NO309984B1

NO309984B1 - AnalogifremgangsmÕte for fremstilling av tripeptidantitrombotiske midler

Info

Publication number: NO309984B1
Application number: NO913773A
Authority: NO
Inventors: Paul David Gesellchen; Robert Theodore Shuman
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 1991-09-26
Publication date: 2001-04-30
Also published as: IE913423A1; EP0837071A1; AU8478091A; DE69132884D1; JP3023019B2; EP0684258A2; CS291391A3; EP0479489A2; NZ239907A; CZ285980B6; EP0684258A3; EP0479489B1; CN1060472A; NO913773D0; ATE211147T1; FI107733B; CA2052013C; BR9104181A; ATE234857T1; RU2077538C1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en analogifremgangsmåte for fremstilling av trombine inhibitorer som er nyttige anti-koaguleringsmidler i mennesker og dyr. Den vedrører spesielt derivater av dipeptide L-prolin-L-arginin aldehydet som har høy antitrombotisk aktivitet.

Trombin inhibisjon blir for tiden oppnådd ved administrasjon av hepariner og kumariner. Mekanismene hvorved disse midlene virker er blitt studert. Hepariner er bare admlnistrerbare parenteralt og nivåene må bli registrert forsiktig. Kumariner virker ved blokkering eller inhibering av dannelsen av protrombin og krever en viss tid for å oppnå maksimal effektivitet.

Til tross for at både heparinene og kumarinene er effektive antikoagulerende midler er det nødvendig med anti-trombinmid-ler som kan virke hurtig for å forhindre dannelsen av koagler og som ikke interfererer med plasminvirkningen for oppløsning av eksisterende koagler.

Foreliggende oppfinnelse omfatter analogifremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv forbindelse med formel

der A er

1) en gruppe med formel

der R er en fenylgruppe med formel

der a og a' uavhengig er hydrogen, lavere alkyl, lavere alkoksy, halogen, trifluormetyl eller hydroksy, eller R er tienyl, naftyl eller naftyl mono- eller disubstituert med lavere alkoksy, eller R er cykloheksyl eller cyklopentyl;

R-L er hydrogen,

P er hydrogen;

B er H eller en aminogruppe med formel

der Rg og R3 uavhengig er hydrogen eller lavere alkyl eller R2 er hydrogen og R3 er acetyl eller en oksykarbonyl-gruppe med formel der R4 er C^-C^ alkyl, forutsatt at når R^ er metyl eller etyl er B forskjellig fra metyl eller etyl eller A er 2) en bicyklisk gruppe med formel der Q er en karbonrest representert ved -CH2-, og eller en to-karbonrest representert ved -CH2-CH2-, -CH2C=0 eller Y er en karbonrest representert ved en to-karbonrest representert ved forutsatt at en, men ikke begge, av Q og Y er eller

og,

forutsatt videre at bare en av Q og Y er en to-karbonrest;

R5 er hydrogen eller en oksykarbonylgruppe som definert ovenfor; og den stiplede sirkelen innenfor den seksleddete ringen angir at ringen er aromatisk eller en perhydroring;

og farmasøytisk akseptable ikke-toksiske salter derav, kjennetegnet ved å redusere A-(C=0)-Pro-Arg(P)laktam med litiumaluminiumhydrid for å tilveiebringe en forbindelse med formel 1 hvor P er en aminobeskyttende gruppe og fjerne den aminobeskyttende gruppen P.

Peptidene representert ved formel 1 er nyttige antitrombotiske midler og kan bli anvendt som supplementer til vevs plasminogen aktivator (tPA), streptokinase eller urokinase-terapi.

Forbindelsene blir fremstilt ved konvensjonelle koblings-metoder. For eksempel blir Boc-D-Phg koblet med en ester av L-prolin for å danne Boc-D-Phg-Pro ester. Estergruppen blir fjernet og Boc-D-Phg-Pro blir koblet med laktam formen av L-arginin for å tilveiebringe Boc-D-Phg-Pro-Arg laktam i aminobeskyttet form. Arg laktam ringen blir åpnet ved reduksjon og arginin amino beskyttelsesgruppen fjernet for å tilveiebringe Boc-D-Phg-Pro-Arg aldehydet. Peptider blir omdannet til egnede saltformer såsom acetater og sulfater.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen representert i formel 1 er tripeptider når A er en aminosyre-rest såsom fenylglycyl (Phg), og når A er forskjellig fra en aminosyrerest f.eks. når B er en gruppe forskjellig fra en amino eller alkylaminogruppe, forbindelsene er N-acyl derivater av dipeptide prolin og arginin aldehyd (Pro-Arg-H). Som vist i formel 1 er det asymmetriske senteret til A(C=0) delen R eller RS, mens det til prolin og arginin aldehyd-delen er L.

Betegnelsene anvendt i formel 1 er definert heri som følger: Lavere alkyl refererer til lineær eller forgrenet kjede C^-4 alkylgrupper såsom metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl og lignende.

Lavere alkoksy refererer til C^- C^ alkoksygruppe såsom metoksy, etoksy, n-propoksy, isopropoksy, n-butoksy, t-butoksy og lignende.

Halogen refererer til fluor, klor, brom eller jod.

Mono- eller di-(lavere alkyl)amino refererer til slike grupper såsom metylamino, etylamino, dimetylamino, metyletyl-amino, dietylamino, n-butylamino, n-propylamino og lignende.

Betegnelsen "C^-C^ alkyl" refererer til lineære og forgrenede alkylgrupper såsom C1-C4 alkylgrupper definert ovenfor og, i tillegg, n-pentyl, isopentyl, n-heksyl, isomere heksylgrupper og lignende.

Som definert i formel 1, når A er gruppen (R) (R^ ) (B )C-, kan R være en fenylgruppe som kan være mono- eller di-substituert. Eksempler på slike fenylgrupper er fenyl (a og a' = H) 4-metylfenyl, 3-etylfenyl, 4-metoksyfenyl, 3-metoksyfenyl, 3-etoksyfenyl, 2-metoksyfenyl, 3-isopropoksyfenyl, 4-hydroksy-fenyl, 4-klorfenyl, 3-klorfenyl, 2-fluorfenyl, 3-fluorfenyl, 3-bromfenyl, 4-fluorfenyl, 3-trifluormetylfenyl, 4-trifluormetylfenyl, 3,4-dlklorfenyl, 3-hydroksy-4-fluorfenyl, 3-hydroksy-4-metylfenyl, 3-klor-4-etoksyfenyl og lignende mono-eller di-substituerte fenylgrupper.

Eksempler på R grupper når R er naftyl er en mono- eller di-substituert naftylgruppe er 1-naftyl, 2-naftyl, 6-metoksy-2-naftyl og 3-metoksy-l-naftyl.

Eksempler på grupper representert i formel 1 når B er en aminogruppe -N(R2)(R3) er amino (R2 = R3 = H), metylamino, etylamino, isopropylamino, dimetylamino og lignende amino-grupper; og når R2 er hydrogen og R3 er en oksykarbonylgruppe R4-0-C(0)-, er eksempler på slike grupper C^-C^ alkoksykar-bonylaminogrupper såsom metoksykarbonylamino, etoksykarbonyl-amino, t-butoksykarbonylamino, isoamyloksykarbonylamino og lignende; C2-C6 alkenyloksykarbonylaminogrupper såsom vinyloksykarbonylamino, allyloksykarbonylamino, 2-butenyl-oksykarbonylamino og lignende; C3-C7 cykloalkoksykarbonyl-aminogrupper såsom cyklopropyloksykarbonylamino, cyklopentyl-oksykarbonylamino, cykloheksyloksykarbonylamino og lignende. Oksykarboksylaminogrupper representert ved betegnelsen B omfatter videre f.eks. benzyloksykarbonylamino, 4-nitroben-zyloksykarbonylamino, difenylmetoksykarbonylamino, fenyloksy-karbonylamino eller en substituert fenyloksykarbonylamino-gruppe der den substituerte fenyldelen er som definert ovenfor, og lignende.

Eksempler på gruppene A(C=0) i formel 1 når A er en gruppe-1-rest med formel (R)(R1)(B)C- er fenylglycyl, 4-metoksyfenyl-glycyl, 3,4-dioklorfenylglycyl, 3-trifluormetylfenylglycyl, N-(t-butyloksykarbonyl)fenylglycyl, N-(t-butyloksykarbonyl-N-metyl )f enylglycyl , a-metylfenylacetyl, a-etylfenylacetyl, a-metoksyfenylacetyl, 1-naftylglycyl, 2-naftylglycyl, N-(t-butyloksykarbonyl)-2-naftylglycyl, 2-tienylglycyl, cykloheksylglycyl og lignende A(C0) grupper.

Eksempler på peptider representert ved formel 1 der A er en bicyklisk gruppe representert ved foregående formel 2 er D-1, 2,3,4-tetrahydroisokinolin-l-ylkarbonyl og D-1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-3-ylkarbonyl, N-acylderivater av Pro-Arg-H er angitt nedenfor:

dihydroisoindol-l-ylkarbonyl derivater angitt nedenfor; oksoderivater representert ved formlene

og perhydroderivater derav. Betegnelsene R^, og R5 har samme betydningene som definert ovenfor. R5 er fortrinnsvis hydrogen.

Farmasøytisk akseptable salter av peptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen omfatter syreaddisjonssalter dannet med uorganiske syrer og karboksylsyrer. Eksempler på uorganiske syrer som danner salter er hydrohalogensyrene saltsyre og hydrobromsyre; fosforsyre og svovelsyre. Karboksylsyresalter blir dannet med syrer såsom eddiksyrer, propionsyre, malonsyre, maleinsyre, sitronsyre, ravsyre, malinsyre, benzosyre, fumarsyre og lignende karboksylsyrer. Sure addisjonssalter blir fremstilt på vanlig måte, f.eks. ved å nøytralisere den frie base- formen til forbindelse 1 med syre. Foretrukne syreaddisjonssalter er sulfat og hydro-kloridsalter.

Foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen er forbindelser representert ved formel 1 der A er

der R er en fenylgruppe eller en naftyl eller substituert naftylgruppe, R^ er hydrogen og B er en aminogruppe -N(R2)(R3). Videre foretrukne forbindelser er representert når R2 er hydrogen og R3 er en oksykarbonylgruppe R40-C(0)-. En ytterligere foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen omfatter forbindelser med formel 1 der A er en bicyklisk gruppe (2). Foretrukne forbindelser av denne utførelsesfor-men er representert ved formel 1 når A(C=0) er 1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-l-ylkarbonyl (formel 2, Q=-CH2-CH2-, Y=-CH- og R5=R6=H) og 1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-3-ylkarbonyl (formel 2, Q =

og Y = -CH2-).

Forbindelsene representert ved formel 1 blir fremstilt ved kjente fremgangsmåter for peptidkobling. Ifølge en slik fremgangsmåte blir syren A-COOH, der A samme betydninger som definert for formel 1, koblet med en karboksybeskyttet prolin for dannelsen av dipeptidet (når A er en aminosyre) eller en N-acylprolinester (når A er forskjellig fra en aminosyre). Den karboksybeskyttende estergruppen til prolindelen til produktet blir fjernet og den frie syreformen av dipeptidet blir koblet med laktamformen til arginin. Ovennevnte reaksjonssekvens er illustrert ved følgende skjema

(a) deesterifisering A-(C=0)-Pro-OH (b)

der P representerer en aminobeskyttende gruppe.

Det koblede Arg(P) laktamproduktet (c) blir redusert med litiumaluminiumhydrid i et inert oppløsningsmiddel for å spalte laktamringen og tilveiebringe tripeptidet i argininaldehyd-form representert ved formel

der Arg(P)-H representerer aminobeskyttet argininaldehyd. Laktamformen av arginin blir oppnådd ved intramolekylær kobling av aminobeskyttet arginin [Arg-OH]. F.eks. blir Boc-Arg(Cbz)OH representert ved formel først omdannet til en aktiv esterform, såsom en aktiv blandet anhydrid, med en klorformatester, f.eks. etylklorformat til isobutylklorformat. Esterdannelsen blir utført i nærvær av et tertiært amin såsom N-metylmorfol in. Tilsetning av en sterkere tertiær aminbase såsom trietylamin påvirker den indre acyleringen for å tilveiebringe laktamformen av di-amino beskyttet arginin som vist nedenfor.

For anvendelse i kobling med A(C=0 )-Pro-OH som vist i ovennevnte skjema blir den Boe beskyttende gruppen selektivt fjernet med trifluoreddiksyre for å tilveiebringe den nødvendige frie aminogruppen.

Kobling av en ACOOH forbindelse med en prolinester, når A er en aminosyrerest, blir utført ved først å beskytte aminogruppen til aminosyren. Konvensjonelle aminobeskyttende grupper vanligvis anvendt for temporær beskytting eller blokkering av aminogruppen blir anvendt. Eksempler på slike beskyttelses-grupper omfatter alkoksy, alkenyloksy, cykloalkoksy og aryloksykarbonylgrupper såsom etoksykarbonyl, t-butyloksykarbonyl, cykloheksyloksykarbonyl, adamantyloksykarbonyl, trikloretoksykarbonyl.benzyloksykarbonyl, difenylmetoksykar-bonyl og lignende grupper. Estergrupper anvendt for å beskytte karboksygruppen til prolin iløpet av koblingsreaksjonen kan være hvilke som helst av de vanligvis anvendte lett fjernbare estergruppene såsom t-butyl, benzyl, p-nitrobenzyl, p-metoksybenzyl, difenylmetyl, trikloretyl, fenacyl eller trialkylsilylestere. Ved utførelse av koblingsreaksjonen anvendes en estergruppe for prolin som kan fjernes ved betingelser for den aminobeskyttende gruppen forblir intakt. Den aminobeskyttende gruppen til den acylerende sure ACOOH forblir dermed på plass for beskyttelse av aminogruppen iløpet av påfølgende kobling med arginin laktamforbindelsen for å danne c.

Forbindelsene representert ved formel 1 der A er gruppen (R)(E1)(B)C- og B er en aminogruppe -N(R2)(R3) der R2 er hydrogen og R3 er lavere alkyl blir fremstilt med korrespond-erende forbindelse der B er amino ved anvendelse av kjente alkyleringsmetoder. F.eks. blir N-metyl-D-fenylglycyl-L-prolyl-L-arginin aldehyd fremstilt ved reduktiv alkylering som følger: Cbz beskyttet D-fenylglycin blir koblet i DMF med L-prolin t-butylester ved anvendelse av dicykloheksylkarbodiimid (DCC) og hydroksybenzotriazol (HOBt) for å danne dipeptidet Cbz-D-fenylglycyl-L-prolin t-butylester. Peptidet blir hydrert i etylalkohol over palladium på karbonkatalysator for å fjerne Cbz beskyttende gruppe, formaldehyd blir tilsatt til reduksjonsblandingen og hydrogenering blir fortsatt for dannelse av N-metyl-D-fenylglycyl-L-prolin t-butyl ester. N-metyl sekundær aminogruppe av fenylglycyl delen blir beskyttet med Cbz gruppen ved å omsette dipeptidet t-butylester med benzylklorformat i THF inneholdende N-metylmorfolin for å danne N-Cbz-N-metyl-D-fenylglycyl-L-prolin t-butylester. t-butylestergruppen blir fjernet ved romtemperatur i trifluoreddiksyre inneholdende anisol for å tilveiebringe N-Cbz-N-metyl-D-fenylglycyl-L-prolin. Sistnevnte dipeptid blir deretter koblet til Cbz beskyttet Arg laktam og laktamringen blir reduktivt åpnet til Arg aldehydet som beskrevet ovenfor. Begge Cbz beskyttende gruppene til tripeptidet blir fjernet ved hydrogenering over Pd/C kataly-sator for å tilveiebringe N-metyl-D-fenylglycyl-L-prolyl-L-argininaldehyd.

Forbindelser representert ved formel 1 der A er (R)(R^)(B)C-og R er cykloheksadienyl eller cykloheksenyl og B er en alkylaminogruppe, -N(R2)(R3) kan bli fremstilt ved reduksjon av iminet dannet med et lavere alkylaldehyd med natrium-cyanoborhydrid. Likeledes kan slike N-alkyleringer bli utført med et lavere alkyljodid og natriumhydrid.

Forbindelsene ifølge formel 1 der A er en bicyklogruppe (2) blir fremstilt ved samme koblingsmetode som ovenfor. F.eks. blir peptidet ifølge formel 1 der A representerer en 1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-l-yl gruppe oppnådd ved acylering av en ester av prolin, såsom benzylester, med et aktivt derivat av 1,2,3,4-tetrahydro-l-karboksyisokinolin. Aktive derivater som kan bli anvendt omfatter sure halider såsom kloridet eller bromidet, surt acid, samt aktive estere og anhydrider såsom de som blir dannet med klorformater som beskrevet ovenfor. Ringnitrogenet til tetrahydroisokinolin (formel 2, R5=H) blir beskyttet eller alkylert iløpet av den acylerende koblingen. F.eks. blir en aktiv ester av N-Boc-1,2,3,4-tetrahydro-l-karboksy-isokinolin dannet med iso-butyl kloroformat anvendt ved acylering av prolinesteren. Peptid-produktet N-Boc-1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-l-ylkarbonyl-prolinester blir deforestret, den frie syren omdannet til en aktiv ester og sistnevnte koblet til laktamformen av arginin. Laktamproduktet blir deretter omdannet til aldehydformen som beskrevet ovenfor for å tilveiebringe forbindelsen med formel 1, dvs. Boc-1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-l-ylkarbonyl-Pro-Arg-H.

Perhydro bicyklogruppen representert ved formel 2 blir fremstilt ved hydrogenering av enten de delvis reduserte eller umettede syrene ved konvensjonelle prosedyrer. F.eks. blir 1, 2,3,4-tetrahydroisokinolin-l-karboksysyre hydrogenert over platinaoksid i et oppløsningsmiddel såsom etanol eller eddiksyre for å tilveiebringe perhydro(dekahydro )isokinolin-1-karboksylsyre. Perhydrosyrene blir deretter anvendt som beskrevet ovenfor for acylering av en prolinester. Eksempler på slike perhydroderivater representert ved formel 1 er N-(D-decahydroisokinolin-3-oyl )-L-prolyl-L-argininaldehyd og N-(D-decahydroisokinolin-3-oyl )-L-prolyl-L-argininaldehyd.

Koblingsreaksjonene beskrevet ovenfor blir utført kaldt fortrinnsvis ved en temperatur på mellom omtrent -20°C og omtrent 15°C. Koblingsreaksjonene blir utført i et inert organisk oppløsningsmiddel såsom dimetylformamid, dimetyl-acetamid, tetrahydrofuran, metylenklorid, kloroform og lignende vanlige oppløsningsmidler. Generelt vannfrie betingelser blir anvendt når det i koblingsreaksjonen blir anvendt en aktiv ester av den acylerende syren.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen blir best isolert i form av syreaddisjonssalter. Salter av forbindelsene med formel 1 dannet med syrer såsom de som er nevnt ovenfor nyttige som farmasøytiske akseptable salter for administrer-ing av de antitrombotiske midlene og for fremstilling av formuleringene til disse midlene. Andre syreaddisjonssalter kan bli fremstilt og anvendt ved isolering og rensing av peptidene. F.eks. kan saltene dannet med sulfonsyrer såsom metansulfonsyre , n-butansulfonsyre, p-toluensulfonsyre og naftalensulfonsyre bli anvendt.

Fremgangsmåten for isolering og rensing av forbindelsene representert ved formel 1 mens det samtidig fremstilles en ønsket stabil saltform. Ifølge fremgangsmåten blir stabile salter av uorganiske syrer såsom sulfat og kloridsalter tilveiebragt ved preparativ rensing over C^g reversert fasekromatografi. Den vandige fasen omfatter svovelsyre eller saltsyre i en konsentrasjon på mellom omtrent 0. 01% og omtrent 0.05$ og acetonitril, THF, metanol eller andre egnede oppløsningsmidler virker som organisk komponent. pH til det sure elueringsmidlet blir justert til mellom omtrent pH 4 og omtrent pH 6, idet nøyaktig pH er en funksjon av det bestemte peptidet, med en basisk harpiks, f.eks. Bio-Rad-AG-lx8 harpiks i hydroksylform. Etter pH justering blir oppløs-ningen av tripeptidsaltet f.eks. sulfat eller hydroklorid lyofilisert for å tilveiebringe den rensede salte tørre pulverformen. I et eksempel på fremgangsmåten blir rå D-Phg-L-Pro-l-Arg-H sulfat, kontaminert med epimerisk D-Arg-H sulfat løst opp i ca. 0. 01% svovelsyre og oppløsningen blir applisert på en Vydac C^g RP-HPLC kolonne. En gradient av 2-10% acetonitril i 0.01$ H2S04 blir anvendt for å eluere kolonnen over 10 timer. Multiple fraksjoner blir samlet og de som inneholder det ønskede produktet bestemt ved analytisk RP-HPLC blir slått sammen. pH til sammenslåtte fraksjoner blir justert til omtrent pH 4.0 til omtrent 4.5 med Bio-Rad Ag-lx8 harpiks i hydroksylcyklusen. Etter filtrering blir oppløsningen lyofilisert for å tilveiebringe rent D-Phg-L-Pro-L-Arg-H sulfat.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen (formel 1) hemmer virkningen av trombin i mennesker og dyr. Hemmingen av trombin blir demonstrert ved in vitro hemming av amidase-aktiviteten til trombin. I følgende Tabell 1 er tilsyne-latende likevektskonstant (Kass) for interaksjon mellom testforbindelse (inhibitor) og trombin. Data i tabellen ble oppnådd i en analyse der trombin hydrolyserer det kromogene substratet, N-benzoyl-D-fenylalanyl-L-valyl-L-arginyl-p-nitroanilid.

Analysen ble utført i 50pl buffer (0.03M Tris, 0.15M NaCl, pH 7.4) med 25pl trombinoppløsning (0.21 mg/ml trombostatpulver i 0.06 M Tris, 0. 3M NaCl, pH 7.4) og 150>j1 av en vandig oppløsning av kromogent substrat ved en konsentrasjon på 0.25 mg/ml. Oppløsninger av testforbindelse (25 jjI ) ved forskjel-lige konsentrasjoner ble tilsatt. Hydrolyserater av substratet ble målt ved å registrere reaksjonene ved 405 nm for frigjøring av p-nitroanilin. Standardkurver ble konstruert ved å plotte fri trombinkonsentrasjon mot hydrolyserate. Hydrolyseratene observert med testforbindelsene ble deretter omdannet til "fri trombin" verdi i de respektive analysene ved anvendelse av standardkurvene. Bundet trombin (bundet til testforbindelsen) ble beregnet ved å subtrahere mengden av fri trombin observert i hver analyse fra den kjente opprinnelige mengden av trombin anvendt i analysen. Mengden av fri inhibitor i hver analyse ble beregnet ved å subtrahere antall mol bundet trombin fra antall mol tilsatt inhibitor (testforbindelse).

Kass-verdien er den hypotetiske likevektskonstanten for reaksjonen mellom trombin og testforbindelse (I).

Kass ble beregnet for et område konsentrasjoner av testforbindelser og gjennomsnittsverdien er angitt i enheter liter pr. mol. Antikoaguleringsaktiviteten til forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen er blitt bestemt i standardtester. Følgende Tabell 2 presenterer data oppnådd med representative forbindelser ifølge oppfinnelsen i tester anvendt for å bestemme trombintiden, trombintiden og aktivert partial tromboplastintid (APTT). De numeriske verdiene i tabellen er konsentrasjoner av testforbindelser (ng/ml) nødvendig for å forlenge koagulasjonen med 2-ganger i tre tester. Trombintid-beregning ble utført i plasma og bestemt separat i et buffersystem ved pH 7.5. Dataene presentert i Tabell 2 ble oppnådd ved anvendelse av et CoaScreener instrument fra Tecan, Inc. i analyseprotokol-lene angitt nedenfor.

Protrombintid: 50 pl plasma

50 pl saltvann

7 pl testoppløsning

50 pl tromboplastin (Dade)

Trombintid: 50 pl plasma

50 pl saltvann

7 pl testforbindelse

50 pl bovint trombin (2 NIH enheter/ml)

I trombintiden bestemt i pH 7.4 buffer ble fibrinogen anvendt istedet for plasma.

APTT: 50 pl plasma

50 pl Actin (Dade)

7 pl testoppløsning

50 pl CaCl (0.01M).

Antitrombotisk aktivitet til representative forbindelser ifølge oppfinnelsen ble bestemt i in vivo tester utført i rotte. Testen som ble anvendt induserte arteriell trombose i karotidarterien til rotten og målte infusjonsdosen til testforbindelsen som var nødvendig for å oppnå blodstrømning i 50 minutter etter okklusjonstidspunktet. Testen ble utført som følger: Arteriell trombose ble indusert i rotten ved å skade karotidarterien. Topisk anvendelse av en jernkloridoppløsning ble anvendt for å skade karet. Han-Sprague-Dawley rotter (375-450 g) ble bedøvet med xylazin (20 mg/kg, s.c.) etterfulgt av ketamin HC1 (100 mg/kg, s.c). Dyrene ble lagt på et vannhåndkle der det sirkulerende vannet ble opprettholdt ved 37°C. Karotidarterien ble tilnærmet gjennom et midtlinje cervikalsnitt. Forsiktig buttdisseksjon ble anvendt for å eksponere og isolere karet fra karotidhuden. En silkesutur ble trukket under arterien for å løfte karet for oppnåelse av tilgang for å innføre et termaelement under det. Kartempera-tur-forandringer ble registrert på en strimmelkart-registrator med en blekk-skrive tidsinnstiller. Små pinsetter ble anvendt for å dyppe skiver (3 mm dia) av Whatman nr. 1 filterpapir inn i en FeCls oppløsning (35$). Skivene ble kuttet i lik størrelse ved anvendelse av et skarpt rustfritt stålrør (3 mm i.d.) inne i en drillpresse. En mettet skive ble plassert på hver karotidarterie over termaelementet. Tidspunkt mellom FeCl3 anvendelse og tiden hvorpå tempera-turen brått ble redusert ble registrert som tid til okklusjon (TTO) av karet. Gjennomsnittstiden som er nødvendig for at begge karene okkluderte ble anvendt for å representere TTO for hvert dyr.

Forsøksforbindelsene ble løst opp i isotonisk saltvann. En sprøytepumpe ble anvendt for å infusere medikamentoppløsning-ene begynnende 15 minutter før FeCl3 applikasjon og med fortsettelse i 60 min. etter FeCl3 applikasjon. Dose-respons kurvene ble plottet for å bestemme forholdet mellom log^Q "t*1 de infiserte dosene og TTO til de skadede arteriene. En komparativ indeks av antitrombotisk aktivitet ble bestemt fra kurvene ved å beregne infusjonsdosen som er nødvendig for å opprettholde blodstrømning i 50 min. (ED 50 min.).

Assosiasjonen mellom karokklusjon og den bråe temperatur-reduksjonen ble bestemt ved samtidig å registrere tempera-turen og blodstrømningen på samme registrator. En pulset Doppler strømningsprobe ble plassert rundt karotidarterien proksimalt for termoelementet. Den registrerte proben forandres i strømningshastighet og ble derfor innstallert i et punkt hvor trombose ikke oppsto og den indre diameteren til beholderen forble konstant forårsaket av utvidelse med fluid blod. Baselinje-temperatur og strømningshastighet (bestemt med et Directional Pulsed Doppler Flowmeter, Model 545-C, University og Iowa Bioengineering) ble registrert før anvendelsen av 35% jernklorid. Resultatene ble rapportert som prosent forandring i forhold til opprinnelige baselinje-verdier (6 min. før okklusjon). Tiden hvor kartemperaturen ble hurtig redusert ble vilkårlig bestemt som null og pre- og post-okklusjonstemperatur og strømningsverdiene ble bestemt fra det punktet.

Følgende Tabell 3 inneholder resultater oppnådd med testforbindelsene i ovennevnte kjemiske induserte trombetest i rotten.

Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen inhiberer koageldannelsen uten betydelig interferens med den naturlige koageliserende evnen f.eks. som har forbindelsene en lav inhibitorisk virkning på fibrinolysen.

En effektiv koagelinhiberende dose er mellom omtrent 5 mg og omtrent 1000 mg. Doseregimet kan variere f.eks. for profyl-aktisk anvendelse kan en enkelt daglig dose bli administrert eller multiple doser såsom 3 eller 5 ganger daglig kan være hensiktsmessig. I kritiske behandlingssituasjoner blir en forbindelse ifølge oppfinnelsen administrert ved iv infusjon i en rate på mellom omtrent 1 mg/kg/t og omtrent 50 mg/kg/t og fortrinnsvis mellom omtrent 2.5 mg/kg/t og omtrent 25 mg/kg/t.

Fremgangsmåten kan også utføres i sammenheng med et koaguli-serende middel f.eks. vevs plasminogen-aktivator (tPA), modifisert tPA, streptokinase eller urokinase. I de tilfeller der clot-dannelse har oppstått og en arterie eller vene er blokkert, enten delvis eller totalt, blir et koageliserende middel vanligvis anvendt. En forbindelse fremstilt ifølge oppfinnelsen kan bli administrert sammen med lyseringsmidlet eller etter dets anvendelse for å forhindre at koageldannelsen gjenoppstår.

Ved å utføre fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er det foretrukket å anvende en foretrukket forbindelse. En forbindelse såsom beskrevet ovenfor blir f.eks. anvendt. Foretrukne peptider er N-Boc-D-fenylglycyl-L-prolyl-L-arginin aldehyd og N-metyl-D-fenylglycyl-L-prolyl-L-argininaldehyd som er i saltform f.eks. som sulfater eller hydroklorider. En spesielt foretrukket forbindelse fremstilt ifølge oppfinnelsen for anvendelse i fremgangsmåten er N-(D-1,2 ,3,4-tetrahydroisokinolin-l-oyl )-2-prolyl-2-argininaldehydsulfat.

Den antitrombotiske forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen kan bli formulert i enhetsdoserings-formuleringer som omfatter en dose på mellom omtrent 1 mg og omtrent 1000 mg. Forbindelsen er fortrinnsvis i form av et farmasøytisk akseptabelt salt såsom f.eks. sulfatsaltet, acetatsaltet eller et fosfatsalt. Et eksempel på en enhetsdoseringsformu-lering omfatter 5 mg N-Boc-D-fenylglycyl-L-prolyl-L-argininaldehyd sulfatsalt i en 10 ml steril glassampulle. Et annet eksempel på en enhetsdoserings-formulering omfatter omtrent 10 mg N-metyl-D-fenylglycyl-L-prolyl-L-arginin aldehydsulfat i 20 ml isotonisk saltvann Innbefattet i en steril ampulle.

En formulering kan være en enhetsdoseringsform som omfatter mellom 5 mg og 50 mg N-(D-1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-l-oyl)-L-prolyl-L-arginin aldehydsulfat i sterile ampuller.

Følgende eksempler er tilveiebragt for ytterligere å beskrive oppfinnelsen og skal ikke virke begrensende på denne.

Rf verdiene i følgende eksempler ble bestemt ved silikagel tynnskiktskromatografi ved anvendelse av Kieselgel 60F-254 (Merck, Darmstadt) i følgende oppløsningsmiddelsystemer:

(A) kloroform-metanol-eddiksyre, 135:15:1, v:v:v

(B) etylacetat-eddiksyre absolutt etanol 90:10:10, v:v:v

(C) kloroform-metanol-eddiksyre 90:30:5, v:v:v

De analytiske HPLC metodene anvendt i Eksemplene var som

følger:

Fremgangsmåte 1. Waters 600E ved anvendelse av en Vydac C-^g revers-fasekolonne på 0.46 cm x 10 cm. Kromatogrammet ble registrert på LDC ved 220 nM ved anvendelse av en gradient på A = 0.01M ammoniumacetat og B = acetonitril.

Fremgangsmåte 2. Pharmacia FPLC ved anvendelse av PepRPC med mål på 0.5 cm x 5.0 cm. Registreringen ble utført på Pharmacia UV-M ved 214 nM ved anvendelse av en gradient på enten A = 0.01M ammoniumacetat eller B = acetonitril.

Forkortingene anvendt i Eksemplene har følgende betydninger.

Aminosyrer: Arg = arginin, Pro = prolin, Phg = fenylglycin

Boe = t-butyloksykarbonyl

Bzl = benzyl

Cbz = benzyloksykarbonyl

DCC = dicykloheksylkarbodiimid

DMF = dimetylformamid

DMSO= dimetylsulfoksid

FAB-MS = hurtig atom bombardement massespektrum

FD-MS = felt desporpsjonsmasse-spektrum

THF = tetrahydrofuran

TLC = tynnsjiktskromatografi

Eksempel 1

N-Boc-D-fenylglycyl-L-Prolyl-L-Arginin aldehyd (Boc-D-Phg-Pro-Arg-H) hemisulfat

1) Boc-D-Phg-Pro-OBzl

En oppløsning av Boc-D-fenylglycin (15.0 g, 59.7 mmol ) og prolin benzylester hydroklorid (14.43 g, 59.7 mmol) i 60 ml DMF ble avkjølt til 0°C og N,N-diisopropyletylamin (10.3 ml, 59.7 mmol) ble tilsatt etterfulgt av 1-hydroksybenzotriazol hydrat (8.1 g, 59.7 mmol) og DCC (12.3 g, 59.7 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 3 dager ved romtemperatur hvorpå den ble filtrert og filtratet ble avdampet til en olje under vakuum. Oljen ble løst opp i 200 ml etylacetat og 150 ml vann og etter risting ble det organiske laget separert, vasket tre ganger med 100 ml porsjoner 0. IN HC1, en gang med 150 ml vann, tre ganger med 100 ml porsjoner 5% natrium bikarbonat og på ny med 150 ml vann. Den vaskede organiske oppløsningen ble tørket over MgS04 og ble deretter avdampet under vakuum for å tilveiebringe 24.8 g Boc-D-Phg-Pro-OBzl som et fast stoff (95% av teori): TLC Rf (A) 0.75; FAB-MS 439

(M+).

2) Boc-D-Phg-Pro-OH

Boc-D-Phg-Pro-0bzl produktet oppnådd som beskrevet ovenfor (24.5 g, 55.7 mmol) ble løst opp i 40 ml DMF og 225 ml isopropylalkohol og 1.0 g 5% Pd på karbonkatalysator ble tilsatt til oppløsningen. Nitrogen ble boblet inn i reaksjonsblandingen via et gass-dispersjonsrør og deretter ble hydrogen boblet gjennom i 16 timer etterfulgt av nitrogenspy-ling i 5 minutter. Katalysatoren ble filtrert gjennom et hyflofilterstykke og filtratet ble avdampet til tørrhet under vakuum for å tilveiebringe en fast rest. Resten ble krystallisert fra dietyleter inneholdende en liten mengde etylacetat. Det ble oppnådd 10.35 g av det deforestrede produktet. Boc-D-Phg-Pro (2), 53% utbytte: TLC Rf

(Å) 0.32; FAB-MS 349 (MH+);

<1->H NMR (DMS0-d6), S 1.35 (s, 9H), 1.71 - 2.10 (m 4H), 3.10 (m, 1H), 3.74 (M, 1H) , 4.20 (m, 1H) , 5.45 (d, 1H), 7.09 (d, 1H), 7.25 - 7.40 (m, 5H), 12.50 (bs, 1E) .

3) Boc-L-Arg(Cbz)-OH

N-Boc-argininhydroklorid (Boc-Arg-OH.HCl). (82.1 g, 250 mmol) ble løst opp i 240 ml 5N NaOH i en 3-halset rundbunnet flaske. Oppløsningen ble avkjølt til -5°C og benzylklorformat (143 ml, 1.0 mol, 4 ek.) ble tilsatt dråpevis iløpet av 55 min. mens pH til blandingen ble opprettholdt ved 13.2-13.5 med 5N NaOH (250 ml). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 1 time ved -5°C etter at tilsetning av klorformatet var fullført. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med 100 ml vann og 500 ml dietyleter og det vandige laget ble separert og ekstrahert to ganger med 40 ml porsjoner dietyleter. Det vandige laget ble surgjort til pH 3.0 med 3N H2S04 (560 ml) og ekstrahert med 550 ml etylacetat. Det separerte vandige laget ble ekstrahert en gang med etylacetat og ekstraktet kombinert med det tidligere etylacetatekstraktet. De kombinerte ekstraktene ble vasket med vann, tørket over MgS04 og avdampet til tørrhet under vakuum. Resten ble triturert med eter og det precipiterte produktet ble filtrert og tørket. Det ble oppnådd 66.1 g (3) Boc-Arg( Cbz)-0H (65% av teoretisk): TLC Rf (C) 0.43;

FD-MS 408 (M+).

<1>H NMR (CDC13), å 1.42 (s, 9H), 1.61 - 1.91 (m, 4H), 3.23 - 3.41 (m, 2H), 4.17 (d, 1H), 5.21 (s, 2H), 5.62 (d, 1H), 7.30 - 7.42 (ra, 6H), 8.37 (m, 1H).

4) Boc-Arg(Cbz)-Laktam

En oppløsning av Boc-Arg(Cbz)-0E (3) fremstilt som beskrevet ovenfor (66.0 g, 0.162 mol) i 230 ml tørr THF ble avkjølt til -10° C i et is-acetonbad. Til den kalde oppløsningen ble det tilsatt N-metylmorfolin (18.7 ml, 1.05 ek) etterfulgt av isobutylkloroformat (22.5 ml, 1.05 ek) og blandingen ble omrørt i 5 minutter ved -10°C. Deretter ble trietylamin (23.5 ml, 1.05 ek) tilsatt og blandingen ble omrørt ilt ved -10° C og ved romtemperatur i lt. Reaksjonsblandingen ble heilt inn i en liter av en is-vannblanding og produktet (4) ble presipitert. Presipitatet ble filtrert, vasket med kaldt vann, tørket under vakuum og ble krystallisert fra etylacetat. Det ble oppnådd 38.05 a (60% av teoretisk) av produkt 4, Boc-Arg(Cbz)-laktam; TLC Rf (A) 0.77; FD-MS 391

(MH+).

<1>H NMR (CDC13) S 1.48 (s, 9H), 1.78 - 1.98 (m, ZR), 2.50 (m, 1H), 3.41 (m, 1H), 4.43 (m, 1H), 4.90 (m, 1H), 4.16 (s, 2H), 5.27 (m, 1H), 7.28 - 7.45 (m, 6H), 9.41 (m, 1H), 9.68 (m, 1H).

5) Arg(Cbz)-laktam trifluoracetatsalt.

Boc-Arg(Cbz )-laktam (4) (38.0 g, 0.097 mol) ble blandet med 200 ml trifluoreddiksyre inneholdende 20 ml anisol og blandingen ble omrørt ved 0°C i en time. Reaksjonsblandingen ble avdampet under vakuum uten oppvarming og 400 ml dietyleter ble satt til resten. Det resulterende faste stoffet ble filtrert, vasket med dietyleter og tørket under vakuum. Det ble oppnådd 40.5 g av produktet (5) trif luoracetatsalt: TLC Rf (C) 0.29; FD-MS 291 (MH+).

6) Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-laktam

Til en oppløsning av Boc-D-Phg-Pro (14.5 g, 41.6 mmol), fremstilt som beskrevet i del 2 ovenfor, i 80 ml DMF avkjølt til -15°C ble 4.6 ml N-metylmorfol in tilsatt etterfulgt av 5.4 ml isobutyl klorformat og reaksjonsblandingen ble omrørt ved -15°C i to minutter.

I en separat flaske ble TFA.Arg(Cbz) laktam (15.3 g, 37.8 mmol) fremstilt som beskrevet ovenfor i del 5), løst opp i 30 ml DMF, oppløsningen ble avkjølt til 0°C og 4.6 ml N-metylmorfolin ble tilsatt. Etter oppløsningen ble omrørt ved 0°C i 2 minutter ble den heilt inn i Boc-D-Phg-Pro-oppløs-ningen fremstilt som beskrevet ovenfor. Reaksjonsblandingen som ble oppnådd ble omrørt i 4 t ved -15°C og ble deretter oppvarmet til romtemperatur over natt. En 5% oppløsning av NaHC03 (5 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen som deretter ble avdampet under vakuum for å tilveiebringe en olje. Oljen ble løst opp i 175 ml etylacetat og 150 ml vann ble tilsatt. Etter risting, ble det organiske laget separert, vasket med 5% NaHC03 og vann, tørket over MgS04 og avdampet til tørrhet under vakuum tilveiebragte 23.0 g Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz) laktam (6) som et amorft fast stoff (98% utbytte). TLC Rf (A) 0.72. FAB-MS 621 (MH+).

7) Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-H

Laktam (6) (23.0 g 37 mmol) oppnådd som beskrevet i del 6 ovenfor ble løst opp i 200 ml tørr THF og oppløsningen ble avkjølt til -15°C under en nitrogenatmosfære. Til den kalde oppløsningen ble det dråpevis tiisatt iløpet av 10 min. en IM oppløsning av litiumaluminiumhydrid i THF (37 ml, 37 mmol) og etter at tilsetningen var fullført ble reaksjonsblandingen oppvarmet til 0°C og omrørt i 1 time. En oppløsning av 12 ml THF og 12 ml 0. 5N H2S04 ble sakte dråpevis tilsatt til blandingen iløpet av 10 min. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med 200 ml etylacetat og 200 ml vann og etter risting ble det organiske laget separert. Det organiske laget ble vasket tre ganger med 150 ml porsjoner vann, tørket over MgS04 og avdampet til tørrhet under vakuum for å tilveiebringe 19.2 g (83% utbytte) Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-H. FAB-MS 623 (MH+). [ot]D 66.1°, C = 0.5, CHC13. 8) Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-H (7) (18.2 g, 29.2 mmol) ble løst opp i 100 ml THF og 100 ml vann og 29.2 ml IN H2S04 og 2 g 10% Pd/C ble tilsatt til oppløsningen. Nitrogen ble boblet inn i suspensjonen i 5 min. via et gass-dispersjonsrør etterfulgt av hydrogen i 4 t. Etter at reduksjonen var fullført ble nitrogen boblet gjennom på ny i 5 minutter. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom et hyflostykke for å fjerne katalysatoren og filtratet ble konsentrert til et volum på 100 ml ved avdampning under vakuum. Til det vandige konsentratet ble 200 ml n-butanol tilsatt og det organiske laget ble separert fra det vandige laget. Væsken ble ekstrahert tre ganger med 100 ml porsjoner n-butanol og ekstraktene ble kombinert og satt til det organiske laget. Det organiske laget ble avdampet til tørrhet under vakuum, resten ble triturert med dietyleter/diisopropyleter, 1:1, v:v, og det faste stoffet ble filtrert og tørket under vakuum for å tilveiebringe 10.26 g av råproduktet (8). Råmaterialet ble løst opp i 10% acetonitrilvann og oppløsningen ble applisert på en 7.5 cm x 53 cm kolonne av HP-20 harpiks tidligere ekvilibrert i 10% acetonitrilvann. Produktet ble eluert fra kolonnene ved trinnvis eluering med økende konsentrasjoner acetonitril i vann (10% til 12% til 15%). Multiple fraksjoner ble samlet og analysert for produkt via revers-fase HPLC. Fraksjoner inneholdende produkter ble slått sammen og avdampet til tørrhet for å tilveiebringe 5.42 g av råproduktet, Boc-D-Phg-Pro-Arg-H hemisulfat, (53% utbytte: [a]D = -125.6°, C = 0.5 CHCI3; FAB-MS 489 (MH+); retensjonstid på RP-HPLC (Fremgangsmåte 2, 10 - 50% B over 45 min., tid = 32.3 min.

Eksempel 2

N- (t-butyloksykarbonyl ) -D-f enylglycyl - L-Prolyl -L-argininaldehyd (Boc-D-Phg-Pro-Arg-H) diacetatsalt.

Til en oppløsning av Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz )-H, fremstilt som beskrevet i del 7 ifølge Eksempel 1 ble (38.0 g, 61 mmol) i 500 ml isopropylalkohol inneholdende 7.1 ml, (2 ek.) eddiksyre ble det tilsatt 2.0 g 10% Pd på karbonkatalysator. Blandingen ble spylt med nitrogen via et gass dispersjonsrør i 5 min. og hydrogen ble sendt igjennom blandingen i 24 t. Etter at reduksjonen var fullført ble nitrogen sendt igjennom blandingen på ny i 5 min. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom et hyflostykke for å fjerne katalysatoren og filtratet ble avdampet til tørrhet for tilveiebringing av 33.6 g av råproduktet som et amorft fast stoff. Produktet ble renset i 5 g porsjoner over en 5 cm x 25 cm kolonne Vydac C^g. Tripeptid-produktet ble eluert iløpet av 8 t med en gradient av 10 - 30% acetonitril/0.01M ammoniumacetat. Multiple fraksjoner ble samlet og de fraksjonene som vist ved revers fase HPLC å inneholde produktet ble slått sammen og frysetør-ket. Det ble oppnådd 11.7 g (35% utbytte) av titteltripep-tidet med følgende kjennetegn:

FAB-MS 489 (MH+)

Aminosyre analyse: Phg = 1.07, Pro = 0.94

[a]D = -108,9° (C = 0.5, CHC13)

Elementanalyse beregnet for C2gH44<N>^<0>g<:>

Teori: C, 55.25; H, 7.29; N, 13.81 Funnet: C, 55.52; H, 7.40; N, 13.93 Retensjonstid = 31.9 min. via HPLC Fremgangsmåte 2; 10 til 50% B iløpet av 45 min.

Forbindelsene karakterisert i følgende Eksempler 3-4 ble oppnådd ved å følge fremgangsmåtene beskrevet ifølge Eksempel 1 der angitt naftylglycin og p-hydroksyfenylglycin er erstattet med fenylglycin ifølge Eksempel 1.

Eksempel 3

N-Boc-D-l-naftylglycyl-Pro-Arg-H diacetat

[a]D = + 18.87°, C = 0.5, 50% eddiksyre FAB-MS (MH+)

539

HPLC fremgangsmåte 1, gradient: 20% til 60% B over 60 min. Retensjonstid = 42.0 min.

Eksempel 4

N-Boc-D-2-naftylglycyl-Pro-Arg-H diacetat

HPLC fremgangsmåte 2, gradient 30% til 60% B iløpet av 60 min.

Retensjonstid = 18.0 min.

Elementanalyse beregnet for CggH^N^Og:

Teori: C, 58.35; H, 7.04; N, 12.76

Funnet: C, 58.59; H, 6.83; N, 13.03

Eksempel 5

N-Boc-D-(4-hydroksyfenylglycyl)-Pro-Arg-H diacetat

HPLC fremgangsmåte 2, gradient 10% til 40% B iløpet av 40 min.

Retensjonstid = 26.5 min.

Aminosyre analyse: 4-hydroksyfenylglycin = 0.99, prolin = 1.01

Eksemplene 6- 23

Forbindelsene oppført i følgende Tabell 4 ble fremstilt ved koblingsfremgangsmåtene beskrevet ifølge Eksempel 1 når den angitte aminosyren eller substituerte addiksyren [A(C=0)] ble erstattet med D-fenylglycin anvendt i Eksempel 1. Alle forbindelsene i Tabell 4 er acetatsalt-former.

Eksempel 27 D-l ,2 ,3 ,4-tetrahydroisokinolin-l-oyl-L-prolyl-L-arginin aldehydsulfat.

Til en oppløsning av isokinolin-l-karboksylsyre (12.5, 0.072 mol) i 185 ml iseddiksyre hie det tilsatt 2 g platinaoksid og suspensjonen ble hydrogenert ved romtemperatur under 414 KPa hydrogentrykk i en Parr hydrogener ingsapparatur i 24 t. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom et filterstykke (Celite) for å fjerne katalysatoren og filtratet ble avdampet til tørrhet i vakuum. Den faste resten ble trituert med vann, filtrert og tørket for å tilveiebringe 8 g (63% utbytte ) DL-1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-1 -karboksylsyre. FD-Mass spektrum 178 (MH+); <1>H NMR (DMS0-d6): S 2.80 - 3.00 (m, 3H), 3.15 (m, 1H), 3.30 - 3.40 (m, 2H), 7.05 - 7.25 (m, 4H), 7.70 (m, 1H).

Produktet (7.08 g, 0.04 mol) ble løst opp i 2N NaOH (40 ml, 0.08 mol) og 40 ml t-butylalkohol og 10.5 g (0.048 mol) di-tert-butyl dikarbonat ble tilsatt til oppløsningen. Etter omrøring i 24 t ved romtemperatur ble hovedmengden av t-butyl alkohol avdampet fra reaksjonsblandingen. Den resulterende vandige oppløsningen ble ekstrahert med dietyleter, det vandige laget separert og surgjort med 2N HC1 til pH 2.0. Den surgjorte vandige fasen ble ekstrahert med etylacetat, ekstraktet tørket over MgS04 og avdampet til tørrhet i vakuum. Den gjenværende oljen ble løst opp i dietyleter og 7.9 ml (0.04 mol) dicykloheksylamin ble tilsatt til oppløs-ningen. Etter henstand ved 4"C i 4 t ble presipitatet av dicykloheksylaminsaltet av N-Boc-DL-1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-l-karboksylsyren filtrert, vasket med dietyleter og tørket i vakuum. Det ble oppnådd 15.7 g (86% utbytte) av det rene saltet. FD-masse spektrum 459 (MH+).

Elementanalyse beregnet for C27<H>42<N>2O4:

Teori: C, 70.71; H, 9.23; N, 6.11

Funnet: C, 71.07; H, 9.37; N, 5.87

Det Boe beskyttede derivatet (73.4 g, 160 mmol) ble suspen-dert i 200 ml etylacetat og suspensjonen ble vasket med 1.5 N sitronsyre og vann, ble tørket over MgSC^ og avdampet til tørrhet under vakuum. Den gjenværende oljen ble løst opp i etylacetat, oppløsningen avkjølt til 0°C og 2,4,5-triklor-fenol (31.6 g, 160 mmol) ble tilsatt til oppløsningen etterfulgt av DCC (33 g, 160 mmol). Reaksjonsblandingen ble omrørt i 1 time ved 0°C og ved romtemperatur i 1.5 t. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til 0°C, presipitatet filtrert og filtratet avdampet til tørrhet under vakuum. Den gjenværende oljen ble løst opp i 100 ml pyridin og prolin (18.42 g, 160 mmol) og trietylamin (22.3 ml, 160 mmol) ble tilsatt til oppløsningen. Etter omrøring ved romtemperatur i 24 t ble reaksjonsblandingen avdampet til tørrhet under vakuum. Resten ble løst opp i etylacetat, vann ble tilsatt og pH justert til 9.5 med 2N NaOH. Det vandige laget ble separert, surgjort til pH 2.0 med 2N HC1 og ekstrahert med etylacetat. Ekstraktet ble tørket over MgS04, filtrert og avdampet til tørrhet under vakuum. Oljeresten ble løst opp i metylenklorid og etylacetat. Etter henstand ved 4°C i 4 t ble et presipitat dannet i oppløsningen, ble filtrert og vasket med etylacetat og krystallisert fra metylenklorid/- etylacetat. Det faste produktet Boc-D-1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-l-oyl-L-prolin(Boc-D-l-Tiq-Pro-OH), ble tørket under vakuum for å tilveiebringe 19.6 g, 33% utbytte av det rene produktet, TLC Rf (A) 0.44; FAB-MS, 375 (MH+);

Elementanalyse beregnet for C2qH26n205;

Teori: C, 64.15; H, 7.00; N, 7.48

Funnet: C, 63.26; H, 6.98; N, 7.52

[a]D = +43.14°, C = 0.5, metanol.

I en første flaske ble Boc-D-l-Tiq-Pro (17.8 g, 47.5 mmol) løst opp i 100 ml DMF, oppløsningen avkjølt til -15°C og 5.3 ml (52.3 mmol) N-metylmorfolin og 6.2 ml (47.5 mmol) isobutylkloroformat ble tilsatt. Blandingen ble omrørt ved

-15°C i 2 min.

I en andre flaske ble Cbz beskyttet arginin laktam som trifluoracetatsalt [Arg(Z)-laktam.TFA] , (19.2 g, 47.5 mmol) løst opp i 40 ml DMF, oppløsningen avkjølt til 0°C og 5.3 ml (52.3 mmol) N-metylmorfolin ble tilsatt. Blandingen ble omrørt i 2 min. ved 0°C før den ble satt til den første flasken. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 4 t ved -15°C og deretter sakte oppvarmet til romtemperatur over natt og 5 ml 5% NaHC03 ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble avdampet under vakuum for å tilveiebringe en olje. Oljen ble løst opp i 175 ml etylacetat og 150 ml vann ble tilsatt til oppløs-ningen. Det organiske laget ble separert, vasket med 5% NaHC03, vann, 0. IN HC1 og med vann på nytt før tørking over MgS04. Den vaskede og tørkede oppløsningen ble avdampet under vakuum til tørrhet for å tilveiebringe 24.3 g (79%) utbytte av produktet. Boc-D-l-Tiq-Pro-Arg(Z) laktam, som et amorft fast stoff.

TLC Rf (A) 0.71

FAB-MS 647 (MH+)

[a]D = -32,8°, C = 0.5 kloroform.

Arg(Z) laktamprodukt oppnådd ovenfor (23.4 g, 36.2 mmol) ble løst opp i 300 ml tørr THF og oppløsningen plassert under Ng. Oppløsningen ble avkjølt til -20°C og 37 ml 1 itiumaluminium-hydrid IM i THF (37 mmol) ble tilsatt dråpevis til en kold oppløsning over 30 min. Etter at tilsetningen var fullsten-dig, ble blandingen omrørt ved -20°C i 30 min. og en oppløs-ning av 20 ml THF og 20 ml 0.5N H2S04 ble dråpevis tilsatt iløpet av 10 min. Reaksjonsblandingen ble fortynnet ved 400 ml etylacetat og 400 ml vann ble tilsatt. Det organiske laget ble separert, vasket to ganger med 150 ml porsjoner vann og tørket over MgS04. Det vaskede og tørkede organiske laget ble avdampet under vakuum for å tilveiebringe 21 g (89% utbytte) av produktet, Boc-D-l-Tiq-Pro-Arg(Z )-H, som et amorft faststoff.

TLC Rf (A) 0.28.

Arg(Z)-H produktet oppnådd som beskrevet ovenfor ble hydrogenert som følger for å fjerne den Cbz beskyttende gruppen. Produktet (18.1 g, 27.9 mmol) ble løst opp i 200 ml THF og 80 ml vann og 28 ml IN H2S04 og 3.0 g 5% Pd-på-karbon ble tilsatt. Nitrogen ble boblet gjennom suspensjonen via et gass-dispersjonsrør i 5 min. etterfulgt av hydrogen i 5 t og deretter nitrogen i 5 min. Katalysatoren ble filtrert og filtratet konsentrert til et volum på 100 ml. Konsentratet ble fortynnet med 200 ml n-butanol og lagene separert. Det vandige laget ble ekstrahert tre ganger med 100 ml porsjoner n-butanol og ekstraktene ble kombinert med det organiske laget. Det organiske laget ble avdampet under vakuum, og reaksjonsprodukt-resten titurert med dietyleter:diisopropyl-eter, 1:1, v:v, og det faste stoffet ble filtrert og tørket under vakuum for å tilveiebringe 11.08 g av råproduktet.

Produktet ble renset og oppnådd som sulfatsalt som følger: Råproduktet som ble oppnådd som beskrevet ovenfor ble løst opp i 20 ml vann og 20 ml 10N H2SO4. Oppløsningen ble oppvarmet ved 50°C i 25 min., avkjølt til romtemperatur og pH til oppløsningen ble justert til 4.0 med Bio-Rad-AGl-X8 harpiks (hydroksidform). Harpiksen ble separert fra oppløs-ningen ved filtrering og oppløsningen ble lyofilisert for å tilveiebringe 8.44 g av råproduktet som sulfatsaltet, D-l-Tiq-Pro-Arg-H.H2S04.

Sulfatsaltet (4.2 g) ble løst opp i 0.01% H2S04 og oppløs-ningen applisert på to 5 cm x 25 cm HPLC revers fasekolonner (Vydac C^8 harpiks) i serier. En gradient av økende konsentrasjoner acetonitril (2% til 10%) ble anvendt for å eluere produktsaltet. Fraksjoner ble oppsamlet og slått sammen på grunnlag av analytisk RP-HPLC profil. pH til de kombinerte fraksjonene ble justert til 4.0 ved anvendelse av AG1-X8 harpiks (Bio-Rad analytisk anion bytte-harpiks på 50 - 100 mesh) i hydroksysyklusen. Oppløsningen ble filtrert for å fjerne harpiksen og filtratet ble lyofilisert. Det ble oppnådd 2.4 g (57% teori) av det rensede produktet.

FAB-MS 415 (MH+)

[a]D = -76.12°, C = 0.5/0.01N H2<S>04

Aminosyre analyse: Pro, 0.92; Tiq. 1.00

Elementanalyse beregnet for C21H32N5O7S:

Teori: C, 49.21; H, 6.29; N, 16.29; S, 6.26 Funnet: C, 51.20; H, 6.17; N, 16.88; S, 5.37.

Claims

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv forbindelse med formel der A er 1) en gruppe med formel der R er en fenylgruppe med formel der a og a' uavhengig er hydrogen, lavere alkyl, lavere alkoksy, halogen, trifluormetyl eller hydroksy, eller R er tienyl, naftyl eller naftyl mono- eller disubstituert med lavere alkoksy, eller R er cykloheksyl eller cyklopentyl; Ri er hydrogen, P er hydrogen; B er H eller en aminogruppe med formel der R2 og R3 uavhengig er hydrogen eller lavere alkyl eller R2 er hydrogen og R3 er acetyl eller én oksykarbonyl-gruppe med formel der R4 er C-^-C^ alkyl, forutsatt at når R^ er metyl eller etyl er B forskjellig fra metyl eller etyl eller A er

2) en bicyklisk gruppe med formel der Q er en karbonrest representert ved -CH2-, og eller en to-karbonrest representert ved -CH2-CH2-, -CH2C=0 eller Y er en karbonrest representert ved -CHg-, eller en to-karbonrest representert ved forutsatt at en, men ikke begge, av Q og Y er eller og, forutsatt videre at bare en av Q og Y er en to-karbonrest; R5 er hydrogen eller en oksykarbonylgruppe som definert ovenfor; og den stiplede sirkelen innenfor den seksleddete ringen angir at ringen er aromatisk eller en perhydroring; og farmasøytisk akseptable ikke-toksiske salter derav, karakterisert ved å redusere A-(C=0)-Pro-Arg(P)-laktam med litiumaluminiumhydrid for å tilveiebringe en forbindelse med formel 1 hvor P er en aminobeskyttende gruppe og fjerne den aminobeskyttende gruppen P.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at N-Boc-D-fenylglycyl-L-prolyl-L-arginal og farme-søytisk akseptable ikke-toksiske salter derav fremstilles.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at N-metyl-D-fenylglycyl-L-prolyl-L-arginal og farmasøytisk akseptable ikke-toksiske salter derav fremstilles .

4 . Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at DL-1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-l-oyl-L-Prolyl-L-arginin aldehydsulfat fremstilles.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at D-l,2,3,4-tetrahydroisokinolin-l-oyl-L-prolyl-L-arginin aldehydsulfat fremstilles.