예로는, p-니트로아닐린, m-아니시딘, 3,5-디브로모-4-히드록시아닐린, N',N'-디에틸페닐렌디아민 또는 3-카르복시-4-히드록시아닐린을 들 수 있다.
Z-H로 표시되는 아미노쿠말린 유도체, 아미노나프탈렌 유도체의 예로는, 7-아미노-4-메틸쿠말린, 4-메틸-2-아미노나프탈렌, 4-메톡시-2-아미노나프탈렌을 들 수 있다.
Z-H로 표시되는 기로는 p-니트로아닐린, m-아니시딘, 7-아미노-4-메틸쿠말린, 4-메틸-2-아미노나프탈렌, 4-메톡시-2-아미노나프탈렌인 것이 바람직하고, p-니트로아닐린, m-아니시딘인 것이 보다 바람직하다.
R이 나타내는 아미노기의 보호기의 예로는, C1∼C6의 알킬카르보닐, C1∼C6의 알킬술포닐, 벤질옥시카르보닐, t-부톡시카르보닐, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 또는 벤조일 또는 그 유도체(벤질옥시카르보닐 또는 벤조일의 각 기 중의 벤젠 고리기 비치환이나, 또는 니트로기, 아미노기, 1개 또는 2개의 C1∼C6의 알킬로 치환된 아미노기, C1∼C6의 히드록시알킬아미노기, 카르복실기, 수산기, 할로겐, C1∼C6의 알킬기, C1∼C6의 알콕시기, 티올기, 술포닐기, C1∼C6의 알킬술포닐기, 또는 화학식 -CH2CH2COOH 또는 -CH=CH-COOH로 표시되는 기로 이루어지는 군 중에서 선택되는 1개∼5개의 치환기로 치환된 벤젠 고리를 갖는 기를 의미함)를 들 수 있다.
상기 C1∼C6의 알킬 카르보닐 중, C1∼C6의 알킬술포닐 중, 치환기 중 및 Z 중의 아닐린 치환기에서 C1∼C6의 알킬이란, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 또는 헥실, 또는 이들의 이성체를 의미한다.
R이 나타내는 D-아미노산 또는 L-아미노산을 1개 또는 2개 갖는 잔기는, X로 표시되는 Lys 또는 Arg 잔기의 α-아미노기의 보호기로 되어 있다. R은 수소 또는 C1∼C6의 알킬카르보닐인 것이 바람직하고, 수소 또는 아세틸인 것이 보다 바람직하다.
X는 염기성 아미노산인 Lys 또는 Arg 잔기이며, 바람직하게는 Lys 잔기이다.
W는 방향족 아미노산인 Phe 또는 Phe(NO2) 잔기이며, 바람직하게는 Phe 잔기이다.
Y는 방향족 아미노산인 Phe, Phe(NO2), Tyr 또는 Dit 잔기, 또는 지방족 아미노산인 Nle, Leu, Asp(OBzl) 또는 Met 잔기이며, 바람직하게는 Phe, Phe(NO2), Tyr 또는 Nle 잔기이며, 보다 바람직하게는 Nle 잔기이다.
본 발명의 펩티드(기질)의 예로는, 상기 화학식 Ia, Ib, Ic, Id, Ie 또는 If로 표시되는 펩티드를 들 수 있고, 바람직하게는 화학식 Ia로 표시되는 펩티드를 들 수 있다.
본 발명 펩티드의 제법
본 발명의 기질로서 사용되는 펩티드는, 일반적으로 펩티드 화학에 있어 잘 알려져 있는 방법에 의해 합성된다. 예를 들면, 본 발명의 펩티드의 합성은 후술하는 반응식 1에 도시한 바와 같이, 먼저 발색기가 되는 화학식 Z-H의 아닐린 유도체, 아미노쿠말린 유도체 또는 아미노나프탈렌 유도체를 화학식 Ral-Y-OH(식 중, Ra1은 아미노기의 보호기를 나타내고, 다른 기호는 상기와 동일한 의미를 나타냄)로 표시되는 아미노산에 결합시킨 후 순차적으로 아미노산을 겹합시키는 방법, 또는 후술하는 반응식 1 또는 실시예에 기재된 바와 같이, 미리 수개의 아미노산을 결합시켜 얻은 수 종류의 부분 폴리펩티드를 순차적으로 결합시키는 방법에 의해 합성할 수 있다.
[반응식 중, Ral∼Ra9은 아미노기의 보호기를 나타내고, Rc는 카르복실기의 보호기를 나타내며, AA는 D-아미노산 또는 L-아미노산을 1개 또는 2개 가진 잔기를 나타내고, 그 밖의 기호는 상기와 동일한 의미를 나타냄]
상기 결합 반응을 실시할 때에는, 반응에 직접 관여하지 않는 아미노기 및 카르복실기를 펩티드 합성에서 통상 사용되는 보호기로 보호한다. Ra1∼Ra9로 표시되는 아미노기의 보호기의 예로는, 벤질옥시카르보닐기(CBZ), t-부톡시카르보닐기(Boc) 또는 9-플루오레닐메톡시카르보닐기(Fmoc) 등을 들 수 있다. Arg나 Lys를 반응에 이용할 때에는 Arg의 δ-구아니디노기, Lys의 ε-아미노기를 보호기로 보호한다. Rc로 표시되는 카르복실기의 보호기의 예로는, 벤질기 또는 t-부틸기 등의 에스테르기를 들 수 있다. Glu를 반응에 이용할 때에는 그 측쇄의 카르복실기를 보호기로 보호한다. 이들 보호기는 반응 후 공지된 방법에 의해서 이탈시킬 수 있다.
발색기와 아미노산과의 결합에는 펩티드 합성에 통상 이용되는 방법, 예를 들면 (1) 산 할라이드를 이용하는 방법, (2) 혼합 산무수물을 이용하는 방법, (3) 축합제(EDC, PyBrop, DCC 등)를 이용하는 방법 등을 들 수 있다.
이들 방법을 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
(1) 산 할라이드를 이용하는 방법은, 예를 들면 아미노기를 보호한 아미노산(예를 들면, 화학식 Ral-Y-OH, 화학식 Ra2-W-OH 등으로 표시되는 아미노산)을 불활성 유기 용매(클로로포름, 염화메틸렌, 디에틸에테르, THF(테트라히드로푸란) 등) 중에서 또는 무용매 하에서, 산 할라이드(옥살릴클로라이드, 티오닐클로라이드 등)와 -20℃∼환류 온도에서 반응시키고, 얻어진 산 할라이드를 3급 아민(피리딘, 트리에틸아민, 디메틸아닐린, 디메틸아미노피리딘, 디이소프로필에틸아민 등)의 존재 하에, 화학식 Z-H의 아닐린 유도체, 아미노쿠말린 유도체 또는 아미노나프탈렌 유도체, 또는 아미노기의 보호기를 이탈시킨 (폴리)펩티드(예를 들면, 화학식 H-Y-Z, 화학식 H-W-Y-Z 등으로 표시되는 (폴리)펩티드)와 불활성 유기 용매(클로로포름, 염화메틸렌, 디에틸에테르, THF 등) 중에서 O℃∼40℃ 하에 반응시킴으로써 수행다.
(2) 혼합 산무수물을 이용하는 방법은, 예를 들면 아미노기를 보호한 아미노산(예를 들면, 화학식 Ral-Y-OH, 화학식 Ra2-W-OH 등으로 표시되는 아미노산)을 불활성 유기 용매(클로로포름, 염화메틸렌, 디에틸에테르, THF 등) 중에서 또는 무용매 하에서, 3급 아민(피리딘, 트리에틸아민, 디메틸아닐린, 디메틸아미노피리딘 등)의 존재 하에, 산 할라이드(피발로일클로라이드, 토실클로라이드, 메실클로라이드 등), 또는 산 유도체(클로로포름산에틸, 클로로포름산이소부틸 등)과 0℃∼40℃에서 반응시키고, 얻어진 혼합 산무수물과 화학식 Z-H로 표시되는 아닐린 유도체, 아미노쿠말린 유도체 또는 아미노나프탈렌 유도체, 또는 아미노기의 보호기를 이탈시킨 (폴리)펩티드(예를 들면, 화학식 H-Y-Z, 화학식 H-W-Y-Z 등으로 표시되는 (폴리)펩티드)를 불활성 유기 용매(클로로포름, 염화메틸렌, 디에틸에테르, THF 등) 중에서 0℃∼70℃ 하에 반응시킴으로써 수행한다.
(3) EDC(1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드), PyBrop(브로모-트리스-피롤리디노-포스포늄헥사플루오로포스페이트), DCC(디시클로헥실카르보디이미드) 등의 축합제를 이용하는 방법은, 예를 들면 아미노기를 보호시킨 아미노산(예를 들면, 화학식 Ral-Y-OH, 화학식 Ra2-W-OH 등으로 표시되는 아미노산)과 화학식 Z-H로 표시되는 아닐린 유도체, 아미노쿠말린 유도체 또는 아미노나프탈렌 유도체, 또는 아미노기의 보호기를 이탈시킨 (폴리)펩티드(예를 들면, 화학식 H-Y-Z, 화학식 H-W-Y-Z 등으로 표시되는 (폴리)펩티드)를, 불활성 유기 용매(클로로포름, 염화메틸렌, 디에틸에테르, THF 등) 중에서 또는 무용매 하에서 3급 아민(피리딘, 트리에틸아민, 디메틸아닐린, 디메틸아미노피리딘, 디이소프로필에틸아민 등)의 존재 하에 또는 3급 아민을 이용하지 않고, EDC, PyBrop, DCC 등을 이용하여 0℃∼40℃에서 반응시킴으로써 수행한다.
이들 (1), (2) 및 (3)의 반응은 모두 불활성 가스(아르곤, 질소 등)의 분위기 하에 무수 조건으로 수행하는 것이 바람직하다.
보호기의 이탈은 공지된 방법에 의해 수행된다. 예를 들면, CBZ기 또는 Bzl기의 제거는 수소 분위기 하에 유기 용매(메탄올, 에탄올, THF 등) 중에서 촉매(Pd-탄소, Pd, 니켈 등)를 이용하여 0℃∼50℃의 온도에서 수행된다. Boc기의 제거는, 물과 혼화할 수 있는 유기 용매(메탄올, 에탄올, THF, 디옥산 등) 중에서, 유기산(초산, p-톨루엔술폰산, 트리플루오로초산, 트리클로로초산 등) 또는 무기산(염산, 브롬화수소산 등)을 이용하여 0℃∼90℃의 온도에서 수행된다. 또한, Boc기 및 Bzl기의 동시 제거는, 티오아니졸, m-크레졸 등의 존재 하에 트리플루오로메탄술폰산 + 트리플루오로초산 용액 중에서 또는 불화수소 중에서 반응시킴으로써 수행된다.
본 명세서 중의 각 반응에 있어서, 반응 생성물은 통상의 정제 수단, 예를 들면, 상압 하에서 또는 감압 하에서 증류, 실리카겔 또는 규산마그네슘을 이용한 고속 액체 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 칼럼 크로마토그래피 또는 세정, 재결정 등의 방법으로 정제할 수 있다. 정제는 각 반응마다 행하여도 좋고, 몇개의 반응 종료 후에 해도 좋다.
화학식 I로 표시되는 펩티드는 공지된 방법에 의해 상당하는 산 부가염으로 변환된다.
출발 물질 및 시약
본 발명에서 사용하는 출발 물질 및 시약은 그 자체로서 공지된 것이거나 또는 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
측정 방법
본 발명의 측정 방법에서 이용하는 효소 반응을 하기 반응식 2에 제시한다.
효소 반응
(1) 제1 반응
(2) 제2 반응
[반응식 중, 모든 기호는 상기와 동일한 의미를 나타냄]
검체가 위액을 제외한 체액, 예를 들면 혈액, 뇨 등인 경우에는, 사람 펩시노오겐 I이 먼저 제1 반응에서 사람 펩신 I로 활성화되어, 상기 화학식 I(식 중, 모든 기호는 상기와 동일한 의미를 나타냄)로 표시되는 펩티드 또는 그 산 부가염을 기질로서 특이적으로 인식하여 소화시킨다. 이 사람 펩시노오겐 I의 활성화는, 예를 들면 산성 조건하에서, 기질의 분해와 동시에 행하여도 좋고, 또한 별도로 행하여도 좋다. 이 산성 조건으로는 pH 1.0∼6.0이 바람직하고, 사용되는 완충액으로는 타르타르산, 글리신, 시트르산, 옥살산, 포름산, 초산 완충액이 바람직하다. 소화되어 유리되는 화학식 Ⅱ의 H-Y-Z(식 중, 모든 기호는 상기와 동일한 의미를 나타냄)의 아미노산 유도체는, 제2 반응에서 아미노펩티다아제(예를 들면, 돼지 신장에서 유래하는 아미노펩티다아제 M을 들 수 있음)로 pH 6∼9에서 소화시켜 화학식 Z-H로 표시되는 아닐린 유도체, 아미노쿠말린 유도체 또는 아미노나프탈렌 유도체를 유리시킨다. 이 유리되는 아닐린 유도체, 아미노쿠말린 유도체 또는 아미노나프탈렌 유도체를 검출함으로써, 검체 중의 사람 펩시노오겐 I를 측정할 수 있다.
또한, 검체가 위액인 경우에는, 사람 펩신 I를 먼저 제1 반응에서 산성 조건 하에 상기 화학식 I(식 중, 모든 기호는 상기와 동일한 의미를 나타냄)로 표시되는 펩티드 또는 그 산 부가염을 기질로서 특이적으로 인식하여 소화시킨다. 이 산성 조건으로는 pH 1.0∼6.0이 바람직하고, 사용되는 완충액으로는 타르타르산, 글리신, 시트르산, 옥살산, 포름산, 초산 완충액이 바람직하다. 소화되어 유리되는 상기 화학식 Ⅱ의 아미노산 유도체는, 동일한 방식으로 소화시켜 아닐린유도체, 아미노쿠말린 유도체 또는 아미노나프탈렌 유도체를 유리시키고, 이 아닐린유도체, 아미노쿠말린 유도체 또는 아미노나프탈렌 유도체를 검출함으로써 검체 중의 사람 펩신 I를 측정할 수 있다.
아닐린 유도체의 검출은, 아닐린 유도체 그 자체의 흡광도의 변화를 이용하여 측정하여도 좋고, 또한 적당한 착색물로 유도함으로써 측정하여도 좋다. 적당한 착색물로 유도하는 방법은, 생성된 아닐린 유도체를, 예를 들면 산성 조건 하에 반응시켜 발색시킴으로써 디아조 색소를 생성시키는 것이다. 디아조 결합 성분의 구체적인 것으로는 3,5-크실레놀이나 N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-3,5-디메틸아닐린 또는 그 염류(MAOS) 등이 알려져 있으므로, 펜타시아노아민페로에이트 등의 금속 킬레이트 착물을 첨가하여 발색시켜도 좋고, 또한 페놀 유도체, 아닐린 유도체 또는 크실레놀 유도체 등과 산화 축합시켜 발색시켜도 좋다.
아미노쿠말린 유도체, 아미노나프탈렌 유도체의 검출은 형광법(예를 들면, 7-아미노-4-메틸쿠말린에서는 λex=380 nm, λem=460 nm, 4-메틸-2-아미노나프탈렌에서는 λex=335 nm, λem=410 nm의 각 파장)으로 측정할 수 있다.
산업상 이용 가능성
본 발명의 화학식 I로 표시되는 펩티드 또는 그 산 부가염은, 사람 펩신 I에 대하여, 우수한 특이성과 감도(펩신 I의 기질 분해 속도가 빠르고/빠르거나, 발색이 양호함)를 갖는 기질이다. 따라서, 본 발명의 펩티드 또는 그 산 부가염을 기질로 이용하는 사람 펩신 I 또는 사람 펩시노오겐 I의 측정 방법은 위암, 위궤양 등의 위질환의 진단에 매우 유용하며, 의료 분야에서 기여하는 바가 크다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 설명하지만, 이것에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
박층 크로마토그래피는 이하에 나타내는 조성의 전개 용매를 이용하여 분석하였다. NMR의 괄호 내 용매는 측정에 사용한 용매를 나타낸 것이다. 또한, 사용하는 기호의 의미는 다음과 같다.
Cbz=벤질옥시카르보닐,
Boc=t-부톡시카르보닐,
TFA=트리플루오로초산,
AcOEt=초산에틸,
THF=테트라히드로푸란,
DMF=N,N-디메틸포름아미드,
N(Et)3=트리에틸아민,
EDC=1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드,
HOBt=1-히드록시벤조트리아졸,
pNA=p-니트로아닐린,
CH2C12=디클로로에탄,
MeOH=메탄올,
Et2O=디에틸에테르,
PyBrop=브로모-트리스-피롤리디노-포스포늄헥사플루오로포스페이트,
TFMSA=트리플루오로메탄술폰산,
Pac=페나실.
본 발명자는 이들 종래 기술의 결점을 해결하고, 사람 펩신 I에 대하여 보다 고감도(효소 반응 속도, 즉 펩신 I의 기질 분해 속도가 빠르고/빠르거나, 발색이 양호함)이고 특이적인 기질을 알아내기 위해 예의 검토를 거듭한 결과, 사람 펩신 I과의 반응 조건에 있어서 측정 감도가 양호하면서 특이성이 매우 높은 기질(펩티드)의 합성에 성공하고, 더욱이 이 기질을 이용함으로써 종래 기술에 비해 매우 단시간에 펩신 I의 측정이 가능하게 되어 범용의 생화학용 자동 분석기를 이용하는 펩시노오겐 I의 측정이 가능하게 되었다.
즉, 본 발명은,
1) 하기 화학식 I로 표시되는 펩티드 또는 그 산 부가염,
화학식 I
R-X-ProIleGlu-W-Y-Z
[식 중, R은 수소, 아미노기의 보호기, 또는 D-아미노산 또는 L-아미노산을 1개 또는 2개 가진 잔기를 나타내고, X는 Lys 또는 Arg 잔기를 나타내고, W는 Phe 또는 Phe(NO2) 잔기(식 중, Phe(NO2)는 p-니트로페닐알라닌 잔기를 나타냄)를 나타내고, Y는 Phe, Phe(NO2), Tyr, Dit, Nle, Leu, Asp(OBzl) 또는 Met 잔기(식 중, Dit는 3,5-디요오도티로신 잔기를 나타내고, Nle는 노르류신 잔기를 나타내고, OBzl은 벤질옥시를 나타내며, Phe(NO2)는 상기와 동일한 의미를 나타냄)를 나타내며, Z는 아닐린 유도체 잔기, 아미노쿠말린 유도체 잔기 또는 아미노나프탈렌 유도체 잔기를 나타냄]
2) Y가 Phe, Phe(NO2), Tyr 또는 Nle 잔기(식 중, 모든 기호는 상기 1)에 기재된 바와 동일한 의미를 나타냄)인 상기 1)에 기재된 펩티드,
3) R이 수소 또는 C1∼C6의 알킬카르보닐인 상기 1) 또는 2)에 기재된 펩티드,
4) 하기 화학식 Ia, Ib, Ic, Id, Ie 또는 If로 표시되는 펩티드 또는 그 산 부가염,
Nα-Ac-LysProIleGluPheNle-pNA
LysProIleGluPheNle-pNA
LysProIleGluPheTyr-pNA
LysProIleGluPhePhe-pNA
LysProIleGluPhePhe(NO2)pNA
Nα-AcLysProIleGluPhe(NO2)-NlepNA
[식 중, Ac는 아세틸기를 나타내고, Nle는 노르류신 잔기를 나타내고, pNA는 p-니트로아닐린 잔기를 나타내며, Phe(NO2)는 p-니트로페닐알라닌 잔기를 나타냄],
5) 검체 중의 사람 펩시노오겐 I를 활성화하여 얻어지는 사람 펩신 I 또는 검체 중의 사람 펩신 I에 의해, 상기 1)에 기재된 화학식 I(식 중, 모든 기호는 상기 1)에 기재된 바와 동일한 의미를 나타냄)으로 표시되는 펩티드 또는 그 산 부가염을 절단하여 얻어지는 화학식 Ⅱ로 표시되는 아미노산 유도체를 아미노펩티다아제로 소화시켜 얻어지는 화학식 Z-H의 아닐린 유도체, 아미노쿠말린 유도체 또는 아미노나프탈렌 유도체를 검출하는 것을 특징으로 하는 사람 펩시노오겐 I 또는 사람 펩신 I의 측정 방법,
화학식 II
H-Y-Z
[식 중, 모든 기호는 상기 1)에 기재된 바와 동일한 의미를 나타냄]
6) 상기 4)에 기재된 화학식 Ia, Ib, Ic, Id, Ie 또는 If(식 중, 모든 기호는 상기 4)에 기재된 바와 동일한 의미를 나타냄)로 표시되는 펩티드 또는 그 산 부가염을 사용하는 상기 5)에 기재된 측정 방법, 및
7) 상기 1)에 기재된 화학식 I(식 중, 모든 기호는 상기 1)에 기재된 바와 동일한 의미를 나타냄)로 표시되는 펩티드 또는 그 산 부가염, 및 아미노펩티다아제를 기질로서 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 펩시노오겐 I 또는 사람 펩신 I 측정용 키트를 제공한다.
실시예 1 : 화학식 Nα-Ac-LysProIleGluPheNle-pNA·CF3COOH로 표시되는 펩티드의 합성
1(1) : BocNle-pNA
BocNle-OH 8.0 g을 THF 320 ml에 용해시키고, N(Et)34.84 ml를 가한 다음, 이것에 실온 하에서 피발로일클로라이드 4.26 ml를 적하하여 1시간 교반하고, pNA 5.73 g을 가하여 70℃에서 16 시간 반응시켰다. 반응 후 THF를 감압 증류시켜 제거하고, 잔류물을 AcOEt로 용해시킨 다음, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 1N 염산 수용액, 포화 식염수로 세정하여 추출한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 유기층을 여과 분리하여 감압 농축시킨 후, 미정제물을 칼럼 크로마토그래피(n-헥산 : AcOEt = 10:1)로 정제하여 하기 물성 수치를 갖는 표제 화합물 3.0l g을 얻었다.
Rf=0.64(n-헥산:AcOEt=2:1).
1(2) : BocIleGlu(OBzl)PheNle-pNA
BocNle-pNA(1(1)에서 제조함) 2.96 g을 4N-HC1의 디옥산 용액 30 m1에 용해시키고, 실온에서 1시간 교반한 후 디옥산을 감압 증류시켜 제거하고, 다시 톨루엔 30 m1를 가하여 감압 증류시킨 후, 에테르 중에서 결정화시켜 Nle-pNA·HCl 2.08 g을 얻었다.
BocPhe-OH 2.06 g과 HOBt 1.05 g을 무수 DMF 40 ml에 용해시키고, -10 ℃에서 EDC 1.49 g을 가하여 30 분 교반한 후, 먼저 제조한 Nle-pNA·HC1 2.03 g과 N(Et)31.03 m1의 DMF 20 ml 용액을 -10℃에서 적하하여 30 분 반응시키고, 다시 실온에서 16 시간 반응시켰다. 반응 후 DMF를 감압 증류시켜 제거하고, 잔류물을 AcOEt로 용해시킨 다음, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 1N 염산 수용액, 포화 염화암모늄 수용액, 포화 식염수로 세정하여 추출한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 유기층을 여과 분리하여 감압 농축시킨 후, 결정을 AcOEt로 세정 여과하여 BocPheNle-pNA 3.37 g(96%)을 얻었다.
상기와 동일한 조작으로 Boc-Glu(OBzl)-OH 2.45 g BocIle-OH 1.44 g과 순차적으로 축합을 행하여 하기 물성 수치를 갖는 표제 화합물 2.63 g을 얻었다.
Rf=0.84(CHC13:MeOH=20:1).
1(3) : IleGlu(OBzl)PheNle-pNA·HC1
BocIleGlu(OBzl)PheNle-pNA(1(2)에서 제조함) 3.59 g을 4N-HC1의 디옥산 용액 15 ml에 용해시키고, 실온에서 1 시간 교반한 후 디옥산을 감압 증발시켜 제거한 후, 톨루엔 30 ml를 가하여 감압 증발시키고, 에테르 중에서 결정화시켜 하기 물성 수치를 갖는 표제 화합물 3.38 g을 얻었다.
Rf=0.09(CHC13:MeOH=20:1).
1(4) : CbzLys(Boc)Pro(OBzl)
Cbz-Lys(Boc)-OH 7.10 g과 디이소프로필에틸아민 6.82 ml를 40 ml의 CH2C12에 용해시키고, -10℃에서 PyBrop 9.14 g을 첨가한 후, Pro(OBzl)·HCl 4.73 g(1.1 eq) 과 디이소프로필에틸아민 3.41 ml(1.1 eq)의 CH2C12용액 5 ml를 첨가한 다음 실온에서 30 분 반응시켰다. 반응 후 CH2C12를 감압 증발시켜 제거하고, 잔류물을 Et2O에 용해시킨 다음, 물, 1O% 시트르산 수용액, 포화 탄산수소나트륨 수용액으로 세정하여 추출하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 다음, 유기층을 여과 분리하여 감압 농축시킨 후, 미정제물을 칼럼 크로마토그래피(CHC13:MeOH = 200:1)로 정제하여 하기 물성 수치를 갖는 표제 화합물 7.12 g을 얻었다.
Rf=0.51(CHC13:MeOH=20:1).
1(5) : Lys(Boc)Pro-OH
Cbz-Lys(Boc)Pro-OBzl(1(4)에서 제조함) 3.45 g과 탄산수소나트륨 51 mg을 50 ml의 MeOH에 용해시키고, 10% Pd-C 400 mg을 첨가한 다음, 실온에서 1 시간 동안 수소 첨가 환원시키고, 반응액을 여과시킨 후, 유기층을 감압 농축시켜 하기 물성 수치를 갖는 표제 화합물 2.06 g을 얻었다.
Rf=0.05(CHCl3:MeOH=20:1).
1(6) : Nα-AcLys(Boc)Pro-OH
Lys(Boc)Pro-OH(1(5)에서 제조함) 1.99 g과 1N-NaOH 10.3 ml를 0℃에서 50% THF 수용액 50 ml에 용해시키고, 아세틸클로라이드 0.37 ml를 적하하여 하기 물성 수치를 갖는 표제 화합물 1.41 g을 얻었다.
Rf=0.72(CHC13:MeOH:AcOH=6:2:1).
1(7) : Nα-Ac-Lys(Boc)ProIleGlu(OBzl)-PheNle-pNA
Nα-Ac-Lys(Boc)-Pro-OH(1(6)에서 제조함) 1.36 g과 HOBt 0.524 g을 무수 DMF 20 ml에 용해시키고, -10℃에서 EDC 0.744 g을 가하여 30 분 교반한 후, Ile-Glu(OBz1)-PheNle-pNA·HC1(1(3)에서 제조함) 2.68 g과 N(Et)30.53 ml의 DMF 15 ml 용액을 -10℃에서 적하하여 30 분간 반응시킨 후, 실온에서 16 시간 반응시켰다. 반응 후 DMF를 감압 증류시켜 제거하고, 잔류물을 15% 시트르산 수용액, 10% 탄산수소나트륨 수용액으로 세정한 후, CHC13:MeOH = 10:1의 혼합 용매에 용해시켜 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 유기층을 여과 분리하여 감압 농축시킨 후, 미정제물을 칼럼 크로마토그래피(CHC13:MeOH=50:1)로 정제하여 하기 물성 수치를 갖는 표제 화합물 2.97 g을 얻었다.
Rf=0.39(CHC13:MeOH=20:1)
1(8) : Nα-Ac-LysProIleGluPheNle-pNA·CF3COOH
Nα-Ac-Lys(Boc)-ProIle-Glu(OBz1)-PheNle-pNA(1(7)에서 제조함) 0.100 g을 0℃에서 m-크레졸 0.38 ml를 포함하는 1M 티오아니졸·lM TFMSA·TFA 혼합 용액 5 ml에 용해시키고, 2 시간 교반하여 보호기를 탈보호시킨 다음, 반응 혼합물을 감압 농축시키고, 1ml의 TFA에 용해시킨 후, 빙냉 에테르(Et2O) 200 ml에 적하하고, 침전물을 원심 분리한 다음, 빙냉 에테르(Et2O) 50 ml로 3회 세정하여 감압 건조시켰다. 미정제물을 MeOH에 용해시키고, C18-HPLC-분취용 칼럼으로 정제하여 하기 물성 수치를 갖는 표제 화합물 79 mg을 얻었다.
1H-NMR : (CD3OD) δ=8.22(2H,d), 7.88(2H,d), 7.26(5H,m), 4.65-4.30(5H,m), 4.08(lH,d), 3.95-3.80(1H,m), 3.70-3.55(lH,m), 3.20(lH,dd), 2.97(1H,dd), 2.92(2H,t), 2.38-1.10(29H,m), 0.98-0.82(6H,m).
MS : (M+1)m/z=908
실시예 2 : 화학식 LysProIleGluPheNle-pNA·2CF3COOH로 표시되는 펩티드의 합성
2(1) : CbzPheNle-pNA
CbzPhe-OH 94 mg과 HOBt 42 mg을 무수 DMF 2 ml에 용해시키고, -10℃에서 EDC 60 mg을 가하여 30 분 교반한 후, Nle-pNA·HC1(1(2)의 공정 중에 제조함) 85 mg과 N(Et)30.040 ml의 DMF 2 ml 용액을 -10℃에서 적하하여 30 분 반응시킨 다음, 실온에서 16 시간 반응시켰다. 반응 후 DMF를 증발시켜 제거하고, 잔류물을 AcOEt에서 용해시킨 다음, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 1N 염산 수용액, 포화 염화암모늄 수용액, 포화 식염수로 세정하여 추출한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 유기층을 여과 분리하여 감압 농축시킨 후, 결정을 물로 세정하고 여과하여 하기 물성 수치를 갖는 표제 화합물 109 mg을 얻었다.
1H-NMR : (d6-DMSO) δ=8.34(1H,d), 8.22(2H,d), 7.88(2H,d), 7.50(1H,d), 7.40-7.10(1OH,m), 4.95(2H,s), 4.52-4.30(2H,m), 3.06(1H,dd), 2.72(1H,dd), 1.72(2H,br m), 1.32(4H, br s), 0.98(3H, br m).
MS : (M+1)m/z=533
2(2) : Boc-Glu(OBz1)-OPac
Boc-Glu(OBz1)-OH 5.0 g을 MeOH:물(=9:1) 용액 20 ml에 용해시키고, 실온에서 탄산세슘 2.41 g을 가하여 1시간 교반한 후, 감압 증발시켜 제거하고, 결정을 감압 건조시켰다. 이 결정을 DMF 20 ml에 용해시키고, 페나실브로미드 2.95 g을 가하여 실온에서 18 시간 반응시킨 후 DMF를 증발시켜 제거하고, 잔류물을 AcOEt에 용해시킨 다음, 5% 옥살산 수용액, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 식염수로 세정하여 추출한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 유기층을 여과 분리하여 감압 농축시킨 후 미정제물을 n-헥산:AcOEt(=1:2)로 결정화시켜 하기 물성 수치를 갖는 표제 화합물 6.183 g을 얻었다.
Rf=0.46(n-헥산:AcOEt=2:1).
2(3) : Cbz-Lys(Cbz)Pro-OtBu
Cbz-Lys(Cbz)-OH 3.00 g과 Pro-OtBu 1.36 g과 N(Et)32.0 ml를 CH2C1220 m1에 용해시키고, PyBrop 3.37 g의 CH2C125 ml를 적하한 다음, 실온에서 3.5 시간 반응시켰다. 반응후 CH2C12를 감압 증발시켜 제거하고, 잔류물을 AcOEt에 용해시킨 다음, 10% 옥살산 수용액, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 포화 염화암모늄 수용액, 포화 식염수로 세정하여 추출하고, 무수 황산마그네슘으로 건조시킨 다음, 유기층을 여과 분리하여 감압 농축시킨 후, 미정제물을 칼럼 크로마토그래피(n-헥산:AcOEt = 1:1)로 정제하여 하기 물성 수치를 갖는 표제 화합물 2.87 g을 얻었다.
Rf=0.35(n-헥산:AcOEt=1:1).
2(4) : Cbz-Lys(Cbz)Pro-OH
Cbz-Lys(Cbz)Pro-OtBu(2(3)에서 제조함) 2.87 g을 상기 1(2)에 기재된 방법과 동일한 방식으로 탈보호시켜 하기 물성 수치를 갖는 표제 화합물 1.707 g을 얻었다.
Rf=0.96(AcOEt).
2(5) : Cbz-Lys(Cbz)ProIleGlu(OBz1)-OPac
Boc-Glu(OBz1)-OPac(2(2)에서 제조함) 3.092 g을 디옥산 4 ml에 용해시키고, 4N-HC1의 디옥산 용액을 이용하여 상기 1(2)에 기재된 방법과 동일한 방식으로 탈보호시킨 후, BocIle-OH·H2O 1.792 g을 상기 1(2)에 기재된 방법과 동일한 방식으로 축합시키고, 상기 1(2)에 기재된 방법과 동일한 방식으로 탈보호시켜 Ile-Glu(OBzl)-OPac·HC1 2.122 g을 얻었다. Cbz-Lys(Cbz)-Pro-OH(2(4)에서 제조함) 1.54 g과 HOBt 0.448 g을 무수 DMF 10 m1에 용해시키고, -10℃에서 EDC 0.635 g을 가하여 30 분 교반한 후, 먼저 얻은 IleGlu(OBzl)-OPac·HC1 1.551g과 N(Et)30.45 ml의 DMF l0ml 용액을 -10℃에서 적하하여 30분 반응시킨 뒤, 실온에서 16 시간 반응시켰다. 반응 후 DMF를 감압 증발시켜 제거하고, 잔류물을 AcOEt로 용해시킨 다음, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 1N 염산 수용액, 포화 염화암모늄 수용액, 포화 식염수로 세정하여 추출한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 유기층을 여과 분리하여 감압 농축시킨 후, 미정제물을 칼럼 크로마토그래피(n-헥산:AcOEt=1:2)로 정제하여 하기 물성 수치를 갖는 표제 화합물 2.542 g을 얻었다.
Rf=0.58(AcOE).
2(6) : Cbz-Lys(Cbz)ProIleGlu(OBz1)-OH
Cbz-Lys(Cbz)ProIleGlu(OBz1)-OPaC(2(5)에서 제조함) 1.996 g을 초산 20 ml에 용해시키고, 아연 분말 2.0 g을 가하여 55℃에서 4 시간 반응시킨 후, 초산을 감압 증류시켜 제거하고, 10 ml의 4N-HC1의 디옥산 용액에 용해시킨 다음, 에테르(Et2O) 20O m1를 가해 결정화시켜 하기 물성 수치를 갖는 표제 화합물 1.23 g을 얻었다.
Rf=0.61(CHC13:MeOH:AcOH=80:15:5)`
2(7) : Cbz-Lys(Cbz)ProIleGlu(OBz1)PheNle-pNA
CbzPheNle-pNA(2(1)에서 제조함) 51 mg을 30% HBr-초산에 용해시키고, 30 분 교반한 후 감압 증발시켜 제거하고, 무수 DMF 2 ml에 용해시킨 다음 N(Et)30.013ml를 적하하여 PheNle-pNA·Et4NHBr를 얻었다.
Cbz-Lys(Cbz)ProlleGlu(OBz1)-OH(2(6)에서 제조함) 80 mg과 HOBt 14 mg을 무수 DMF 2 m1에 용해시키고, -10℃에서 EDC 20 mg을 가해 30 분 교반한 후, 먼저 얻어진 PheNle-pNA·Et4NHBr의 DMF 용액을 -10℃에서 적하하여 30 분간 반응시킨 다음 실온에서 16 시간 반응시켰다. 반응 후 DMF를 증발시켜 제거하고 잔류물을 AcOEt에 용해시킨 다음, 1N-HC1 수용액, 10% 탄산수소나트륨 수용액으로 세정하고, 포화 염화암모늄 수용액, 포화 식염수로 세정하여 추출한 후, 무수 황산마그네슘으로 건조시키고, 유기층을 여과 분리하여 감압 농축시킨 후, 하기 물성 수치를 갖는 표제 화합물의 미정제물 106 mg을 얻었다.
Rf=0.39(CHC13:MeOH=20:1).
2(8) : LysProIleGluPheNlepNA·2 CF3COOH
Cbz-Lys(Cbz)ProIleGlu(OBz1)PheNle-pNA(2(7)에서 제조함) 106 mg을 0℃에서 m-크레졸 0.38 ml를 포함하는 1M 티오아니졸·1M TFMSA·TFA 혼합 용액 5 ml에 용해시키고, 2 시간 교반하여 보호기를 탈보호시킨 후, 반응 혼합물을 감압 농축시키고, 1 ml의 TFA에 용해시킨 다음, 빙냉 에테르(Et2O) 200 m1에 적하하고, 침전물을 원심 분리하고 빙냉 에테르(Et2O) 50 ml로 3회 세정하여 감압 건조시켰다. 미정제물을 MeOH에 용해시키고, C18-HPLC-분취용 컬럼으로 정제하여 하기 물성 수치를 갖는 표제 화합물 17 mg을 얻었다.
1H-NMR : (CD3OD) δ= 8.24(2H,d), 7.85(2H,d), 7.26-7.10(5H,m), 4.64(1H,dd), 4.55(1H,dd), 4.42(1H,dd), 4.38(1H,dd), 4.25(1H,dd), 4.11(lH,d), 3.73(1H,m), 3.59(1H,dd), 3.16(1H,dd), 2.96(1H,dd), 2.94(2H,t), 2.36(2H,t), 2.24(1H,m), 2.12-1.64(23H,m), 1.96(1H,m), 0.96-0.85(6H,m).
MS : (M+1+18)m/z=884.
실시예 3 : 화학식 LysProIleGluPheTyr-pNA·2 CF3COOH로 표시되는 펩티드의 합성
실시예 2에 기재된 방법과 동일한 방식으로 합성을 실시하여 하기 물성 수치를 갖는 표제 화합물을 얻었다.
1H-NMR : (CD3OD) δ=8.20(2H,d), 7.79(2H,d), 7.16(5H, br s), 7.06(2H,d), 6.66(2H,d), 4.57(3H,m), 4.36(1H,dd), 4.25(1H,dd), 4.11(1H,d), 3.72(1H,br m), 3.58(1H,br m), 3.14-2.84(4H, m), 2.38-1.06(18H, m), 0.89(3H,t).
MS : (M+1)m/z=916.
실시예 4 : 화학식 LysProIleGluPhePhe-pNA·2CF3COOH로 표시되는 펩티드의 합성
실시예 2에 기재된 방법과 동일한 합성을 실시하여 하기 물성 수치를 갖는 표제 화합물을 얻었다.
1H-NMR : (CD3OD) δ=8.20(2H,d), 7.79(2H,d), 7.30-7.10(10H,m), 4.75-4.04(6H,m), 3.78-3.54(2H,m), 3.20-2.84(4H,m), 2.38-1.06(18H,m), 0.89(3H,br m).
MS : (M+23)m/z=922.
실시예 5 : 화학식 LysProIleGluPhePhe(NO2)-pNA·2CF3COOH로 표시되는 펩티드의 합성
실시예 2에 기재된 방법과 동일한 방식으로 합성을 실시하여 하기 물성 수치를 갖는 표제 화합물을 얻었다.
1H-NMR : (CD3OD) δ=8.21(2H,d), 8.14(2H,d), 7.81(2H,d), 7.52(2H,d), 7.20-7.06(5H,m), 4.61-4.50(3H,m), 4.34(1H,dd), 4.25(1H,dd), 4.11(1H,d), 3.72(1H,br m), 3.58(1H,br m), 3.14-2.84(4H,m), 2.38-1.06(18H,m), 0.89(3H,t).
MS : (M+1)m/z=945,
실시예 5(a) : 화학식 Nα-AcLysProIleGlu-Phe(NO2)-Nle-pNA·CF3COOH로 표시되는 펩티드의 합성
실시예 1에 기재된 방법과 같은 방식으로 합성을 실시하여 하기 물성 수치를 갖는 표제 화합물을 얻었다.
1H-NMR : (CD3OD) δ=8.21(2H,d), 8.05(2H,d), 7.83(2H,d), 7.50(2H,d), 4.74(1H,dd), 4.58(1H,dd), 4.45(1H,dd), 4.42(1H,dd), 4.34(1H,dd), 4.08(1H,d), 3.90-3.82(1H,m), 3.68-3.60(1H,m), 3.31(2H,dd), 3.08(2H,dd), 2.94(2H,t), 2.33(2H,t), 2.25-2.19(1H,m), 2.10-1.24(20H,m), 1.24-1.14(1H,m), 0.92(3H,t), 0.88(3H,t), 0.82(3H,d).
MALDI + : (M+H)m/z=953, (M+Na)m/z=975, (M+K)m/z=991.
실시예 6 : 펩신 I 및 펩신의 본 발명 기질에 대한 분해성의 측정
시약
실시예 1∼5(a)에서 제조한 것 중 어느 하나의 펩티드 0.5 mM을 함유하는 포름산 완충액 또는 글리신 완충액(pH 2.0∼3.0).
효소액 I
0.0l mg/ml의 사람 펩신 I 또는 사람 펩신 수용액.
효소액
아미노펩티다아제 M(베링거만하임사의 제품, 돼지 신장에서 유래한 것)이 2U/ℓ의 농도가 되도록 1M Tris-HC1 완충액(pH 9.0)에 용해시켰다.
측정법
(1) HPLC에 의한 측정
시약 1.0 ml에 효소액 I 0.1 ml를 첨가한 후, 37℃에서 10 분, 30 분, 60 분 가온한 후, 혼합액을 0.3 ml 취한 다음, 2N-NaOH 0.025 ml을 첨가하여 반응을 정지시키고, 2N-HCl 0.025 ml를 첨가하여 한외 여과법에 의해 단백을 제거하였다. 단백을 제거한 후, 용액을 C18 컬럼을 이용한 HPLC에 의해, 사람 펩신으로 소화시켜 생성시킨 H-Y-pNA(Nle-pNA : 실시예 1 및 2, Tyr-pNA : 실시예 3, Phe-pNA : 실시예 4, Phe(NO2)-pNA : 실시예 5)에 대해 정량하였다.
(2) p-NA 발색에 의한 측정
시약 1.0ml에 효소액 I 0.1 ml를 첨가한 후, 37℃에서 10 분 가온한 다음, 혼합액 0.25 ml에 효소액 Ⅱ 0.05 ml를 첨가하고, 37℃에서 5 분간 가온한 후, 405nm의 흡광도차 Es를 구하였다. 한편, 정제물을 이용하여 동일한 방식으로 조작하여, 맹검치(盲檢値) E(BL)를 측정하였다. 하기 수학식 1에 따라 흡광도 변화 E를 측정하였다.
E=Es-E(BL)
(1) HPLC 및 (2) p-NA 발색에 의한 측정 결과는 하기 표 1에 기재하였다.
펩신 I/펩신 상대 반응비는 HPLC에 의한 측정 결과에 근거하여 산출하였다. 이것은, 기질이 정확하게 펩신 I 또는 펩신에 의해 소화되어 H-Y-pNA가 유리되는 것을 확인하기 위한 것이다.
구조식(실시예 번호) 반응 pH 펩신 효소량(ng/ml) 펩신 활성화(μM/분ㆍ909 ngEnz/ml) HPLC에 의한 측정 펩신 활성화(mABS/10분ㆍ909 ngEnz/ml)p-NA에 의한 측정 펩신I/펩신II의 상대반응비
펩신I 펩신 II 펩신 I 펩신 II
Nα-Ac-Lys-Pro-Ile-Glu-Phe-Nle-pNAㆍCF3COOH(실시예 1) 2.0 909 52.7 0.55 4391.7 45.8 95.8
Lys-Pro-Ile-Glu-Phe-Nle-pNAㆍ2CF3COOH(실시예 2) 3.0 909 8.6 0.37 716.7 30.8 23.2
Lys-Pro-Ile-Glu-Phe-Tyr-pNAㆍ2CF3COOH(실시예 3) 2.0 909 17.1 0.37 1425.0 30.8 46.2
Lys-Pro-Ile-Glu-Phe-Phe-pNAㆍ2CF3COOH(실시예 4) 3.0 909 10.9 0.16 908.3 13.3 68.1
Lys-Pro-Ile-Glu-Phe-Phe(NO2)-pNAㆍ2CF3COOH(실시예 5) 3.0 909 1.2 0.07 100.0 5.8 17.1
Nα-Ac-Lys-Pro-Ile-Glu-Phe(NO2)-Nle-pNAㆍCF3COOH(실시예 5(a)) 2.0 909 36.4 0.69 3036.2 57.3 52.8
상기 표 1로부터 분명하게 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩티드는 펩신 I에 특이적이라는 것을 알 수 있다. pNA 발색에 의한 측정시에도 동일한 효과를 나타내었다.
실시예 7 : 본 발명의 방법에 의한 사람 혈청 중의 펩시노오겐 I의 정량(RIA법과의 상관)
시액 I
Nα-Ac-LysProIleGluPheNle-pNA·CF3COOH(실시예 1에서 제조함)가 0.5 mM의 농도가 되도록, 50mM의 타르타르산 완충액(pH 2.0)에 용해시켰다.
시액 Ⅱ
암모니펩티다아제 M(베링거만하임사의 제품, 돼지 신장에서 유래한 것임)이 2U/l의 농도가 되도록, 0.8M Tris-HCl 완충액(pH 9.0)에 용해시켰다.
시료
사람 혈청 30 검체
측정 방법
시료 0.025 ml에 시액 I 0.25 ml를 가하고, 37℃에서 5 분간 가온한 후, 시액 Ⅱ 0.05 ml를 가하여 동일한 온도에서 5 분간 가온하고, 405 nm의 흡광도에서 600 nm의 흡광도를 뺀 흡광도차 Es를 구하였다. 한편, 생리 식염수를 이용하여 동일한 방식으로 조작하여, 맹검치 E(BL)를 구하고, 하기 수학식 1에 따라 5 분간의 흡광도 변화 E를 산출하였다.
수학식 1
E=Es-E(BL)
비교
시판되는 펩시노오겐 I 측정용 키트(다이나봇트사의 제품)(RIA법)을 이용하여, 설명서의 방법에 따라 혈청 중의 펩시노오겐 I를 측정하였다. 본 방법과 RIA법과의 상관도를 도 1에 도시하였다.
도 1에서 분명하게 알 수 있는 바와 같이, 본 방법에 의한 측정치와 RIA법의 측정치는 양호한 상관 관계가 있으므로, 본 방법에 의해 혈청 중의 펩시노오겐 I를 측정할 수 있다는 것을 알 수 있다.
[서열 목록]
출원인 성명 : 오노 야쿠힝 고교 가부시키가이샤
발명의 명칭 : 펩티드, 사람 펩시노오겐 I 또는 사람 펩신 I의 측정 방법, 및 측정
용 키트
정리 번호 : ONF-2478PCT
출원 번호 : PCT/JP97/04540
출원일 : 1997. 12. 10.
우선권 번호 : 평성 8년 특허 출원 제351807호
우선일 : 1996. 12. 12.
서열의 수 : 7
서열 번호 1에 대한 정보
서열의 길이 : 8
서열의 형태 : 아미노산
토폴로지 : 직쇄형
서열의 특징
존재 위치 : 1
기타 정보 : 수소, 아미노기의 보호기, 또는 D-아미노산 또는 L-아미노산을 1개
또는 2개 가진 잔기
존재 위치 : 2
기타 정보 : Lys 또는 Arg
존재 위치 : 6
기타 정보 : Phe 또는 p-니트로페닐알라닌 잔기
존재 위치 : 7
기타 정보 : Phe, Tyr, Nle, Leu, Met, 3,5-디요오도티로신, p-니트로페닐알라
닌 잔기, 벤질옥시아스파라긴산 잔기
존재 위치 : 8
기타 정보 : 아닐린 유도체 잔기, 아미노쿠마린 유도체 잔기 또는 아미노나프탈
렌 유도체 잔기
[서열]
Xaa Xaa Pro Ile Glu Phe Xaa Xaa
1 5
서열 번호 2에 대한 정보
서열의 길이 : 6
서열의 형태 : 아미노산
토폴로지 : 직쇄형
서열의 특징
존재 위치 : 1
기타 정보 : Nα-아세틸리딘 잔기
존재 위치 : 6
기타 정보 : p-니트로아닐릴노르류신 잔기
[서열]
Lys Pro Ile Glu Phe Nle
1 5
서열 번호 3에 대한 정보
서열의 길이 : 6
서열의 형태 : 아미노산
토폴로지 : 직쇄형
서열의 특징
존재 위치 : 6
기타 정보 : p-니트로아닐릴노르류신 잔기
[서열]
Lys Pro Ile Glu Phe Nle
1 5
서열 번호 4에 대한 정보
서열의 길이 : 6
서열의 형태 : 아미노산
토폴로지 : 직쇄형
서열의 특징
존재 위치 : 6
기타 정보 : p-니트로아닐릴티로신 잔기
[서열]
Lys Pro Ile Glu Phe Tyr
1 5
서열 번호 5에 대한 정보
서열의 길이 : 6
서열의 형태 : 아미노산
토폴로지 : 직쇄형
서열의 특징
존재 위치 : 6
기타 정보 : p-니트로아닐릴페닐알라닌 잔기
[서열]
Lys Pro Ile Glu Phe Phe
1 5
서열 번호 6에 대한 정보
서열의 길이 : 7
서열의 형태 : 아미노산
토폴로지 : 직쇄형
서열의 특징
존재 위치 : 6
기타 정보 : p-니트로(p-니트로아닐릴)페닐알라닌 잔기
[서열]
Lys Pro Ile Glu Phe Phe
1 5
서열 번호 7에 대한 정보
서열의 길이 : 6
서열의 형태 : 아미노산
토폴로지 : 직쇄형
서열의 특징
존재 위치 : 1
기타 정보 : Nα-아세틸리딘 잔기
존재 위치 : 5
기타 정보 : p-니트로페닐알라닌 잔기
존재 위치: 6
기타 정보 : p-니트로아닐릴노르류신 잔기
[서열]
Lys Pro Ile Glu Phe Nle
1 5

Claims (7)

  1. 화학식 I로 표시되는 펩티드 또는 그 산 부가염:
    화학식 I
    R-X-ProIleGlu-W-Y-Z
    [식 중,
    R은 수소, 아미노기의 보호기, 또는 D-아미노산 또는 L-아미노산을 1개 또는 2개 가진 잔기를 나타내고,
    X는 Lys 또는 Arg 잔기를 나타내고,
    W는 Phe 또는 Phe(NO2) 잔기(식 중, Phe(NO2)는 p-니트로페닐알라닌 잔기를 나타냄)를 나타내고,
    Y는 Phe, Phe(NO2), Tyr, Dit, Nle, Leu, Asp(OBzl) 또는 Met 잔기(식 중, Dit는 3,5-디요오도티로신 잔기를 나타내고, Nle는 노르류신 잔기를 나타내며, OBz1는 벤질옥시를 나타내고, Phe(NO2)는 상기와 동일한 의미를 나타냄)를 나타내며,
    Z는 아닐린 유도체 잔기, 아미노쿠말린 유도체 잔기 또는 아미노나프탈렌 유도체 잔기를 나타냄].
  2. 제1항에 있어서, Y가 Phe, Phe(NO2), Tyr 또는 Nle 잔기(식 중, 모든 기호는 제1항에 기재된 바와 동일한 의미를 나타냄)인 펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R이 수소 또는 C1∼C6의 알킬카르보닐인 펩티드.
  4. 하기 화학식 Ia, Ib, Ic, Id, Ie 또는 If로 표시되는 펩티드 또는 그 산 부가염:
    화학식 Ia
    Nα-Ac-LysProIleGluPheNle-pNA
    화학식 Ib
    LysProIleGluPheNle-pNA
    화학식 Ic
    LysProIleGluPheTyr-pNA
    화학식 Id
    LysProIleGluPhePhe-pNA
    화학식 Ie
    LysProIleGluPhePhe(NO2)-pNA
    화학식 If
    Nα-Ac-LysProIleGluPhe(NO2)Nle-pNA
    [식 중, Ac는 아세틸기를 나타내고, Nle는 노르류신 잔기를 나타내고, pNA는 p-니트로아닐린 잔기를 나타내며, Phe(NO2)는 p-니트로페닐알라닌 잔기를 나타냄]
  5. 검체 중의 사람 펩시노오겐 I를 활성화하여 얻어지는 사람 펩신 I 또는 검체중의 사람 펩신 I에 의해, 제1항에 기재된 화학식 I(식 중, 모든 기호는 제1항의 기재와 동일한 의미를 나타냄)로 표시되는 펩티드 또는 그 산 부가염을 절단하여 얻어지는 화학식 Ⅱ로 표시되는 아미노산 유도체를 아미노펩티다아제로 소화시켜 얻어지는 화학식 Z-H의 아닐린 유도체, 아미노쿠말린 유도체 또는 아미노나프탈렌 유도체를 검출하는 것을 특징으로 하는 사람 펩시노오겐 I 또는 사람 펩신 I의 측정 방법:
    화학식 II
    H-Y-Z
    [식 중, 모든 기호는 제1항에 기재된 바와 동일한 의미를 나타냄]
  6. 제5항에 있어서, 제4항에 기재한 화학식 Ia, Ib, Ic, Id, Ie 또는 If(식 중, 모든 기호는 제4항에 기재된 바와 동일한 의미를 나타냄)로 표시되는 펩티드 또는 그 산 부가염을 사용하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.
  7. 제1항에 기재된 화학식 I(식 중, 모든 기호는 제1항에 기재된 바와 동일한 의미를 나타냄)로 표시되는 펩티드 또는 그 산 부가염, 및 아미노펩티다아제를 기질로서 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 펩시노오겐 I 또는 사람 펩신 I 측정용 키트.
KR1019990705189A 1996-12-12 1997-12-10 펩티드, 사람 펩시노오겐 ｉ 또는 사람 펩신 ｉ의 측정 방법,및 측정용 키트 KR20000057503A (ko)

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