JPH0234959B2 - Horipepuchidojudotai - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はヒト脾臓フイブリン分解酵素（以下
SFPと略す。）と特異的に反応する新規な合成基
質に関するものである。 本発明者らはSFP、白血球中のエラストターゼ
様酵素を特異的に且つ感度よく測定できる新規合
成基質サクシニル―Ｌ―チロシル―Ｌ―ロイシル
―Ｌ―バリン―Ｐ―ニトロアニリドについて先に
特許出願（特願昭55−131709号）を行なつている
が、本発明者らはさらに研究を重さねた結果SFP
に対しすぐれた特異性を有する新規合成基質を見
い出し、本発明を完成した。 SFPは特異的にフイブリンおよびフイブリノー
ゲンを分解する中性プロテイナーゼであり、分子
量約30000の塩基性蛋白質である。SFPは無菌動
物には存在しない。細菌性内毒素投与により惹起
した血管内凝固症候群においては血液凝固機能亢
進の発現と共に増加し、その消退と共に回復す
る。この酵素は網内系（以下RESと略す。）細胞
における微細血栓除去機構と密接な関連を有する
ものと考えられる。 本酵素は元来不溶性細胞顆粒内酵素であるが、
活性増加時には溶性酵素として血中にも出現す
る。従つて本基質を使用しての血中酵素測定によ
りプラスミン作用とは分離してSFPが測定でき、
RESの活性亢進を推察することができる。本発
明に係る新規なポリペプチド誘導体は次の一般式
で示される。 （式中Ａは第三ブチルオキシカルボニル基また
はサクシニル基を示す。） 本基質によるSFPの測定原理を化学式で示せば
下記の通りである。 （式中Ａは前記と同様である。） 即ち本基質をPH７の緩衝液中被検査血清と混合
し、SFPの濃度に比例して生成するＰ―ニトロア
ニリンの吸光度を測定する。なお、Ｐ―ニトロア
ニリンの代りに他の発色性物質あるいは螢光性物
質を使用し、可視部の吸光度の変化、螢光スペク
トルの変化により直接測定したり、あるいは芳香
族アミノ化合物の定量で通常行なわれるジアゾ発
色反応、インドフエノール発色反応等を応用し、
発色度を高めて測定することも可能である。以上
の如く測定系は臨床検査の分野で行なわれている
公知方法を応用して種々の組合せにより実施する
ことができるが、本発明の範囲がそれにより限定
されるものではない。該ポリペプチド誘導体は次
の如くして得ることができる。 例えば保護されたアミノ基をもつＬ―アラニン
（以下Ｌ―Alaと略す。）とＬ―チロシル―Ｌ―ロ
イシル―Ｌ―バリン―Ｐ―ニトロアニリド（以下
Ｌ―Tyr―Ｌ―Leu―Ｌ―Val―PNAと略す。）
をＮ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミド法、
Ｎ，N′―ジシクロヘキシルカルボジイミドと添
加剤による方法、アチド法あるいは混合酸無水物
法等常法により縮合させ、Ｎ―保護ポリペプチド
誘導体即ち保護基―Ｌ―AIa―Ｌ―Tyr―Ｌ―
Leu―Ｌ―Val―PNAを得ることができる。な
お、該縮合物のアミノ保護基を常法により脱離さ
せ、遊離ポリペプチド誘導体Ｈ―Ｌ―AlaL―
Tyr―L′―Leu―Ｌ―Val―PNAを得、次いでこ
の遊離したアミノ基をトリエチルアミン存在下、
酢酸エチルまたはピリジン中無水コハク酸にてサ
クシニル化しサクシニル―Ｌ―Ala―Ｌ―Tyr―
Ｌ―Leu―Ｌ―Val―PNAとするか、またはアミ
ノ保護基を脱離させた該ポリペプチド誘導体にさ
らに保護されたアミノ基をもつＬ―Alaを前記と
同様の方法で縮合させ保護基―Ｌ―Ala―Ｌ―
Ala―Ｌ―Tyr―Ｌ―Leu―Ｌ―Val―PNAを得、
該ポリペプチド誘導体を前記同様常法により保護
基を脱離させ遊離ポリペプチド誘導体Ｈ―Ｌ―
Ala―Ｌ―Ala―Ｌ―Tyr―Ｌ―Leu―Ｌ―Val―
PNAを得た後、さらにこの遊離したアミノ基を
前記同様にしてサクシニル化しサクシニル―Ｌ―
Ala―Ｌ―Ala―Ｌ―Tyr―Ｌ―Leu―Ｌ―Val―
PNAとすればよい。 なお、本発明で使用するＬ―Alaは市販品が利
用できる。一方、保護されたアミノ基を持つＬ―
Ala―Ｌ―Tyr―Ｌ―Leu―Ｌ―Val―PNAは本
発明者らが出願した特許願昭56−44745号に記載
の方法で合成することができる。なお、合成方法
については後にも参考例として記載した。 本発明も実施するに必要な保護基はベンジルオ
キシカルボニル基、第三ブチルオキシカルボニル
基などペプチド合成に際し慣用されているアミノ
基の保護基をあげることができる。 また、保護基を脱離するにはペプチド合成の際
にアミノ基の保護基を脱離するのに慣用されてい
る手段に従つて容易に行なうことができる。 この様にして得た本発明の新規合成基質はSFP
の酵素作用によつてＰ―ニトロアニリンが生成せ
られるので、このものを比色定量することにより
SFP活性を求めることができる。本基質は以下に
記載の如くSFPを測定するためのすぐれた新規合
成基質である。

【表】 次に参考例及び実施例により本発明をさらに詳
細に説明する。 参考例 １ Ｎ―第三ブチルオキシカルボニル―Ｌ―アラニ
ル―Ｌ―チロシル―Ｌ―ロイシル―Ｌ―バリン
―Ｐ―ニトロアニリド Ｎ―第三ブチルオキシカルボニル―Ｌ―チロシ
ル―Ｌ―ロイシル―Ｌ―バリン―Ｐ―ニトロアニ
リド1.2g（0.002モル）に7.5規定塩化水素ジオキサ
ン溶液1.8mlを加え、40分間撹拌した後エーテル
50mlを加え、生じた白色沈殿を遠心分離して集め
た。デシケーター中水酸化カリウム上で乾燥し、
得られたＬ―チロシル―Ｌ―ロイシル―Ｌ―バリ
ン―Ｐ―ニトロアニリドの塩化水素基をＮ，Ｎ―
ジメチルホルムアミド（DMF）30mlに溶解し、
トリエチルアミンでPH８に調節した後Ｎ―第三ブ
チルオキシカルボニル―Ｌ―アラニン0.38g
（0.002モル）、１―ヒドロキシベンゾトリアゾー
ル0.27g（0.002モル）を加え溶解し、氷―食塩に
て冷却し、Ｎ，N′―ジシクロヘキシルカルボジ
イミド0.45g（0.0022モル）を加えて室温にて18時
間撹拌した。生じた沈殿を去し、溶媒を減圧下
留去した。残留物を酢酸エチルに溶解し、氷冷下
10％クエン酸、５％炭酸ナトリウム続いて水で洗
浄した。酢酸エチル層を無水硫酸ナトリウム上で
乾燥し、酢酸エチルを留去。残渣オイルにエーテ
ルを加え、粗生成物を得た。シリカゲルクロマト
グラフイーで精製し、クロロホルム―エーテルよ
り結晶化し、融点153〜155℃旋光度〔α〕²⁵ _D−
65.9゜（メタノール、Ｃ＝1.38）の目的化合物を得
た。収量540mg（収率39.4％）、このものはシリカ
ゲル薄層クロマトグラフイー（クロロホルム：メ
タノール：酢酸＝90：８：２；クロロホルム：メ
タノール：水＝８：３：１の下層）にて単一のス
ポツトを示した。 元素分析値（C₃₄H₄₈N₇C₉として） 計算値；C59.64 H7.06 N12.27 実測値；C59.44 H7.01 N12.23 参考例 ２ サクシニル―Ｌ―アラニル――Ｌ―チロシル―
Ｌ―ロイシル―Ｌ―バリン―Ｐ―ニトロアニリ
ド Ｎ―第三ブチルオキシカルボニル―Ｌ―アラニ
ル―Ｌ―チロシル―Ｌ―ロイシル―Ｌ―バリン―
Ｐ―ニトロアニリド340mg（0.50ミリモル）に7.5
規定塩化水素ジオキサン溶液1.2mlを加え、室温
で撹拌した。20分後エーテル50mlを加え生じた沈
殿を吸引過で集め、デシケーター中水酸化カリ
ウム上で乾燥した。この化合物を水10mlに溶解し
炭酸ナトリウムを加えPH８〜９とした。生じたオ
イルを酢酸エチルにて抽出するとＬ―アラニル―
Ｌ―チロシル―Ｌ―ロイシル―Ｌ―バリン―Ｐ―
ニトロアニリドが結晶として析出する。これを吸
引過で集めピリジン10mlに溶解し、トリエチル
アミン0.07ml（0.50ミリモル）を加え氷冷し撹拌
した。無水コハク酸150mg（1.5ミリモル）を５回
に分けて15分間隔で加え、さらに３時間撹拌し
た。反応液を留去し、残留物を10％酢酸―酢酸エ
チル（10ml＋10ml）に溶解し、酢酸エチル層を分
離後水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後酢
酸エチルを留去した。残渣にエーテルを加え生じ
た白色沈殿を吸引過で集めた。この粗サクシニ
ル―Ｌ―アラニル―Ｌ―チロシル―Ｌ―ロイシル
―Ｌ―バリン―Ｐ―ニトロアニリド240mg（0.35
ミリモル）をメタノール15mlに溶解し、１規定水
酸化ナトリウム0.70ml（0.70ミリモル）を加え室
温にて40分間撹拌した。酢酸で中和の後メタノー
ルを留去し、残渣を酢酸エチル―10％酢酸（10ml
―10ml）に溶解した。有機層を水で洗浄し、無水
硫酸ナトリウムで乾燥した後、酢酸エチルを留去
した。残渣にエーテルを加え、生じた白色結晶を
吸引過で集め目的化合物を得た。収量180mg
（収率56.2％）、融点230〜234℃、旋光度〔α〕²⁵ _D
−28.0゜（メタノール、Ｃ＝1.0）、薄層クロマトグ
ラフイー上（クロロホルム：メタノール：酢酸＝
90：８：２；クロロホルム：メタノール：水＝
８：３：１の下層）で単一スポツトを示した。 元素分析値（C₃₃H₄₄N₆O₁₀） 計算値；C57.88 H6.47 N12.27 実測値；C57.71 H6.77 N11.97 実施例 １ Ｎ―第三ブチルオキシカルボニル―Ｌ―アラニ
ル―Ｌ―アラニル―Ｌ―チロシル―Ｌ―ロイシ
ル―Ｌ―バリン―Ｐ―ニトロアニリド Ｎ―第三ブチルオキシカルボニル―Ｌ―アラニ
ル―Ｌ―チロシル―Ｌ―ロイシル―Ｌ―バリン―
Ｐ―ニトロアニリド490mg（0.72ミリモル）に7.5
規定塩化水素ジオキサン溶液0.28ml（2.1ミリモ
ル）を加え室温にて30分撹拌した。エーテル50ml
を加え、生じた白色沈殿を吸引過で集めた。こ
の化合物の水に溶解し、炭酸トリウムを加え、PH
９とし吸引過にて沈殿を集めた。これを20mlの
Ｎ，Ｎ―ジメチルホルムアミド20mlに溶解し、Ｎ
―第三ブチルオキシカルボニル―Ｌ―アラニン
0.14g（0.72ミリモル）、１―ヒドロキシベンゾト
リアゾール0.10g（0.72ミリモル）を加え、食塩―
氷で冷却した。これにＮ，N′―ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド0.16g（0.80ミリモル）を加え、
室温で18時間撹拌した。生じた沈殿を吸引過で
除き、溶媒を留去した後残渣に酢酸エチルを加
え、生じた沈殿を吸引過で集め次いでシリカゲ
ルクロマトグラフイーで精製し目的物を得た。収
量370mg（収率68.0％）、融点238〜241℃、旋光度
〔α〕²⁵ _D−15.2゜（DMF，Ｃ＝0.48）、薄層クロマトグ
ラフイー（クロロホルム：メタノール：酢酸＝
90：８：２；クロロホルム：メタノール水＝８：
３：１の下層）上にて単一スポツトを示した。 元素分析値（C₃₇H₅₃N₇O₁₀として） 計算値；C58.79 H7.06 N12.97 測定値；C58.66 H7.21 N12.98 実施例 ２ サクシニル―Ｌ―アラニル―Ｌ―アラニル―Ｌ
―チロシル―Ｌ―ロイシル―Ｌ―バリン―Ｐ―
ニトロアニリド Ｎ―第三ブチルオキシカルボニル―Ｌ―アラニ
ル―Ｌ―アラニル―Ｌ―チロシル―Ｌ―ロイシル
―Ｌ―バリン―Ｐ―ニトロアニリド270mg（0.36
ミリモル）に7.5規定塩酸ジオキサン溶液2.47ml
（18.7ミリモル）を加え、室温で30分間撹拌した。
エーテル50mlを加え、吸引過して沈殿を集めた
後デシケーター中水酸化カリウム上で乾燥した。
得られた化合物を水10mlに溶解し、炭酸ナトリウ
ムでPH８〜９とした。生じた沈殿を吸引過で集
め、水、酢酸エチルで洗浄した。 本品をピリジン20mlに溶解し、トリエチルアミ
ン0.05ml（0.36ミリモル）を加え０℃で撹拌した
後、無水コハク酸100mg（1.0ミリモル）を20分お
きに５回に分けて加えた。さらに１時間０℃で撹
拌を続けた。溶媒を留去し残渣オイルを酢酸エチ
ル20ml、10％酢酸20mlに溶解後分液した。酢酸エ
チル層を取り、水で洗浄するとゲルが析出する。
このゲル状物質を吸引過で目的物質を得る。収
量220mg（収率81.6％）、融点214〜218℃、旋光度
〔α〕²⁵ _D−35.7゜（メタノール、Ｃ＝0.85）、薄層ク
ロ
マトグラフイー（クロロホルム：メタノール：酢
酸＝90：８：２；クロロホルム：メタノール：水
＝８：３：１の下層）上にて単一スポツトを与え
た。 元素分析値（C₃₆H₄₉N₇O₁₁として） 計算値；C57.21 H6.57 N12.97 実測値；C57.27 H6.21 N12.65

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 （式中Ａは第三ブチルオキシカルボニル基また
   はサクシニル基を示す。）で表わされるポリペプ
   チド誘導体。