HU217441B

HU217441B - Eljárás trombózis elleni hatású di-és tripeptidszármazékok és az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására

Info

Publication number: HU217441B
Application number: HU037/91A
Authority: HU
Inventors: Paul David Gesellchen; Robert Theodore Shuman
Original assignee: Eli Lilly And Co.
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 1991-09-23
Publication date: 2000-01-28
Also published as: CA2052013A1; FI107733B; BR9104181A; CZ285980B6; ES2194835T3; EP0684258A2; CS291391A3; NZ239907A; JP3023019B2; HU211634A9; KR100219993B1; FI914566A0; HU913037D0; EP0685489A2; ES2169105T3; NO913773D0; IE913423A1; PT99068B; EP0479489A2; CA2052013C

Abstract

A találmány tárgya eljárás az (1) általánős képletű vegyületek ésgyógyszerészetileg elfőgadható, nem tőxikűs sóik előállítására, ahőlaz általánős képletben A jelentése (4) általánős képletű csőpőrt, ahőlR jelentése (5) általánős képletű fenilcsőpőrt, ahől a és a’ jelentéseegymástól függetlenül hidrőgénatőm, kis szénatőmszámú alkőxicsőpőrt,halőgénatőm, triflűőr-metil- csőpőrt, hidrőxilcsőpőrt; vagy Rjelentése tienilcsőpőrt, adőtt esetben kis szénatőmszámúalkőxicsőpőrttal helyettesített naftilcsőpőrt, ciklőhexilcsőpőrt vagyciklőpentilcsőpőrt; R1 jelentése hidrőgénatőm; B jelentése kisszénatőmszámú alkilcsőpőrt, kis szénatőmszámú alkőxi- csőpőrt, vagy–N(R2)(R3) általánős képletű aminőcsőpőrt, ahől R2 jelentésehidrőgénatőm és R3 jelentése hidrőgénatőm, 1–6 szénatőmősalkilcsőpőrt, acetilcsőpőrt, vagy 1–6 szénatőmős alkőxi-karbőnil-csőpőrt; A jelentése 1- vagy 3-perhidrő- vagy tetrahidrő-izőkinőlin-vagy N-Bőc- tetrahidrő-izőkinőlin-csőpőrt; P jelentése hidrőgénatőm. Atalálmány szerinti eljárással előállítőtt (1) általánős képletűvegyületek antikőagűláns hatással rendelkeznek, emberekben ésállatőkban és gyógyszerészetben alkalmazhatók. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás trombin inhibitorok előállítására, amelyek emberekben és állatokban koagulációellenes szerként alkalmazhatók. Részletesebben, a találmány tárgya eljárás magas trombózisellenes aktivitással rendelkező új L-prolin-L-arginin-aldehid-származékok, valamint az ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására.

A trombin inhibiálást jelenleg heparinok vagy kumarinok adagolásával végzik. Ezen szerek hatásmechanizmusát igen széleskörűen vizsgálták. A heparinok csak parenterális úton adagolhatok, és adagolási szintjüket pontosan követni kell. A kumarinok úgy hatnak, hogy a protrombinképződést blokkolják vagy inhibiálják, ennélfogva a maximális hatásosságuk kialakulása időt igényel.

Ugyan a heparinok és kumarinok hatásos koagulálást gátló anyagok, mégis szükség van arra, hogy trombinképződést gátló szereket dolgozzanak ki, amelyek gyorsan megakadályozzák a vérrögképződést, és amelyek nem lépnek kölcsönhatásba a plazminhatással abban a vonatkozásban, hogy a jelen lévő vérrögöket oldja.

Az FR 247 799 számú francia szabadalmi leírás például antikoaguláns hatású D-Phe-Pro-Arg-H-tripeptidaldehidet ismertet.

A találmány tárgya eljárás az (1) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek trombin inhibiáló hatással rendelkeznek, ahol az általános képletben A jelentése (4) általános képletű csoport, ahol

R jelentése fenilcsoport vagy (5) általános képletű csoport, ahol a és a’ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, kis szénatomszámú alkoxicsoport, halogénatom, trifluor-metil-csoport, hidroxilcsoport; vagy

R jelentése tienilcsoport, adott esetben kis szénatomszámú alkoxicsoporttal helyettesített naftilcsoport, ciklohexilcsoport, vagy ciklopentilcsoport;

R, jelentése hidrogénatom,

B jelentése kis szénatomszámú alkilcsoport, kis szénatomszámú alkoxicsoport, hidroxilcsoport vagy -N(R₂)(R₃) általános képletű aminocsoport, ahol R₂ jelentése hidrogénatom és R₃ jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomszámú alkilcsoport, acetilcsoport vagy 1-6 szénatomos alkoxikarbonil-csoport,

A jelentése 1- vagy 3-perhidro-, tetrahidro-izokinolinvagy N-Boc-tetrahidro-izokinolin-csoport;

P jelentése hidrogénatom, valamint eljárás gyógyszerészetileg elfogadható, nem toxikus sóik előállítására.

Az (1) általános képletű találmány szerinti vegyületeket úgy állíthatjuk elő, hogy az (1) általános képletű vegyületből, amelyben P jelentése amino-védőcsoport és A jelentése a fenti, a védőcsoportot eltávolítjuk, és kívánt esetben gyógyszerészetileg elfogadható, nem toxikus sóvá alakítjuk.

Az (1) általános képletű találmány szerinti peptidek alkalmas trombózisellenes szerek, és alkalmazhatók a szövet plazminogén aktivátor (tPA), a sztreptokináz vagy urokináz terápiában.

A találmány szerinti kiindulási vegyületeket szokásos kapcsolási eljárással állíthatjuk elő, például a BocD-Phg vegyületet az L-prolin egy észterével kapcsoljuk és így a Boc-D-Phg-Pro észtert állítjuk elő. Az észtercsoportot eltávolítjuk, majd a Boc-D-Phg-Pro vegyületet az L-arginin laktám formájával kapcsoljuk és így aminocsoporton védett formájú Boc-D-Phg-Pro-Arg laktámot nyerünk. Az Arg-laktámgyűrűt redukció segítségével felnyitjuk és az arginin aminocsoport védőcsoportját eltávolítjuk és így Boc-D-Phg-Pro-Arg aldehidet állítunk elő. A peptideket alkalmas sóformává alakítjuk, mint például acetát vagy szulfát formát állítunk elő.

A találmány tárgya továbbá eljárás a fentiekben alkalmazható gyógyszerészeti formált alak előállítására.

A találmány szerinti (1) általános képletű vegyületek tripeptidek abban az esetben, amennyiben A jelentése aminosavmaradék, mint például fenil-glicil-csoport (Phg), illetve a prolin- és arginin-aldehid dipeptidjének (Pro-Arg-H) N-acil-származékai, amennyiben A jelentése aminosavmaradéktól eltérő, például, amennyiben B jelentése aminocsoporttól vagy alkil-amino-csoporttól eltérő csoport. Mint az (1) általános képletben látható, az A(C=O) csoport aszimmetrikus atomja R vagy RS konfigurációjú, míg a prolin és arginin-aldehid egységek konfigurációja L.

Az (1) általános képletű vegyületre alkalmazott elnevezések értelmezése az alábbi:

A „kis szénatomszámú alkilcsoport” elnevezés alatt egyenes vagy elágazó szénláncú 1-4 szénatomszámú alkilcsoportokat értünk, amelyek lehetnek például metilcsoport, etilcsoport, n-propil-csoport, izopropil-csoport, n-butil-csoport és hasonló csoportok.

A „kis szénatomszámú alkoxicsoport” elnevezés alatt 1 -4 szénatomszámú alkoxicsoportokat értünk, amelyek lehetnek például metoxicsoport, etoxicsoport, n-propoxicsoport, izopropoxi-csoport, n-butoxi-csoport, terc-butoxi-csoport és hasonló csoportok.

A „halogénatom” elnevezés alatt fluoratomot, klóratomot, brómatomot vagy jódatomot értünk.

A „mono(kis szénatomszámú)-alkil-amino-csoport” elnevezés alatt például metil-amino-csoportot, etil-amino-csoportot, n-butil-amino-csoportot, n-propil-aminocsoportot és hasonló csoportokat értünk.

Az „1-6 szénatomszámú alkilcsoport” elnevezés alatt egyenes vagy elágazó szénláncú csoportokat értünk, mint például a fent megadott 1 -4 szénatomszámú alkilcsoportok, továbbá n-pentil-csoportot, izopentilcsoportot, n-hexil-csoportot, az izomer-hexil-csoportokat, és hasonló csoportokat értünk.

Mint az (1) általános képletre megadtuk, amennyiben A jelentése (R)(R])(B)C- képletű csoport, R jelentése lehet fenilcsoport, amely lehet mono- vagy diszubsztituált. Ilyen fenilcsoportok például lehetnek a fenilcsoport (amelyben a és a’ jelentése hidrogénatom), 4-metoxi-fenil-csoport, 3-metoxi-fenil-csoport, 3-etoxi-fenil-csoport, 2-metoxi-fenil-csoport, 3-izopropoxi-fenil-csoport, 4-hidroxi-fenil-csoport, 4-klór-fenil-csoport, 3-klór-fenil-csoport, 2-fluor-fenil-csoport, 3-fluor-fenil-csoport, 3-bróm-fenil-csoport, 4-fluor2

HU 217 441 Β fenil-csoport, 3-(trifluor-metil)-fenil-csoport, 4-(trifluor-metil)-fenil-csoport, 3,4-diklór-fenil-csoport, 3hidroxÍ-4-fluor-fenil-csoport, 3-metoxi-4-hidroxi-fenilcsoport, 3-klór-4-etoxi-fenil-csoport és hasonló monovagy diszubsztituált fenilcsoport.

Az R csoport lehet például 6-metoxi-2-naftil-csoport.

Az (1) általános képletű vegyületben a B csoport jelentése, amennyiben ez -N(R₂)(R₃) általános képletű aminocsoport, lehet aminocsoport (amennyiben R₂ és R₃jelentése egyaránt hidrogénatom), metil-amino-csoport, etil-amino-csoport, izopropil-amino-csoport és hasonló aminocsoportok; és amennyiben R₂ jelentése hidrogénatom és R₃ jelentése R^O-C^O)- általános képletű oxikarbonil-csoport, ilyen csoport lehet például 1-6 szénatomszámú alkoxi-karbonil-amino-csoport, mint például metoxi-karbonil-amino-csoport, etoxi-karbonil-aminocsoport, terc-butoxi-karbonil-amino-csoport.

Az A(C=O) csoportok az (1) általános képletű vegyületekben, amennyiben A jelentése az 1 típusú (R)(R))(B)C- általános képletű csoport, lehet például fenil-glicil-csoport, 3-metoxi-fenil-glicil-csoport, 4-metoxi-fenil-glicil-csoport, 4-klór-fenil-glicil-csoport, 3,4diklór-fenil-glicil-csoport, 3-(trifluor-metil)-fenil-glicilcsoport, N-(terc-butoxi-karbonil)-fenil-glicil-csoport, N(terc-butoxi-karbonil)-N-metil-fenil-glicil-csoport, alfametil-fenil-acetil-csoport, alfa-etil-fenil-acetil-csoport, alfa-metoxi-fenil-acetil-csoport, alfa-izopropoxi-fenilacetil-csoport, 1 -naftil-glicil-csoport, 2-naftil-glicil-csoport, N-(terc-butoxi-karbonil)-2-naftil-glicil-csoport, 2tienil-glicil-csoport, 3-tienil-glicil-csoport, N-(ciklopentil-oxi-karbonil)-2-tienil-glicil-csoport, 2-furil-glicilcsoport, N-etil-2-furil-glicil-csoport, alfa-hidroxi-alfa(2-naftil)-acetil-csoport, alfa-hidroxi-alfa-(2-tienil)-acetil-csoport, ciklohexil-glicil-csoport és hasonló A(CO) csoportok.

Az (1) általános képletű, találmány szerinti peptidvegyületek, amennyiben A jelentése akirális 1-aminociklopentil-csoport vagy 1-amino-ciklohexil-csoport, a (6) általános képletű vegyületek lehetnek, ahol az általános képletben

P jelentése egy szénkötés vagy egy metiléncsoport; és R₂ és R₃ jelentése a fent megadott.

Ilyen tripeptidek például az N-(l-amino-ciklohexanoil)-Pro-Arg-H, az N-(l-amino-ciklopentanoil)-ProArg-H, az N-(l-metil-amino)-ciklohexanoil-Pro-Arg-H, az N-( l-terc-butil-oxi-karbonil-amino)-ciklohexanoilPro-Arg-H és hasonló vegyületek.

A találmány szerinti (1) általános képletű peptidek példái, amelyekben A jelentése a fenti, a D-l,2,3,4tetrahidro-izokinolin-l-il-karbonil-származékok és a Dl,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-3-il-karbonil-származékok, amelyek a (7) általános képletű, illetve a (8) általános képletű N-acil-származékai a Pro-Arg-H vegyületnek felelnek meg.

A találmány szerinti peptidek gyógyszerészetileg elfogadható sói lehetnek például savaddíciós sók, amelyeket szervetlen savakkal és karbonsavakkal képezhetünk. Ilyen szervetlen savak, amelyek sóképzésre alkalmazhatók a hidrogén-halogenidek, mint például a hidrogén-klorid és a hidrogén-bromid; a foszforsav és a kénsav. A savaddíciós sók képzésére alkalmas karbonsavak például lehetnek az ecetsav, a propionsav, a malonsav, a maleinsav, a citromsav, a borostyánkősav, az almasav, a benzoesav, a fumársav és hasonló karbonsavak. A savaddíciós sókat szokásos eljárással állítjuk elő, például az (1) általános képletű vegyület szabad bázis formáját savval semlegesítjük. Előnyös savaddíciós sók a szulfátok és a hidrokloridok.

A találmány szerinti előnyös (1) általános képletű vegyületek, amelyekben az általános képletben A jelentése (4) általános képletű csoport, ahol R jelentése (5) általános képletű fenilcsoport vagy naftilcsoport vagy szubsztituált naftilcsoport, R¹ jelentése hidrogénatom és B jelentése -M(R₂)(R₃) általános képletű csoport. További előnyös találmány szerinti vegyületek, amelyekben R₂ jelentése hidrogénatom és R₃jelentése R₄O-C(O)- általános képletű oxi-karbonilcsoport.

További előnyös találmány szerinti (1) általános képletű vegyületek, amelyekben A jelentése (2) általános képletű biciklusos csoport. Ilyen előnyös vegyületek, amelyekben az (1) általános képletben A(C=O) jelentése 1,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-l-il-karbonil-csoport (olyan (2) általános képletű csoport, amelyben Q jelentése etiléncsoport, Y jelentése -CH-csoport és R₅, valamint R₆ jelentése hidrogénatom), valamint 1,2,3,4tetrahidro-izokinolin-3-il-karbonil-csoport (olyan (2) általános képletű csoport, ahol az általános képletben Q jelentése -CH₂-CH- csoport és Y jelentése metiléncsoport).

Az (1) általános képletű találmány szerinti vegyületeket a peptidkapcsolás ismert eljárásaival állíthatjuk elő. Az egyik ilyen eljárásnak megfelelően az A-COOH általános képletű savat, ahol A jelentése az (1) általános képletre megadott, kapcsoljuk egy karboxilcsoporton védett prolinnal és így dipeptidet állítunk elő (amennyiben A jelentése egy aminosav) vagy egy N-acil-prolin-észtert állítunk elő (amennyiben A jelentése aminosavtól eltérő). A kapott termékből a prolinegységen található karboxilcsoportot védő észtercsoportot ezután eltávolítjuk, és a szabad sav dipeptid formát arginin-laktám formával kapcsoljuk. A fenti reakciósorozatot az 1. reakcióvázlaton mutatjuk be; ahol az általános képletekben P jelentése amino-védőcsoport.

A kapcsolt (c) általános képletű Arg(P)-laktám terméket lítium-alumínium-hidriddel inért oldószerben redukáljuk és így a laktámgyűrűt felnyitjuk és az A(C=O)Pro-Arg(P)-H általános képletű tripeptidet kapjuk, amely arginin-aldehid formájú, ahol az általános képletben Arg(P)-H jelentése aminocsoporton védett arginin-aldehid.

Az arginin laktámformáját intramolekuláris kapcsolással nyerjük az aminocsoporton védett argininből (Arg-OH), például a (13) képletű Boc-Arg(Cbz)OH vegyületet először aktív észter formává, mint például aktív vegyes anhidriddé alakítjuk klór-formiát-észterrel, például etil-klór-formiáttal, izobutil-klór-formiáttal. Az észterképzést tercier-amin, mint például N-metil-morfolin jelenlétében hajtjuk végre. Erősebb tercier-amin bázis adagolása, amely lehet például trietil-amin, belső

HU 217 441 Β acilezést eredményez és így a (14) képletű laktám-formáját kapjuk a diaminovédett argininnek. Mielőtt ezt a vegyületet az A(C=O)-Pro-OH vegyülettel az 1. reakcióvázlatnak megfelelően kapcsolnánk, a Boc védőcsoportot szelektíven eltávolítjuk trifluor-ecetsav segítségével és így a kívánt szabad aminocsoportot állítjuk elő.

Az ACOOH általános képletű vegyület prolin-észterrel történő kapcsolását, amennyiben A jelentése aminosavmaradék, úgy hajtjuk végre, hogy először az aminosav aminocsoportját védőcsoporttal látjuk el. Szokásos aminocsoport védőcsoportokat alkalmazhatunk, amelyek alkalmasak arra, hogy az aminocsoportot időlegesen a reakcióktól megóvják. Ilyen védőcsoportok lehetnek például az alkoxicsoport, az alkenil-oxi-csoport, a cikloalkoxi-csoport és az aril-oxi-karbonil-csoport, mint például az etoxi-karbonil-csoport, a terc-butoxikarbonil-csoport, a ciklohexil-oxi-karbonil-csoport, az adamantil-oxi-karbonil-csoport, a triklór-etoxi-karbonilcsoport, a benzil-oxi-karbonil-csoport, a difenil-metoxikarbonil-csoport és hasonló csoportok. A kapcsolási reakció során a prolin karboxilcsoportjának védésére alkalmazott észtercsoport a szokásosan alkalmazott, később könnyen eltávolítható észtercsoportok valamelyike lehet, mint például terc-butil-csoport, benzilcsoport, pnitro-benzil-csoport, p-metoxi-benzil-csoport, difenilmetil-csoport, triklór-etil-csoport, fenacilcsoport vagy trialkil-szilil-csoport. A kapcsolási reakció során a prolin esetében olyan észtercsoportokat alkalmazunk, amelyek olyan körülmények között távolíthatók el a molekulából, hogy az aminocsoport védőcsoport nem hasad le. így az ACOOH általános képletű acilezősavban található aminocsoport védőcsoport a molekulán marad a következő kapcsolási reakció során, amelyet az argininlaktám vegyülettel végzünk, és amelynek során a (c) általános képletű terméket állítjuk elő.

Az (1) általános képletű vegyületeket, amelyekben A jelentése (RXRjXBjC- általános képletű csoport és B jelentése -N(R₂)(R₃) általános képletű aminocsoport, ahol R₂ jelentése hidrogénatom és R₃ jelentése kis szénatomszámú alkilcsoport - a megfelelő vegyületekből állíthatjuk elő - amelyekben B jelentése aminocsoport, ismert alkilezési eljárásokkal. Például N-metil-D-fenilglicil-L-prolil-L-arginin-aldehidet állíthatunk elő az alábbi reduktív alkilezési eljárással. Cbz-csoporttal védett D-fenil-glicint dimetil-formamidban L-prolin-tercbutil-észterrel kapcsolunk diciklohexil-karbodiimid (DCC) és hidroxi-benzotriazol (HOBt) jelenlétében és így a Cbz-D-fenil-glicil-L-prolin-terc-butil-észter dipeptidet állítjuk elő. A peptídet etil-alkoholban, aktív szénre felvitt palládiumkatalizátor jelenlétében hidrogénezzük és így a Cbz-védőcsoportot eltávolítjuk, majd a redukciós elegyhez formaldehidet adunk, és a hidrogénezést folytatjuk, így N-metil-D-fenol-glicil-L-prolin-tercbutil-észtert állítunk elő. A fenil-glicil egység N-metil másodrendű aminocsoportját Cbz-csoporttal védjük úgy, hogy a dipeptid-terc-butil-észtert benzil-klór-formiáttal tetrahidrofuránban reagáltatjuk N-metil-morfolin jelenlétében, és így az N-Cbz-N-metil-D-fenil-glicil-Lprolin-terc-butil-észtert nyerjük. A terc-butil-észter-csoportot szobahőmérsékleten, trifluor-ecetsavban eltávolítjuk, amely reakcióelegy anizolt tartalmaz, és így az N-Cbz-N-metil-D-fenil-glicil-L-prolint nyerjük. Az utóbbi dipeptidet ezután Cbz-védett Arg-laktámmal kapcsoljuk és ezt követően a laktámgyűrűt reduktív módon nyitjuk és a fent leírt Arg-aldehidet nyeljük. A tripeptidből mindkét Cbz-védőcsoportot hidrogénezés segítségével aktív szénre felvitt palládium katalizátor alkalmazásával eltávolítjuk és így az N-metil-D-fenil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehidet kapjuk.

Az (1) általános képletű vegyületeket, amelyekben A jelentése (R)(R,)(B)C- általános képletű csoport, és R jelentése ciklohexadienilcsoport vagy ciklohexenilcsoport, továbbá B jelentése -N(R₂)(R₃) általános képletű alkil-amino-csoport, úgy állíthatjuk elő, hogy kis szénatomszámú alkil-aldehiddel képzett iminszármazékot nátrium-ciano-bórhidrid-del redukáljuk. Hasonlóan, az ilyen N-alkilezést végrehajthatjuk kis szénatomszámú alkil-jodid és nátrium-hidrid alkalmazásával.

Az (1) általános képletű vegyületeket, amelyekben A jelentése a (2) általános képletű biciklusos csoport, hasonló fenti kapcsolási eljárásokkal állíthatjuk elő, például az (1) általános képletű peptídet, amelyben A jelentése l,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-l-il-csoport, úgy állíthatjuk elő, hogy a prolin észterét, mint például benzilészterét acilezzük az 1,2,3,4-tetrahidro-l-karboxi-izokinolin aktív származékával. Az alkalmazható aktív származékok lehetnek például savhalogenidek, mint például savklorid vagy savbromid, savazidok, továbbá aktív észterek és anhidridek, mint például klór-formiátokkal képzett anhidridek, amelyeket a fentiekben ismertettünk. A tetrahidro-izokinolin-gyűrűben található nitrogénatomot [(2) általános képlet, R₅ jelentése hidrogénatom] az acilező kapcsolás során védőcsoporttal látjuk el vagy alkilezzük. Például az N-Boc-l,2,3,4-tetrahidro-l-karboxi-izokinolin aktív észtere képződik izobutil-klór-formiát segítségével, amennyiben a prolin-észter acilezésére ezt alkalmazzuk. Az N-Boc-l,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-l-il-karbonil-prolin-észterből az észtercsoportot eltávolítjuk, majd a szabad savat aktív észterré alakítjuk, és ezt az arginin laktám formájával kapcsoljuk. A laktámterméket ezután a fentiek szerint aldehid formává alakítjuk, és így az (1) általános képletű vegyületet kapjuk, amely a Boc-l,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-l-il-karbonil-Pro-Arg-H.

A (2) általános képletű perhidro-biciklusos csoportot a részben redukált vagy telítetlen savak hidrogénezésével állíthatjuk elő, amelyet szokásos eljárással végezhetünk, például az 1,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-l-karbonsavat palládium-oxid-katalizátor jelenlétében, oldószerben, mint például etanolban vagy ecetsavban hidrogénezzük, és így a perhidro(dekahidro)-izokinolin-l-karbonsavat állítjuk elő. A perhidro savakat ezután ugyanolyan eljárásban alkalmazzuk, mint amelyet a prolin-észter acilezésére korábban leírtunk. Ilyen (1) általános képletű perhidro-származékok például az N-(D-dekahidro-izokinolin-l-oil)-L-prolil-L-arginin-aldehid és az N-(D-dekahidro-izokinolin-3-oil)-L-prolil-L-arginin-aldehid.

A fent leírt kapcsolási reakciókat hideg körülmények között, előnyösen körülbelül -20 °C-körülbelül 15 °C hőmérsékleten hajtjuk végre. A kapcsolási reak4

HU 217 441 Β ciókat inért szerves oldószerben, mint például metilformamidban, dimetil-acetamidban, tetrahidrofuránban, diklór-metánban, kloroformban, és hasonló oldószerben végezzük. Általában vízmentes körülményeket alkalmazunk a kapcsolási reakcióban, amennyiben acilező szerként aktív észter formát alkalmazunk.

A találmány szerinti vegyületeket savaddíciós só formában izoláljuk. A találmány szerinti (1) általános képletű vegyületek sóit, amelyeket a fent leírt savakkal képeztünk, alkalmasak gyógyszerészetileg elfogadható sóként történő adagolásra trombózisellenes szerként, illetve az ilyen szerekből készült gyógyszerészeti formált alakokban történő felhasználásra. Más savaddíciós sókat is előállíthatunk és alkalmazhatunk a találmány szerinti peptidek izolálása és tisztítása céljából, például ilyen sók lehetnek a szulfonsavakkal képzett sók, mint például a metánszulfonsawal, az n-butánszulfonsawal, a p-toluolszulfonsawal és a naftolszulfonsawal képzett sók.

Az (1) általános képletű vegyületek előnyös izolálási és tisztítási eljárása, amelynek során egy időben a kívánt, stabil sót is képezzük. Az eljárás szerint szervetlen savakkal képzett stabil sók, mint például szulfátok vagy hidrokloridsók előállítását végezzük, és ezeket preparatív eljárással C_lg reverz fázisú kromatográfia segítségével tisztítjuk. A vizes fázis kénsav vagy sósav, amelynek koncentrációja körülbelül 0,01% és körülbelül 0,05%, valamint acetonitril, tetrahidrofürán, metanol vagy más alkalmas oldószer, amely szerves komponensként szolgál. A savas eluálószer pH-értékét körülbelül pH=4 és pH=6 közé állítjuk be, a pontos pH-érték az adott peptidtől függ. Erre a célra bázikus gyantát, például Bio-Rad Ag-lX8 gyantát alkalmazunk hidroxil formában. A pH beállítása után a tripeptidsó oldatát, például szulfát- vagy hidrokloridsó-oldatot liofilizáljuk és így a tisztított sót száraz por formában kapjuk. Az eljárás egyik példájában nyers D-Phg-L-Pro-L-Arg-Hszulfátot, amely epimer D-Arg-H szulfáttal szennyezett, oldunk körülbelül 0,01% koncentrációjú kénsavban, és az oldatot Vydac C₁₈ RP-HPLC oszlopra visszük. Gradiens eluciót alkalmazunk, amelynek során 2-10% acetonitril 0,01% kénsavban képzett oldatát használjuk eluensként, és az oszlopot ezzel az eluenssel 10 órán át fejlesztjük ki. Számos frakciót gyűjtünk, és azokat a frakciókat, amelyek a kívánt terméket tartalmazzák, analitikai RP-HPLC vizsgálat segítségével választjuk ki és egyesítjük. Az egyesített frakciók pHértékét körülbelül pH=4,0 - körülbelül 4,5 értékre állítjuk be Bio-Rad AG-1X8 gyanta segítségével a hidroxilciklusban. Az oldatot szűrés után liofilizáljuk és így tiszta, D-Phg-L-Pro-L-Arg-H-szulfátot nyerünk.

A találmány szerinti (1) általános képletű vegyületek trombinhatását inhibiálják emberben és állatokban. A trombininhibiálást in vitro kimutattuk a trombin amidáz aktivitásának inhibiálása segítségével. Az alábbi I. táblázatban bemutatjuk a tesztvizsgálati vegyületek (inhibitorok) és a trombin között fennálló látszólagos egyensúlyi állandó értékeket (Kass). Az adatokat úgy kaptuk, hogy a trombin kromogén-szubsztrát hidrolízisére kifejtett hatását mértük, amely szubsztrát az N-benzoil-Dfenil-alanil-L-valil-L-arginil-p-nitro-anilid volt.

A tesztvizsgálatot 50 μΐ puffer (0,03 mól Tris, 0,15 mól NaCl, pH = 7,4) továbbá 25 μΐ trombinoldat (0,21 mg/ml trombosztát por 0,06 mól Tris, 0,3 mól NaCl-oldatban pH = 7,4) és 150 /μΐ kromogénszubsztrát vizes oldat (amely 0,25 mg/ml koncentrációjú) elegyében végeztük. 25 μΐ térfogatú tesztvizsgálati vegyület oldatot adagoltunk ehhez az elegyhez, különféle koncentrációban. A szubsztrát hidrolízisének sebességét mértük 405 nm értéknél és így meghatároztuk a p-nitro-anilin-kibocsátás sebességét. Standard görbéket hoztunk létre úgy, hogy a szabad trombinkoncentrációt a hidrolízis sebességének függvényében ábrázoltuk. A tesztvizsgálati vegyületekkel ezután mért hidrolízis-sebességeket „szabad trombin” értékekké alakítottuk át az egyes kísérletekben a standard görbék segítségével. A kötött trombin (a tesztvizsgálati vegyülethez kötött trombin) mennyiségét úgy számítottuk, hogy az egyes kísérletekben tapasztalt szabad trombinmennyiséget levontuk az ismert kezdeti trombinmennyiségből, amelyet az egyes kísérletek kezdetén alkalmaztunk. A szabad inhibitor mennyiségét az egyes tesztvizsgálatokban úgy számítottuk, hogy a trombinhoz kötött mólok számát levontuk a beadagolt inhibitor móljainak számából (amely inhibitor a tesztvizsgálati vegyület).

A Kass értéke ezután az elméleti egyensúlyi állandó az alábbi trombin és tesztvizsgálati (1) vegyület közötti reakcióra vonatkoztatva.

trombin+(l) ₍ ⁾ trombin-(l) /trombin-(1)/

Kass=/trombin χ (1)/

A Kass-értéket a tesztvizsgálati vegyületek különféle koncentrációjára számítottuk, és az átlagértéket liter/mól értékben adjuk meg.

I. táblázat

Trombin amidáz aktivitás inhibiálása

Teszt vizsgálati inhibitor¹ A(C=0)-	Trombin amidáz Kassx 10⁶(liter/mól)
D-fenil-glicil	75
N-Boc-D-fenil-glicil	88
N-Boc-D-fenil-glicil	73
N-Boc-D-fenil-glicil (szulfátsó)	107
N-Boc-D-(4-hidroxi-fenil)-glicil	115
N-Boc-D-(4-metoxi-fenil)-glicil	75
N-Boc-DL-(3,4-diklór-fenil)-glicil	40
N-acetil-D-(4-metoxi-fenil)-glicil	15,5
N-Boc-D-I-naftil-glicil	52
N-Boc-D-2-naftil-glicil	22,2
N-Boc-DL-1 -naftil-glic il	18,1
N-Boc-D-(6-metoxi-2-naftiI)-glicil	6,1
N-Boc-D-2-tienil-glicil	14

HU 217 441 Β

I. táblázat (folytatás)

Tesztvizsgálati inhibitor¹ A(C=0)-	Trombin amidáz Kass χ 10« (liter/mól)
N-Boc-D-ciklohexil-glicil	120
N-metil-D-fenil-glicil	91,5
N-Boc-N-metil-D-fenil-glicil	5,2
(R)-alfa-metil-fenil-acetil	11,0
(R)-alfa-etil-fenil-acetil	7,5
(R)-alfa-metoxi-fenil-acetil	4,2
(S)-alfa-metil-fenil-acetil	0,2
N-Boc-DL-1,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-l-il-karbonil	3,8
DL-1,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-1 il-karbonil	87,7

A találmány szerinti vegyületek antikoaguláns aktivitását a standard teszt vizsgálati eljárásokkal határoztuk meg. Az alábbi II. táblázatban bemutatjuk a találmány szerinti reprezentatív vegyületekkel végzett tesztvizsgálatokban mért protrombinidő, trombinidő és aktivált részleges tromboplasztinidő (APTT) értékeket. A táblázatban bemutatott számértékek a tesztvizsgálati vegyületek koncentrációi (ng/ml) értékben, amelyek ahhoz szükségesek, hogy a három tesztvizsgáid latban a koagulációt kétszeres időre növeljék. A trombinidő értékelést plazmában végeztük és külön meghatároztuk egy pufferrendszerben, amelynek pH-értéke

7,5 volt.

¹ Az (I) általános képletben az A(C=O) csoport helyén található csoport. Hacsak másként nem jelezzük, a tesztvizsgálatban alkalmazott inhibitorok acctátsó formájúak.

II. táblázat

Trombin inhibitorok koagulációellenes aktivitása

Tesztvizsgálatban alkalmazott inhibitor’ A(C=O)	Plazmakoagulációs próba²	Puffer (pH=7,5)2
Protrombinidő	APTT³	Trombinidő	Trombinidő
D-fenil-glicil	91	1139	91	NA⁴
N-Boc-D-fenil-glicil⁵	667	1169	110	118
N-Boc-D-(4-metoxi-fenil)-glicil	NA	640	80	NA
N-Boc-D-(4-hidroxi-fenil)-glicil	1636	1091	182	NA
N-Boc-DL-l-naftil-glicil	1136	2272	320	112
N-Boc-D-l-naftil-glicil	1225	3100	230	105
N-Boc-D-2-naftil-glicil	1200	1200	230	142
N-acetil-D-(4-metoxi-fenil)-glici 1	900	2600	160	NA
N-Boc-D-(6-metoxi-2-naftil)-glicil	35 489	2239	460	466
N-Boc-D-ciklohexil-glicil	522	748	79	60
N-Boc-N-metil-D-fenil-glicil	300	4545	300	NA
N-metil-D-fenil-glicil	899	909	92	67
(R)-alfa-etil-fenil-acetil	700	2275	115	NA
(R)-alfa-metoxi-fenil-acetil	909	909	13.9	173

¹ Az (1) általános képletben az A(C=O) csoport helyén álló csoport.

² A tcsztvizsgálati vegyület koncentrációja (ng/ml), amely ahhoz szükséges, hogy a koagulációt kétszeres időre növelje.

³ APTT=aktivált részleges tromboplasztinidő.

⁴ NA=ncm áll rendelkezésre.

⁵ Az értékek nyolc kísérlet átlagértékei.

A II. táblázatban megadott adatokat CoaScreener berendezés alkalmazásával mértük, amely a Tecán, Inc. terméke. A próbaeljárást az alábbiakban ismertetjük. Protrombinidő: 50 μΐ plazma μΐ fiziológiás sóoldat 7 μΐ tesztvizsgálati oldat

50 μΐ tromboplasztin (Dade).

Trombinidő: 50 μΐ plazma μΐ fiziológiás sóoldat 7 μΐ tesztvizsgálati vegyület μΐ marhatrombin 60 (2 NIH egység/ml).

HU 217 441 Β

Abban az esetben, amely esetben a trombinidőt pH=7,4 pufferben határoztuk meg, plazma helyett fibrinogént alkalmaztunk.

APTT: 50 μΐ plazma μΐ Aktin (Dade) μΐ tesztvizsgálati oldat 50 μΐ kalcium-klorid (0,01 mól).

A találmány szerinti reprezentatív vegyületek trombózisellenes aktivitását in vivő tesztvizsgálatokban határoztuk meg patkányokon. A patkány nyaki artériájában artériás trombózist indukálunk és a tesztvizsgálati vegyületet alkalmazzuk, és azt méljük, hogy milyen infúziós dózis szükséges ahhoz a tesztvizsgálati vegyületből, hogy a véráramot 50 percig az elzáródás után fenntartsuk. A tesztvizsgálatot az alábbiak szerint hajtottuk végre.

Artériás trombózist indukálunk a patkányban a nyaki artéria sérülése révén. Vas(III)-klorid-oldatot alkalmaztunk helyileg a véredény sérülésének előidézéséhez. 375-440 g súlyú, hím Sprague-Dawley patkányokat érzéstelenítünk xilazin (20 mg/kg, s.c.) segítségével, majd ketamin HCl-t adagolunk (100 mg/kg, s.c.). Az állatokat egy víztakaróra fektetjük, amelyben 37 °C hőmérsékletű vizet cirkuláltatunk. A nyaki verőeret középvonal mentén végzett nyaki bemetszéssel közelítjük meg. Óvatos, tompa bemetszést alkalmazunk abból a célból, hogy a nyaki burokból a véredényt kiemeljük és izoláljuk. Selyem varratanyagot nyomunk az artéria alá, hogy a véredényt felemeljük, és így megfelelő üreget képezzünk arra a célra, hogy a termoelemet ez alá behelyezhessük. A véredény hőmérséklet-változásait egy sávrekorderen regisztráljuk, amely tintaírásos időbeállítóval rendelkezik. Kis csipeszeket alkalmazunk arra a célra, hogy a 3 mm átmérőjű Whatman no. 1 szűrőpapírt 35%-os FeCl₃-oldatba merítsük. A szűrőpapír korongokat azonos méretre vágjuk egy kiélesített acélcső segítségével, amelynek belső átmérője 3 mm, és amelyet egy présben alkalmazunk. Egy-egy telített korongot helyezünk minden egyes nyaki artériára a termőelem fölé. Az az idő, amely eltelik a vas-klorid alkalmazása és a hirtelen hőmérséklet-csökkenés között, az az idő, amely ahhoz szükséges, hogy a véredény elzáródása megtörténjen. Az egyes állatok esetében azt az átlagos időtartamot nevezzük TTO időnek, amely szükséges ahhoz, hogy mindkét edény elzáródjon.

A tesztvizsgálati vegyületeket izotóniás sóoldatban oldjuk. Egy injekcióstű szivattyút alkalmaztunk arra a célra, hogy a hatóanyagoldatot infúzióval adagoljuk, amely infúziót a vas-klorid adagolása előtt 15 perccel kezdünk és a vas-klorid adagolás után 60 percig folytatunk. Dózis-válasz függvényeket hoztunk létre úgy, hogy ábrázoltuk az infúzióval adagolt dózis log_i0 értékét és a sérült artériák TTO idejét. Összehasonlító indexet határoztunk meg az anyagok trombózisellenes aktivitására ezekből a görbékből úgy, hogy kiszámítottuk azt az infúziós dózist, ami ahhoz szükséges, hogy a véráramot 50 percig fenntartsa (ED₅₀ perc).

A véredény-elzáródás, illetve a hirtelen hőmérséklet-csökkenés együttesét szimultán rekorderen határoztuk meg úgy, hogy ez a kijelző jelezte a véredény hőmérsékletét és a véráramot is. Egy pulzáló Doppleráramlásmérőt helyezünk a nyaki artéria köré a termőelem közelében. A mérőelem az áramlás sebességének változását méri, ennélfogva ezt egy olyan helyre építjük be, ahol nem keletkezik trombózis és így az edény belső átmérője állandó marad amiatt, hogy folyékony vérrel kitöltött. Az alapvonal hőmérséklet- és áramlási sebességértéket rögzítjük a 35%-os vas(III)-klorid alkalmazása előtt (amelyet Directional Pulsed Doppler Flowmeter, Model 545-C, segítségével határozunk meg, University of Iowa Bioengineering). Az eredményeket a kezdeti alapértékek százalékaként adjuk meg (6 perc az elzáródás előtt). Az időpontot, amikor a véredény hőmérséklete gyorsan csökken, önkényesen állapítjuk meg 0-ként és az elzáródás előtt és utáni hőmérsékletet, valamint áramlási sebességértékeket ehhez a ponthoz viszonyítjuk.

Az alábbi III. táblázatban megadjuk a tesztvizsgálati vegyületekkel kapott értékeket a fenti kémiailag indukált trombózisteszt-vizsgálatban, patkányok esetében.

111. táblázat

Trombózisellenes aktivitás patkányokban artériás trombózis esetében

Tesztvizsgálati vegyület A(C=O)-(1)	ED'_O (mg/kg/óra)
N-Boc-D-fenil-glicil	2,9
N-Boc-D-ciklohexil-glicil	11,3
N-Boc-D-l-naftil-glicil	6,4
N-Boc-DL-l-naftil-glicil	5,5
N-Boc-D-2-naftil-glicil	NA²

¹ ED₅₀ az az infiiziós dózis, amely ahhoz szükséges, hogy a véráramlást 50 percen át fenntartsuk.

² Nem aktív 4 mg/kg/óra vagy 7 mg/kg/óra értéknél, amely a legmagasabb vizsgált dózis.

A találmány szerinti vegyületek inhibiálják a vérrögképződést anélkül, hogy megfigyelhetően kölcsönhatásba lépnének a test természetes vérrögbontó készségével, például a vegyületek igen kis inhibiáló hatást fejtenek ki a fibrinolizisre.

A találmány tárgya továbbá eljárás vérrögképződés inhibiálására emberben és állatokban, azzal jellemezve, hogy az embernek vagy állatnak vérrögképzést inhibiáló hatásos mennyiségű, de nem toxikus (1) általános képletű vegyület dózist adagolunk. A találmány szerinti antikoaguláns vegyületet orálisan, parenterálisan, például intravénás infúzióval (iv) intramuszkuláris injekcióval (im) vagy szubkután (se) adagolhatjuk. Előnyös adagolási mód az iv. infúzió.

A hatásos vérrögképződés-inhibiáló dózis körülbelül 5 mg és körülbelül 1000 mg közötti. A dózis alkalmazása változhat, például megelőző kezelés esetében egyszeres napi dózist alkalmazhatunk vagy többszöröst, mint például 3- vagy 5-ször adagolt napi dózist. Kritikus szituációkban a találmány szerinti vegyületeket iv. infúzió segítségével adagoljuk körülbelül 1 mg/kg/óra és körülbe7

HU 217 441 Β lül 50 mg/kg/óra, előnyösen körülbelül 2,5 mg/kg/óra és körülbelül 25 mg/kg/óra dózisban.

A találmány szerinti eljárást végezhetjük vérrögbontó szer adagolásával együtt is, például ez lehet szövet plazminogén aktivátor (tPA), módosított tPA, sztreptokináz vagy urokináz. Azokban az esetekben, amikor a vérrögképződés már megtörtént és egy artéria vagy egy véna elzáródott részben vagy teljesen, valamely vérrögbontó szert általában alkalmazunk. A találmány szerinti vegyületeket a vérrögbontó hatóanyaggal párhuzamosan adagolhatjuk vagy ennek alkalmazása után abból a célból, hogy a vérrögképződés újbóli előfordulását megelőzzük.

Az eljárásban előnyösen a találmány szerinti előnyös vegyületeket alkalmazzuk. Például előnyös ilyen vegyületek az alábbiak: előnyös peptidek az N-Boc-Dfenil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid és az N-metil-Dfenil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid, amelyek só formájúak, például szulfátok vagy hidrokloridok. Különösen előnyös vegyület, amelyet a találmány szerinti eljárásban alkalmazhatunk az N-(D-1,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-l-oil)-2-prolil-2-arginin-aldehid-szulfát.

A találmány tárgya továbbá eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, amelyet a fenti gyógyászati eljárásban alkalmazunk. A találmány szerinti gyógyszerészeti formált alakok az (1) általános képletű, találmány szerinti vegyület vérrögképződést inhibiáló hatásos mennyiségét, valamint gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagot tartalmaznak. Orális adagolás céljára a trombózisellenes vegyületet zselatinkapszula vagy tabletta formává alakíthatjuk, amely hordozóanyagokat, mint például kötőanyagokat, kenőanyagokat, dezintegrálószereket és hasonlókat tartalmazhat. Parenterális adagolás céljára a találmány szerinti trombózisellenes anyagot gyógyszerészetileg elfogadható hígítóanyaggal elegyítjük, amely lehet például fiziológiás sóoldat (0,9%), 5%-os dextróz, Ringer-féle oldat és hasonló hígítóanyag.

A találmány szerinti trombózisellenes vegyület egységdózis formált alakká alakítható, amely esetben a dózis körülbelül 1 mg és körülbelül 1000 mg közötti. A vegyület előnyösen gyógyszerészetileg elfogadható só formájú, amely lehet például szulfátsó, acetátsó vagy foszfátsó. Például egy egységdózis formált alak 5 mg N-Boc-Dfenil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid-szulfátsót tartalmazhat 10 ml-es steril üvegampullában. Más egységdózis forma körülbelül 10 mg N-metil-D-fenil-glicil-Lprolil-L-arginin-aldehid-szulfátot tartalmazhat 20 ml izotóniás sóoldatban, amely steril ampullába helyezett.

Előnyös egységdózis formált alak az, amely 5 mg és 50 mg közötti N-(D-1,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-loil)-L-prolil-L-arginin-aldehid-szulfátot tartalmaz steril ampullákban.

A találmány szerinti eljárást az alábbi példákon részletesen bemutatjuk.

A példákban megadott R_r-értékeket szilikagélen, vékonyréteg-kromatográfía segítségével határoztuk meg, amelyben Kieselgel 60F-254 (Merck, Darmstadt) adszorbenst alkalmaztunk és az alábbi oldószerrendszereket használtuk:

(A) kloroform-metanol-ecetsav, 135:15:1, tf:tf:tf (B) etil-acetát-ecetsav-száraz etanol, 90:10:10, tf: tf: tf (C) kloroform-metanol-ecetsav, 90:30:5, tf: tf: tf.

A MgSO₄ fölött végzett szárításnál vízmentes MgSO₄-t alkalmaztunk.

A példákban alkalmazott analitikai nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárások az alábbiak voltak (HPLC):

1. eljárás

Waters 600E, Vydac C₁₈ reverzfázisú oszlop, mérete 0,46 cmx 10 cm. A kromatogramot LDC berendezésen mértük 220 nm mellett, gradiens A=0,01 mól ammónium-acetát és B = acetonitril alkalmazásával.

2. eljárás

Pharmacia FPLC, PepRPC, 0,5 cmx5,0 cm. A kijelzést Pharmacia UV-M berendezésen 214 nm mellett végeztük gradiens vagy A=0,01 ammónium-acetát vagy B=acetonitril alkalmazással.

A példákban alkalmazott rövidítések jelentése az alábbi:

Aminosavak: Arg=arginin, Pro=prolin, Phg=fenil-glicin.

Boc=terc-butil-oxi-karbonil-csoport

Bzl=benzilcsoport

Cbz=benzil-oxi-karbonil-csoport

DCC = diciklohexil-karbodiimid

DMF=dimetil-formamid

DMSO=dimetil-szulfoxid

FAB-MS=gyors atombombázásos tömegspektrum

FD-MS=térdeszorpciós tömegspektrum

THF=tetrahidrofurán

VRK=vékonyréteg-kromatográfia.

1. példa

N-Boc-D-fenil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehidhemiszulfát (Boc-D-Phg-Pro-Arg-H)

1. Boc-D-Phg-Pro-OBzl

15,0 g (59,7 mmol) Boc-D-fenil-glicin és 14,43 g (59,7 mmol) prolin-benzil-észter-hidroklorid 60 ml dimetil-formamidban készült oldatát 0 °C hőmérsékletre hűtjük és 10,3 ml (59,7 mmol) N,N-diizopropil-etilamint, majd ezt követően 8,1 g (59,7 mmol) 1-hidroxibenzotriazol-hidrátot és 12,3 g (59,7 mmol) diciklohexil-karbodiimidet adunk hozzá. A reakcióelegyet 3 napon át szobahőmérsékleten keverjük, majd leszűrjük és a szűrletet vákuumban bepároljuk. Az olajos maradékot 200 ml etil-acetát és 100 ml víz elegyében oldjuk, majd a szerves fázist elválasztjuk, 3x1000,1 n sósavval, 1 χ 150 ml vízzel, 3 χ 100 ml 5%-os nátrium-hidrogénkarbonát-oldattal és végül ismét 150 ml vízzel mossuk. A mosott, szerves oldatot magnézium-szulfáton megszárítjuk és vákuumban bepároljuk. 24,8 g szilárd BocD-Phg-Pro-OBzl terméket kapunk (95% kitermelés): VRKR_f(A) 0,75;

FAB-MS-spektrum=439 (M+).

2. Boc-D-Phg-Pro-OH

24,5 g (55,7 mmol) fent leírt Boc-D-Phg-Pro-OBzl terméket 40 ml dimetil-formamid és 225 ml izopropanol elegyében oldjuk. Az oldathoz 1,0 g 5%-os aktív

HU 217 441 Β szénre felvitt palládiumkatalizátort adunk. A reakcióelegybe gázbevezető csövön keresztül nitrogéngázt buborékoltatunk, majd 16 órán át hidrogéngázt, és végül az elegyet 5 percen át nitrogéngázzal átöblítjük. Ezután a katalizátort szűrési segédanyagon leszűrjük és a szűrletet vákuumban szárazra pároljuk. A szilárd maradékot kis mennyiségű etil-acetátot tartalmazó dietil-éterből átkristályosítjuk. 10,35 g terméket kapunk, amely nem észterforma. Boc-D-Phg-Pro-OH (2), 53% kitermelés: VRKR_f(A) 0,32;

FAB-MS-spektrum=349 (MH+).

Ή-NMR-spektrum (DMSO-d₆), delta:

1,35 (s, 9H), 1,71-2,10 (m, 4H), 3,10 (m, 1H),

3,74 (m, 1H), 4,20 (m, 1H), 5,45 (d, 1H), 7,09 (d,

1H), 7,25-7,40 (m, 5H), 12,50 (sz, 1H).

3. Boc-L-Arg(CBz)-OH

82,1 g (250 mmol) N-Boc-arginin-hidrokloridot oldunk 240 ml 5 n nátrium-hidroxidban egy háromnyakú gömblombikban. Az oldatot -5 °C hőmérsékletre hűtjük és 143 ml (1,0 mól, 4 ekv.) benzil-klór-formiátot csepegtetünk hozzá 55 perc alatt, miközben az elegy pH-értékét 5 n nátrium-hidroxid segítségével (250 ml) 13,2-13,5 értéken tartjuk. A kapott reakcióelegyet 1 órán át -5 °C hőmérsékleten keverjük, majd 100 ml vízzel és 500 ml dietil-éterrel hígítjuk. A vizes fázist elválasztjuk és 2x40 ml dietil-éterrel extraháljuk. Ezután a vizes fázist 3 n kénsav (560 ml) segítségével 3,0 pH-értékre savanyítjuk, majd 550 ml etil-acetáttal extraháljuk. Az elválasztott vizes fázist egyszer etilacetáttal extraháljuk, majd az extraktumokat egyesítjük az előző etil-acetát extraktummal. Az egyesített extraktumot vízzel mossuk, majd magnézium-szulfáton megszárítjuk és vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot éterrel eldolgozzuk és a kivált csapadékot leszűrjük és megszárítjuk. 66,1 g (3) Boc-Arg(Cbz)-OH terméket kapunk (65% kitermelés) VRK R_f (C) 0,43; FD-MS-spektrum=408 (M⁺).

Ή-NMR-spektrum (CDC1₃), delta:

1,42 (s, 9H), 1,61-1,91 (m, 4H), 3,23-3,41 (m,

2H), 4,17 (d, 1H), 5,21 (s, 2H), 5,62 (d, 1H),

7,30-7,42 (m, 6H), 8,37 (m, 1H).

4. Boc-Arg(CBz)-laktám

66,0 g (0,162 mól) (3) Boc-Arg(Cbz)-OH fent előállított anyag 230 ml száraz tetrahidrofuránban készült oldatát jeges acetonos fürdőben -10 °C hőmérsékletre hűtjük. A hideg oldathoz 18,7 ml (1,05 ekv.) N-metil-morfolint, majd 22,5 ml (1,05 ekv.) izobutil-klór-formiátot adagolunk, és az elegyet 5 percen át -10 °C hőmérsékleten keveijük. Ezután a keverékhez 23,5 ml (1,05 ekv.) trietil-amint adagolunk, és az elegyet 1 órán át -10 °C hőmérsékleten, majd 1 órán át szobahőmérsékleten keveijük. A reakcióelegyet 1 liter jeges vízbe öntjük és a (4) terméket csapadékként leválasztjuk. A csapadékot leszűijük, hideg vízzel mossuk, vákuumban megszárítjuk és etil-acetátból kristályosítjuk. 38,05 g (60%-os kitermelés) (4) Boc-Arg(Cbz)-laktám terméket kapunk; VRK R_f(A) 0,77; FD-MS-spektrum=391 (MH⁺).

Ή-NMR-spektrum (CDC1₃), delta:

1,48 (s, 9H), 1,78-1,98 (m 2H), 2,50 (m, 1H),

3,41 (m, 1H), 4,43 (m, 1H), 4,90 (m, 1H), 4,16 (s,

2H), 5,27 (m, 1H), 7,28-7,45 (m, 6H), 9,41 (m,

1H), 9,68 (m, 1H).

5. Arg(Cbz)-laktám-trifluor-acetátsó

38,0 g (0,097 mól) (4) Boc-Arg(Cbz)-laktámot elegyítünk 200 ml trifluor-ecetsavval, amely 20 ml anizolt tartalmaz, majd az elegyet 1 órán át 0 °C hőmérsékleten keverjük. Ezután a reakcióelegyet melegítés nélkül vákuumban bepároljuk és a maradékhoz 400 ml dietilétert adunk. A kapott szilárd anyagot leszűrjük, dietiléterrel mossuk és vákuumban megszárítjuk. 40,5 g (5) trifluor-acetátsó terméket kapunk: VRK R_f (C) 0,29; FD-MS-spektrum=291 (MH⁺).

6. Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-laktám

14,5 g (41,6 mmol) 2) pontban előállított Boc-DPhg-Pro 80 ml dimetil-formamidban készült oldatát -15 °C hőmérsékletre hűtjük, majd az oldathoz 4,6 ml N-metil-morfolint és ezt követően 5,4 ml izobutil-klórformiátot adagolunk. A reakcióelegyet 2 percen át -15 °C hőmérsékleten keverjük.

Külön edényben 15,3 g (37,8 mmol) Arg(Cbz)laktám-trifluor-acetátsót (amelyet az 5) pontban állítunk elő) oldunk 30 ml dimetil-formamidban és az oldatot 0 °C hőmérsékletre hűtjük, majd 4,6 ml N-metil-morfolint adunk hozzá. Az elegyet 2 percen át 0 °C hőmérsékleten keveijük, majd a fent elkészített Boc-D-Phg-Pro oldathoz öntjük. A reakcióelegyet 4 órán át -15 °C hőmérsékleten keveijük, majd éjszakán át hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni. Az elegyhez 5 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldatot adunk, majd vákuumban bepároljuk. Az olajos maradékot 175 ml etil-acetát és 150 ml víz elegyében oldjuk. Az elegyet összerázzuk, a szerves fázist elválasztjuk, majd 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és ezután vízzel mossuk. A szerves fázist magnézium-szulfáton megszárítjuk és vákuumban szárazra pároljuk. 23,0 g amorf szilárd (6) Boc-D-PhgPro-Arg(Cbz)-laktámot kapunk (98% kitermelés). VRK R_f(A)0,72.

FAB-MS-spektrum: 621 (MH+).

7. Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-H

A fenti 6) pontban előállított (6) laktam 23,0 g mennyiségét (37 mmol) 200 ml száraz tetrahidrofüránban oldjuk, majd az oldatot nitrogénatmoszférában -15 °C hőmérsékletre hűtjük. A hideg oldathoz 10 percen át 37 ml (37 mmol) 1 mól koncentrációjú tetrahidrofurános lítium-alumínium-hidrid-oldatot csepegtetünk. A beadagolás befejezése után a reakcióelegyet 1 órán 0 °C hőmérsékleten keveijük. Az elegyhez ezután 10 percen át óvatosan 12 ml tetrahidrofurán és 12 ml 0,5 mól kénsavelegyet csepegtetünk. A reakcióelegyet 200 ml etil-acetáttal és 200 ml vízzel hígítjuk, majd összerázzuk és a szerves fázist elválasztjuk. A szerves fázist 3 χ 150 ml vízzel mossuk, majd magnézium-szulfáton megszárítjuk és vákuumban szárazra pároljuk. 19,2 g Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-H terméket kapunk (83% kitermelés).

FAB-MS-spektrum: 623 (MH+).

(alfa)_D=-66,l°, c=0,5 CHC1₃.

8. Boc-D-Phg-Pro-Arg-H-hemiszulfát

18,2 g (29,2 mmol) (7) Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-H anyagot oldunk 100 ml tetrahidrofurán és 100 ml víz

HU 217 441 Β elegyében, majd az oldathoz 29,2 ml 1 n kénsavat és 2 g 10%-os aktív szénre felvitt palládiumot adunk. A szuszpenzión gázbevezetőn keresztül 5 percen át nitrogéngázt buborékoltatunk keresztül, majd 4 órán át hidrogéngázt. Miután a reakció befejeződött, ismét 5 percig nitrogéngázt buborékoltatunk az elegybe, majd a reakcióelegyet szűrési segédanyagon leszűrjük és a katalizátort eltávolítjuk. A szűrletet vákuumban 100 ml térfogatra pároljuk, majd a vizes koncentrátumhoz 200 ml n-butanolt adunk és a szerves fázist a vizes fázistól elválasztjuk. A vizes fázist 3 χ 100 ml n-butanollal extraháljuk és az extraktumokat egyesítjük és az első szerves fázishoz adjuk. A szerves oldatot vákuumban szárazra pároljuk, majd a maradékot dietil-éter/diizopropil-éter 1:1 tf:tf eleggyel eldolgozzuk. A kapott szilárd anyagot leszűrjük és vákuumban megszárítjuk. 10,26 g (8) nyersterméket kapunk. A nyersterméket 10%-os acetonitril-víz elegyben oldjuk, majd az oldatot HP-20 gyantából készült 7,5 cmx53 cm oszlopra visszük, amelyet előzetesen 10% acetonitril-víz eleggyel egyensúlyba hoztunk. A terméket az oszlopról lépésenkénti elúcióval eluáljuk úgy, hogy az acetonitril koncentrációját a vízben növeljük (10%—12%— 15%). Számos frakciót gyűjtünk és a termék tartalmát reverzfázisú nagynyomású folyadékkromatográfia segítségével analizáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és szárazra pároljuk. 5,42 g tiszta terméket kapunk, amely Boc-D-Phg-ProArg-H-hemiszulfát (53% kitermelés).

[a]_D=-125,5° (8c=0,5, CHC1₃).

FAB-MS-spektrum: 489 (MH⁺).

RP-HPLC retenciós idő [2) eljárás 10-50% B 45 perc alatt]=32,3 perc.

2. példa

N-(terc-Butil-oxi-karbonil)-D-fenil-glicil-L-prolil-Larginin-aldehid-diacetátsó (Boc-D-Phg-Pro-Arg-H)

Az 1. példa 7) pontja szerint előállított 38,0 g (61 mmol) Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-H vegyületet 50 ml izopropanolban oldjuk, amely 7,1 ml (2 molekv.) ecetsavat tartalmaz. Az oldathoz 2,0 g 10%-os aktív szénre felvitt palládiumkatalizátort adunk. Az elegyet gázbevezető csövön keresztül 5 percen át nitrogéngázzal átöblítjük, majd 24 árán át hidrogéngázt vezetünk rajta keresztül. Miután a redukció befejeződött, ismét 5 percen át nitrogéngázt vezetünk át az elegyen, majd szűrési segédanyagon leszűijük, hogy a katalizátort eltávolítsuk.

A szűrletet szárazra pároljuk és így 33,6 g amorf szilárd nyersterméket kapunk. A terméket 5 g adagokban 5 cmx25 cm Vydac C₁₈ oszlopon tisztítjuk. A tripeptid terméket 8 órán át gradiens 10-30% acetonitril/0,0: mól ammónium-acetát eluenssel eluáljuk. Számos frakciót gyűjtünk és a terméket tartalmazó frakciókat reverz fázisú nagynyomású folyadékkromatográfia segítségével analizáljuk, ezeket egyesítjük és fagyasztva szárítjuk. A tisztítás után 11,7 g (35% kitermelés) cím szerint tripeptidet kapunk.

FAB-MS-spektrum: 489 (MH+).

Aminosavanalízis: Phg=l,07, Pro=0,94.

[a]_D= -108, 9° (c=0,5, CHC1₃).

Elemanalízis a C2₈H₄₄N₆C)₉ képlet alapján: számított: C: 55,25, H: 7,29, N: 13,81% mért: C: 55,52, H: 7,40, N: 13,93%.

Retenciós idő=31,9 perc; HPLC 2) eljárás; 10-50% B 45 perc alatt.

Az alábbi 3—4. példák szerinti vegyületeket az 1. példa szerinti eljárással állítjuk elő úgy, hogy a fenilglicin helyett naftil-glicint és p-hidroxi-fenil-glicint alkalmazunk.

3. példa

N-Boc-D-l-naftil-glicil-Pro-Ar-H-diacetát [a]_D= + 18,870, c=0,5, 50% ecetsav.

FAB-MS-spektrum: 539 (MH+).

HPLC 1. eljárás, gradiens: 20 - 60% B 60 perc alatt. Retenciós idő=42,0 perc.

4. példa

N-Boc-D-2-naftil-glicil-Pro-Arg-H-diacetát HPLC 2. eljárás, gradiens: 30-60% B 60 perc alatt. Retenciós idő: 18,0 perc.

Elemanalízis a C₃₂H₄₆N₆O₉ képlet alapján:

számított: C: 58,35, H: 7,04, N: 12,76%; mért: C:58,59, H: 6,83, N: 13,03%.

5. példa

N-Boc-D-(4-hidroxi-fenil-glicil)-Pro-Arg-H-diacetát HPLC 2. eljárás, gradiens 10-40% B 40 perc alatt. Retenciós idő: 26,5 perc.

Aminosavanalízis: 4-hidroxi-fenil-glicin = 0,99, prolink,01.

6-26. példák

Az alábbi IV. táblázatban bemutatott vegyületeket az

1. példa szerinti eljárással állítjuk elő úgy, hogy a jelzett aminosavat vagy szubsztituált ecetsavat [A(C=0)j helyettesítjük az 1. példában alkalmazott D-fenil-glicin helyett. Valamennyi, a IV. táblázatban megadott vegyület acetátsó formájú.

IV. táblázat

A(C=O)-Pro-Arg-H

A pclda száma	A(C=O)-	MS¹	HPLC-eljárás (gradiens)	Retenciós idő (perc)
6.	N-metil-D-fenil-glicil	403	1/10%-50%Β60 perc	44,2
7.	N-Boc-DL-l-naftil-glicil	539	l/5%-50% B 30 perc	27,9
8.	N-Boc-D-(6-metoxi)-2-naftil-glicil	569	2/10%-50%B45 perc	42,2
9.	R(+)-alfa-etil-fenil-acetil	402	l/5%-40% B 60 perc	22,1

HU 217 441 Β

IV. táblázat (folytatás)

A pclda száma	A(C=O)-	MS¹	HPLC-eljárás (gradiens)	Retenciós idő (perc)
10.	N-Boc-N-metil-D-fenil-glicil	503	2/5 g-50% B 40 perc	36,9
11.	R(+)-alfa-metoxi-fenil-acetil	404	2/10%-40%B40 perc	21,0
12.	D-fenil-glicil	388	2/10%-50% B 45 perc	13,6
13.	N-Boc-D-(4-metoxi-fenil)-glicil	519	2/10%-45% B 40 perc	34,0
14.	N-acetil-D-(4-metoxi-fenil)-glicil	461	2/10%-40% B 40 perc	19,0
15.	N-Boc-D-ciklohexil-glicil	495	2/10%-50%B45 perc	36,5
16.	N-Boc-DL-(3,4-diklór-fenil)-glicil	557	2/10%—70% B 60 perc	40,5
17.	R(+)-alfa-metil-fenil-acetil	388	2/10%-50% B 45 perc	21,9
18.	S(-)-alfa-metil-fenil-acetil	388	2/10%—50% B 45 perc	22,6
19.	N-Boc-D-2-tienil-glicil	495	l/10%-60% B 60 perc	23,8
20.	N-Boc-D-(4-fluor-fenil)-glicil	507	2/10%-50%B60 perc	38,4
21.	N-Boc-DL-(4-fluor-fenil)-glicil	507	2/10%-50%B60 perc	37,3
22.	N-Boc-D-( 1,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-1 -il)karbonil	515	l/20%-60% B 60 perc	49,0
23.	D-( 1,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-1 -il)karbonil	415	2/5%—50% B 60 perc	30,6
24.	D-( 1,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-3 -i 1) karbonil	415	2/5%-5O% B 60 perc	26,4
25.	D-(perhidro-izokinolin-1 -i 1 )-karbonil	421	2/5% 5O% B 60 perc	22,2 25,9
26.	N-Boc-DL-/3-(trifluor-metil)-fenil/-glicil	557	2/5%-5O% B 60 perc	51,5

¹ FAB-MS(MH⁺).

² HPLC-cljárás a fent leírt.

27. példa

D-(1,2,3,4-Tetrahidro-izokinolin-l-il-karbonil)-Lprolil-L-arginin-aldehid-szulfát

12,5 g (0,072 mól) izokinolin-l-karbonsav 185 ml jégecetben készült oldatához 2 g platina-oxidot adunk, majd a szuszpenziót szobahőmérsékleten 60 psi hidrogénnyomás alkalmazásával Parr hidrogénezőberendezésben 24 órán át hidrogénezzük. Ezután a reakcióelegyet Celite szűrési segédanyagon leszűrjük és a katalizátort eltávolítjuk. A szűrletet vákuumban szárazra pároljuk, majd a maradékot vízzel eldolgozzuk. A szilárd anyagot leszűrjük és szárítjuk, 8 g (63 s kitermelés) DL-1,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-l-karbonsavat kapunk. FD-MS-spektrum: 178 (MH+).

Ή-NMR-spektrum (DMSO-d₆), delta:

2,80-3,00 (m, 3H), 3,15 (m, 1H), 3,30-3,40 (m,

2H), 7,05 - 7,25 (m, 4H), 7,70 (m, 1H).

A fenti 7,08 g terméket (0,04 mól) 40 ml (0,08 mól) 2 n nátrium-hidroxid és 40 ml terc-butanol elegyében oldjuk, majd az oldathoz 10,5 g (0,048 mól) di-tercbutil-karbonátot adunk. Az elegyet 24 árán át szobahőmérsékleten keverjük, majd a reakcióelegyből a tercbutanolt elpárologtatjuk. A kapott vizes oldatot dietiléterrel extraháljuk, majd a vizes fázist elválasztjuk és 2 n sósavval 2,0 pH-értékre savanyítjuk. A savas vizes fázist etil-acetáttal extraháljuk, az extraktumot magnézium-szulfáton megszárítjuk, és vákuumban szárazra pároljuk. A kapott olajos maradékot dietil-éterben oldjuk és 7,9 ml (0,04 mól) diciklohexil-amint adunk az oldathoz. Az oldatot 4 órán át 4 °C hőmérsékleten állni hagyjuk, majd a N-Boc-DL-1,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-l-karbonsav-diciklohexil-aminsót leszűijük. A sót dietil-éterrel mossuk és vákuumban megszárítjuk. 15,7 g (86% kitermelés) tiszta sót kapunk. FD-MS-spektrum: 459 (MH+).

Elemanalízis a C₂₇H₄₂N₂O₄ képlet alapján: számított: C: 70,71, H: 9,23, N: 6,11%; mért: C: 71,07, H: 9,37, N: 5,87%.

73,4 g (160 mmol) Boc védett származékot oldunk 200 ml etil-acetátban és a szuszpenziót 1,5 n citromsavval és vízzel mossuk. Ezután az oldatot magnézium-szulfáton megszárítjuk és vákuumban szárazra pároljuk. A maradék olajos anyagot etil-acetátban oldjuk, az oldatot 0 °C hőmérsékletre hűtjük és 31,6 g (160 mmol) 2,4,5-triklór-fenolt, majd ezt követően 33 g (160 mmol) diciklohexil-karbodiimidet adunk az elegyhez. A reakcióelegyet 1 órán át 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd 1,5 órán át szobahőmérsékleten. Ezután az elegyet 0 °C hőmérsékletre hűtjük, a csapadékot leszűrjük és a szűrletet vákuumban szárazra pároljuk. A maradék olajos anyagot 100 ml piridinben oldjuk és az oldathoz 18,42 g (160 mmol) prolint, valamint 22,3 ml (160 mmol) trietil-amint adunk. A reakcióelegyet 24 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot etil-acetátban oldjuk, az oldathoz vizet adunk és pH-értékét 2 n nátrium-hidroxid-oldat adagolásával 9,5 értékre állítjuk be. A vizes fázist elválasztjuk, 2 n

HU 217 441 Β sósav segítségével 2,0 pH-értékre savanyítjuk, majd etil-acetáttal extraháljuk. Az extraktumot magnéziumszulfáton megszárítjuk, leszűrjük és vákuumban szárazra pároljuk. Az olajos maradékot diklór-metán és etil-acetát elegyében oldjuk. Az oldatot 4 órán át 4 °C hőmérsékleten állni hagyjuk, majd a kivált csapadékot leszűrjük, etil-acetáttal mossuk és diklór-metán/etilacetát oldószerelegyből átkristályosítjuk. A kapott Boc-D-(1,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-l-oil)-L-prolin (Boc-D-l-Tiq-Pro-OH) terméket vákuumban megszárítjuk, és így 19,6 g (33% kitermelés) tiszta terméket kapunk. VRK R_f(A) 0,44.

FAB-MS-spektrum: 375 (MH+).

Elemanalízis a C₂₀H₂₆N₂O₅ képlet alapján:

számított: C: 64,15, H: 7,00, N: 7,48% mért: C: 63,26, H: 6,98, N: 7,52%.

[a]_D= + 43,14°, c=0,5, metanol.

Egy első lombikban 17,8 g (47,5 mmol) Boc-D-1Tiq-Pro anyagot oldunk 100 ml dimetil-formamidban és az oldatot -15 °C hőmérsékletre hűtjük. A hideg oldathoz 5,3 ml (52,3 mmol) N-metil-morfolint, és 6,2 ml (47,5 mmol) izobutil-klór-formiátot adunk. Az elegyet 2 percen át -15 °C hőmérsékleten keverjük.

Egy második lombikban Cbz-védett arginin-laktámtrifluor-acetátsót /Arg(Z)-laktámxTFA/ oldunk (19,2 g, 47,5 mmol) 40 ml dimetil-formamidban. Az oldatot 0 °C hőmérsékletre hűtjük, majd 5,3 ml (52,3 mmol) N-metil-morfolint adunk hozzá. Az elegyet 2 percen át 0 °C hőmérsékleten keveijük, majd az első lombikban található elegyhez adjuk. A reakcióelegyet ezután 4 órán át -15 °C hőmérsékleten keverjük, majd lassan szobahőmérsékletre melegítjük éjszakán át, és ezután 5 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-oldatot adunk hozzá. A reakcióelegyet vákuumban bepároljuk, így olajos maradékot kapunk, amelyet 175 ml etil-acetát és 150 ml víz elegyében oldunk. A szerves fázist elválasztjuk 5%-os nátrium-hidrogénkarbonát-oldattal, vízzel, 0,1 n sósavoldattal, majd végül ismét vízzel mossuk és ezután magnézium-szulfáton megszárítjuk. A mosott és szárított oldatot vákuumban bepároljuk és így 24,3 g (79% kitermelés) terméket kapunk. Boc-D-l-Tiq-Por-Arg(Z)-laktám, amely amorf, szilárd anyag.

VRKR_f(A) 0,71.

FAB-MS-spektrum: 647 (MH+).

[a]_D=-32,8, c=0,5 kloroform.

23,4 g (36,2 mmol) fent kapott Arg(Z)-laktám terméket 300 ml száraz tetrahidrofuránban oldunk, és az oldatot nitrogénatmoszférába helyezzük. Ezután az oldatot -20 °C hőmérsékletre hűtjük, majd 37 ml (37 mmol) lítium-alumínium-hidrid 1 n tetrahidrofurános oldatot adunk hozzá cseppenként 30 perc alatt. A beadagolás befejezése után az elegyet 30 percen át -20 °C hőmérsékleten keverjük, majd 10 perc alatt 20 ml tetrahidroíuránt és 20 ml 0,5 n kénsavat csepegtetünk hozzá. Ezután az elegyet 400 ml etil-acetáttal és 400 ml vízzel hígítjuk. A szerves fázist elválasztjuk, 2 χ 150 ml vízzel mossuk és magnézium-szulfáton megszárítjuk. A mosott és szárított szerves fázist vákuumban bepároljuk és 21 g (89%-os kitermelés) terméket kapunk. Boc-D-l-Tiq-Pro-Arg(Z)-H, amorf, szilárd anyag.

VRKR_f(A) 0,28.

A fent nyert Arg(Z)-H terméket hidrogénezzük az alábbiak szerint és a Cbz védőcsoportot eltávolítjuk. 18,1 g (27,9 mmol) terméket 200 ml tetrahidrofuránban oldunk, majd az oldathoz 80 ml vizet és 28 ml 1 n kénsavat adunk, valamint 3,0 g 5%-os aktív szénre felvitt palládiumkatalizátort adagolunk. A szuszpenzión gázbevezetőn keresztül 5 percen át nitrogéngázt buborékoltatunk, majd 5 órán át hidrogéngázt, és végül ismét 5 percen át nitrogéngázt buborékoltatunk az oldatba. A katalizátort ezután leszűrjük és a szűrletet ezután 100 ml térfogatra bepároljuk. A koncentrátumot 200 ml 2 n butanollal hígítjuk és a rétegeket elválasztjuk. A vizes fázist 3x100 ml n-butanollal extraháljuk, majd az extraktumokat és a szerves fázist egyesítjük. A szerves fázist vákuumban bepároljuk és a reakcióterméket dietil-éter: diizopropil-éter 1:1 tf/tf eleggyel eldolgozzuk. A szilárd anyagot leszűrjük és vákuumban megszárítjuk. 11,08 g nyersterméket kapunk.

A terméket az alábbiak szerint tisztítjuk és szulfátsót nyerünk. A fent kapott nyersterméket 20 ml víz és 20 ml 10 n kénsav elegyében oldjuk. Az oldatot 25 percen át 50 °C hőmérsékletre melegítjük, majd szobahőmérsékletre hűtjük és pH-értékét Bio-Rad AG1X8 gyanta segítségével (hidroxid forma) 4,0 értékre állítjuk be. A gyantát az oldattól szűréssel elválasztjuk, majd az oldatot liofilizáljuk. 8,44 g nyerstermék szulfátsót kapunk, D-1-Tiq-Pro-Arg-H.H₂SO₄.

4,2 g szulfátsót 0,01% kénsavban oldunk, és az oldatot két 5x25 cm nagynyomású, reverz fázisú folyadékkromatográfiás oszlopra visszük (Vydac C₁₈ gyanta), amelyek sorba kötöttek. Gradiens növekvő acetonitril koncentrációjú (2-10%) eluenst alkalmazunk a só eluálására. Frakciókat gyűjtünk és az RP-HPLC analízis alapján terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük. Az egyesített frakció pH-értékét AG1-X8 gyanta alkalmazásával (Bio-Rad analitikai anioncserélő gyanta, 50-100 mesh) 4,0 értékre állítjuk be, ahol a gyanta hidroxid formájú. Az oldatot ezután leszűrjük és a gyantát eltávolítjuk, majd a szűrletet liofilizáljuk. 2,4 g (57% kitermelés) tisztított terméket kapunk.

FAB-MS-spektrum: 415 (MH+).

[a]_D=-76,12°, c=0,5/0,01 n kénsav.

Aminosavanalízis: Pro=0,92, Tiq=l,00.

Elemanalízis a C₂₁H₃₂N₆O₇S képlet alapján: számított: C: 49,21, H: 6,29, N: 16,29, S: 6,26% mért: C: 51,20, H: 6,17, N: 16,88, S: 5,37%

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás az (1) általános képletű vegyületek és gyógyszerészetileg elfogadható, nem toxikus sóik előállítására, ahol az általános képletben

A jelentése (4) általános képletű csoport, ahol

R jelentése (5) általános képletű fenilcsoport, ahol a és a’ jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, kis szénatomszámú alkoxicsoport, ha12

HU 217 441 Β logénatom, trifluor-metil-csoport, hidroxilcsoport; vagy

R jelentése tienilcsoport, adott esetben kis szénatomszámú alkoxicsoporttal helyettesített naftilcsoport, ciklohexilcsoport vagy ciklopentilcsoport;

R¹ jelentése hidrogénatom;

B jelentése kis szénatomszámú alkilcsoport, kis szénatomszámú alkoxicsoport, vagy -N(R₂)(R₃) általános képletű aminocsoport, ahol R₂ jelentése hidrogénatom és R₃ jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomszámú alkilcsoport, acetilcsoport vagy 1-6 szénatomos alkoxi-karbonil-csoport, vagy

A jelentése 1- vagy 3-perhidro-, tetrahidro-izokinolinvagy N-Boc-tetrahidro-izokinolin-csoport;

P jelentése hidrogénatom;

azzal jellemezve, hogy valamely olyan (1) általános képletű vegyületből, amelyben P jelentése amino-védőcsoport és A jelentése a tárgyi kör szerinti, a védőcsoportot eltávolítjuk, és kívánt esetben a kapott vegyületet gyógyszerészetileg elfogadható, nem toxikus sóvá alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan vegyületek előállítására, amelyekben A jelentése a (4) általános képletű csoport, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás olyan vegyületek előállítására, amelyekben B jelentése az -N(R₂)(R₃) általános képletű aminocsoport, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás az N-Boc-D-fenilglicil-L-prolil-L-arginin-aldehid és gyógyszerészetileg elfogadható, nem toxikus sói előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
5. A 3. igénypont szerinti eljárás az N-metil-D-fenil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid és gyógyszerészetileg elfogadható, nem toxikus sói előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás D-( 1,2,3,4-tetrahidro-izokinolin-1 -il-karbonil)-L-propil-L-arginin-aldehid-szulfát előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
7. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerint előállított (1) általános képletű vegyületet - ahol A és P jelentése az 1. igénypontban megadott - vagy gyógyszerészetileg elfogadható, nem toxikus sóit és egy vagy több gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyagot, hígítóanyagot vagy töltőanyagot összekeverünk és gyógyszerkészítménnyé feldolgozunk.