JPH0244839B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、蛋白分解酵素、特に酵素部類E.
C.3.4.21.の酵素、例えば器官又は腺カリクレイ
ン、トロンビン及びプラズミンを定量分析するた
めの基質として有用な新規のトリペプチド誘導体
に関する。 所謂器官カリクレイン又は腺カリクレインは、
種々の器官及び腺、例えば分泌腺、唾液腺、腎
臓、消化管粘膜等によつて得られ、前酵素の形又
は活性形で分泌される。これらの器官又は腺カリ
クレインは、化学的及び生理学的に血漿カリクレ
インとは異なるものである。一定の病理学的条件
下で器官カリクレイン分泌物濃度は、正常値より
も低下するか又は正常値よりも上昇する。すなわ
ち、例えば尿のカリクレイン分泌は、腎臓疾病の
患者の正常値よりも実質的に減少する。腎臓硬化
症の患者においてカリクレイン分泌は、殆んど完
全に抑圧されている。特発性高血圧症の患者にお
いて、24時間―尿のカリクレイン分泌は、正常値
の50％平均として有効に減少されている（例え
ば、H.S.Margolius著、“Chemilstry and
Biology of the Kallikrein―Kinin System in
Health and Disease”、1974年、第399〜409頁、
参照）。それ故、簡単な処理方法で器官カリクレ
インを迅速に定量分析することは重要である。例
えば、一定のアルギニンエステル、例えばトジル
―イルギニンメチルエステル（TAME）をエス
テル分解することによつて尿カリクレインを分析
することは、公知である。改善されたエステル分
解法では、三重水素で標識されたトジル―アルギ
ニンメチルエステルを使用し、エステル分解によ
つて放出されるメタノールの放射能を測定する。
しかし、これらのエステル分解法は、該方法がカ
リクレインがエステル分解によらずアミド分解に
より天然のペプチド鎖を分解する蛋白分解酵素で
ある程度に非生理学的であるという欠点を有す
る。更に、エステル基質は、該基質が多数の他の
酵素によつて分解されている、すなわちカリクレ
インによつて不明確に分解されているという欠点
を有する。三重水素で標識されたTAMEを用い
る方法は、三重水素で標識されたメタノールの放
射能測定よりも前に、エステル分解混合物中にな
お存在する三重水素で標識された残留TAMEが
測定を邪魔するのでメタノールをエステル分解混
合物から水を不混和性の液体で抽出しなければな
らない程度に複雑である。 審査されずに公告された西ドイツ国特許出願公
開第2527932号明細書には、式： R¹―Pro―Ｘ―Arg―NH―R²（但しR¹は保護
基を表わし、−NH―R²は発色団を表わし、Ｘは
フエニルアラリル基、β―シクロヘキシルアラニ
ル基、フエニルグリシル基又はチロシル基を表わ
す）で示される基質が記載されている該基質は、
血漿カリクレインによつて極めて簡単に分解さ
れ、有色の分解生成物R²―NH₂を生じ、この場
合この分解生成物の量は、測光法、分光測光法又
は螢光測光法によつて測定することができる。ま
た、器官又は腺カリクレインを分析するために該
基質を使用することも試みられた。しかし、意外
なことに、該基質は、器官又は腺カリクレインに
対して敏感でない、すなわち器官又は腺カリクレ
インによつて分解されないか又は少量が分解され
るにすぎないことが判明した。 審査されずに公告された西ドイツ国特許出願公
開第2629067号明細書には、特定の蛋白分解酵素、
例えば腺又は器官カリクレイン及びプラブミンを
分析するための基質として有用なトリペプチド誘
導体が記載されている。すなわち、Ｈ―Ｄ―バリ
ル―ロイシル―アルギニル―ｐ―ニトロアニリド
ジヒドロクロリド及びＨ―Ｄ―バリル―ロイシル
―リジル―ｐ―ニトロアニリドジヒドロクロリド
が２つの例として挙げられている。第１のトリペ
プチド誘導体は、腺カリクレインのための基質で
あり、第２のトリペプチド誘導体は、プラズミン
のための基質である。これら２つの化合物は、該
酵素によつて分解され、ｐ―ニトロアニリンを生
じ、この場合このｐ―ニトロアニリンの量は、測
光法又は分光測光法により測定することができ
る。しかしながら、Ｈ―Ｄ―バリル―ロイシル―
アルギニル―ｐ―ニトロアニリドジヒドロクロリ
ドの感受率は、濃縮されていない尿中の尿カリク
レインを正確に分析するのに必要な限界値に到達
する。しかし、該アミド基質を濃縮された尿中で
使用する場合には、ｐ―ニトロアニリンの測光法
による測定は、尿の独自の色によつて強固に阻止
される。 前記の西ドイツ国特許明細書に記載された２つ
のトリペプチド誘導体のトリペプチド鎖中の第１
の２つのアミノ酸は、α―又はβ位に阻水性イソ
プロピル基を有する。この阻水性を増大させ、そ
の後に腺カリクレインに対する感受性を増大させ
るために、ジペプチド鎖の基本構造を維持しなが
ら、イソプロピル基を芳香族基、例えばフエニル
基に代えることが試みられた。しかし、この試み
は失敗した。芳香族基を装入することによつて得
られるトリペプチド基質は、腺カリクレインによ
つて全く分解されないか又は多くの場合極めて少
量が分解されるにすぎない。しかし、芳香族基を
有するこれらのトリペプチド基質は、プラズミン
に対して驚異的に高い感受性を有する。更に、意
外なことに、該トリペプチドプラズミン基質にお
ける芳香族基の水素添加は、器官又は腺カリクレ
インに対して驚異的に高い感受性を有する新規部
類のトリペプチド基質を生じることが見い出され
た。トリペプチド鎖を増加させるには、蛋白分解
酵素によつて分解される基質を得るために天然に
生じるアミノ酸だけを使用することができること
が判明していた。それ故、シクロヘキシル基を含
有しかつ天然に生じないアミノ酸を使用すること
により、器官又は腺カリクレイン及びその他の蛋
白分解酵素、例えば血漿カリクレインによつて簡
単に分解される発色団基質を得ることができるこ
とが見い出されたことは意外なことであつた。 本発明は、特定の蛋白分解酵素、特に酵素部類
E.C.3.4.21.の酵素、例えば器官又は腺カリクレイ
ン、プラズミン及びトロンビンに対して高い感受
性を有し、したがつて該酵素を定量分析するため
の基質として有用な新規の発色団基質に関する。
該基質は、一般式： Ｈ―Ｄ―Ｘ―Ｙ―Arg―Ｒ ［式中、 Ｘはシクロヘキシルグリシル基、シクロヘキシ
ルアラニル基又はシクロヘキシル基を表わし、 Ｙはロイシル基、ノルロイシル基、ノルバリル
基、α―アミノブチリル基、アラニル基、プロリ
ル基又はピペコリノイル基を表わし、 Ｒはｐ―ニトロフエニルアミノ、２―ナフチル
アミノ、４―メトキシ―２―ナフチルアミノ、４
―メチル―クマリル―７―アミノまたは１，３―
ジ（メトキシカルボニル）―フエニル―５―アミ
ノ基を表わす〕で示されるトリペプチド誘導体で
ある。 式のトリペプチド誘導体は、水性媒体に対し
て難溶性であり、したがつてその酸との塩の形
で、殊に鉱酸、例えばHCl、HBr、H₂SO₄、
H₃PO₄等、又は有機酸、例えば蟻酸、酢酸、プ
ロピオン酸、トリメチル酢酸、メトキシ酢酸、ト
リクロル―又はトリフルオル酢酸のようなハロゲ
ン化酢酸、アミノ酢酸、乳酸、蓚酸、マロン酸、
クエン酸、安息香酸、核中で置換された芳香族
酸、例えばトルイル酸、クロル―又はブロム安息
香酸、メトキシ安息香酸及びアミノ安息香酸、フ
タル酸等との塩の形で有利に使用される。該酸の
性質は、該酸が基質と酵素との間の反応に関与し
ないので重要ではない。 式の基質及びその酸との塩は、特定の蛋白分
解酵素、特に酵素部類E.C.3.4.21.の酵素
（“Enzyme Nomenclature”、Elsevier Scientific
Publishing Company（Amsterdam）社刊、1973
年、第238頁以降、参照）、例えば器官カリクレイ
ン及び腺カリクレイン、プラズミン及びトロンビ
ンの作用によつて加水分解により分解され、その
結果式：Ｒ―NH₂の有色性又は螢光性分解生成
物が形成され、この場合この分解生成物の量は、
測光法、分光測光法、螢光分光測光法又は電気化
学的方法によつて測定することができる。従つ
て、この新規の基質は、蛋白分解酵素、殊にアル
ギニンのカルボキシル側鎖上の天然のペプチド鎖
を分解する酵素部類E.C.3.4.21.の酵素、例えば器
官又は腺カリクレイン、プラズミン、血漿カリク
レイン、トロンビンないしはそれらの抑制因子及
び前酵素、ならびに該酵素の形成又は抑御に関与
するその他の因子を定量分析するのに有用であ
る。 次の実施例２，３，４，５，７，８，15に記載
のトリペプチド誘導体は、殊に尿カリクレインを
分析するための基質として有用である。 ヒトの喀痰中のカリクレインを分析するには、
次の実施例１，２，３，４，５，８，９，15，
17，18，19，20，21，22、及び23に記載のトリペ
プチド誘導体を使用することができる。 次の実施例１，７，８，13，17，18に記載のト
リペプチド誘導体は、プラズミンを分析するのに
使用することができる１群の基質を構成する。 次の実施例７，８，９，10，11，12，13，14，
15，16，18，19，20，21，22及び23に記載のトリ
ペプチド誘導体は、トロンビンを分析するための
極めて敏感な基質である。 本発明によれば、蛋白分解酵素、殊にアルギニ
ンのカルボキシル側鎖上の天然のペプチド鎖を分
解する酵素部類E.C.3.4.21.の酵素、例えば器官又
は腺カリクレイン、プラズミン及びトロンビンを
定量分析する方法が記載される。本発明によれ
ば、この方法は、前記酵素を含有するか又は該酵
素を形成又は消費する物質を、式のトリペプチ
ド誘導体と反応させ、このトリペプチド誘導体に
おける酵素の加水分解作用によつて形成される有
色又は螢光分解生成物Ｒ―NH₂の量を、測光法、
分光測光法、螢光分光測光法又は電気化学的方法
によつて測定することによりなる。本発明によれ
ば、この方法は、例えば酵素標本の酵素含量又は
ヒトの体液及び哺乳動物の体液、例えば尿、膵
液、腸粘液、乳腺分泌物、汗腺分泌物、喀痰及び
血液中の酵素濃度を分析することができる。本発
明方法は、殊に前記体液中の器官又は腺カリクレ
イン及び血漿カリクレインを定量分析するのに有
用である。この方法によれば、遊離器官カリクレ
イン及び粘膜カリクレインないしはプレカリクレ
インから形成されたカリクレイン、さらにカリク
レインの生理学的又は非生理学的抑制因子及びプ
レカリクレインの生理学的又は非生理学的賦活体
を分析することができる。 式のトリペプチド誘導体は、以下に記載した
方法により製造することができる： (1) Ｒを、Ｃ―末端アルギニンのカルボキシル基
に結合させ、その際にα―アミノ基を保護基、
例えばカルボベンゾキシ基又はｔ―ブトキシカ
ルボニル基によつて保護し、アルギニンの場合
にはδ―グアニジル基を、例えばHClを用いる
プロトン化、ニトロ化又はトジル化によつて保
護する。また、Ｃ―末端Ｒ―NH基は、ペプチ
ド鎖を段階的に合成する間保護基として役立
つ。その他の保護基は、必要な場合には所謂の
ペプチド鎖が完全に合成されるまで他のアミノ
酸誘導体を結合させるために選択的に除去する
ことができる。最後に、残留する保護基を、Ｒ
―NH―基を作用させることなしに完全に分解
する（例えば、Miklos Bodansky他、
“Peptide Synthesis”、Interscience
Publishers社刊、1966年、第163〜165頁）。 (2) 第１にペプチド鎖を（Bodansky他による方
法、上記引用文中、により）合成するが、その
際にアルギニンのＣ―末端カルボキシル基を常
用のエステル基、例えばメトキシ基、エトキシ
基又はベンジルオキシ基によつて保護する。該
エステル基は、トリフルオル酢酸により選択的
に分解しなければならないｔ―ブトキシ基を除
いて、アルカリ加水分解によつて除去すること
ができる。アルギニンのδ―グアニジル基をプ
ロトン化する場合には、該エステル基をトリプ
シンを用いて酵素により除去し、この場合ラセ
ミ化は起こらない。次に、発色団Ｒ―NH―を
結合させる。アルギニンのδ―グアニジノ基を
ニトロ基又はトシル基によつて保護し、トリペ
プチド誘導体のＮ―末端α―アミノ基をカルボ
ベンゾキシ基又はｐ―メチル―、ｐ―メトキシ
―又はｐ―クロルベンジルオキシカルボニル基
又はｔ―ブトキシ基によつて保護する場合に
は、全ての保護基を同時に除去する。この除去
は、保護されているトリペプチド誘導体を無水
HFで室温で処理することによつて実施するこ
とができ、したがつてこの場合にはアミノ基及
びδ―グアニジノ基の全ての前記保護基が除去
される。また、この除去は、保護されているト
リペプチド誘導体が保護ニトロ基又はトシル基
を含有しない場合、氷酢酸中の2N HBrで室温
で処理することによつて実施することもでき
る。 本発明によるトリペプチド誘導体の製造は、次
の実施例に詳記されている。 実施例によつて得られた溶出液及び生成物の分
析は、シリカゲルで被覆されたガラス板
（Merck社、F254）を用いて薄層クロマトグラフ
イーによつて行なわれた。薄層クロマトグラム
は、次の溶剤系によつて展開した： Ａ クロロホルム／メタノール（９：１） Ｂ ｎ―プロパノール／酢酸エチル／水（７：
１：２） Ｃ ｎ―ブタノール／酢酸／水（３：１：１） 次の略語を使用する。 AcOH＝酢酸 Ala＝アラニン Arg＝アルギニン BOC＝ｔ―ブトキシカルボニル But＝α―アミノ酪酸 Cbo＝カルボベンゾキシ CHA＝シクロヘキシルアラニン CHG＝シクロヘキシルグリシン CHT＝シクロヘキシルチロシン＝
ｐ―ヒドロキシシクロヘキシルアラニン DMF＝ジメチルホルムアミド DPA＝１，３―ジ（メトキシカル
ボニル）―フエニル―(5)―アミド TLC＝薄層クロマトグラフイー Et₃N＝トリエチルアミン HMPTA＝燐酸Ｎ，Ｎ，N′，N′，
N″，N″―ヘキサメチルトリアミド Iie＝イソロイシン Leu＝ロイシン SS＝溶剤系 Lys＝リジン MCA＝４―メチル―クマリル―(7)
―アミド MeOH＝メタノール ４―MeO―２―NA＝４―メトキシ―２―ナフチ
ルアミド Nleu＝ノルロイシン Nval＝ノルバリン OpNP＝ｐ―ニトロフエノキシ Phe＝フエニルアラニン Ph′Gly＝フエニルグリシン Pip＝ピペコリン酸 pNA＝ｐ―ニトロアニリド Pro＝プロリン THF＝テトラヒドロフラン Tyr＝チロシン Val＝バリン 特に記載しない限り、ペプチド鎖中のアミノ酸
はＬ―形を有する。 例 １ Ｈ―Ｄ―CHG―Ala―Arg―pNA.2HBr 1a Cbo―Arg―pNa.HCl 250mlの三首フラスコ中で（真空中でP₂O₅上
で乾燥した）Cbo―Arg―OH.HCl16.0ｇ（47.0
ミリモル）を20℃で無水HMPTA90mlに溶解
し、この場合フラスコ中の雰囲気は湿分を含ま
ないように保持した。得られた溶液に室温でま
ずHMPTA10ml中のEt₃N4.74ｇ（47.0ミリモ
ル）の溶液を添加し、次に（100％過剰の）ｐ
―ニトロフエニルイソシアネート16.4ｇ（100
ミリモル）を滴加した。20℃での24時間の反応
時間後、HMPTAの大部分を真空中で蒸留す
ることによつて除去した。この残滓を30％
AcOHで数回抽出した。この残滓を廃棄した。
合した酢酸抽出液を30％AcOHで平衡させかつ
30％AcOHで溶解せしめる“セフアデツクス
（Sephadex）Ｇ―15”（登録商標）のカラムを
通すことによつてさらに精製した。ｐ―ニトロ
アニリンの遊離下にトリプシンで処理すること
によつて分解されたAcOH溶出液の画分を凍結
乾燥した。こうして、TLCによつて示される
ようにSS Ｃ中で均一な無定形粉末12.6ｇが得
られた。元素分析及び実験式C₂₀H₂₅N₆O₅Clか
らの計算により次の値が得られた（実験式から
の値は括弧内のものである）：Ｃ＝51.29％
（51.67％）、Ｈ＝5.48％（5.42％）、Ｎ＝17.29％
（18.08％）、Cl＝7.50％（7.63％）。 1b 2HBr.H―Arg―pNA 化合物1a4.65ｇ（10ミリモル）を撹拌下で氷
酢酸中の2N HBr40mlで20℃で湿分の不在下に
45分間処理した。アミノ酸誘導体はCO₂の発生
下に溶解した。この反応溶液を強力撹拌下で無
水エーテル250mlに滴加した。この溶液は、
2HBr.H―Arg―pNAの沈殿物を生じた。エー
テル相を吸引過し、その上固体相を副生成物
として形成された臭化ベンジルならびに過剰の
HBr及びAcOHを除去するために無水エーテ
ル100mlの量で４回洗浄した。この残滓をメタ
ノール50mlに溶解し、そのPHをEt₃Nを添加す
ることによつて4.5に調節し、この溶液を真空
中で30℃で濃縮乾燥した。得られた生成物を
MeOH75mlに溶解し、MeOHで平衡させた
“セフアデツクス（Sephadex）LH―20”（架
橋デキストランゲル）のカラムを通した。この
溶出液の画分から、TLCによつて示されるよ
うにSS Ｃ中で均一な無定形化合物1b4.18ｇ
（理論値の91.6％）が得られた。元素分析及び
実験式C₁₂H₂₀N₆O₃Br₂からの計算により次の
値が得られた：Ｃ＝31.15％（31.60％）、Ｈ＝
4.35％（4.42％）、Ｎ＝18.84％（18.43％）及び
Br＝34.81％（35.03％）。 1c Cbo―Ala―Arg―pNA.HBr 化合物1b4.56ｇ（10ミリモル）を新しく蒸留
したDMF30mlに溶解し、この溶液を−10℃に
冷却した。この溶液に撹拌下でEt₃N1.40ml
（10ミリモル）を添加した。形成したEt₃N.
HBrを過することによつて除去し、冷たい
DMFの少量で洗浄した。この液に−10℃で
Cbo―Ala―OpNP3.79ｇ（11ミリモル）を添
加し、反応を湿分の不在下に２〜３時間継続さ
せ、この場合反応溶液の温度は次第に約20℃に
到達した。この溶液を再び−10℃に冷却し、
Et₃N0.70ml（５ミリモル）で緩衝し、−10℃で
約２時間反応させ、室温で約３時間反応させ
た。この方法をHt₃N0.70mlを用いて繰り返し、
16時間この反応溶液を真空中で50℃で濃縮乾燥
した。この残滓を50％AcOH75mlに溶解し、50
％AcOHで平衝させた“セフアデツクス
（Sephadex）Ｇ―15”のカラムでゲル過する
ことによつて精製した。ｐ―ニトロアニリンの
遊離下でトリプシンで処理することによつて分
解されたAcOH溶出液の主画分を真空中で40℃
で濃縮乾燥した。この残滓をMeOH150mlに溶
解し、再び濃縮して乾燥した。得られた残滓を
真空デシケーター中で60℃でP₂O₅で乾燥し、
TLCによつて示されるようにSS Ｃ中で均一な
無定形化合物lc5.14ｇ（理論値の88.5％）を得
た。元素分析及び実験式C₂₃H₃₀N₇O₆Brからの
計算により次の値が得られた：Ｃ＝47.19％
（47.59％）、Ｈ＝5.21％（5.21％）、Ｎ＝17.18％
（16.89％）及びBr＝13.10％（13.77％）。 1d 2HBr.H―Ala―Arg―pNA 化合物1c4.64ｇ（８ミリモル）を撹拌下で氷
酢酸中の2N HBr32mlで20℃で40分間処理し
た。ジペプチド誘導体は、CO₂の発生下に次第
に溶解した。この反応溶液を強力撹拌下で無水
エーテル250mlに滴加した。この溶液は、
2HBr.H―Ala―Arg―pNAの沈殿物を生じた。
エーテル相を吸引過し、その上固体相を副生
成物として形成した臭化ベンジルならびに過剰
のHBr及びAcOHを除去するために無水エー
テル100mlの量で４回洗浄した。この残滓を
MeOH50mlに溶解した。PHをEt₃Nを用いて4.5
に調節し、この溶液を真空中で30℃で濃縮乾燥
した。得られた残滓をMeOH50mlに溶解し、
MeOHで平衡させた“セフアデツクス
（Sephadex）LH―20”のカラムで精製した。
ｐ―ニトロアニリンの遊離下でトリプシンで処
理することによつて分解されたMeOH溶出液
の画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。得られ
た残滓を真空デシケーター中で40℃でP₂O₅上
で乾燥し、TLCによつて示されるようにSS Ｃ
中で均一な無定形化合物1d3.83ｇ（理論値の
91.9％）を得た。元素分析及び実験式
C₁₅H₂₅N₇O₄Brからの計算により次の値が得ら
れた：Ｃ＝34.01％（34.17％）、Ｈ＝4.76％
（4.78％）、Ｎ＝18.85％（18.10％）及びBr＝
29.88％（30.31％）。 1e Cbo―Ｄ―CHG―Ala―pNA.HBr 化合物1d2.64ｇ（５ミリモル）を新しく蒸留
したDMF20mlに溶解し、この溶液を−10℃に
冷却した。この溶液にEt₃N0.70ml（５ミリモ
ル）を撹拌下で添加した。形成したEt₃N.HBr
を過することによつて除去し、冷たいDMF
の少量で洗浄した。この液に−10℃でCbo―
Ｄ―CHG.OpNP2.27ｇ（5.5ミリモル）を撹拌
下で添加した。この反応混合物を湿分の不在下
で２〜３時間反応させ、この場合この反応溶液
の温度は次第に約20℃に到達した。この溶液を
再び−10℃に冷却し、Et₃N0.35ml（2.5ミリモ
ル）で緩衝し、−10℃で約２時間反応させ、室
温でさらに３時間反応させた。この方法を
Et₃N0.35mlを用いて繰り返し、16時間後この
反応溶液を真空中で５℃で濃縮乾燥した。この
残滓を50％AcOH50mlに溶解し、50％AcOHで
平衡させた“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ
―15”のカラムでゲル過することによつて精
製した。ｐ―ニトロアニリンの遊離下でトリプ
シンで処理することによつて分離されたAcOH
溶出液の主画分を真空中で40℃で濃縮乾燥し
た。この残滓をMeOH100mlに溶解し、この溶
液を再び濃縮して乾燥した。得られた残滓を真
空デシケーター中で60℃でP₂O₅上で乾燥し、
TLCによつて示されるようにSS Ｃ中で均一な
無定形化合物1e3.12ｇ（理論値の86.7％）を得
た。元素分析及び実験式C₃₁H₄₃N₈O₇Brからの
計算により次の値が得られた：Ｃ＝51.66％
（51.74％）、Ｈ＝6.06％（6.02％）、Ｎ＝15.80％
（15.57％）及びBr＝10.96％（11.10％）。 1f 2HBr.H―Ｄ―CHG―Ala―Arg―pNA 化合物1e2.16ｇ（３ミリモル）を撹拌下で氷
酢酸中の2N HBr12mlで20℃で湿分の不在下に
40分間処理した。トリペプチド誘導体は、脱カ
ルボキシル化下及びCO₂の発生下で次第に溶解
した。この反応溶液を強力撹拌下で無水エーテ
ル120mlに滴加した。この溶液は、2HBr.H―
Ｄ―CHG―Ala―Arg―pNAの沈殿物を生じ
た。エーテル相を過棒を通して吸引過し、
次に固体相を無水エーテル50mlの量で４回洗浄
した。得られた残滓をMeOH40mlに溶解した。
PHをEt₃Nを用いて4.5に調節し、この溶液を真
空中で30℃で濃縮乾燥した。この残滓を
MeOH30mlに溶解し、MeOHで平衡させた
“セフアデツクス（Sephadex）LH―20”のカ
ラムで精製した。ｐ―ニトロアニリンの遊離下
でトリプシンで処理することによつて分解され
たMeOH溶出液の画分を真空中で30℃で濃縮
乾燥した。後精製するために、予備精製された
残滓を33％AcOH30mlに溶解し、33％AcOHで
平衡させた“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ
―15”のカラムでゲル過することによつて精
製した。ｐ―ニトロアニリンの遊離下でトリプ
シンで処理することによつて分解されたAcOH
溶出液の主画分を真空中で40℃で濃縮乾燥し
た。得られた残滓を真空デシケーター中で40℃
でP₂O₅上で乾燥し、TLCによつて示されるよ
うにSS Ｃ中で均一な無定形化合物1f1.67ｇ
（理論値の83.4％）を得た。元素分析及び実験
式C₂₃H₃₈N₈O₅Br₂からの計算により次の値が
得られた：Ｃ＝41.66％（41.45％）、Ｈ＝5.74％
（5.75％）、Ｎ＝17.09％（16.82％）及びBr＝
23.90％（23.98％）。 アミノ酸分析により次の正確な比率で所望の
アミノ酸の存在が確認された： Arg：0.99―Ala：1.00―Ｄ―CHG：0.96。 Rf値：0.39 例 ２ 2HBr.H―Ｄ―CHG―Ala―Arg―MCA 2b 2HBr.H―Arg―MCA 市販のCbo―Arg―MCA.HCl13.0ｇ（25.9ミ
リモル）を氷酢酸中の2N HBrのの溶液104ml
（208ミリモル）を用いて例1bにより解封鎖し
た。この乾燥残滓をMeOH400mlに溶解し、こ
の溶液を“セフアデツクス（Sephadex）LH
―20”のカラムで精製し。４―メチル―７―ア
ミノ―クマリンの遊離下でトリプシンで処理す
ることによつて分解されたMeOH溶出液の画
分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。得られた残
滓を真空デシケーター中で４℃でP₂O₅上で乾
燥し、TLCによつて示されるようにSS Ｃ中で
均一な無定形化合物2b11.2ｇ（理論値の87.7
％）を得た。元素分析及び実験式
C₁₆H₂₃N₅O₃Br₂からの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝39.40％（38.96％）、Ｈ＝4.61％
（4.70％）、Ｎ＝14.48％（14.20％）及びBr＝
31.90％（32.40％）。 2c Cbo―Ala―Arg―MCA.HBr 化合物2b4.93ｇ（10ミリモル）及びCbo―
Ala―OpNP3.79ｇ（11ミリモル）を新しく蒸
留したDMF75mlに添加した。−10℃への冷却
後、撹拌下でEt₃Nをまず1.40ml（10ミリモ
ル）、次に0.70ml（５ミリモル）添加した。こ
の混合物を、湿分の不在下で、まず−10℃で３
時間反応させ、次に室温で４時間反応させた。
この反応溶液を再び−10℃に冷却し、
Et₃N0.70mlで緩衝し、かつ20℃で１晩撹拌し
た。この反応混合物を真空中で50℃で濃縮乾燥
し、この残滓を50％AcOH200mlに溶解し、こ
の溶液を“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ―
15”のカラムで精製した。４―メチル―７―ア
ミノ―クマリンの遊離下でトリプシンで処理す
ることによつて分解されたAcOH溶出液の画分
を真空中で40℃で濃縮乾燥した。こうして得ら
れた残滓を真空デシケーター中で60℃でP₂O₅
上で乾燥し、TLCによつて示されるようにSS
Ｃ中で均一な無定形化合物2C5.25ｇ（理論値の
85.0％）を得た。元素分析及び実験式
C₂₇H₃₃N₆O₆Brからの計算により、次の値が得
られた：Ｃ＝52.09％（52.52％）、Ｈ＝5.46％
（5.39％）、Ｎ＝13.80％（13.61％）及びBr＝
12.18％（12.94％）。 2d Ｈ―Ala―Arg―MCA 化合物2c4.94ｇ（８ミリモル）を氷酢酸中の
2N HBr32mlを用いて例1dにより解封鎖した。
得られた粗製生成物をMeOH100mlに溶解し、
この溶液を“セフアデツクス（Sephadex）
LH―20”のカラムで精製した。４―メチル―
７―アミノ―クマリンの遊離下でトリプシンで
処理することによつて分解されたMeOH溶出
液の画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。得ら
れた残滓を真空デシケーター中で40℃でP₂O₅
上で乾燥し、TLCによつて示されるようにSS
Ｃ中で均一な無定形化合物2d4.10ｇ（理論値の
90.8％）を得た。元素分析及び実験式
C₁₉H₂₈N₆O₄Br₂からの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝41.01％（40.44％）、Ｈ＝5.03％
（5.00％）、Ｎ＝15.05％（14.89％）及びBr＝
27.98％（28.32％）。 2e Cbo―Ｄ―CHG―Ala―Arg―MCA.HBr 化合物2d2.78ｇ（５ミリモル）を例1eにより
Cbo―Ｄ―CHG―OpNP2.27ｇ（5.5ミリモル）
と反応させた。得られた粗製生成物を50％
AcOH75mlに溶解し、この溶液“セフアデツク
ス（Sephadex）Ｇ―15”のカラムで精製した。
４―メチル―７―アミノ―クマリンの遊離下で
トリプシンで処理することによつて分解された
AcOH溶出液の画分を真空中で40℃で濃縮乾燥
した。この残滓を真空デシケーター中で60℃で
P₂O₅上で乾燥し、TLCによつて示されるよう
にSS Ｃ中で均一な無定形化合物2e2.98ｇ（理
論値の78.8％）を得た。元素分析及び実験式
C₃₅H₄₆N₇O₇Brからの計算により、次の値が得
られた：Ｃ＝55.10％（55.55％）、Ｈ＝6.18％
（6.13％）、Ｎ＝12.68％（12.96％）及びBr＝
10.33％（10.56％）。 2f 2HBr.H―Ｄ―CHG―Ala―Arg―MCA 化合物2d2.17ｇ（３ミリモル）を氷酢酸中の
2N HBr12mlを用いて例1fにより解封鎖した。
得られた粗製生成物をMeOH50mlに溶解し、
この溶液を“セフアデツクス（Sephadex）
LH―20”のカラムで精製した。４―メチル―
７―アミノ―クマリンの遊離下でトリプシンで
処理することによつて分解されたMeOH溶出
液の画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。更
に、精製するために、予備精製された生成物を
50％AcOH40mlに溶解し、この溶液を“セフア
デツクス（Sephadex）Ｇ―15”のカラムでゲ
ル過することによつて精製した。４―メチル
―７―アミノ―クマリンの遊離下でトリプシン
で処理することによつて分解されたAcOH溶出
液の主画分を真空中で40℃で濃縮乾燥した。こ
の残滓を真空デシケーター中で40℃でP₂O₅上
で乾燥し、TLCによつて示されるようにSS Ｃ
中で均一な無定形化合物2f1.72ｇ（理論値の
81.5％）を得た。元素分析及び実験式
C₂₇H₄₁N₇O₅Br₂からの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝45.78％（46.10％）、Ｈ＝5.90％
（5.87％）、Ｎ＝13.70％（13.94％）及びBr＝
22.55％（22.72％）。 アミノ酸分析により正確な比率で所望のアミ
ノ酸の存在が確認された： Ala：1.00―Arg：1.01―Ｄ―CHG：0.98。 Rf値：0.41。 例 ３ 2HBr.H―Ｄ―CHG―Ala―Arg―DPA 3a Cbo―Arg―DPA.HCl 無水Cbo―Arg―OH.HCl34.48ｇ（0.1モル）
を1000mlの三首フラスコ中で新しく蒸留した無
水DMF150mlと無水THF300mlとの混合物に20
℃で溶解した。−10℃に冷却した該溶液に撹拌
下でEt₃N10.2ｇ（0.1モル）を湿分の不在下で
添加した。更に、THF5ml中のクロル蟻酸イソ
ブチル13.65ｇ（0.1モル）の溶液を20分間で滴
加し、その後に反応温度は−５℃を決して越え
ないようにした。−10℃〜−５℃の温度で10分
間の付加的な反応時間後、DMF75ml中のジメ
チル５―アミノ―イソフタレート20.92ｇ（0.1
モル）の溶液を30分間で滴加し、その後に反応
温度はいつも−５℃以下に保持した。この反応
混合物を−５℃でさらに１時間反応させた。こ
の反応混合物を、Et₃N.HClを晶出させるため
に、20℃で１晩撹拌し、次に−15℃に冷却し
た。形成したEt₃N.HClを別し、冷たいDMF
の少量で洗浄した。この液と洗浄液を一緒に
真空中で50℃で濃縮乾燥した。この残滓を50％
AcOH1000mlに溶解し、この溶液を50％AcOH
で平衡させた“セフアデツクス（Sephadex）
Ｇ―15”のカラムでゲル過することによつて
精製した。ジメチル５―アミノ―イソフタレー
トの遊離下でトリプシンで処理することによつ
て分解されたAcOH溶出液の主画分を真空中で
40℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケー
ター中で50℃でP₂O₅上で乾燥し、TLCによつ
て示されるようにSS Ｃ中で均一な無定形化合
物3a24.6ｇ（理論値45.9％）を得た。元素分析
及び実験式C₂₄H₃₀N₅O₇Clからの計算により、
次の値が得られた：Ｃ＝53.21％（53.78％）、
Ｈ＝5.71％（5.64％）、Ｎ＝13.20％（13.07％）
及びCl＝6.52％（6.62％）。 3b 2HBr.H―Arg―DPA 化合物3a21.44ｇ（40ミリモル）を例1bによ
り解封鎖した。普通の処理後、得られた粗製生
成物をMeOH250mlに溶解し、この溶液を“セ
フアデツクス（Sephadex）LH―20”のカラ
ムでゲル過することによつて精製した。ジメ
チル５―アミノ―イソフタレートの遊離下でト
リプシンで処理することによつて分解された
MeOH溶出液の画分を真空中で濃縮乾燥した。
この残滓を真空デシケーター中で40℃でP₂O₅
上で乾燥し、TLCによつて示されるようにSS
Ｃ中で均一な無定形化合物3b19.93％（理論値
の93.1％）を得た。元素分析及び実験式
C₁₆H₂₅N₅O₅Br₂からの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝36.82％（36.45％）、Ｈ＝4.67％
（4.78％）、Ｎ＝13.45％（13.28％）及びBr＝
29.85％（30.31％）。 3c Cbo―Ala―Arg―DPA.HBr 化合物3b5.27ｇ（10ミリモル）を例1cにより
Cbo―Ala―OpNP4.69ｇ（11ミリモル）と反
応させた。普通の処理後に得られた粗製生成物
を50％AcOH200mlに溶解し、この溶液をセフ
アデツクス（Sephadex）Ｇ―15”のカラムで
精製した。ジメチル５―アミノ―イソフタレー
トの遊離下でトリプシンで処理することによつ
て分解されたAcOH溶出液の画分を真空中で40
℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケータ
ー中で60℃でP₂O₅上で乾燥し、TLCによつて
示されるようにSS Ｃ中で均一な無定形化合物
3c5.47ｇ（理論値の84.0％）を得た。元素分析
及び実験式C₂₇H₃₅N₆O₈Brからの計算により、
次の値が得られた：Ｃ＝49.48％（49.77％）、
Ｈ＝5.50％（5.41％）、Ｎ＝13.01％（12.90％）
及びBr＝12.11％（12.26％）。 3d 2HBr.H―Ala―Arg―DPA 化合物3c5.21ｇ（８ミリモル）を氷酢酸中で
2N HBr32mlを用いて例1dにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH100mlに溶解し、ここの溶液を“セフア
デツクス（Sephadex）LH―20”のカラムで
精製した。ジメチル５―アミノ―イソフタレー
トの遊離下でトリプシンで処理することによつ
て分解されたMeOH溶出液の画分を真空中で
30℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケー
ター中で40℃でP₂O₅上で乾燥し、TLCによつ
て示されるようにSS Ｃ中で均一な無定形化合
物3d4.12ｇ（理論値の86.1％）を得た。元素分
析及び実験式C₁₉H₃₀N₆O₆Brからの計算によ
り、次の値が得られた：Ｃ＝37.85％（38.14
％）、Ｈ＝5.11％（5.05％）、Ｎ＝13.88％
（14.05％）及びBr＝26.40％（26.71％）。 3e Cbo―Ｄ―CHG―Ala―Arg―DPA.HBr 化合物3d2.99ｇ（５ミリモル）を例1eにより
Cbo―Ｄ―CHG―OpNP2.27ｇ（5.5ミリモル）
と反応させた。普通の処理後に得られた粗製生
成物を50％AcOH100mlに溶解し、この溶液
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ―15”のカラ
ムで精製した。ジメチル５―アミノ―イソフタ
レートの遊離下でトリプシンで処理することに
よつて分解されたAcOH溶出液の画分を真空中
で40℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケ
ーター中で60℃でP₂O₅上で乾燥し、TLCによ
つて示されるようにSS Ｃ中で均一な無定形化
合物3e3.18ｇ（理論値の80.4％）を得た。元素
分析及び実験式C₃₅H₄₈N₇O₉Brからの計算によ
り、次の値が得られた：Ｃ＝52.76％（53.16
％）、Ｈ＝6.15％（6.12％）、Ｎ＝12.22％
（12.40％）及びBr＝10.00％（10.11％）。 3f 2HBr.H―Ｄ―CHG―Ala―Arg―DPA 化合物3e2.37ｇ（３ミリモル）と氷酢酸中の
2N HBr12mlを用いて例1fにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH50mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH―20”のカラムで予
備精製した。ジメチル５―アミノ―イソフタレ
ートの遊離下でトリプシンで処理することによ
つて分解されたMeOH溶出液の画分を真空中
で30℃で濃縮乾燥した。この予備精製された生
成物を50％AcOH50mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ―15”のカラ
ムでゲル過することによつて精製した。ジメ
チル５―アミノ―イソフタレートの遊離下でト
リプシンで処理することによつて分解された
AcOH溶出液の主画分を真空中で40℃で濃縮乾
燥した。この残滓を真空デシケーター中で40℃
でP₂O₅上で乾燥し、TLCによつて示されるよ
うにSS Ｃ中で均一な無定形化合物3f1.88ｇ
（理論値の85.0％）を得た。元素分析及び実験
式C₂₇H₄₃N₇O₇Br₂からの計算により、次の値
が得られた：Ｃ＝43.88％（43.97％）、Ｈ＝5.92
％（5.88％）、Ｎ＝13.18％（13.30％）及びBr＝
21.25％（21.67％）。 アミノ酸分析により正確な比率で所望のアミ
ノ酸の存在が確認された： Ｄ―CHG：0.97―Arg：0.99―Ala：1.00。 Rf値：0.44 例 ４ 2HBr.H―Ｄ―CHG―Ala―Arg―２―NA 4b 2HBr.H―Arg―２―NA 市販のCbo―Arg―２―NA.HCl9.40ｇ（20
ミリモル）を例1bにより氷酢酸中の2N
HBr80mlの溶液と反応させた。普通の処理後
に得られた生成物をMeOH150mlに溶解し、こ
の溶液を“セフアデツクス（Sephadex）LH
―20”のカラムで精製した。２―ナフチルアミ
ンの遊離下でトリプシンで処理することによつ
て分解されたMeOH溶出液の画分を真空中で
30℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケー
ター中で40℃でP₂O₅上で乾燥し、TLCによつ
て示されるようにSS Ｃ中で均一な無定形化合
物4b8.60ｇ（理論値の93.2％）を得た。元素分
析及び実験式C₁₆H₂₃N₅OBr₂からの計算によ
り、次の値が得られた：Ｃ＝42.08％（41.67
％）、Ｈ＝5.12％（5.03％）、Ｎ＝14.68％
（15.19％）及びBr＝33.96％（34.65％）。 4c CboｇAla―Arg―２―NA.HBr 化合物4b4.6ｇ（10ミリモル）を例1cにより
Cbo―Ala―OpNP3.79ｇ（11ミリモル）と反
応させた。普通の処理後に得られた粗製生成物
を50％AcOH150mlに溶解し、この溶液を“セ
フアデツクス（Sephadex）Ｇ―15”のカラム
で精製した。２―ナフチルアミンの遊離下でト
リプシンで処理することによつて分解された
AcOH溶出液の画分を真空中で40℃で濃縮乾燥
した。この残滓を真空デシケーター中で60℃で
P₂O₅上で乾燥し、TLCによつて示されるよう
にSS Ｃ中で均一な無定形化合物4c4.74ｇ（理
論値の1.0％）を得た。元素分析及び実験式
C₂₇H₃₃N₆O₄Brからの計算により、次の値が得
られた：Ｃ＝55.15％（55.39％）、Ｈ＝5.70％
（5.68％）、Ｎ＝14.12％（14.35％）及びBr＝
13.47％（13.15％）。 4d 2HBr.H―Ala―Arg―２―NA 化合物4c4.10ｇ（７ミリモル）を氷酢酸中の
2N HBr28mlを用いて例1dにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH100mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH―20”のカラムで精
製した。２―ナフチルアミンの遊離下でトリプ
シンで処理することによつて分解された
MeOH溶出液の画分を真空中で30℃で濃縮乾
燥した。この残滓を真空デシケーター中で40℃
でP₂O₅上で乾燥し、TLCによつて示されるよ
うにSS Ｃ中で均一な無定形化合物4d3.48ｇ
（理論値の93.4％）を得た。元素分析及び実験
式C₁₉H₂₈N₆O₂Br₂からの計算により、次の値
が得られた：Ｃ＝42.81％（42.87％）、Ｈ＝5.33
％（5.30％）、Ｎ＝15.69％（15.79％）及びBr＝
29.70％（30.02％）。 4e Cbo―Ｄ―CHG―Ala―Arg―２―NA.HBr 化合物4d2.66ｇ（５ミリモル）を例1eにより
Cbo―Ｄ―CHG―OpNP2.27ｇ（5.5ミリモル）
と反応させた。普通の処理後に得られた粗製生
成物を50％AcOH100mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ―15”のカラ
ムで精製した。２―ナフチルアミンの遊離下で
トリプシンで処理することによつて分解された
AcOH溶出液の第１の主画分を真空中で40℃で
濃縮乾燥し、真空デシケーター中で60℃で
P₂O₅上で乾燥した。こうして、TLCによつて
示されるようにSS Ｃ中で均一な無定形化合物
4e3.11―（理論値の85.8％）が得られた。元素
分析及び実験式C₃₅H₄₆N₇O₅Brからの計算によ
り、次の値が得られた：Ｃ＝57.90％（58.01
％）、Ｈ＝6.95％（6.40％）、Ｎ＝13.40％
（13.53％）及びBr＝10.78％（11.03％） 4f 2HBr.H―Ｄ―CHG―Ala.Arg―２―NA 化合物4e1.45ｇ（２ミリモル）を氷酢酸中の
2N HBr8mlを用いて例1fにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物をMeOH4
mlに溶解し、この溶液を“セフアデツクス
（Sephadex）LH―20”のカラムで精製した。
２―ナフチルアミンの形成下でトリプシンで処
理することによつて分解されたMeOH溶出液
の主画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。この
生成物を50％AcOH50mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ―15”のカラ
ムで精製した。２―ナフチルアミンの形成下で
トリプシンで処理することによつて分解された
AcOH溶出液の主画分を真空中で40℃で濃縮乾
燥した。この残滓を真空デシケーター中で40℃
でP₂O₅上で乾燥し、TLCによつて示されるよ
うにSS Ｃ中で均一な無定形化合物4f1.06ｇ
（理論値の73.6％）を得た。元素分析及び実験
式C₂₇H₄₁N₇O₃Br₂からの計算により次の値が
得られた：Ｃ＝48.20％（48.30％）、Ｈ＝6.21％
（6.15％）、Ｎ＝14.48％（14.60％）及びBr＝
23.52％（23.80％）。 アミノ酸分析により正確な比率で所望のアミ
ノ酸の存在が確認された： Ｄ―CHG：0.98―Arg：0.97―Ala：1.00。 Rf値：0.41。 例 ５ 2HBr.H―Ｄ―CHG―Ala―Arg―４―MeO―
２―NA 5b 2HBr.H―Arg―４―MeO―２―NA 市販のCbo―Arg―４―MeO―２―NA.
HCl10.0ｇ（20ミリモル）を氷酢酸中の2N
HBr 80mlを用いて例1bにより解封鎖した。普
通の処理後に得られた粗製生成物をMeOH150
mlに溶解し、この溶液を“セフアデツクス
（Sephadex）LH―20”のカラムで精製した。
４―メトキシ―２―ナフチルアミンの遊離下で
トリプシンで処理することによつて分解された
MeOH溶出液の主画分を真空中で30℃で濃縮
乾燥した。この残滓を真空デシケーター中で40
℃でP₂O₅上で乾燥した後、TLCによつて示さ
れるようにSS Ｃ中で均一な無定形化合物
5b8.98ｇ（理論値の91.4％）が得られた。元素
分析及び実験式C₁₇H₂₅N₅O₂Br₂からの計算に
より、次の値が得られた：Ｃ＝41.22％（41.57
％）、Ｈ＝5.19％（5.13％）、Ｎ＝14.40％
（14.26％）及びBr＝32.01％（32.53％）。 5c Cbo―Ala―Arg―４―MeO―２―Na.HBr 化合物5b4.91ｇ（10ミリモル）を例1cにより
Cbo―Ala―OpNP3.79ｇ（11ミリモル）と反
応させた。普通の処理後に得られた粗製生成物
を50％AcOH150mlに溶解し、この溶液を“セ
フアデツクス（Sephadex）Ｇ―15”のカラム
で精製した。４―メトキシ―２―ナフチルアミ
ンの遊離下でトリプシンで処理することによつ
て分解されたAcOH溶出液の第１の主画分を真
空中で40℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デ
シケーター中で60℃でP₂O₅上で乾燥した後、
TLCによつて示されるようにSS Ｃ中で均一な
無定形化合物5c4.80ｇ（理論値の78.0％）が得
られた。元素分析及び実験式C₂₈H₃₅N₆O₅Brか
らの計算により、次の値が得られた：Ｃ＝
54.22％（54.64％）、Ｈ＝5.80％（5.73％）、Ｎ
＝13.55％（13.65％）及びBr＝12.76％（12.98
％）。 5d 2HBr.H―Ala―Arg―４―MeO―２―NA 化合物5c4.31ｇ（７ミリモル）を氷酢酸中の
2N HBr28mlを用いて例1dにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH100mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH―20”のカラムで精
製した。４―メトキシ―２―ナフチルアミンの
形成下でトリプシンで処理するこによつて分解
されたMeOH溶出液の主画分を真空中で30℃
で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケーター
中で40℃でP₂O₅上で乾燥した後、TLCによつ
て示されるようにSS Ｃ中で均一な無定形化合
物5d3.66ｇ（理論値の93.0％）が得られた。元
素分析及び実験式C₂₀H₃₀N₆O₃Br₂からの計算
により、次の値が得られた：Ｃ＝42.91％
（42.72％）、Ｈ＝5.37％（5.38％）、N14.73％
（14.95％）及びBr＝28.05％（28.42％）。 5e Cbo―Ｄ―CHG―Ala―Arg―４―MeO―２
―NA.HBr 化合物5d2.81ｇ（５ミリモル）を例1eにより
Cbo―Ｄ―CHG―OpNP2.27ｇ（5.5ミリモル）
と反応させる。普通の処理後に得られた粗製生
成物を50％AcOH125mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ―15”のカラ
ムで精製した。４―メトキシ―２―ナフチルア
ミンの遊離下でトリプシンで処理することによ
つて分解されたAcOH溶出液の第１の主画分を
真空中で40℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空
デシケーター中で60℃でP₂O₅上で乾燥した後、
TLCによつて示されるようにSS Ｃ中で均一な
無定形化合物5e3.07ｇ（理論値の81.4％）が得
られた。元素分析及び実験式C₃₆H₄₈N₇O₆Brか
らの計算により、次の値が得られた：Ｃ＝
57.02％（57.29％）、Ｈ＝6.48％（6.41％）、Ｎ
＝12.73％（12.99％）及びBr＝10.45％（10.59
％）。 5f 2HBr.H―Ｄ―CHG―Ala―Arg―４―MeO
―２―NA 化合物5e1.51ｇ（２ミリモル）を氷酢酸中の
2N HBr8mlを用いて例1fにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物をMeOH4
mlに溶解し、この溶液を“セフアデツクス
（Sephadex）LH―20”のカラムで予備精製し
た。４―メトキシ―２―ナフチルアミンの形成
下でトリプシンで処理することによつて分解さ
れたMeOH溶出液の主画分を真空中で30℃で
濃縮した。この予備精製された生成物を50％
AcOH60mlに溶解し、この溶液を“セフアデツ
クス（Sephadex）Ｇ―15”のカラムで精製し
た。４―メトキシ―２―ナフチルアミンの形成
下でトリプシンで処理することによつて分解さ
れたAcOH溶出液の主画分を真空中で４℃で濃
縮乾燥した。この残滓を真空デシケーター中で
40℃でP₂O₅上で乾燥した後、TLCによつて示
されるようにSS Ｃ中で均一な無定形化合物
5f1.22ｇ（理論値の86.9％）が得られた。元素
分析及び実験式C₂₈H₄₃N₆O₄Br₂からの計算に
より、次の値が得られた：Ｃ＝47.75％（47.94
％）、Ｈ＝6.22％（6.18）、Ｎ＝13.69％（13.98
％）及びBr＝22.40％（22.78％）。 アミノ酸分析により正確な比率で所望のアミ
ノ酸の存在が確認された： Ｄ―CHG：0.99―Arg：1.01―Ala：1.00。 Rf値：0.45。 一連の他のトリペプチド誘導体を前記実施例
に記載の方法により製造した。これらのトリペ
プチド誘導体は、次の第１表に纒められてい
る。 第１表に示したトリペプチド誘導体の製造に
使用されたジペプチド中間体及びトリペプチド
中間体は、第２表及び３表に記載されている。

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】 例 24 2AcOH.H―Ｄ―Nval―CHA―Arg―pNA 2HBr.H―Ｄ―Nval―CHA―Arg―pNA（例38
により製造）7.09ｇ（10ミリモル）を60％MeOH
水溶液75mlに溶解した。この溶液を酢酸塩の形で
“アンバーライト（Amberlite）”（登録商標）
JRA―401のカラムに充填した。このカラムを60
％MeOH水溶液で溶離し、その後にHBrをイオ
ン交換することによつてAcOHに代えた。この溶
出液を真空中で40℃で濃縮乾燥した。この残滓を
真空デシケーター中で40℃でP₂O₅上で乾燥した
後、臭化物不含の2AcOH.H―Ｄ―Nval―CHA
―Arg―pNA6.33ｇ（理論値の98.5％）が得られ
た。 上記方法によれば、有機酸、例えば蟻酸、プロ
ピオン酸、蓚酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、安息
香酸、クロル安息香酸、サリチル酸又はフタル酸
との他の塩は、前記のトリペプチド誘導体から製
造することができる。イオン交換体、例えば塩酸
塩の形の“アンバーライト（Aaberlite）”JRA―
401を使用することができ、これは苛性ソーダ液
で処理することによつて該イオン交換体を塩基性
OH形に変換し、次に該塩基性イオン交換体を60
％MeOH水溶液中の所望の有機酸とそのナトリ
ウム塩との１：１混合物の溶液で処理することに
よつて所望の酸塩の形に変換することができる。 本発明によるトリペプチド基質を用いての酵素
の定量分析は、次のようにして実施することがで
きる： １ 尿カリクレイン分析 尿１ならびにPH7.9及びイオン強度1.0を有す
るTRIS―イミダゾール緩衝液１mlを37℃で５
分間恒温保持し、次に沈殿物を除去するために
遠心分離する。 37℃に加熱した蒸留水1.4mlと遠心分離物0.4
mlをプラスチツク製キユベツト中で充分に混合
する。この混合物に２×10^-3モルの基質水溶液
0.2mlを添加し、成分を迅速に混合する。この
混合物を37℃で正確に15分間恒温保持する。次
に、この反応混合物を酵素反応を停止させるた
めに氷酢酸0.2mlと混合する。色を計測するた
めには、同じ成分からなるが、酵素反応を阻止
するための基質添加前に添加された氷酢酸を有
する空試料を使用する。次に、形成された有色
化合物Ｒ―NH₂の量を空試料と試験試料との
差から405nmで測光法又は分光測光法により測
定する。得られる値から尿における尿カリクレ
イン活量を次式により測定する： ΔOD15分間×Ｖ×1000×Ｆ／15分間×ｖ×ε＝mU／尿
のml 数 ΔOD＝15分間の405nmでの光学濃度の増加
分 Ｖ＝試験混合物の全容量＝2.2ml 1000＝ＵをmUに変換するための変換係数 Ｆ＝尿(2)の稀釈係数 ｖ＝試料の容量＝0.4ml ε＝1000で割つて吸光係数＝10.4 尿における尿カリクレイン含量の計算は、形
成される生成物Ｒ―NH₂（例えば、ｐ―ニトロ
アニリン）を連続的に測定することによつて実
施することもできる。この方法を喀痰中の腺カ
リクレインの分析に適用するように後記する。 尿カリクレイン以外に、尿も本発明による基
質を少量ではあるが分解することもできる蛋白
分解酵素としてのウロキナーゼを含有する。前
記分析方法においては、尿カリクレインとウロ
キナーゼとの活量の合計が測定される。尿カリ
クレイン活量の正確な値を得るためには、ウロ
キナーゼ活量は差し引かなければならない。こ
のウロキナーゼ活量は、比較試験において尿カ
リクレイン活量を完全に抑制するために緩衝液
１ml当りトリプシン抑制因子（牛の肺からのト
リプシン抑制因子）0.075単位を添加し、かつ
単独にウロキナーゼ活量を測定することによつ
て測定することができる。 ２ 喀痰における腺カリクレイン分析： 喀痰0.5mlをTRIS―イミダゾール緩衝液（イ
オン強度1.0）２mlと混合し、この混合物を37
℃で５分間予め恒温保持する。この恒温保持物
を遠心分離する。試験キユベツトに37℃の蒸留
水1.5mlを充填し、これに遠心分離物0.25mlを
添加する。これらの成分を充分に混合する。更
に、２×10^-3モルの基質水溶液0.2mlを添加す
る。次に、405nmでの吸光変化を記録装置を用
いて５〜10分間連続的に追跡する。毎分の
ΔODの測定値から喀痰１ml当りのカリクレイ
ン活量は、mUで次式により計算される： ΔOD毎分数×Ｖ×100×Ｆ／ｖ×ε＝喀痰のmU／ml数 Ｆ＝５ Ｖ＝1.95 ｖ＝0.25 1U（単位）＝PH、イオン強度、温度及び基質
濃度の最適条件下又は他の規定される条件下に
１分間で基質１マイクロモルを分解することの
できる酵素量。 膵液において膵臓カリクレインは、主にプレ
カリクレインの形で存在し、活性化後でのみ、
例えばトリプシンを用いて分析することができ
る。プレカリクレインの活性後、トリプシン
は、大豆トリプシン抑制因子（SSTI）により
抑制されている。この活性化混合物中のカリク
レイン含量は前記方法の１つによつて測定する
ことができる。 ３ プラズミン分析： TRIS―イミダゾール緩衝液（PH7.5、イオン
強度0.2）1.7mlを25％グリセロール中のプラズ
ミン溶液0.1mlと37℃で混合し、この混合物を
37℃で１分間恒温保持する。この混合物に37℃
の２×10^-3モルの基質水溶液0.2mlを添加し、
成分を迅速に混合する。次に、単位時間当りの
基質から分離される分解生成物Ｒ―NH₂の量
を連続的に測定する。試料１ml当りのプラズミ
ン活量は、毎分測定される値からmUで次式に
より計算される： ΔE／min×Ｖ×1000／ｖ×ε＝試料のmU／ml数 ΔE＝毎分分離される分離生成物の量 Ｖ＝試験混合物の全容量 ｖ＝試料の容量 ε＝1000で割つた吸光係数 ４ ヒトの血漿における抗プラズミン分析： １：20の比率でTRIS―イミダゾール緩衝液
で稀釈された血漿0.1mlを、25％グリセロール
１ml当りのヒトプラズミン（AB Kabi
（Stockholm、Sweden）社製）1.25CU及びヒ
ルジン（Pentapharm A.G.（Basle、
Switzerland）社製）50ATUの溶液0.02mlと混
合する。この混合物を37℃で90秒間恒温保持す
る。この恒温保持物に37℃のTRIS―イミダゾ
ール緩衝液（PH7.5、イオン強度0.2）1.7mlを混
合し、さらに２×10^-3モルの基質水溶液0.2ml
mlを混合する。次に、単位時間当りの基質から
分離される分離生成物Ｒ―NH₂の量を連続的
に測定する。残留プラズミン活量は、測定値か
ら前記方法により計算される。 空試験では、血漿は緩衝液の相当量に代える
が、それ以外はこの試験は前記方法により実施
される。測定されるプラズミン活量は、開始プ
ラズミン量に相当する。抗プラズミン活量は、
空試験で測定される残留プラズミン活量と、血
漿を用いる試験で測定される残留プラズミン活
量との差から次式により計算される： （ΔE空試料−ΔE血漿試料）／min、×Ｖ×Ｆ×1000
／ｖ×ε＝血漿のmIU／ml量 Ｆ＝血漿（20）の稀釈係数。 本発明による基質は、血漿中に存在するプラ
ズミノジエンを緩衝系中のウロキナーゼ又はス
トレプトキナーゼを用いて変換しかつ形成され
るプラズミンの量を前記プラズミン分析法によ
り本発明による基質の１つを用いて測定するこ
とによつてヒトの血漿中のプラズミノジエンを
分析するのに使用することもできる。血漿中に
元来存在するプラズミノジエンの量は、活性下
でプラズミン１分子がプラズミノジエン１分子
から形成れるのでプラズミンに対する測定値か
ら誘導される。 次に第４表には、器官又は腺カリクレイン、プ
ラズミン及びトロンビンに対する本発明による若
干の基質の感受性が示されている。

【表】

【表】 基質の酵素加水分解によつて形成される分解生
成物Ｒ―NH₂の測定は、この分解生成物が基質
の紫外スペクトルとは異なる紫外スペクトルを有
しかつより高い波長に向つて移動するという前提
条件に基づく。405nmにおける基質の吸収は、実
際に皆無である。分解生成物としてのｐ―ニトロ
アニリンは、380nmでの吸収最高及びモル吸光係
数13200を示す。しかし、該吸光係数は405nmで
僅かに低下する、すなわち9650になる。分離され
るｐ―ニトロアニリン量に比例する基質の酵素加
水分解による量は、405nmで分光測光法により測
定することによつて測定することができる。過剰
の基質の存在下であつても405nmにおける測定に
は支障がない。 分解生成物Ｒ―NH₂の量は、２―ナフチルア
ミノ基、４―メトキシ―２―ナフチルアミノ基、
４―メチル―クマリル―(7)―アミノ基又は１，３
―ジ（メトキシカルボニル）―フエニル―(5)―ア
ミノ基を含有する基質を用いて螢光分光測光法に
より測定される。酵素、緩衝液及び基質からなる
試験系において、低エネルギー量の輻射線、形成
された螢光性分解生成物が高エネルギー量の光線
によつて励起された後、400〜470nmで連続的に
測定される。単位時間当りに形成される分解生成
物の量は、存在する酵素活量に対して測定され
る。前記のように、毎分の分解生成物１ミクロン
モルは、所定の基質に基づく１酵素単位に相当す
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式： Ｈ―Ｄ―Ｘ―Ｙ―Arg―Ｒ ［式中、 Ｘはシクロヘキシルグリシル基、シクロヘキシ
   ルアラニル基又はシクロヘキシルチロシル基を表
   わし、 Ｙはロイシル基、ノルロイシル基、ノルバリル
   基、α―アミノブチリル基、アラニル基、プロリ
   ル基又はピペコリノイル基を表わし、 Ｒはｐ―ニトロフエニルアミノ、２―ナフチル
   アミノ、４―メトキシ―２―ナフチルアミノ、４
   ―メチル―クマリル―７―アミノまたは１，３―
   ジ（メトキシカルボニル）―フエニル―５―アミ
   ノ基を表わす］で示されるトリペプチド誘導体及
   びその酸との塩。 ２ 鉱酸、例えばHCl、HBr、H₂SO₄又は
   H₃PO₄、又は有機酸、例えば、蟻酸、酢酸、プ
   ロピオン酸、トリメチル酢酸、メトキシ酢酸、ト
   リクロルー又はトルフルオル酢酸のようなハロゲ
   ン化酢酸、アミノ酢酸、乳酸、蓚酸、マロン酸、
   クエン酸、安息香酸、核中で置換された芳香族
   酸、例えばトルイル酸、クロルー又はブロム安息
   香酸、メトキシ安息香酸及びアミノ安息香酸、又
   はフタル酸でプロトン化されている、特許請求の
   範囲第１項記載のトリペプチド誘導体。