DK159458B - Tripeptid-p-nitroanilider og anvendelse deraf til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer - Google Patents

Tripeptid-p-nitroanilider og anvendelse deraf til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer Download PDF

Info

Publication number
DK159458B
DK159458B DK509788A DK509788A DK159458B DK 159458 B DK159458 B DK 159458B DK 509788 A DK509788 A DK 509788A DK 509788 A DK509788 A DK 509788A DK 159458 B DK159458 B DK 159458B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
acid
acids
arg
chg
cha
Prior art date
Application number
DK509788A
Other languages
English (en)
Other versions
DK509788D0 (da
DK159458C (da
DK509788A (da
Inventor
Lars Gundro Svendsen
Original Assignee
Pentapharm Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pentapharm Ag filed Critical Pentapharm Ag
Publication of DK509788D0 publication Critical patent/DK509788D0/da
Publication of DK509788A publication Critical patent/DK509788A/da
Publication of DK159458B publication Critical patent/DK159458B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK159458C publication Critical patent/DK159458C/da

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Hydrogenated Pyridines (AREA)

Description

i
DK 159458 B
Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte tripeptidderivater, der er nyttige som substrater til kvantitativ analyse for proteolyti-ske enzymer fra enzymklassen E.C. 3.4.21, særlig thrombin og plasmin.
Nærmere bestemt angår den foreliggende opfindelse hidtil ukendte 5 chromogene substrater, som har høj følsomhed over for visse proteoly-tiske enzymer af enzymklassen E.C. 3.4.21., særlig thrombin og plasmin, og derfor er nyttige som substrater til kvantitativ analyse for disse enzymer. Disse substrater er tripeptidderivater med den almene formel I
10 H-D-X-Y- Arg - p-nitroanilid I
hvor X betegner cyclohexylglycyl (CHG), cyclohexylalanyl (CHA) eller cyclohexyltyrosyl (CHT) og Y betegner alanyl, a-aminobutyryl (But), eller norvalyl, og deres 15 salte med syrer.
Tripeptidderivaterne med formlen I er tungt opløselige i vandige medier og anvendes derfor fortrinsvis i form af deres salte med syrer, især deres salte med mineralsyrer, fx saltsyre, brombrinte-syre, svovlsyre, phosphorsyre osv. eller organiske syrer, fx myre-20 syre, eddikesyre, propionsyre, trimethyleddikesyre, methoxyeddike-syre, halogenerede eddikesyrer såsom trichlor- eller trifluoreddi-kesyre, aminoeddikesyre, mælkesyre, oxalsyre, malonsyre, citronsyre, benzoesyre, i kernen substituerede aromatiske syrer såsom toluensyrer, chlor- eller brombenzoesyrer, methoxybenzoesyrer eller amino-25 benzoesyrer eller phthalsyre. Syrens natur er ikke kritisk, da syren ikke deltager i reaktionen mellem substraterne og enzymerne.
Substraterne med formlen I og deres salte med syrer spaltes hydro-lytisk ved indvirkning af visse proteolytiske enzymer af enzymklassen 3.4.21. (jfr. "Enzyme Nomenclature", Elsevier Scientific Publishing 30 Company, Amsterdam 1973, side 238 ff), særlig thrombin og plasmin, og som et resultat dannes et farvet eller fluorescerende spaltningsprodukt, som er p-nitroanilin, hvis mængde kan måles ved fotometriske, spektrofotometriske, fluorescensspektrofotometriske eller elektroke-
DK 159458 B
2 miske metoder. De hidtil ukendte substrater er derfor nyttige til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer fra enzymklassen E.C.
3.4.21., som spalter naturlige peptidkæder på carboxysiden af ar-ginin, fx plasmin og thrombin samt deres inhibitorer og proenzymer.
5 Opfindelsen angår derfor også en fremgangsmåde til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer fra enzymklassen E.C. 3.4.21., som spalter naturlige peptidkæder på carboxysiden af arginin, særlig thrombin og plasmin, i medier, der indeholder enzymerne. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at mediet omsættes med 10 et tripeptidderivat med den almene formel I eller et salt deraf, og mængden af farvet eller fluorescerende spaltningsprodukt p-nitroanilin dannet ved den hydrolytiske indvirkning af enzymet på tripeptid-derivatet måles ved fotometriske, spektrofotometriske, fluorescens-spektrofotometriske eller elektrokemiske metoder.
15 Tripeptidderivater, der kan anvendes som substrat til bestemmelse af enzymer fra enzymklassen E.C.3.4.21 såsom plasmin og thrombin er beskrevet i dansk patentansøgning nr. 3127/76, dansk patentansøgning nr. 3126/76 og dansk patentansøgning nr. 2400/73. Det er imidlertid hverken antydet eller vist, at de i disse patentansøgninger beskrevne 20 tripeptidderivater spaltes af både plasmin og thrombin med en udmærket og anvendelig spaltningshastighed, således som det er tilfældet for forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse. De tripeptidderivater, der er beskrevet i ovennævnte danske ansøgninger, er også strukturelt forskellige fra tripeptidderivåterne ifølge op-25 findelsen. Således adskiller de fra dansk patentansøgning nr. 3127/76 kendte tripeptidderivater sig strukturelt fra tripeptidderivåterne ifølge den foreliggende opfindelse ved at deres N-terminale aminosyre enten ikke indeholder sidekæder eller indeholder en ligekædet eller forgrenet alkylgruppe med 1-4 carbonatomer. Herudover kan den N-ter-30 minale amino gruppe også være en cyclisk aminosyre. Den N-terminale aminogruppe i tripeptidderivåterne ifølge den foreliggende opfindelse indeholder derimod en sterisk voluminøs og hydrofob sidekæde, der indeholder 6-7 carbonatomer, og som bærer en cyclohexylring.
De tripeptidderivater, der er beskrevet i dansk patentansøgning nr.
35 3126/76, indeholder~som N-terminal aminogruppe en D-aminosyre, hvis
DK 159458 B
3 sidekæde indeholder en aromatisk phenylring og 7 carbonatomer. Disse tripeptidderivater indeholder også som midterste aminosyre en 4-6-leddet cyclisk aminosyre. I modsætning hertil indeholder den N-terminale aminosyre i tripeptidderivaterne ifølge den foreliggende 5 opfindelse som nævnt ovenfor en sidekæde, som indeholder 6-7 carbonatomer og en ikke-aromatisk cyclohexylring. Herudover har den midterste aminosyre en åben sidekæde, der udgøres af en ligekædet alkyl-gruppe med 1-3 carbonatomer.
De tripeptidderivater, der er beskrevet i dansk patentansøgning nr.
10 2400/73 adskiller sig fra tripeptidderivaterne ifølge den foreliggen de opfindelse ved, at deres N-terminale aminosyrer har en sidekæde, som indeholder en phenylring og derfor har aromatisk karakter. Dette er i modsætning til tripeptidderivaterne ifølge den foreliggende opfindelse, hvis N-terminale aminogruppe, som nævnt ovenfor, har en 15 sidekæde, der indeholder en cyclohexylring, og som således har en stærkt hydrofob og cycloaliphatisk karakter.
Tripeptidderivaterne med formlen I kan fremstilles ved de nedenfor beskrevne fremgangsmåder: 1) Den chromogene gruppe p-nitroanilid (pNA) knyttes til carboxygrup-20 pen hos den C-terminale arginin, hvorhos a-aminogruppen beskyttes med en beskyttelsesgruppe, fx en carbobenzoxy- eller tert.butoxycarbonyl-gruppe. i -guanidylgruppen for arginins vedkommende beskyttes ved pro-tonisering, fx med HCl, nitrering eller tosylering. Den C-terminale pNA-gruppe tjener også som en beskyttelsesgruppe under den trinvise 25 syntese af peptidkæden. De andre beskyttelsesgrupper kan fjernes selektivt som nødvendigt for at tilknytte yderligere aminosyrederiva-ter, indtil den ønskede peptidkæde er fuldstændig syntetiseret. Til sidst spaltes de tilbageværende beskyttelsesgrupper fuldstændig af, uden at pNA-NH-gruppen påvirkes (jfr. fx Miklos Bodansky et al., 30 "Peptide Synthesis", Interscience Publishers, 1966, side 163 - 165).
2) Først syntetiseres peptidkæden (ifølge Bodansky el al., loc.cit.), hvorhos den C-terminale carboxylgruppe i arginin imidlertid beskyttes under anvendelse af en sædvanlig estergruppe, fx en methoxy-, ethoxy- · eller benzyloxygruppe. Estergrupperne kan fjernes ved alkalisk hydro-
DK 159458 B
4 lyse undtagen tert.butoxygruppen, som må fraspaltes selektivt ved hjælp af trifluoreddikesyre. Hvis S-guanidylgruppen i arginin pro-toniseres, fjernes denne estergruppe enzymatisk ved hjælp af trypsin, idet der ikke foregår nogen racemisering. Derefter tilknyttes den 5 chromogene pNA-NH-gruppe. Når £-guanidinogruppen i arginin er beskyttet med en nitro- eller tosylgruppe og N-terminal-a-aminogruppen i tripeptidderivatet er beskyttet med en carbobenzoxygruppe eller en p-methyl-, p-methoxy- eller p-chlorbenzyloxycarbonylgruppe eller en tert.butoxygruppe, fjernes alle beskyttelsesgrupper samtidigt. Fjer-10 nelsen kan udføres ved at behandle det beskyttede tripeptidderivat med vandfrit HF ved stuetemperatur, idet alle de nævnte beskyttelsesgrupper på amino- og δ-guanidinogrupperne således fjernes. Fjernelsen kan også udføres ved behandling med 2N brombrintesyre i iseddike ved stuetemperatur, hvis det beskyttede tripeptidderivat ikke indeholder 15 nitro- eller tosylbeskyttelsesgrupper.
Fremstillingen af tripeptidderivaterne ifølge opfindelsen beskrives detaljeret i de nedenstående eksempler.
Analyser af eluater og produkter, der er fremstillet i henhold til eksemplerne, udføres ved tyndtlagschromatografi under anvendelse af 20 glasplader overtrukket med silicagel (Merck, F 254). Tyndtlagsch-romatogrammerne udvikles ved hjælp af følgende opløsningsmiddelsystemer: A Chloroform/methanol (9:1). ~ B n-Propanol/ethylacetat/vand (7:1:2).
25 C n-Butanol/eddikesyre/vand (3:1:1).
DK 159458B
5
Der anvendes følgende forkortelser:
AcOH = eddikesyre
Ala = alanin
Arg = arginin 5 BOG = tert.butoxycarbonyl
But = a- amino smørsyre
Cbo = carbobenzoxy CHA = cyclohexylalanin CHG = cyclohexylglycin 10 CHT = cyclohexyltyrosin = p-hydroxycyclohexylalanin DMF = dimethylformamid TLC = tyndtlagschromatografi ΕίβΝ = triethylamin HMPTA = phosphorsyre-Ν,Ν,Ν',Nf ,N" ,Ν''-hexamethyltriainid 15 Ile = isoleucin
Leu = leucin SS = opløsningsmiddelsystem/er
MeOH = methanol
Nleu = norleucin 20 Nval = norvalin
OpNP = p-nitrophenoxy
Phe = phenylalanin pH'Gly = phenylglycin
Pip = pipecolinsyre 25 pNA = p-nitroanilid THF = tetrahydrofuran
Val = val in
Medmindre andet er angivet, har aminosyrerne i peptidkæderne L-form.
EKSEMPEL 1
DK 159458 B
6 H-D-CHG-Ala-Arg-pNA. 2HBr.
la. Cbo-Arg-pNA.HC1.
I en 250 ml's trehalset kolbe opløses 16,0 g (47,0 millimol) Cbo-Arg-5 0H.HC1, som er tørret i vakuum over P2O5, i 90 ml absolut HMPTA ved 20°C, medens atmosfæren i kolben holdes fugtfri. Til den resulterende opløsning sættes ved stuetemperatur først en opløsning af 4,74 g (47,0 millimol) ΕίβΝ i 10 ml HMPTA og derefter portionsvis 16,4 g (100 millimol) p-nitrophenylisocyanat (100%'s overskud). Efter en 10 reaktionstid på 24 timer ved 20°C fjernes hoveddelen af HMPTA ved destillation i vakuum. Remanensen ekstraheres adskillige gange med 30%'s AcOH. Remanensen kasseres. De forenede eddikesyreekstrakter renses yderligere ved føre dem gennem en søjle af "Sephadex G-15"® ækvilibreret med 30%'s AcOH og elueres med 30%'s AcOH. Den fraktion 15 af AcOH-eluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres. Således fås 12,6 g af et amorft pulver, som er homogent i opløsningsmiddelsystem C som vist ved TLC.
Analyse: 20 Beregnet for c20h25N605C1: C 51,67 H 5,42 N 18,08 Cl 7,63.
Fundet: C 51,29 H 5,48 N 17,92 Cl 7,50.
lb. 2HBr.H-Arg-pNA".
4,65 g (10 millimol) af forbindelse la behandles under omrøring med 40 ml 2N HBr i iseddike i 45 minutter ved 20°C i fraværelse af fugt.
25 Aminosyrederivatet opløses under C02-udvikling. Reaktionsopløsningen sættes dråbevis under kraftig omrøring til 250 ml absolut ether.
Dette resulterer i udfældning af 2HBr.H-Arg-pNA. Den etheriske fase frasuges, hvorefter den faste fase vaskes fire gange med 100 ml af absolut ether til fjernelse af benzylbromid, der er dannet som bipro-30 dukt, samt overskydende HBr og AcOH. Remanensen opløses i 50 ml methanol, pH-værdien indstilles til 4,5 ved tilsætning af EtjN, og opløsningen inddampes til tørhed -i vakuum ved 30°C. Det resulterende
DK 159458 B
7 produkt opløses 1 75 ml MeOH og føres gennem en søjle af "Sephadex LH-20"® (tværbundet dextrangel) ækvilibreret med MeOH. Fra en fraktion af eluatet fås 4,18 g (91,6% af det teoretiske) amorf forbindelse lb, som er homogen i opløsningsmiddelsystem C som vist ved tyndt-5 lagschromatografi.
Analyse:
Beregnet for ^2^20^^3^2 C 31,60 H 4,42 N 18,43 Br 35,03.
Fundet: C 31,15 H 4,35 N 18,84 Br 34,81.
lc. Cbo-Ala-Arg-pNA.HBr.
10 2,28 g (5 millimol) af forbindelse lb opløses i 30 ml friskt destil leret DMF, og opløsningen afkøles til -10°C. 0,70 ml (5 millimol) i Et3N sættes til opløsningen under omrøring. Det dannede Et3N.HBr fjernes ved filtrering og vaskes med en lille mængde koldt dimethyl-formamid. 1,89 g (5,5 millimol) Cbo-Ala-OpNP sættes ved -10°C til 15 filtratet, og reaktionen lades forløbe i 2 - 3 timer i fraværelse af fugt, hvorved reaktionsopløsningens temperatur gradvis når ca. 20°C. Opløsningen afkøles atter til -10eC, pufres med 0,35 ml (2,5 millimol) Et3N og lades reagere i 2 timer ved -10'C og i ca. 3 timer ved stuetemperatur. Denne procedure gentages med 0,35 ml ΕίβΝ, og efter 20 16 timer inddampes reaktionsopløsningen til tørhed i vakuum ved 50°C.
Remanensen opløses i 40 ml 50% AcOH og renses ved gelfiltrering på en søjle af "Sephadex G-15"® ækvilibreret med 50%'s AcOH. Hovedfraktionen af AcOH-eluatet, der spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af p-nitroanilin, inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C.
25 Remanensen opløses i 75 ml MeOH og inddampes atter til tørhed. Den resulterende remanens tørres i en vakuumexsiccator ved 60°C over P2O5, hvorved fås 2,57 g (88,5% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse lc, som er homogen i opløsningsmiddelsystem C som vist ved TLC.
30 Analyse:
Beregnet for C23H30N7O6Br: C 47,59 H 5,21 N 16,89 Br 13,77.
Fundet: C 47,19 H 5,22 N 17,18 Br 13,60.
DK 159458 B
8 ld. 2HBr.H-Ala-Arg-pNA.
1,74 g (3 millimol) af forbindelse lc behandles under omrøring med 12 ml 2N HBr i iseddike i 40 minutter ved 20°C. Peptidderivatet opløses gradvis under C0£-udvikling. Reaktionsopløsningen sættes dråbevis 5 under kraftig omrøring til 100 ml absolut ether. Dette resulterer i udfældning af 2HBr.H-Ala-Arg-pNA. Den etheriske fase frasuges, hvorefter den faste fase vaskes fire gange med 50 ml absolut ether til fjernelse af benzylbromid, der er dannet som biprodukt, samt overskydende HBr og AcOH. Remanensen opløses i 20 ml MeOH. pH-Værdien 10 indstilles til 4,5 ved hjælp -af Et3N, og opløsningen inddampes til tørhed i vakuum ved 30°C. Den resulterende remanens opløses i 25 ml MeOH og renses på en søjle af "Sephadex LH-20"®, der er ækvilibreret med MeOH. Den fraktion af MeOH-eluatet, der spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af p-nitroanilin, inddampes til tørhed i 15 vakuum ved 30°C. Den resulterende remanens tørres i en vakuumexslocator ved 40°C over P2O5, hvorved fås 1,44 g (90,8% af det teoretiske) ______ amorf forbindelse ld, som er homogen i opløsningsmiddelsystem C.
Analyse:
Beregnet for C15H25N7O4.Br: C 34,17 H 4,78 N 18,60 Br 30,31.
20 Fundet: C 34,01 H 4,76 N 18,85 Br 29,88.
le. Cbo-D-CHG-Ala-Arg-pNA.HBr.
0,78 g (1,5 millimol) forbindelse ld opløses i 8 ml friskt destilleret DMF, og opløsningen afkøles til -10°C. 0,21 ml (1,5 millimol)
EtjN sættes til opløsningen under omrøring. Det dannede Et3N.HBr 25 fjernes ved filtrering og vaskes med en lille mængde koldt DMF. 0,68 g (1,65 millimol) Cbo-D-GHG.OpNP sættes ved -10°C under omrøring til filtratet. Reaktionsblandingen lades reagere i 2 - 3 timer i fraværelse af fugt, hvorved reaktionsopløsningstemperaturen gradvis når ca. 20°G. Opløsningen afkøles atter til -10°G, pufres med 0,105 ml \ 30 (0,75 millimol) Et3N og lades reagere i ca. 2 timer ved -10°G og i yderligere 3 timer ved stuetemperatur. Denne procedure gentages med 0,105 ml i EtjN, og efter 16 timer inddampes reaktionsopløsningen til tørhed i vakuum ved 50°C. Remanensen opløses i 15 ml 50%'s AcOH og
ÆV
renses ved gelfiltrering på eri søjle af "Sephadex G-15" ækvili-
DK 159458 B
9 breret med 50%'s AcOH. Hovedfraktionen af AcOH-eluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af p-nitroanilin, inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C. Remanensen opløses i 40 ml MeOH, og opløsningen inddampes atter til tørhed. Den resulterende remanens 5 tørres i en vakuumexsiccator ved 60°C over P2°5> hvorved fås 936 mg (86,7% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse le, som er homogen i opløsningsmiddelsystem C som vist ved TLC.
Analyse:
Beregnet for CsiHz^NgOyBr: C 51,74 H 6,02 N 15,57 Br 11,10.
10 Fundet: C 51,66 H 6,06 N 15,80 Br 10,96.
lf. 2HBr.H-D-CHG-Ala-Arg-pNA.
0,72 g (1 millimol) forbindelse le behandles under omrøring med 4 ml 2N HBr i iseddike i 40 minutter ved 20°C i fraværelse af fugt. Tri-peptidderivatet opløses gradvis under decarboxylering og C02-udvik-15 ling. Reaktionsopløsningen sættes dråbevis under kraftig omrøring til 40 ml absolut ether. Dette resulterer i udfældning af 2HBr.H-D-CHG-Ala-Arg-pNA. Den etheriske fase frasuges gennem en filterstav, og derefter vaskes den faste fase fire gange med portioner på 15 ml absolut ether. Den resulterende remanens opløses i 15 ml MeOH. pH-20 Værdien indstilles til 4,5 ved hjælp af EtgN, og opløsningen inddampes til tørhed i vakuum ved 30°C. Remanensen opløses i 30 ml MeOH og renses på en søjle af "Sephadex LH-20"® ækvilibreret med MeOH. Den fraktion af MeOH-eluatet, der spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af p-nitroanilin, inddampes til tørhed i vakuum ved 25 30°C. Til yderligere rensning opløses den forrensede remanens i 10 ml 33%'s AcOH og renses ved gelfiltrering på en søjle af "Sephadex G-15"® ækvilibreret med 33% AcOH. Hovedfraktionen af AcOH-eluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af p-nitroanilin, inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C. Den resulterende 30 remanens tørres i vakuumexsiccator ved 40°C over P2O5, hvorved fås 556 mg (83,4% af det teoretiske) amorf forbindelse lf, som er homogen i opløsningsmiddelsystem C som vist ved TLC.
DK 159458 B
10
Analyse:
Beregnet for 023Η38Ν805Β^: C 41,45 H 5,75 N 16,82 Br 23,98.
Fundet: C 41,66 H 5,74 N 17,09 Br 23,90.
Aminosyreanalysen bekræfter tilstedeværelsen af de forventede amino -5 syrer i de korrekte forhold: D-CHG: 0,96 - Ala: 1,00 - Arg: 0,99.
En serie af andre tripeptidderivater fremstilles ved de fremgangsmåder, der beskrives i ovenstående eksempler. Disse tripeptidderivater grupperes i nedenstående tabel I.
Dipeptid- og tripeptidmellemprodukterne, der anvendes til fremstil-10 ling af de i tabel I viste derivater, er anført i tabellerne II og III.
Tabel I
Frem- Analyse
Udgangspro- gangs- Fundet Beregnet % 15 dukter måde _
Eksem- (mmol) (eks.) Aminosyreanalyse pel Slutprodukt Udbytte% 2 2HBr.H-D-CHA- 2e (1 mmol) (lf) 88,1 C 42,54 42,36 20 Ala-Arg-pNA 2N HBr/AcOH H 5,98 5,93 C24H40N8°5Br2 N 16’60 16’47
Br 23,19 23,49 ...... - CHA:Ala:Arg - ......... . _ 0,98:1,00:1,00 25 3 2HBr.H-D-CHA- 3e (0,5 mmol) (lf) 90,2 C 43,90 44,08
Nval-Arg-pNA 2N HBr/AcOH H 6,32 6,26 C26H44N8°5Br2 N 16>18 l5>82
Br 22,39 22,56 CHA:Nval:Arg 30 0,97:1,00:0,99
DK 159458B
11
Tabel I fortsat
Frem- "Analyse
Udgangspro- gangs- Fundet Beregnet % dukter måde _ 5 Eksem- (mmol) (eks.) Aminosyreanalyse pel Slutprodukt Udbytte% 4 2HBr.H-D-CHG- 4e (0,5 mmol) (lf) 88,5 C 43,20 43,24
Nval-Arg-pNA 2N HBr/AcOH H 6,15 6,10 10 C25H42N8°5Br2 N 16,36 16,14
Br 22,78 23,01 CHG:Nval:Arg 0,96:1,00:1,01 5 2HBr.H-D-CHG- 5e (1 mmol) (lf) 84,7 C 42,18 42,36 15 But-Arg-pNA 2N HBr/AcOH H 6,00 5,93 C24H40N8°5Br2 N 16*52 16>47
Br 23,18 23,49 CHG:But:Arg 0,97:0,99:1,00 20 6 2HBr.H-D-CHA- 6e (1 mmol) (lf) 88,5 C 42,96 43,24
But-Arg-pNA 2N HBr/AcOH H 6,12 6,10 C25H42N8°5Br2 N 16>25 16·14
Br 22,69 23,01 CHA:But:Arg 25 0,98:0,98:1,00 7 2HBr.H-D-CHT- 7e (1 mmol) (lf) 82,3 C 41,89 42,26
But-Arg-pNA 2N HBr/AcOH H 6,01 5,96 C25H42N8°6Br2 N i5’96 i5>77
Br 22,15 22,49 30 CHT:But:Arg 0,96:0,99:1,00 8 2HBr.H-D-CHT- 8e (1 mmol) (lf) 82,7 C 41,61 41,39
Ala-Arg-pNA 2N HBr/AcOH H 5,82 5,99 C24H40N8°6Br2 N 16>29 16'09 35 Br 22,75 22,95 CHT:Ala:Arg 0,97:1,00:0,98
Tabel II
DK 159458 B
12
Frem-
Udgangspro- gangsmåde 5 Eksem- Dipeptid- dukter (eks.) Analyse pel precursor (mmol) Udbytte % Fundet % Beregnet % 3c Cbo-Nval-Arg- lb (5 mmol) (lc) 90,8 C 49,13 49,35 pNA.HBr Cbo-Nval-OpNP H 5,69 5,63 10 C25H34N706Br (5,5 mmol) N 16,38 16,11
Br 13,00 13,13 3d 2HBr.H-Nval- 3c (3 mmol) (ld) 96,0 C 36,4’5 36,77
Arg-pNA 2N HBr/AcOH H 5,30 5,26 C17H29N7°4Br2 N 18,01 17,66 15 Br 28,55 28,78 5c Cbo-But-Arg- lb (5 mmol) (lc) 91,6 C 48,09 48,49 pNA.HBr Cbo-But-OpNP H 5,46 5,43 C24H32N7°6Br (5>5 ππη°1) N 16,83 16,49
Br 13,22 13,44 20 5d 2HBr.Η-But- 5c (3 mmol) (ld) 94,2 C 35,50 35,51
Arg-pNA 2N HBr/AcOH H 5,08 5,03 C16H27N7°4Br2 N 18,40 18,12
Br 29,08 29,53
DK 159458 B
13
Tabel III Frem-
Ek- Udgangspro- gangsmåde sem- Tripeptid- dukter (eks.) Analyse 5 pel precursor (nmol) Udbytte % Fundet % Beregnet % 2e Cbo-D-CHA-Ala-ld (1,5 nmol) (le) 88,4 C 52,09 52,39
Arg-pNA.HBr Cbo-D-CHA- H 6,22 6,18 C32H45N8°7Br 0pNP (1)65 ^1°1) N 15,55 15,27 10 Br 10,70 10,89 3e Gbo-D-CHA- 3d (1 mmol) (le) 86,0 C 53,48 53,61
Nval-Arg- Cbo-D-CHA- H 6,46 6,48 pNA.HBr OpNP (1,1 nmol) N 14,80 14,71 C34H49NS°7Br Br 10>31 10’49 15 4e Cbo-D-CHG- 3d (1 nmol) (le) 88,8 C 52,88 53,01
Nval-Arg- Cbo-D-CHG- H 6,35 6,34 pNA.HBr OpNP (1,1 mmol) N 15,18 14,99 C33H47N807Br Br 10,49 10,69 5e Cbo-D-CHG-But- 5d (2 mmol) (le) 84,7 C 52,19 52,39 20 Arg-pNA.HBr Cbo-D-CHG- H 6,17 6,18 C32H45N8°7Br °pNP (2)2 N 15,35 15,27
Br 10,70 10,89 6e Cbo-D-CHA-But- 5d (2 mmol) (le) 80,6 C 52,87 53,01
Arg-pNA.HBr Cbo-D-CHA- H 6,41 6,34 25 C33H47Ng07Br OpNP (2,2 mmol) N 15,17 14,99
Br 10,55 10,69 7e Cbo-D-CHT-But- 5d (2 mmol) (le) 83,3 C 51,72 51,90
Arg-pNA.HBr Cbo-D-CHT- H 6,25 6,20 C33H47N8°8Br 0pNP (2)2 nunol) N 14,88 14,67 30 Br 10,37 10,46 8e Cbo-D-CHT-Ala- ld (1,5 mmol) (le) 79,4 C 51,01 61,27
Arg-pNA.HBr Cbo-D-CHT- H 6,09 6,05 C32H45N8°sBr °pNP <1,65 ^11°1) N 15)10 14)95
Br 10,48 10,66 EKSEMPEL 9
DK 159458 B
14 2AcOH.H-D-CHG-Ala-Arg-pNA.
6,66 g (10 millimol) 2HBr.H-D-CHG-Ala-Arg-pNA (fremstillet ifølge eksempel 1) opløses i 75 ml 60%'s vandig MeOH. Opløsningen føres på 5 en søjle af "Amberlite" JRA-401 i acetatform. Søjlen elueres med 60%'s vandig MeOH, hvorved HBr erstattes med AcOH ved ionbytning.
Eluatet inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C. Efter tørring i vakuumexsiccatoren ved 40°C over P2O5 fås 6,15 g bromidfrit 2AcOH.H-D-CHG-Ala-Arg-pNA (98,5% af det teoretiske).
10 Ved denne fremgangsmåde kan fremstilles andre salte med organiske syrer, fx myresyre, propionsyre, oxalsyre, vinsyre, citronsyre, mælkesyre, benzoesyre, chlorbenzoesyre, salicylsyre eller phthalsyre, ud fra det ovenfor nævnte tripeptidderivat. En ionbytter, fx "Amber-lite" JRA-401 i hydrochloridform, kan anvendes til omdannelse til 15 den ønskede syresaltform ved at omdanne ioribytteren til den basiske OH-form ved behandling med natriumhydroxidopløsning og derefter behandle den basiske ionbytter med en opløsning af en l:l-blanding af den overskydende organiske syre og dens natriumsalt i 60%'s vandig MeOH.
20 Analyse for thrombin kan udføres som følger: 0,25 ml thrombin-opløsning (0,56 NIH-enheder humant thrombin pr. ml) sættes til 2,0 ml Tris-imidazol puffer (pH 8,4, ionstyrke 0,15).
Blandingen præirikuberes i 2 minutter ved 37°C. Derefter sættes 0,25 ml vandig substratopløsning (2 μιηοΐ af et substrat ifølge opfindel-25 sen) til den præinkuberede blanding ved 37“C. Absorptionsstigningen måles spektrofo tometrisk yed 405 nm og følges kontinuerligt ved hjælp af et målingsudstyr. De opnåede resultater er angivet i tabel IV.
Mængden af det dannede spaltningsprodukt er et mål for substratets tilgængelighed for thrombin. Ved beregning af mængden (nanomol) af 30 p-nitroanilin dannet pr. minut anvendes en molær ekstinktionskoeffi cient på 10.000 i stedet for 9.620 for nemheds skyld. Dette har ingen indflydelse på forholdet mellem de forskellige substraters tilgængelighed overfor thrombin.
DK 159458 B
15
Analyse for plasmin kan udføres som følger: 1,7 ml tris-imidazolbuffer (pH 7,5, ionstyrke 0,2) blandes med 0,1 ml af en opløsning af plasmin i 25% glycerol ved 37eC, og blandingen inkuberes ved 37°C i 1 minut. 0,2 ml af en vandig 2 x 10'^ molær 5 substratopløsning sættes ved 37°C til blandingen, og bestanddelene blandes hurtigt. Den mængde af spaltningsproduktet p-nitroanilid, der frigøres fra substratet pr. tidsenhed, måles derefter kontinuerligt.
Fra den værdi, der bestemmes pr. minut, udregnes plasminaktiviteten pr. ml prøve i mU ud fra følgende formel: 10 ΔΕ/min. x V x 1000 __ = mU/ml af prøve v x e ΔΕ = mængde af spaltningsprodukt, der frigives pr. minut 10V = samlet volumen af testblanding 15 v — prøvevolumen e = extinktionskoefficient delt med 1000
DK 159458 B
16
Tabel IV
Aktivitet af humant NIH-thrombin og humant plasmin målt ved hjælp af tripeptid-p-nitroanilideme ifølge opfindelsen ved konstant substrat-og enzymkoncentration. Til sammenligning er de tilsvarende værdier 5 for de kendte tripeptidderivater 2HCl.H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (forbindelse VII i dansk patentansøgning nr. 3126/76) og 2HCl.H-D-Pro-Phe-Arg-pNA (forbindelse XL i dansk patentansøgning nr. 3127/76) også anført. Substratkoncentration: 2 x 10'^ molær.
10 Tripeptid- Mængde i nanomol af p-nitroanilin, frigivet i derivat løbet af 1 minut af henholdsvis 1 NIH-enhed hu mant thrombin og 1 CU-enhed humant plasmin
Substrat ifølge 15 opfindelsen fremstillet i eks. Humant thrombin Humant plasmid 1 158 2 163,5 20 3 97,1 574 4 67,4 488 5 102,9 439 6 108,9 478 7 114,2 463 25 8 156,4
Kendte substrater VII 120,2 XL 451 30 _ NIH-enhed er en standard-thrombinenhed, der er defineret af the US National Institute of Health CU-enhed er en standard-plasmin-erihed, jfr. Commitée on
Thrombolytic Agents in Recommandations on Units, 35 published in Thrombosis DIATH, Haemorrhag'ica HEAM0RRH, vol. 30, s. 259, 1969.

Claims (5)

1. Tripeptidderivater med den almene formel I H-D-X-Y- Arg - p-nitroanilid I 15 hvor X betegner en cyclohexylglycyl- (CHG), cyclohexylala-nyl- (CHA) eller cyclohexyltyrosylgruppe (CHT), og Y betegner en alanyl-, α-aminobutyryl- (But) eller norvalylgruppe, og deres salte med syrer.
2. Tripeptidderivater ifølge krav 1, kendetegnet ved, at dipeptidfragmentet knyttet til Arg er CHG-Ala, CHG-But, CHG-Nval, CHA-Ala, CHA-But, CHA-Nval, eller CHT-But.
3. Tripeptidderivater ifølge krav 1 eller 2, 25 kendetegnet ved, at de er protoniseret med en mineralsyre, fx saltsyre, brombrintesyre, svovlsyre eller phosphorsyre, eller en organisk syre, fx myresyre, eddikesyre, propionsyre, trimethyleddike-syre, methoxyeddikesyre, halogenerede eddikesyrer såsom trichlor-eller trifluoureddikesyrer, aminoeddikesyre, mælkesyre, oxalsyre, 30 malonsyre, citronsyre, benzoesyre, i kernen substituerede aromatiske \ DK 159458 B syrer såsom toluensyrer, chlor- eller brombenzoesyrer, methoxyben-zoesyrer eller aminobenzoesyrer eller phtalsyre.
4. Fremgangsmåde til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer fra enzymklasse E.C. 3.4.21., som spalter naturlige peptidkæder på 5 carboxylsiden af arginin, i medier, som indeholder enzymerne, kendetegnet ved, at mediet omsættes med et tripeptidderi-vat med formlen I eller et salt deraf ifølge krav 1 eller 2, og mængden af farvet eller fluorescerende spaltningsprodukt p-nitroani-lin dannet ved den hydrolytiske virkning af enzymet på tripeptid-10 derivatet måles ved fotometriske, spektrofotometriske, fluorescens-spektrofotometriske eller elektrokemiske metoder.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at der analyseres for thrombin i blod eller blodplasma.
DK509788A 1980-05-06 1988-09-13 Tripeptid-p-nitroanilider og anvendelse deraf til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer DK159458C (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH351580 1980-05-06
CH351580 1980-05-06

Publications (4)

Publication Number Publication Date
DK509788D0 DK509788D0 (da) 1988-09-13
DK509788A DK509788A (da) 1988-09-13
DK159458B true DK159458B (da) 1990-10-15
DK159458C DK159458C (da) 1991-03-04

Family

ID=4257649

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK155781A DK155051C (da) 1980-05-06 1981-04-06 Tripeptidderivater samt fremgangsmaade til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer under anvendelse deraf
DK509788A DK159458C (da) 1980-05-06 1988-09-13 Tripeptid-p-nitroanilider og anvendelse deraf til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK155781A DK155051C (da) 1980-05-06 1981-04-06 Tripeptidderivater samt fremgangsmaade til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer under anvendelse deraf

Country Status (3)

Country Link
JP (4) JPS572253A (da)
DK (2) DK155051C (da)
NO (1) NO155540C (da)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1179200B (de) * 1960-01-26 1964-10-08 Hoechst Ag Verfahren zur Herstellung von N-Benzolsulfonyl-N'-methyl-cyclohexylharnstoffen
SE380257B (sv) * 1972-05-02 1975-11-03 Bofors Ab Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser
JPS4942396A (da) * 1973-05-01 1974-04-20
SE407571B (sv) * 1975-07-11 1979-04-02 Kabi Ab Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
SE407405B (sv) * 1975-07-11 1979-03-26 Kabi Ab Nya kromogena trombinsubstrat
CH634662A5 (de) * 1976-05-28 1983-02-15 Pentapharm Ag Verwendung von tripeptidderivaten zur quantitativen bestimmung von plasminogen-aktivatoren.
CA1161431A (en) * 1979-05-11 1984-01-31 Lars G. Svendsen Tripeptide derivatives

Also Published As

Publication number Publication date
JPH0244840B2 (da) 1990-10-05
NO155540C (no) 1987-04-15
JPS6257197B2 (da) 1987-11-30
DK509788D0 (da) 1988-09-13
DK155051C (da) 1989-07-03
DK155051B (da) 1989-01-30
JPH0244518B2 (ja) 1990-10-04
DK159458C (da) 1991-03-04
JPS62294695A (ja) 1987-12-22
JPS62294696A (ja) 1987-12-22
DK509788A (da) 1988-09-13
NO811510L (no) 1981-11-09
NO155540B (no) 1987-01-05
DK155781A (da) 1981-11-07
JPS62296899A (ja) 1987-12-24
JPH0244839B2 (da) 1990-10-05
JPS572253A (en) 1982-01-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0004256B1 (en) Easily split substrates for the quantification of proteases, a process for their production and a method for the quantification of proteases
EP0110306B1 (de) Chromogene Verbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
Coggins et al. Affinity labelling of proteinases with tryptic specificity by peptides with C-terminal lysine chloromethyl ketone
NO147212B (no) Kormogent h.h.v. fluorescerende tripeptid for kvantitativ bestemmelse av proteolytiske enzymer
DK149333B (da) Tripeptidderivater samt salte deraf med mineralsyrer eller organiske syrer til anvendelse som substrater til kvantitativ bestemmelse af thrombin og thrombinlignende enzymer, ecarinthrombin, plasmin og plasminlignende enzymer samt proenzymer, proenzymaktivatorer og enzyminhibitorer herfor i legemsvaeskerfra mennesker og pattedyr samt i dyriske celleekstrakter
DK154221B (da) Tripeptidderivater og fremgangsmaade til kvantitativt at analysere faktor xa i et xa-holdigt medium, faktor x i blodplasma, heparin i hepariniseret blodplasma eller antifaktor xa i blodplasma
NO142812B (no) Nye diagnostisk aktive kromogene enzymsubstrater
NO135245B (da)
NO309984B1 (no) AnalogifremgangsmÕte for fremstilling av tripeptidantitrombotiske midler
NO142074B (no) Nye kromogene enzymsubstrater for serinproteaser
NO156067B (no) Substrat for bestemmelse av plasminogenaktivatorer.
US4428874A (en) Tripeptide derivatives
NO317089B1 (no) Kininogeninhibitorer
US4221706A (en) Chromogenic substrates
US4568636A (en) Tripeptide derivatives
DK145799B (da) Tripeptider eller salte deraf til anvendelse som diagnostisk kromogent substrat med hoej specificitet overfor thrombin og thrombinlignende enzymer
DK168574B1 (da) Peptidderivater og salte deraf med mineralsyrer eller organiske syrer samt anvendelsen heraf som substrat til kvantitativ bestemmelse af C1-esterase
DK159458B (da) Tripeptid-p-nitroanilider og anvendelse deraf til kvantitativ analyse for proteolytiske enzymer
AU602527B2 (en) Chromogenic compounds, a process for their preparation and their use
Harnois-Pontoni et al. Hydrosoluble fluorogenic substrates for plasmin
US4569907A (en) Thiopeptolide substrates for vertebrate collagenase
Basak et al. Aminoethyl benzenesulfonyl fluoride and its hexapeptide (Ac-VFRSLK) conjugate are both in vitro inhibitors of subtilisin kexin isozyme-1
MAZALEYRAT et al. Synthesis and enzymic hydrolysis of cyclic peptides containing an anthranilic acid residue
JPH0360837B2 (da)
US4434096A (en) Substrates for the quantitative determination of proteolytic enzymes

Legal Events

Date Code Title Description
PBP Patent lapsed