JP2890330B2 - ファクターＸａを同定するためのペプチド基質 - Google Patents

ファクターＸａを同定するためのペプチド基質

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の技術分野 本発明は新規な工業製品としてトリーまたはテトラペ
プチドに関する。これらの新規製品はヘモスタシス機構
に関与するファクターXa（例えば活性化されたファクタ
ーＸ）を同定および分析するための基質として特に有用
である。本発明は、さらに、上記新製品を製造する方法
および前記製品によってファクターXaを分析および／ま
たは同定する方法に関する。
従来技術 クラスE.C.3.4.21に属する酵素（Enzyme Nomenclatur
e,Elsevier Scientific Publication Company,Amsterda
m,1973,pg.238 et seq.に定義されていてそれ以前の名
称はクラスE.C.3.4.4）はタンパク質またはペプチド骨
格をArg,Lys,OrnおよびHis残基のカルボキシル基で開裂
する基質として知られている。この開裂機構は当業者に
は十分知られていて以下に引用する従来技術文献におい
て詳細に例証されている。
前記クラスに属する酵素にたいし現在使用されている
基質はそのＮ末端が一般に保護基例えばベンゾイル、ベ
ンジロキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、ｔ−
アミロキシカルボニル、トシル、アセチルその他で置換
されそのCO末端が放射性基またはラジカル、特にｐ−ニ
トロアニソール基でありうるアミノ化された原子団でア
ミド化された本来トリーまたはテトラペプチドであり開
裂前、好ましくは開裂後着色または蛍光を発することの
できるものである。これに関する引例は下記のものであ
る。
FR−Ａ−2 372 798,EP−Ａ−0 004 256,US−Ａ−4 50
8 644,US−Ａ−4 448 715,FR−Ａ−2 471 411,FR−Ａ−
2 317 280およびFR−Ａ−2 459 226. 上記引用特許文献中のペプチド誘導体は水にたいして
親和性が乏しいことが知られている。即ち、これらペプ
チドは水にたいし溶解性が乏しいか、あるいは、分散性
が乏しい。したがって、これらペプチド誘導体を使用す
るためには場合によって有機溶媒を加える必要がある。
混合溶媒からなる系は生物学的媒体と相溶性に乏しい。
この場合、基質の活性を低下させ、場合によっては、被
験酵素の変敗を起こすことになる。さらに、これら基質
の水にたいする親和性が乏しいことは酵素分析法の感度
を悪くすることになる。
酵素基質の水への溶解性を改良する方法として、EP−
Ａ−0 025 190は、Ｎ−末端をアルキル基でモノエステ
ル化したポリエチレングリコール残基例えばMe-O(CH2CH
2O)x-CO（式中、ｘはポリエチレングリコール残基平均
分子量600を有す。）で置換し、ペプチド鎖のCO末端を
含むアミノ酸残基が以下に明細書中で述べる本願発明に
おいてみられるArg,Lys以外であることからなるはじめ
ての溶液手段を開示している。また、本出願人のEP−Ａ
−0 280 610は、アルコキシカルボニルメチレンカルボ
ニル残基例えばメトキシマロニル残基（即ち、Me-O-CO-
CH2-CO,MMと略記する）をジペプチドのＮ末端に結合さ
せることからなるもうひとつの溶液手段を開示してい
る。
さらに、上記引用したEP−Ａ−0 280 610によれば、
前記Ｎ末端に前記メトキシマロニル残基を有するジペプ
チド基質は、前記トリーおよびテトラペプチドよりも、
クラスE.C.3.4.21に属する酵素にたいしてより感度のよ
いものとして一般に存在する。しかし、EP−Ａ−0 280
610によれば、これらジペプチドはファクターXaにたい
し特に特異的ではなく前記ファクターXaの効果的な分析
法とはならない。
ファクターXaは、サブクラスE.C.3.4.12.6に属する
が、ヘモスタシス機構に関与する重要な成分のひとつで
ある。ファクターＸを活性化するとファクターXaが形成
される。これはプロトロンビンをトロンビンに変換する
ためのセリンプロテアーゼである。したがって、ファク
ターXaに対して特異的であり、かつ、簡単な測定技術に
よってなんらかの不利なトロンボエンボリックアクシデ
ントが起こる前に使用することができるペプチド基質を
有することは、診断学的見地から、きわめて興味深い。
周知のとおり、トリーおよびテトラペプチドはファク
ターXaの測定のために既に推奨されている。下記は推奨
されているトリペプチドのよく知られた具体例である。
上記引用したEP−Ａ−0 004 256から Cbo−Ｌ−Pyr−Gly−Ｌ−Arg−pNA、 Ｈ−Ｌ−Pyr−Gly−Ｌ−Arg−pNA およびこれらの酸付加塩； EP−Ａ−0 110 306から Ｚ−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg−pNA （従来技術を示すものとしてある。EP−Ａ−0 110 306
の32ページの第VIII参照。） Ｚ−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg（２−OMe）pNA, Ｚ−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg（２−CONHMe）pNA, Ｚ−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg（２−COOBu）pNA, Ｈ−Ｄ−Lys（Ｚ）−Gly−Ｌ−Arg（２−Ｚ）pNA, Tos−Gly−Ｌ−Pro−Ｌ−Arg（２−CONHiPr）pNA およびこれらの酸付加塩。
US−Ａ−4 440 678およびUS−Ａ−4 480 030（EP−Ａ−
0 034 122に対応する）から式Ioの化合物 式中、X1はC2-C8のアルカノイル基、C2-C8のω−アミ
ノアルカノイル基、フェニルアルカノイル基（アルカノ
イル部分はC2-C4であり、フェニル部分はパラ位をNH2で
置換されていてもよい。）、シクロヘキシルカルボニル
基（４−位をMeNHで置換されていてもよい。）、ベンゾ
イル基（オルト位またはパラ位を置換されていてもよ
い。）、アルコキシカルボニル基（アルコキ基部分はC1
-C8である。）、ベンジロキシカルボニル基（ベンジロ
キシ部分はパラ位をMeO,MeまたはClで置換されていても
よい。）、C1-C4のアルカンスルホニル基、フェニルス
ルホニル基（フェニル部分はパラ位をMe基で置換されて
いてもよい。）またはα−もしくはβ−ナフチルスルホ
ニル基であり、 X2は直鎖または分岐の炭素鎖を有するC1-C6のアルキ
ル基、C1-C2のヒドロキシアルキル基、アルコキシアル
キル基（アルコキシ部分はC1-C4であり、アルキル部分
はC1-C2である。）、ω−カルボキシアルキル基もしく
はω−アルコキシカルボニルアルキル基（アルキル部分
はC1-C4である。）、ω−ベンジロキシカルボニルアル
キル基（アルキル部分はC1-C3である。）、シクロヘキ
シル基、シクロヘキシルメチル基、４−ヒドロキシシク
ロヘキシルメチル基、フェニル基、ベンジル基、４−ヒ
ドロキシベンジル基またはイミダゾール−４−イルメチ
ル基（ただし、X2がイソプロピルまたはシクロヘキシル
である場合にはX1はベンジロキシカルボニル基以外のも
のである。）、 X3はC1-C4のアルキル基であり、 X4はH,MeまたはEtであり、 X5は芳香族またはヘテロ環により置換されたアミノ基を
有するアミノ化された基であり、酵素による加水分解で
開裂して光度測定法、分光光度測定法または蛍光光度測
定法により検出可能な着色または蛍光性化合物H-X5を生
成することができる基であり、かつ、H-X5の量がペプチ
ド基質の開裂を起こす酵素の量に比例して放出されるよ
うな基およびそれらの酸付加塩である。
下記トリペプチド およびそれらの酸付加塩はファクターXaを測定するため
に提案された式Ioのなかでも特に好ましい。
以下に述べるものはファクターXaの測定において有用
な基質として記載されているテトラペプチド化合物のう
ちとくに知られている。
化合物Ｓ−2222（Kabi Diagnostica,Stockholm,Swede
nにより市販されている）。この化合物は式 Bz−Ｌ−Ile−Glu−Gly−Ｌ−Arg−pNA.HCl; を有する。
CH−Ａ−637 627（上記引用したFR−Ａ−2 372 798に対
応）の化合物 およびそれらの酸付加塩：ならびに 上記引用したEP−Ａ−0 010 306の化合物 Bz−Ｌ−Ile−Ｌ−Glu（OMe）−Gly−Ｌ−Arg−（２−C
ONHMe）pNA およびその酸付加塩。
ファクターXaの測定のために推奨されているトリーま
たはテトラペプチドに関する従来技術は、その特異性が （ｉ）ペプチド鎖の性質、 （ii）Ｎ末端保護基の構造、および （iii）前記鎖のCO末端における開裂可能に伸長した基
の選択、 の関数であることを教示している。
発明の主題 本発明は、 （ｉ）ペプチド鎖のＮ末端を保護する基の選択において
従来技術と異なり、 （ii）ファクターXaの測定において有用なトリまたはテ
トラペプチド化合物の水溶性または水にたいする親和性
を改良する、 新規な溶液を提供するものとして推奨されるものであ
る。
したがって、本発明の第一の特徴は、 （ｉ）次式（Ｉ）で表されるトリまたはテトラペプチド Q-A1-A2-Gly-A4-R （Ｉ） 式中、Ｑはペプチド鎖のＮ末端を保護し、 （ａ）式R1-O-CO-CH2-CO（式中、R1はC1-C4のアルキル
基、フェニル基、一以上のMe,MeO,Cl,Br,FまたはCF3基
で置換されたフェニル基、ベンジル基、一以上のMe,Me
O,Cl,Br,FまたはCF3で置換されたベンジル基またはシク
ロアルキル部分がC3-C6であるシクロアルキルメチル
基）で表されるオキシマロニル基；および （ｂ）式R2-O(CH2CH2)n（式中、R2はC1-C6のアルキル
基、フェニル基またはベンジル基であり、ｎは１から17
0までの整数である）で表されるポリエチレングリコー
ル残基からなる群より選択される基であり、 A1はLeu,Ile,Nle,Nva,CHA,CHG,CHT,Phe,AlaおよびLys
基からなる群から選択され、 A2は単結合、Asp,またはGluであり、AspおよびGluの
カルボン酸側鎖基がエステル化またはアミド化されてい
るものであり、 A4はArgおよびLysからなる群から選択されるものであ
り、そして、 Ｒは開裂可能な標識手段である、 化合物：および （ii）それらの付加塩、 を工業製品として推奨するものである。
本発明の第２の特徴は、ファクターXaを測定するため
の酵素基質として、式（Ｉ）の化合物およびそれらの酸
付加塩を使用することを推奨するものである。
非常に驚嘆すべきことに、本発明に従うトリーおよび
テトラペプチドがファクターXaを測定する領域において
従来公知のトリーおよびテトラペプチドよりも活性に優
れるか、または選択性に優れるか、あるいは従来の前記
基質よりも水溶性に優れるゆえに、さらに貴重であると
いうことを発見した。
本発明の第３の特徴は、式（Ｉ）の化合物およびそれ
らの付加塩を製造する方法が推奨すべきことである。
さらに、本発明の第４の特徴は、式（Ｉ）の化合物お
よびそれらの付加塩を使用するファクターXaの測定方法
が提供されることである。
省略記号 本明細書中において、便宜上、以下の省略記号を使用
する。
発明の詳細な説明 上記したように、基Ｑは、ペプチド鎖A1-A2-Gly-A4の
Ｎ末端を保護する基である。Ｑ基は式R1-O-CO-CH2-COで
表されるオキシマロニル基または式R2-O(CH2CH2O)nで表
されるPEG残基である。上記オキシマロニル基におい
て、R1は、 −C1-C4のアルキル基（好ましくはMe,Et,Pr,Buもしくは
tBu）、 −フェニル基、トリル基、キシリル基、2,3−もしく
は４−メトキシフェニル基、2,4−、2,6−、3,4−もし
くは3,5−ジメトキシフェニル基、４−クロルフェニル
基、４−フルオルフェニル基、3,4−、3,5−もしくは2,
6−ジクロルフェニル基または３−トリフルオルメチル
フェニル基、 −シクロプロピル基、シクロペンチル基、もしくはシ
クロヘキシル基、 −ベンジル基、 −２−,3−もしくは４−メチルベンジル基、２−、３
−もしくは４−メトキシベンジル基、2,4−、2,6−、3,
4−もしくは3,5−ジメチルベンジル基、2,4−、2,6−、
3,4−もしくは3,5−ジメトキシベンジル基、２−、３−
もしくは４−クロルベンジル基、２−、３−もしくは４
−フルオルベンジル基、2,4−、2,6−、3,4−もしくは
3,5−シクロベンジル基または３−トリフルオルメチル
ベンジル基、あるいは −シクロプロピルメチル基、シクロペンチルメチル基
またはシクロヘキシルメチル基である。
R1が置換されたフェニル基または置換されたベンジル
基である場合には、置換基は２、３および／または４位
に位置する。さらに好ましくは、R1はMeまたはEtであれ
ば、ペプチド化合物により大きい水に対する親和性を付
与する。換言すれば、ＱはそのときMMまたはEMである。
PEG残基のO(CH2CH2O)部分においては、ｎは上記した
ように１〜170の値を有する整数である。とくにO(CH2CH
2O)部分の平均分子量は約60（ｎ＝１）〜約7100（ｎ＝1
61）である。上記PEG残基において、R2は、好ましく
は、Me,Et,Pr,iPr,Bu,tBuまたはｎ−ヘキシル基であ
り、さらに好ましくは、R2はMeまたはEtである。
上述したように、A1は、Leu,Ile,Nle,Nva,CHA,CHT,Ph
e,AlaおよびLysからなる群から選択されるアミノ酸残基
であり、Lys残基の塩基性側鎖基は適当な酸例えばBoc,
Z,Z（ｐ−Cl）,Z（pOMe）,Adoc,Aoc,Fmoc,Foc,Ibocで保
護されている。Lys残基の場合、かかる酸基は、実際
上、塩基性側鎖基の基本特性を取り除くことを可能とす
る。
残基A1は、ＬまたはＤのコンフィギュレーションを有
することができる。しかし、ファクターXaの測定におい
て、より活性または高感度にするには、上記A1残基はＤ
コンフィギュレーションを有するのが好ましい。
このため、A1はＤ−Leu,D−Ile,D−Nle,D−Nva,D−CH
A,D−CHT,D−Phe,D−AlaおよびＤ−Lys基からなる群か
ら選択されるのが好ましい。この際、Ｄ−Lysの塩基性
側鎖基は適当な酸基で保護しておく。
本発明においては最も重要であると考えられる残基A1
はＤ−Nle,D−LeuおよびＤ−CHAである。
上記したように、A2は単結合またはAspもしくはGlu残
基であり、適切な場合には、それぞれのAspおよびGlu残
基のカルボニル側鎖基はエステル化｛即ち、COOH基のOH
基はOR3基［式中、R3は特にC1-C4のアルキル基（例え
ば、Me,Et,iPr,Pr,Bu,tBuまたはiBu）、C1-C4のヒドロ
キシアルキル基（好ましくは、CH2CH2OH、C3-C6のシク
ロアルキル基（例えば、シクロプロピル、シクロペンチ
ルまたは、好ましくは、シクロヘキシル）または、ω−
アミノアルキル基（アルキル部分がC2-C4であり、アミ
ノ部分の窒素がモノアルキル化（NHR4）、ジアルキル化
（NR4R5）もしくは環内に取り込まれ（NR4R5＝Ｎ−ヘテ
ロサイクル基）ている）］で置換されている。｝されて
いてもよく、また、アミド化｛即ち、COOH基のOH基はNH
2基、NHR4またはNR4R5［式中、R4およびR5は、同一であ
ってもよく、または相異なっていてもよく、それぞれが
C1-C4のアルキル基であり、R4とR5が窒素原子を介して
結合し５〜７員環のＮ−ヘテロ環を形成していてもよ
く、具体的には、ピリジノ、ピペリジノ、モルホリノ、
チオモルホリノ、ピペラジノ、４−（２−ヒドロキシエ
チル）ピペラジノ、４−メチルピペラジノ、４−（４−
クロルフェニル）ピペラジノおよびヘキサメチレンイミ
ノ基である。］で置換されている｝でアミド化されてい
てもよい。
COOH側鎖基がエステル化またはアミド化されているGl
uおよびAsp残基の例は上述したCH−Ａ−637 627およびF
R−Ａ−2 372 798に挙げられており、本発明において
は、これら引例に挙げられたものはすべて含まれる。
A2がアミノ酸残基である場合、好ましくは、該残基が
Ｌコンフィギュレーションであるのがよい。即ち、A2は
単結合であるかまたはＬ−Glu,L−Asp,L−Glu（Mor）,L
−Glu（py）,L−Glu（pi）,L−Glu（OMe）,L−Glu（OE
t）,L−Glu（OtBu）,L−Asp（Mor）,L−Asp（py）,L−A
sp（Pi）,L−Asp（Me）,L−Asp（OEt）およびＬ−Asp
（OtBu）基からなる群から選択されたGluまたはAsp残基
であるのが好ましい。
A4もまた好ましくはＬ−ArgまたはＬ−Lysである。
標識手段Ｒは生物学的および微生物学的分析方法に関
する領域においては十分に知られている。上述した従来
技術において、特にUS−Ａ−4 448 715において開示さ
れているので引用する。上記標識手段としては、 （ｉ）色彩変化を生ずるか、 （ii）蛍光変化を生ずる、 アミノ化されたNH−Ｒ′基、または、 （iii）少なくとも一つの放射性同位元素を含有するア
ミノ化されたNH−Ｒ′基例えば14Cまたは3H放射性同位
元素で標識されたアニリノまたはベンジルアミノ基、か
らなる群から選択するのが好ましい。本発明において
は、酵素反応の際または酵素反応後に、測定可能な信号
の測定例えば所定の波長における光学密度の測定や放射
活性の測定を行えばよい。酵素による加水分解における
開裂で生ずる生成物のＨ−Ｒの量は使用する酵素の量に
比例する。上記Ｈ−Ｒの量は測光法、分光光度法、蛍光
分光分析法または電気化学的方法により測定可能であ
る。
Ｒ基は、本発明に従い好ましくは、クロモジェニック
原子団具体的にはニトロフェニルアミノ基（フェニル基
はCOOH,F,Cl,Br,CH3，OCH3,CN,CF3および／またはSO3H
で置換されていてもよい。）またはフルオロジェニク原
子団具体的にはナフチルアミノ基（ナフチル基がOCH3,C
OOH,SO3HまたはCH3で置換されていてもよい。）および
４−メチルクマリル−７−アミノ基や４−トリフルオロ
メチルクマリル−７−アミノ基等類縁体である。
本発明に従う適切なアミノ化されたクロモジェニック
原子団およびフルオロジェニク原子団を下記に列挙す
る。即ち、ｐ−ニトロアニリノ（ｐ−NAと略記）、２−
カルボキシ−４−ニトロアニリノ、３−カルボキシ−４
−ニトロアニリノ、２−ハロゲン−４−ニトロアニリノ
および３−ハロゲノ−４−ニトロアニリノ（ハロゲンは
F,ClまたはBrである。）、２−メトキシ−５−メチル−
４−ニトロアニリノ、２−ヒドロキシスルホニル−４−
ニトロアニリノ、４−トリフルオルメチル−２−ニトロ
アニリノ、４−トリフルオロメチル−３−ニトロアニリ
ノ、４−シアノ−２−ニトロアニリノ、ナフチル−２−
アミノ、４−ヒドロキシスルホニルナフチル−１−アミ
ノ、キノリルアミノ、ニトロキノリルアミノ等である。
本発明に従う好ましい基Ｒはクロモジェニック原子団
である。即ち、一方においてpNAを、もう一方においてp
NAのフェニル環が２−、３−位で置換された下記式（I
I） 式中、ＹはBr,Cl,F,CF3,COOH,COOW,CONH2,CONHW,CONW
2，CONH(CH2)mNMe2,OHまたはOW（式中、ＷはC3-C6のア
ルキル、C6-C10のアリール、C7-C11のアラルキルまたは
C3-C8のアリサイクリック基であり、ｎは１−10の整数
である。） を有する類縁体である。
式（II）の原子団（式中、pNA基のフェニル基が置換
されたものである）はEP−Ａ−0 110 306に特に開示さ
れている。
本発明に従う付加塩は、本質的には式（Ｉ）の化合物
と無機または有機酸との酸付加塩である。
本発明の最も好ましい実施態様においては、次式（II
I） Q-A1-A2-Gly-A4-pNA （III） ［式中、ＱはMM,EMまたはR2O(CH2CH2O)n（式中、R2は
Me,Et,Pr,iPr,Bu,iBuまたはｎ−ヘキシルであり、ｎは
１〜161の整数である。）であり、A1は、Ｄ−Leu,D−Il
e,D−Nva,D−CHA,D−CHT,D−Phe,D−Ala,D−Lys（Cbo）
およびＤ−Lys（Boc）からなる群から選択されるもので
あり、好ましくは、Ｄ−Nle,D−LeuおよびＤ−CHAであ
り、A2は、単結合であるか、または、Ｌ−GluおよびＬ
−Aspのカルボン酸側鎖基のOH基がOMe,OEt,OtBu,モノホ
リノ，ピペリジノ，ピロリドノで置換されていてもよい
Ｌ−GluおよびＬ−Aspであり、A4は、Ｌ−ArgおよびＬ
−Lysからなる群から選択される。］ で示される化合物およびその酸付加塩である。
特に限定する訳ではないが、本発明に従うペプチド化
合物を以下の第Ｉ表および第II表に列挙する。便宜上、
ファクターXaに対して特異的な基質として市販されてい
るペプチドも比較のために第Ｉ表に含めて挙げた。
本発明に従うペプチドで特に優れた値を呈するものを
以下に列挙する。
本発明に従うトリーおよびテトラペプチド化合物は従
来の反応機構を応用することによりそれ自体公知の方法
に従い製造することができる。本発明において推奨する
方法は、次式（IV）のペプチド H-A1-A2-Gly-A4-R （IV） （式中、A1、A2、A4およびＲは上記定義されたものであ
る。） を、 （ａ）次式（Ｖ）のオキシマロニル誘導体 R1-O-CO-CH2-CO-T （Ｖ） （式中、R2は上記定義されたとおりであり、かつ、Ｔは
OH,F,ClまたはBrである。） および （ｂ）次式（VI）のPEG誘導体 R2-O(CH2CH2O)n-CO-Hal （VI） （式中、R2およびｎは上記定義されたとおりであり、Ha
lはF,ClまたはBrである。） と反応させることからなる。
反応IV＋Ｖ＝ＩおよびIV＋VI＝Ｉはそれぞれ共溶媒と
して作用する過剰の塩基とプロトン受容体例えばEt3N,D
IEAまたはその他の適当な第３級アミンの存在下、不活
性溶媒中でおこなわれる。
実際には、反応IV＋Ｖ＝Ｉを行うには基Ｔの性質に従
い２つの相異なる技術が推奨される。ＴがF,ClまたはBr
である場合、モル比IV/Vは1/2以下で使用される。ＴがO
Hである場合、反応はカップリング剤例えばBopまたはHO
BT（適当な場合にはカップリング剤HOBTにDCCIを加え
て）の存在下、反応温度約０℃で少なくとも１時間行
い、ついで室温で少なくとも24時間行う。この時、IV/V
は1/1〜1/1.5とする。
さらに、前記反応IV＋Ｖ＝Ｉにおいて、ＴがF,Clまた
はBrである場合、モル比IV/Et3Nは1.7/3.6使用し、好ま
しくは、2/1〜3.1使用する。
実際、反応IV＋Ｖ＝Ｉは、モル比１以下、好ましく
は、0.8以下で行われる。
反応IV＋VI＝Ｉを実施するためには、式中HalがClで
ある式VIの誘導体を使用するのが好ましい。前記反応IV
＋VI＝Ｉの反応に対する出発原料として使用されるかか
るクロル化された誘導体は以下の反応スキームに従い合
成することができる。
一方、式Ｖの化合物はマロン酸から製造され、また他
方、式IVの化合物は従来のペプチド合成法例えばEP−Ａ
−0 028 610に記載された方法で得られる。
本発明に従う化合物はファクターXaの測定に有用であ
り、式Ｉの化合物およびそれらの付加塩からなる群から
選択される少なくとも一のペプチド化合物を含有するフ
ァクターXa測定用の分析キットはファクターXaの標準試
料と緩衝希釈液をも備えていて推奨に値する。
式Ｉの化合物の所定の量またはその付加塩の所定の量
を、生物学的水性媒体中ファクターXaを含むと思われる
試験試料場合によっては希釈された試験試料と接触させ
ることからなるファクターXaの測定方法もまた推奨に値
する。
本発明のさらなる利点および特性は以下に記載する製
造例および比較実験の結果からより明確に理解されるで
あろう。これらのデータは本発明においていかなる限定
を与えるものでもなく、理解を容易にするためのもので
ある。
製造例Ｉ MM−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg−pNA.AcOHの製造（実施例
１） ａ）Ｚ−Ｌ−Arg−pNA.HCl Ｚ−Ｌ−Arg 344g（1mol）を新たに蒸留し、モルキュ
ラーシイブで乾燥した無水のHMPTに室温で溶解させ、Et
3N 139ml（1mol）を室温で乾燥しながら加えた。この溶
液にｐ−ニトロフェニルイソシアネート328g（2mol）を
加えた。得られた反応溶液を室温で24時間攪拌し、減圧
下、反応溶媒を留去し、残渣を出来るだけ少量のAcOHで
取り出し、AcOEtで希釈した。この得られた溶液を続け
て３回少量の0.5mol NaHCO3で抽出し、KHSO4 50g/lで３
回抽出し、NaClでなかば飽和した水で数回抽出した。続
いて有機層を無水の硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過
によりNa2SO4を除去した後、溶媒を留去した。蒸留残渣
をAcOEt/MeOMe混合物（3/7v/v）から再結晶させると、
予想される生成物が白い粉末の形態で350g得られた。融
点128−120℃ 分析（シリカゲル薄層クロマトグラフィ）： Rf＝0.5AcOEt/ピリジン/AcOH/H2O（20/4.5/3/1 v/v）； Rf＝0.69CHCl3/MeOH/AcOH/（5/3/1 v/v） ｂ）Ｈ−Ｌ−Arg−pNA.2HBr Ｚ−Ｌ−Arg−PNA.2HBr 100gをガラス／テフロン装置
中に入れた。氷酢酸800ml、アニソール200mlおよびHBr
氷酢酸溶液1000mlを不活性雰囲気（窒素雰囲気）下で加
えた。窒素雰囲気室温で１時間反応させた。１時間経過
後、反応混合物は、脱保護中に均一となり、エーテル20
l（MeOMeまたはEtOEt）中に沈澱した。デカンテーショ
ン後、上澄み液を捨て沈澱をエーテルで数回洗浄した。
濾過により沈澱を収集し減圧下KOHで24時間乾燥させる
と予想される生成物94.2gが得られた。（収率96％） 分析（シリカゲル薄層クロマトグラフィ） Rf＝0.04AcOEt/ピリジン/AcOH/H2O（20/4.5/3/1.5 v/
v） Rf＝0.38BuOH/AcOH/H2O（3/1/1 v/v） ｃ）Boc−Gly−Ｌ−Arg−pNA.HBr Ｈ−Ｌ−Arg−pNA.HBr 1g（2.19mmol）をDMF 10mlに
溶解し、DIEA 0.854ml（6.57mmol）を加えた。別の容器
に、Boc−Gly 384mg（2.19mmol）の5ml DMF溶液を入れD
IEA 0.285mlで中和した。このようにして得られた２つ
の溶液を混合し、この混合溶液にBop 970mgを加え、室
温で保持した。反応中、DIEAを少量加え、pHを７−８に
保持した。１時間後、反応は完結し、反応溶媒は減圧下
留去され乾燥された。蒸留残渣をAcOH/MeOH混合物で取
り出しNaHCO3 0.5mol水溶液で抽出した。有機層を硫酸
ナトリウムで乾燥し、減圧下濃縮し、エーテル（MeOME
またはEtOEt）で沈澱させると、予想される生成物874mg
が得られた。（収率75％） 分析（シリカゲルの薄層クロマトグラフィ） Rf＝0.53CHCl3/MeOH/AcOH（10/3/1 v/v） ｄ）Boc−Ｌ−Arg−pNA.2H−TFA Boc−Gly−Ｌ−Arg−pNA.HBr 874mg（1.64mmol）を反
応容器に入れ、CH2Cl2 6.6mlとＨ−TFA 6.6mlとを続い
て加えた。室温で0.25hr反応させた後、反応混合物はエ
ーテル中で直接沈澱させた。白い薄片の沈澱物が形成さ
れ、これを濾過し乾燥させると、予想される生成物910m
gが得られた。（収率96％） 分析（シリカゲルの薄層クロマトグラフィ） Rf＝0.09CHCl3/MeOH/AcOH（5/3/1 v/v） ｅ）Boc−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg−pNA.H−TFA 製造例Icの処理に続いて、 ｉ）Ｈ−Gly−Ｌ−Arg−pNA.2H−TFA 910mg（1.57mmo
l）と、 ii）Boc−Ｄ−Leu−OH 363mg（1.57mmol）と、 iii）DIEA 1.2mlと、 iv）Bop 695mg（1.57mmol）と、 を含有してなる反応混合物を、DMF中で反応させ、反応
混合物を室温で２時間攪拌させておいた。減圧下留去乾
燥させた後、蒸留残渣を、CHCl3/MeOH/AcOH（20/3/1−1
0/3/1 v/v）を展開液として、シリカゲルのクロマトグ
ラフィにかけた。収集した均一な分画を集め、その溶離
液を蒸発留去した。リオフィリゼーションすると予想さ
れる生成物785mgが得られた。（収率80％） 分析（シリカゲルの薄層クロマトグラフィ） Rf＝0.33CHCl3/MeOH/AcOH（10/3/1 v/v） ｆ）Ｈ−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg−pNA.2H−TFA 製造例Ieに従って得られたBoc−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−A
rg−pNA.H−TFA 785mgをCH2Cl2 5mlとＨ−TFA 5mlと室
温で0.25hr反応させた。反応混合物をエーテル中で直接
沈澱させると、白色の沈澱物が得られた。この沈澱物を
濾過し、エーテルで洗浄し乾燥させた。予想される生成
物779mgが収集された。（収率90％） 分析（シリカゲルの薄層クロマトグラフィ） Rf＝0.2CHCl3/MeOH/AcOH（5/3/1 v/v） ｇ）Ｈ−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg−pNA.2H−AcOH Ｈ−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg−pNA.2H−TFA 7.79mg
（1.12mmol）を反応容器に入れ、DMF 15mlとEt3N 0.517
ml（3.705mmol）とをついで加えた。生じた混合物を攪
拌しながら−30℃に冷却し、反応温度を−30℃に保持し
たままメトキシマロニルクロライド（MeO-CO-CH2CO-C
l）0.265mlを滴下した。この反応混合物を−30℃で0.5h
r保持した後、室温にもどした。２時間室温で反応させ
た後、反応混合物を濾過し、形成されたトリメチルアン
モニウム塩を除去し、濾液を減圧下留去した。蒸留残渣
をエーテル（EtOEt）で沈澱させ、濾過し、ついで、あ
らかじめアセチル化したイオン交換樹脂（AMBERLITE IR
A401 S）のクロマトグラフィにかけ、MeOH/H2O混合物
（3/2 v/v）で溶離させた。均一な分画を集め、蒸留留
去した。得られた蒸留残渣をリオフィリゼーションする
と、予想される生成物566mgが得られた。（収率81％） 分析 TLC（シリカゲル上で） Rf＝0.71CHCl3/MeOH/AcOH（10/3/1 v/v） HPLC（HYPERSIL C 18カラム上で（粒子径３μm Merk社
製） TR＝10分（水72.4％、アセトニトリル27.5％、酢酸0.2
％ w/wを含有する定濃度溶液で） 製造例II MM−Ｄ−Leu−Ｌ−Arg−pNA.AcOHの製造 工程Igを以下の工程で置き換える以外は製造例Ｉで示
した処理に従った。
Ｈ−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg−pNA.2H−TFA 1391mg（2
mmol）を反応容器に入れ、DMF 30mlとEt3N 0.7mg（5mmo
l）とを加えた。Bop 973.5mgを室温で加え、メトキシマ
ロニックアシッド（MeO-CO-CH2-CO-OH）の259mgのDMF10
ml溶液とEt3N 0.7mlをついで生じた混合物に加えた。反
応が進行するに連れて、少量のEt3Nを引き続き加えるこ
とによりカップリング中pHを７−８に保つ。３時間攪拌
しながら反応させた後、カップリングは完結した。反応
溶媒をAcOEt/KHSO4の溶液（５％ w/v）で抽出し、つい
で、AcOH/0.5M NaHSO3で抽出した。AcOEt層を、NaClで
なかば飽和させた水で洗浄した。AcOEt層は減圧下蒸留
し、蒸留残渣を粒子径40−60マイクロメータのシリカゲ
ルのカラムでクロマトグラフィを行った。溶離系として
は、CHCl3/MeOH/AcOH（8/3/1 v/v）を使用した。均一な
分画を集め、溶媒を留去した。得られた蒸留残渣のリオ
フィリゼーションにより予想される生成物812mgが得ら
れた。（収率65％） 分析 TLC シリカゲル上で Rf＝0.71CHCl3/MeOH/AcOH/（10/3/1 v/v） HPLC上記工程Igに示したとおり TR＝10分 製造例III Me-OCH2CH2O-CO-D-Leu-Gly-L-Arg-pNA.AcOHの製造 ａ）Et-OCH2CH2O-CO-Cl フォスゲンを−30℃の温度で反応容器に凝縮させた。
エチレングリコール10mlをあらかじめTHFに溶解させて
おき、これを滴下ロートを用いて−30℃の温度で反応容
器に滴下した。反応混合物は−30℃で２時間攪拌し、つ
いで室温まで温度上昇させた。過剰のホスゲンを窒素流
により除去した。ホスゲンが痕跡量になるまで数時間の
操作を要した。反応混合物をついで減圧下蒸留し、得ら
れた液体は続くカップリング工程に使用した。予想され
る生成物1320mgが得られた。（収率95％） 分析（赤外吸収スペクトル） 3300cm-1のアルコールバンドが消えた。
1776,1152および690cm-1のクロロフォルメイトバンドが
出現した。
コメント：工程IIIaの方法は式R2-O(CH2CH2O)n-CO-Cl
で示される他のクロロフォルメイトを得るために直接使
用することができる。
ｂ）MeOCH2CH2O-CO-D-Leu-Gly-L-Arg-pNA.AcOG Ｈ−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg−pNA.2HTFA（製造例Ifに示
したようにして得られる。）1391mg（2mmol）を反応容
器に入れ、DMF 30mlとEt3N 0.624mlを加えた。生じた混
合物をアイスバスで０℃に冷却した。クロロフォルメイ
ト（MeOCH2CH2O-CO-Cl 0.304g（2.2mmol）をこの冷却し
た混合物に加えた。反応溶液を１時間攪拌しその後室温
にまで温度を上げ、室温でさらに１時間反応させた。反
応混合物は濾過され、減圧蒸留され、蒸留残渣は、あら
かじめアセチル化されたイオン交換樹脂（AMBERLITE IR
A 400S）のクロマトグラフィにかけられた。溶離液とし
ては、MeOH/H2O混合物（3/2 v/v）を使用した。均一な
分画を集め蒸留した。得られた残留残渣をリオフィリゼ
ーションしたところ、予想される生成物814mgが得られ
た。
分析 TLC:シリカゲル上で Rf＝0.65CHCl3/MeOH/AcOH/（10/3/1） 製造例IV Me-O(CH2CH2O)7-CO-O-D-Leu-Gly-L-Arg-pNA.AcOHの製造 （実施例64） 製造例IIIbで示した操作に従った。ただし、MeO-CH2C
H2O-CO-Clに代えてMeO-(CH2CH2O)7-CO-Clを使用したと
ころ予想される生成物1.038gが得られた。（収率61％） 分析（シリカゲルTLCで） Rf＝0.61CHCl3/MeOH/AcOH/（10/3/1） Rf＝0.14CHCl3/MeOH/AcOH/（20/3/1） 製造例Ｖ Me-O(CH2CH2O)2-CO-D-Leu-Gly-L-Arg-pNA.AcOH（実施例
62） Me-OCH2CH2O-CO-Clに代えてMeO(CH2CH2O)2COClを使用
した以外は製造例IIIbの操作に従った。予想される生成
物851mgを得た。（収率68％） 分析（シリカゲルTLCで） Rf＝0.45CHCl3/MeOH/AcOH/（15/3/1） 比較試験 ファクターXaに対する本発明のペプチドの活性を従来
の方法のひとつ例えばEP−Ａ−0 280 160に記載された
方法で測定した。経時的に光学密度が変化することによ
り加水分解速度が計られた。等モルで得られた結果を以
下の第III表に示した。参照生成物CP1の活性を便宜上10
0％に等しいとした。第III表における比較結果は、本発
明のペプチドが少なくとも参照生成物CP1と等しい活性
を示すことを表している。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＣＡＯＬＤ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (11)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】トリーおよびテトラペプチドのファミリー
    に属するペプチド化合物であって、 （ｉ）次式（Ｉ）で示されるトリまたはテトラペプチド Q-A1-A2-Gly-A4-R （Ｉ） 式中、Ｑはペプチド鎖のＮ末端を保護し、 （ａ）式R1-O-CO-CH2-CO（式中、R1はC1-C4のアルキル
    基、フェニル基、一以上のMe,MeO,Cl,Br,FまたはCF3基
    で置換されたフェニル基、ベンジル基、一以上のMe,Me
    O,Cl,Br,FまたはCF3で置換されたベンジル基またはシク
    ロアルキル部分がC3-C6であるシクロアルキルメチル
    基）で表されるオキシマロニル基；および （ｂ）式R2-O(CH2CH2)n（式中、R2はC1-C6のアルキル
    基、フェニル基またはベンジル基であり、ｎは１〜170
    までの整数である）で表されるポリエチレングリコール
    残基からなる群より選択される基であり、 A1はLeu,Ile,Nle,Nva,CHA,CHG,CGT,Phe,AlaおよびLys基
    からなる群から選択され、 A2は単結合、AspまたはGluであり、AspおよびGluのカル
    ボン酸側鎖基がエステル化またはアミド化されているも
    のであり、 A4はArgおよびLysからなる群から選択されるものであ
    り、そして、 Ｒは、ニトロフェニルアミノ基（フェニル基はCOOH,F,C
    l,Br,CH3，OCH3,CN,CF3および／またはSO3Hで置換され
    ていてもよい）、ナフチルアミノ基（ナフチル基がOC
    H3,COOH,SO3HまたはCH3で置換されていてもよい）、４
    −メチルクマリル−７−アミノ基、又は４−トリフルオ
    ロメチルクマリル−７−アミノ基である、 化合物；および （ii）それらの付加塩、 からなる群から選択されるペプチド化合物。
  2. 【請求項２】原子団R1-O-CO-CH2-COにて、R1がC1-C4の
    アルキル、フェニル、トシル、キシリル、２−,3−もし
    くは４−メトキシフェニル、2,4−,2,6−,3,4−もしく
    は3,5−ジメトキシフェニル、４−クロルフェニル、４
    −フルオルフェニル、3,4−,3,5−もしくは2,6−ジクロ
    ルフェニル、３−トリフルオルメチルフェニル、シクロ
    プロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、ベンジ
    ル、２−,3−もしくは４−メチルベンジル、２−,3−も
    しくは４−メトキシベンジル、2,4−,2,6−,3,4−もし
    くは3,5−ジメトキシベンジル、２−,3−もしくは４−
    クロルベンジル、２−,3−もしくは４−フルオルベンジ
    ル、2,4−,2,6−,3,4−もしくは3,5−ジクロルベンジ
    ル、３−トリフルオルメチルベンジル、シクロプロピル
    メチル、シクロペンチルメチルおよびシクロヘキシルメ
    チル基からなる群から選択される請求の範囲１記載のペ
    プチド。
  3. 【請求項３】残基R2-O(CH2CH2O)nにて、ｎが１〜160の
    値を有する整数である請求の範囲１記載のペプチド。
  4. 【請求項４】A1がＤ−Leu,D−Ile,D−Nle,D−Nva,D−CH
    A,D−CHG,D−CHT,D−Phe,D−AlaおよびＤ−Lysからなる
    群から選択され、Ｄ−Lysの塩基性側鎖基が適当な酸基
    で保護されている請求の範囲１記載のペプチド。
  5. 【請求項５】A1がＤ−Leu,D−NleまたはＤ−CHAである
    請求の範囲１記載のペプチド。
  6. 【請求項６】A2が単結合、Ｌ−Glu,L−Asp,L−Glu（Mo
    r）,L−Glu（Py）,L−Glu（Pi）,L−Glu（OMe）,L−Glu
    （OEt）,L−Glu（OtBu）,L−Asp（Mor）,L−Asp（Py）,
    L−Asp（Pi）,L−Asp（OMe）,L−Asp（OEt）またはＬ−
    Asp（OtBu）である請求の範囲１記載のペプチド。
  7. 【請求項７】（ｉ）次式（III）で示されるトリーまた
    はテトラペプチド Q-A1-A2-Gly-A4-pNA （III） ［式中、Ｑは、MM,EMまたはR2O(CH2CH2O)n（式中、R2は
    Me,Et,Pr,iPr,Bu,iBuまたはｎ−ヘキシルであり、ｎは
    １〜161の整数である。）であり、A1は、Ｄ−Leu,D−Il
    e,D−Nle,D−Nva,D−CHA,D−CHT,D−Phe,D−Alaおよび
    Ｄ−Lys（Boc）からなる群から選択されるものであり、
    A2は、単結合であるか、またはＬ−GluおよびＬ−Aspの
    カルボン酸側鎖基のOH基がOMe,OEt,OtBu,モルホリノ，
    ピペリジノ，ピロリドノで置換されていてもよいしＬ−
    GluおよびＬ−Aspであり、A4は、Ｌ−ArgおよびＬ−Lys
    からなる群から選択される。］ で示される化合物；および （ii）その酸付加塩 からなる群から選択される請求の範囲１記載のペプチ
    ド。
  8. 【請求項８】（ａ）MM−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg−pNA, （ｂ）EM−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg−pNA, （ｃ）MeO(CH2CH2O)−CO−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg−pN
    A, （ｄ）MeO(CH2CH2O)2−CO−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg−pN
    A, （ｅ）MeO(CH2CH2O)3−CO−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg−pN
    A, （ｆ）MeO(CH2CH2O)7−CO−Ｄ−Leu−Gly−Ｌ−Arg−pN
    A, （ｇ）MM−Ｄ−Nle−Gly−Ｌ−Arg−pNA, （ｈ）MM−Ｄ−Nle−Ｌ−Glu（Py）−Gly−Ｌ−Arg−pN
    A, （ｉ）MM−Ｄ−CHA−Gly−Ｌ−Arg−pNA, （ｊ）MM−Ｄ−Ile−Ｌ−Glu（OMe）−Gly−Ｌ−Arg−p
    NA, （ｋ）EM−Ｄ−Nle−Gly−Ｌ−Arg−pNAおよび （ｌ）それらの酸付加塩 からなる群から選択される請求の範囲１記載のペプチ
    ド。
  9. 【請求項９】請求の範囲１記載の式Ｉのトリーまたはテ
    トラペプチドおよびその付加塩の製造方法であって、前
    記方法が、次式（IV）のペプチド H-A1-A2-Gly-A4-R （IV） （式中、A1,A2,A4およびＲは上記定義されたものであ
    る。） を、 （ａ）次式（Ｖ）のオキシマロニル誘導体 R1-O-CO-CH2-CO-T （Ｖ） （式中、R1は上記定義されたとおりであり、かつ、Ｔは
    OH,F,ClまたはBrである。） および （ｂ）次式（VI）のPEG誘導体 R2-O(CH2CH2O)n-CO-Hal （VI） （式中、R2およびｎは上記定義されたとおりであり、Ha
    lはF,ClまたはBrである。） からなる群から選択される物質と反応させることからな
    る方法。
  10. 【請求項１０】式Ｉの化合物またはその付加塩のひとつ
    の所定量を水性生物学的媒体中でファクターXaを含有す
    るかもしれない試験試料と接触させることからなるファ
    クターXaの測定方法。
  11. 【請求項１１】請求の範囲１記載の式Ｉの化合物および
    それらの付加塩からなる群から選択される少なくともひ
    とつのペプチドと、適当な場合には、ファクターXaの標
    準試料ならびに緩衝希釈溶媒を含有してなるファクター
    Xaの測定用分析キット。
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