DE69133217T2

DE69133217T2 - Antithrombotische Tripeptid-Wirkstoffe

Info

Publication number: DE69133217T2
Application number: DE69133217T
Authority: DE
Inventors: Paul David Indianapolis Gesellchen; Robert Theodore Greenwood Shuman
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 1991-09-26
Publication date: 2004-02-05
Anticipated expiration: 2011-09-27
Also published as: IE913423A1; EP0837071A1; AU8478091A; DE69132884D1; JP3023019B2; NO309984B1; EP0684258A2; CS291391A3; EP0479489A2; NZ239907A; CZ285980B6; EP0684258A3; EP0479489B1; CN1060472A; NO913773D0; ATE211147T1; FI107733B; CA2052013C; BR9104181A; ATE234857T1

Description

Die Erfindung betrifft Thrombininhibitoren, die bei Menschen und Tieren brauchbare Antikoagulantien sind. Insbesondere betrifft sie Derivate des Dipeptids L-Prolin-L-Argininaldehyd mit einer starken antithrombotischen Wirkung.
Die Thrombinhemmung wird derzeit durch die Verabreichung von Heparinen und Kumarinen erreicht. Der Mechanismus durch den diese Mittel wirken, wurde ausgiebig untersucht. Heparine sind nur parenteral verabreichbar und die Spiegel müssen sorgfältig überwacht werden. Kumarine wirken durch Blockierung oder Hemmung der Bildung von Prothrombin und erfordern einige Zeit, um die maximale Wirksamkeit zu erreichen.
Obwohl sowohl die Heparine als auch die Kumarine wirksame Antikoagulantien sind, besteht ein Bedarf für Antithrombinmittel, die zur Verhinderung der Gerinnselbildung schnell wirken und die die Plasminwirkung bei der Auflösung von bestehenden Gerinnseln nicht beeinträchtigen.
Okamoto et al., BORC, 101, 440-446 (1981) beschreiben die Hemmung von Thrombin durch das Argininderivat 805, eine Tetrahydrochinolin enthaltende Verbindung.
Shuman et al., Peptides: Chemistry and Biology, Herausgeber Smith und Rivier, Proceedings of the American Peptide Symposium, June 16-21, 1991, 801-802 betrifft Tripeptidaldehyde, die eine Hemmung von Thrombin zeigen.
Die durch die Erfindung bereitgestellten Thrombin-hemmenden Verbindungen werden durch die folgende Formel I dargestellt
worin A für eine bicyclische Gruppe der Formel 2 steht
worin Q für einen Rest mit einem Kohlenstoff steht, der dargestellt wird durch -CH₂- und
oder einen Rest mit zwei Kohlenstoffen, der dargestellt wird durch -CH₂-CH₂- oder
Y für einen Rest mit einem Kohlenstoff steht, der dargestellt wird durch -CH₂- oder
mit der Maßgabe, daß wenn Q für
oder
steht, Y dann für -CH₂und wenn
Y für
steht, Q dann für -CH₂- oder -CH₂-CH₂- steht,
R₅ für Wasserstoff oder eine Oxycarbonylgruppe der Formel R₄-OC(O)- steht, worin R₄ für C₁-C₆ Alkyl, C₂-C₆ Alkenyl, C₃-C₇ Cycloalkyl, Benzyl, Nitrobenzyl, Diphenylmethyl oder eine Phenylgruppe der folgenden Formel steht
worin a und a' unabhängig für Wasserstoff Niederalkyl, Niederalkoxy, Halogen, Trifluormethyl, Hydroxy, Hydromethyl, Amino oder Aminomethyl stehen und
R₆ für Wasserstoff, Halogen, Hydroxy, Niederalkyl oder Niederalkoxy steht und der gestrichelte Ring innerhalb des sechsgliedrigen Rings anzeigt, daß der Ring ein aromatischer Ring ist und pharmazeutisch annehmbare, nicht-toxische Salze hiervon.
Die durch die Formel 1 dargestellten Peptide sind als antithrombotische Mittel brauchbar und können als Zusätze zu einer Therapie mit Gewebsplasminogenaktivator (tPA), Streptokinase und Urokinase verwendet werden.
Die Verbindungen werden durch herkömmliche Kupplungsverfahren hergestellt. Beispielsweise wird Boc-D-Phg mit einem Ester von L-Prolin unter Bildung eines Boc-D-Phg-Pro-Esters gekuppelt. Die Estergruppe wird entfernt und das Boc-D-Phg-Pro wird mit der Lactamform von L-Arginin unter Bildung von Boc-D-Phg-Pro-Arg-Lactam in aminogeschützer Form gekuppelt. Der Arg-Lactamring wird durch Reduktion geöffnet und die Argininaininoschutzgruppe wird unter Bildung des Boc-D-Phg-Pro-Arg-Aldehyds entfernt. Die Peptide werden in geeignete Salzformen umgewandelt, wie die Acetate und Sulfate.
Wie in Formel 1 gezeigt, ist das asymmetrische Zentrum des A(C=O) Rests R oder RS, während das von Prolin- und Argininaldehydresten L ist.
Die in Formel 1 verwendeten Ausdrücke werden hierin wie folgt definiert:
Niederalkyl bezieht sich auf geradkettige und verzweigtkettige C₁-C₄ Alkylgruppen, wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl und dergleichen.
Niederalkoxy bezieht sich auf C₁-C₄ Alkylgruppen, wie Methoxy, Ethoxy, n-Propoxy, Isopropoxy, n-Butoxy, t-Butoxy und dergleichen.
Halogen bezieht sich auf Fluor, Chlor, Brom oder Iod.
Mono- oder Di(niederalkyl)amino bezieht sich auf Gruppen, wie Methylamino, Ethylamino, Dimethylamino, Methylethylamino, Diethylamino, n-Butylamino, n-Propylamino und dergleichen.
Der Ausdruck "C₁-C₆ Alkyl" bezieht sich auf gerad- und verzweigtkettige Alkylgruppen, wie die oben definierten C₁-C₄ Alkylgruppen und zusätzlich n-Pentyl, Isopentyl, n-Hexyl, die isomeren Hexylgruppen und dergleichen. "C₂-C₆ Alkenyl" bezieht sich auf olefinische Gruppen, wie Vinyl, Allyl, Butenyl, isomerische Pentenylund Hexenylgruppen. "C₃-C₇ Cycloallcyl" bezieht sich auf die cyclischen Kohlenwasserstoffe mit 3 bis 7 Ringkohlenstoffatomen, wie Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl und Cycloheptyl.
Beispiele für Peptide, die durch die Formel 1 dargestellt werden, worin A für eine bicyclische Gruppe steht, die durch die vorangehende Formel 2 dagestellt wird, sind D-1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-1-ylcarbonyl und D-1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-3-ylcarbonyl, N-Arylderivate von Pro-Arg-H, wie sie im folgenden gezeigt sind
und die im folgenden gezeigten Dihydroisoindol-1-ylcarbonylderivate
Die Symbole R₆ und R₅ haben dieselben Bedeutungen, wie sie oben definiert wurden. R₅ steht vorzugsweise für Wasserstoff und R₆ steht vorzugsweise für Wasserstoff Methoxy, Ethoxy, Chlor oder Methyl.
Pharmazeutisch annehmbare Salze der erfindungsgemaßen Peptide umfassen die Säureadditionssalye, die mit anorganischen Säuren und Carbonsäuren gebildet werden. Beispiele für salzbildende anorganische Säuren sind die Halogenwasserstoffsäuren Chlorwasserstoff und Bromwasserstoffsäure und die Säuren Phosphorsäure und Schwefelsäure. Carbonsäuresalze werden mit Säuren gebildet, wie Essig-, Propion-, Malon-, Malein-, Citronen-, Bernstein-, Äpfel-, Benzoe-, Fumarsäure und ähnlichen Carbonsäuren. Die Säureadditionssalze werden auf herkömmliche Weise hergestellt, beispielsweise durch Neutralisierung der freien Basenform der Verbindung 1 mit der Säure. Bevorzugte Säureadditionssalze sind Sulfat- und Hydrochloridsalze.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfaßt Verbindungen der Formel 1, worin A für eine bicyclische Gruppe steht. Bevorzugte Verbindungen dieser Ausführungsform werden durch die Formel 1 dar gestellt, wenn A(C=O) für 1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-1-ylcarbonyl (Formel 2, Q = -CH₂-CH₂-, Y = -CH- und R₅ = R₆ = H) und 1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-3-ylcarbonyl steht (Formel 2, Q = -CH₂-CH- und Y = -CH₂-).
Die durch die Formel 1 dargestellten Verbindungen werden durch bekannte Verfahren der Peptidkupplung hergestellt. Gemäß einem solchen Verfahren wird die Säure A-COOH, worin A dieselbe Bedeutung hat, wie dies für Formel 1 definiert ist, mit einem carboxygeschützten Prolin unter Bildung des Dipeptids (wenn A für eine Aminosäure steht) oder einem N-Acylprolinester (wenn A nicht für eine Aminosäure steht) gekuppelt. Die carboxyschützende Estergruppe des Prolinrests im Produkt wird entfernt und die freie Säureform des Dipeptids wird mit der Lactamform des Arginins gekuppelt. Die obige Reaktionssequenz wird durch das folgende Schema erläutert.
worin P für eine Aminoschutzgruppe steht.
Das gekuppelte Arg(P) Lactamprodukt (c) wird mit Lithiumaluminiumhydrid in einem inerten Lösemittel reduziert, um den Lactamring zu spalten und das Tripeptid in der Argininaldehydform bereitzustellen, das durch die folgende Formel dargestellt wird A(C=O)-Pro-Arg(P)-H worin Arg(P)-H für den aminogeschützten Argininaldehyd steht.
Die Lactamform des Arginins erhält man durch intramolekulare Kupplung des aminogeschützten Arginins (Arg-OH). Beispielsweise wird Boc-Arg-(Cbz)OH, das durch die folgende Formel dargestellt wird
zuerst mit einem Chlorformiatester, beispielsweise Ethylchlorformiat bis Isobutylchlorformiat, in eine aktive Esterform umgewandelt, wie ein aktives gemischtes Anhydrid. Die Esterbildung wird in Gegenwart eines tertiären Amins ausgeführt, wie N-Methylmorpholin. Der Zusatz einer stärkeren tertiären Aminbase, wie Triethylamin bewirkt die interne Acylierung unter Bildung der Lactamform des diaminogeschΰtzten Arginins, wie dies im folgenden gezeigt ist.
Vor der Verwendung zur Kupplung mit A(C=O)-Pro-OH, wie dies im obigen Schema gezeigt ist, wird die Boc Schutzgruppe selektiv mit Trifluoressigsäure unter Bildung der erforderlichen freien Aminogruppe entfernt.
Die Kupplung einer ACOOH Verbindung mit einem Prolinester wird ausgeführt, indem man zuerst die Aminogruppe der Aminosäure schützt, wenn A für einen Aminosäurerest steht. Herkömmliche Aminoschutzgruppen, die gewöhnlich zum vorübergehenden Schutz oder Blockade der Aminogruppe verwendet werden, werden benutzt. Beispiele für solche Schutzgruppen sind unter anderem die Alkoxy-, Alkenyloxy-, Cycloalkoxy- und Arzloxycarbonylgruppen, wie Ethoxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl, Czclohexyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Trichlorethoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Diphenylmethoxycarbonyl und ähnliche Gruppen. Die zum Schutz der Carboxygruppe des Prolins während der Kupplungsreaktion verwendete Estergruppe kann eine der herkömmlich verwendeten leicht entfernbaren Estergruppen sein, wie t-Butyl-, Benzyl-, p-Nitrobenzyl-, p-Methoxybenzyl-, Diphenylmethyl-, Trichlorethyl-, Phenacyl- oder Trialkzsilyiester. Bei der Durchführung der Kupplungsreaktion verwendet man eine Estergruppe für Prolin, die durch Bedingungen entfernbar ist, unter denen die Aminoschutzgruppe intakt bleibt. Die Aminoschutzgruppe der acylierenden Säure ACOOH bleibt daher an ihrem Platz zum Schutz der Aminogruppe während dem anschließenden Kuppeln mit der Argininlactamverbindung unter Bildung von c.
Die Verbindungen der Formel I, worin A für eine Bicyclogruppe (2) steht, werden durch dieselben Kupplungsverfahren wie oben hergestellt. Beispielsweise erhält man das Peptid der Formel 1, worin A für die 1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-1-ylgruppe steht, durch die Acylierung eines Prolinesters, wie dem Benzylester, mit einem aktiven Derivat von 1,2,3,4-Tetrahydro-1-carboxyisochinolin. Aktive Derivate, die verwendet werden können, umfassen die Säurehalogenide, wie das Chlorid oder Bromid, das Säureazid, wie auch aktive Ester und Anhydride, wie die, die mit den oben beschriebenen Chlorformiaten gebildet werden. Der Ringstickstoff des Tetrahydroisochinolins (Formel 2, R₅ = H) wird während der acylierenden Kupplung geschützt oder alkyliert. Beispielsweise wird ein Ester von N-Boc-1,2,3,4-Tetrahydro-1-carboxyisochinolin, der mit Isobutylchlorformiat gebildet wird, bei der Acylierung des Prolinesters verwendet. Das Peptidprodukt N-Boc-1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-1-ylcarbonylprolinester wird einer Esterspaltung unterzogen, die freie Säure wird zu einem aktiven Ester umgewandelt und der letztere wird mit der Lactamform von Arginin gekuppelt. Das Lactamprodukt wird dann in die Aldehydform umgewandelt, wie dies oben beschrieben ist, um die Verbindung der Formel 1 bereitzustellen, nämlich Boc-1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-1-ylcarbonyl-Pro-Arg-H.
Die oben beschriebenen Kupplungsreaktionen werden im Kalten durchgeführt, vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen etwa -20°C und etwa 15°C. Die Kupplungsreaktionen werden in einem inerten organischen Lösemittel ausgeführt, wie Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetrahydrofuran, Methylenchlorid, Chloroform und ähnlichen herkömmlichen Lösemitteln. Im allgemeinen werden wasserfreie Bedingungen verwendet, wenn in der Kupplungsreaktion ein aktiver Ester der acylierenden Säure verwendet wird.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden am besten in Form der Säureadditionssalze isoliert. Salze der Verbindungen der Formel 1, wie die, die mit den oben erwähnten Säuren gebildet werden, sind als pharmazeutisch annehmbare Salze zur Verabreichung der antithrombotischen Mittel und zur Herstellung von Formulierungen dieser Mittel brauchbar. Es können andere Säureadditionssalze hergestellt und zur Isolierung und Reinigung der Peptide verwendet werden. Beispielsweise können so die Salze verwendet werden, die mit den Sulfonsäuren gebildet werden, wie Methansulfonsäure, n-Butansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure und Naphthalinsulfonsäure.
Das bevorzugte Verfahren zur Isolierung und Reinigung der durch die Formel 1 dargestellten Verbindungen unter gleichzeitiger Bildung der gewünschten stabilen Salzform ist das folgende. Stabile Salze von anorganischen Säuren, wie die Sulfat- und Hydrochloridsalze, werden durch die präparative Reinigung über eine C₁ ₈ Umkehrphasenchromatographie bereitgestellt. Die wäßrige Phase enthält Schwefelsäure oder Chlorwasserstoffsäure in einer Konzentration zwischen etwa 0,01 % und etwa 0,05 % und Acetonitril, THF, Methanol oder ein anderes geeignetes Lösemittel dient als organische Komponente. Der pH des sauren Eluenden wird zwischen etwa pH 4 und etwa pH 6 mit einem basischen Harz, beispielsweise Bio-Rad AG-1 × 8 Harz in der Hydroxylform eingestellt, wobei der exakte pH eine Funktion des einzelnen Peptids ist. Nach dem Einstellen des pH wird die Lösung des Tripeptidsalzes, beispielsweise Sulfat oder Hydrochlorid, unter Bildung des gereinigten Salzes in Form des trockenen Pulvers lyophilisiert. In einem Beispiel des Verfahrens wird das rohe D-Phg-L-Pro-L-Arg-H-Sulfat, das mit dem epimeren D-Arg-H-Sulfat kontaminiert ist, in etwa 0,01 % Schwefelsäure gelöst und die Lösung wird auf eine Vydac C₁₈ RP-HPLC Säule aufgetragen. Ein Gradient von 2-10 % Acetonitril in 0,01 % H₂SO₄ wird zur Elution der Säule über 10 Stunden verwendet. Es werden mehrere Fraktionen gesammelt und die, die das gewünschte Produkt enthalten, wie dies durch analytische RP-HPLC bestimmt wird, werden vereinigt. Der pH der vereinigten Fraktionen wird auf etwa pH 4,0 bis etwa 4,5 mit dem Bio-Rad AG-1 × 8 Harz im Hydroxylzyklus eingestellt. Nach dem Filtrieren wird die Lösung unter Bildung von reinem D-Phg-L-Pro-L-Arg-H-Sulfat lyophilisiert.
Die durch die Erfindung bereitgestellte Verbindung (Formel 1) hemmt selektiv die Wirkung von Thrombin bei Menschen und Tieren. Die Hemmung von Thrombin wird durch die in vitro Hemmung der Amidaseaktivität von Thrombin gezeigt. Die folgende Tabelle 1 listet die scheinbare Gleichgewichtskonstante (Kass) für die Wechselwirkung zwischen der Testverbindung (Inhibitor) und Thrombin auf. Die Daten in der Tabelle erhält man in einem Test, worin Thrombin das chromogene Substrat N-Benzoyl-D-Phenylalanyl-L-valyl-L-arginyl-p-nitroanilid hydrolysiert.
Der Test wird in 50 μl Puffer (0,03 M Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,4) mit 25 μl Thrombinlösung (0,21 mg/ml Thrombostatpulver in 0,06 M Tris, 0,3 M NaCl, pH 7,4) und 150 μl einer wäßrigen Lösung des chromogenen Substrats mit einer Konzentration von 0,25 mg/ml ausgefüht. Lösungen der Testverbindung (25 μl) werden mit verschiedenen Konzentrationen zugegeben. Die Hydrolyseraten des Substrats werden gemessen, indem man die Reaktionen bei 405 nm durch die Freisetzung des p-Nitroanilins verfolgt. Es werden Standardkurven durch die Auftragung der freien Thrombinkonzentration gegen die Hydrolyserate erstellt. Die mit den Testverbindungen beobachteten Hydrolyseraten werden dann in "freie Thrombinwerte" in den jeweiligen Tests durch die Verwendung der Standardkurven umgewandelt. Das gebundene Thrombin (an die Testverbindung gebunden) wird durch Subtraktion der Menge an freiem Thrombin, die in jedem Test beobachtet wird, von der bekannten Anfangsmenge an Thrombin, die in jedem Test beobachtet wird, errechnet. Die Menge an freiem Inhibitor in jedem Test wird durch Subtraktion Anzahl der Mole an gebundenem Thrombin von der Anzahl der Mole an zugegebenem Inhibitor (Testverbindung) errechnet.
Der Kass Wert ist die hypothetische Gleichgewichtskonstante für die Reaktion zwischen Thrombin und der Testverbindung (I).
Kass wird für einen Konzentrationsbereich der Testverbindungen errechnet und der Mittelwert wird in Einheiten pro Liter pro Mol angegeben. Tabelle 1 Hemmung der Thrombinamidaseaktivität

Testinhibitor A(C=O)- Thrombinamidase Kass × 10⁶ (1/mol)

N-Boc-DL-1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-1-ylcarbonyl 3,8

DL-1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-1-ylcarbonyl 87,7
Die antithrombotische Aktivität der repräsentativen Verbindungen der Erfindung wird bei in vivo Tests bestimmt, die in der Ratte ausgeführt werden. Der Test verwendet eine induzierte arterielle Thrombose in der Arteria carotis der Ratte und mißt die Infusionsdosis der Testverbindung, die zur Aufrechterhaltung des Blutflusses für 50 Minuten nach dem Zeitpunkt des Verschlusses erforderlich ist. Der Test wird folgendermaßen ausgeführt.
Die arterielle Thrombose wird in der Ratte durch die Verletzung der Arteria carotis induziert. Eine topische Verabreichung einer Eisen-(III)-chloridlösung wird zur Verletzung des Gefäßes verwendet. Männliche Sprague Dawley Ratten (375-450 g) werden mit Xylazin (20 mg/kg, s. c.) gefolgt von Ketamin HCl (100 mg/kg, s. c.) betäubt. Die Tiere werden auf eine Wasserdecke gelegt, worin das zirkulierende Wasser bei 37°C gehalten wird. Die Arteria carotis wird durch eine cervikale Mittellinieninzision zugänglich gemacht. Eine sorgfältige tiefe Sektion wird verwendet, um das Gefäß aus der Carotisscheide zu isolieren und zu exponieren. Ein Seidenfaden wird unter der Arterie durchgezogen, um das Gefäß anzuheben und darunter die Insertion eines Thermoelements zu ermöglichen. Die Veränderungen der Gefäßtemperatur werden auf einem Papierschreiber aufgezeichnet, der eine Zeitaufzeichnung mit Tinte aufweist. Es werden kleine Pinzetten verwendet, um Scheibchen (3 mm Durchmesser) aus Whatman Nr. 1 Filterpapier in eine FeCl₃ Lösung (35 %) zu tauchen. Die Scheibchen werden mittels eines geschärften Edelstahlrohrs auf eine gleiche Größe geschnitten (3 mm im Durchmesser), das in einer Drehbank eingespannt ist. Ein gesättigtes Scheibchen wird auf jede Arteria carotis über dein Thermoelement plaziert. Die Zeit zwischen der FeCl₃ Auftragung und der Zeit, bei der die Temperatur abrupt abfällt, wird als Zeit bis zum Verschluß (TTO) des Gefäßes aufgezeichnet. Die mittlere Zeit, die erforderlich ist, um beide Gefäße zu verschließen, wird verwendet, um die TTO für jedes Tier darzustellen.
Die Testverbindungen werden in isotonischer Kochsalzlösung gelöst. Es wird eine Spritzenpumpe verwendet, um Arzneimittellösungen 15 Minuten vor der FeCl₃ Verabreichung zu infundieren und dies wird für 60 Minuten nach der FeCl₃ Verabreichung fortgesetzt. Die Dosis-Antwort-Kurven werden aufgetragen, um die Beziehung zwischen dem logo der infundierten Dosen und der TTO der verletzten Arterien zu bestimmen. Es wird ein Vergleichsindex der antithrombotischen Aktivität aus den Kurven durch Berechnung der Infusionsdosis bestimmt, die zur Aufrechterhaltung des Blutflusses für 50 Minuten erforderlich ist (ED 50 Minuten).
Die Beziehung zwischen dein Gefäßverschluß und dem abrupten Temperaturabfall wird durch simultane Aufzeichnung der Temperatur und des Blutflusses auf dem selben Schreiber etabliert. Eine gepulste Dopplerflußsonde wird um die Arteria carotis proximal zum Thermoelement plaziert. Die Sonde zeichnet die Veränderungen der Fließgeschwindigkeit auf und sie wird daher an einem Punkt installiert, an dem keine Thrombose auftritt und der innere Durchmesser des Gefäßes aufgrund der Ausdehnung mit flüssigem Blut konstant bleibt. Die Basistemperatur und die Fließgeschwindigkeit (bestimmt mit einem Directional Pulsed Doppler Flowmeter, Modell 545-C, University of Iowa Bioengineering) werden vor der Anwendung von 35 % Eisen-(III)-chlorid aufgezeichnet. Die Ergebnisse werden als prozentuale Veränderung von den ursprünglichen Basiswerten angegeben (6 Minuten vor dem Verschluß). Die Zeit, bei der die Gefäßtemperatur schnell abfällt, wird willkürlich als Temperatur zum Zeitpunkt 0 und Temperatur vor und nach dem Verschluß festgesetzt und die Fließwerte werden auf diesen Zeitpunkt bezogen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen hemmen selektiv die Gerinnselbildung ohne wesentliche Beeinträchtigung der natürlichen gerinnselauflösenden Fähigkeit des Körpers, beispielsweise weisen die Verbindungen eine geringe liemmende Wirkung auf die Fibrinolyse auf.
Die Erfindung liefert in einem Aspekt ein Verfahren zur Hemmung der Bildung von Blutgerinnseln bei Menschen und Tieren, das gekennzeichnet ist durch die Verabreichung einer wirksamen gerinnselhemmenden nichttoxischen Dosis einer durch die Formel 1 dargestellten Verbindung an einen Menschen oder ein Tier. Die Antikoagulansverbindung wird oral, parenteral, beispielsweise durch intravenöse Infusion (iv), intramuskuläre Injektion (im) oder subkutan (sc) verabreicht. Vorzugsweise wird die Verabreichung durch i. v. Infusion ausgeführt.
Eine wirksame gerinnselhemmende Dosis liegt zwischen etwa 5 mg und etwa 1000 mg. Der Dosierungsplan kann variieren, beispielsweise für die prophylaktische Verwendung kann eine einzelne Tagesdosis verabreicht werden oder es können mehrere Dosierungen geeignet sein, wie drei- oder fünfmal täglich. In kritischen Behandlungssituationen wird eine erfindungsgemäße Verbindung durch iv Infusion mit einer Geschwindigkeit zwischen etwa 1 mg/kg/h und etwa 50 mg/kg/h und vorzugsweise zwischen etwa 2,5 mg/kg/h und etwa 25 mg/kg/h verabreicht.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird auch zusammen mit einem gerinnselauflösenden Mittel, beispielsweise Gewebsplasminogenaktivator (tPA), modifiziertem tPA, Streptokinase oder Urokinase durchgeführt. In Fällen, bei denen eine Gerinnselbildung aufgetreten ist und eine Arterie oder Vene entweder teilweise oder völlig blokkiert ist, wird gewöhnlich ein gerinnselauflösendes Mittel verwendet. Eine erfindungsgemäße Verbindung kann zusammen mit dem Lysemittel oder anschließend an dessen Verwendung verabreicht werden, um das Wiederauftreten der Gerinnselbildung zu vermeiden.
Bei der Durchführung des Verfahrens ist die Verwendung einer bevorzugten Verbindung der Erfindung erwünscht. Eine besonders bevorzugte erfindungsgemäße Verbindung zur Verwendung im Verfahren ist N-(D-1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-1-oyl)-2-prolyl-2-argininaldehydsulfat.
Die Erfindung liefert auch pharmazeutische Formulierungen zur Verwendung im oben beschriebenen therapeutischen Verfahren. Erndungsgemäße pharmazeutische Formulierungen enthalten eine wirksame gerinnselhemmende Menge einer durch die Formel 1 dargestellten Verbindung und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Zur oralen Verabreichung wird die antithrombotische Verbindung in Gelatinekapseln oder Tabletten formuliert, die Hilfsstoffe enthalten können, wie Bindemittel, Gleitmittel, Zerfallshilfsmittel und dergleichen. Zur parenteralen Verabreichung wird das Antithrombotikum in einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel formuliert, beispielsweise physiologische Kochsalzlösung (0,9 %), 5 % Glucose, Ringerlösung und dergleichen.
Die erfindungsgemäße antithrombotische Verbindung kann in Einheitsdosierungsformulierungen formuliert werden, die eine Dosis zwischen etwa 1 mg und etwa 1000 mg enthalten. Vorzugsweise liegt die Verbindung in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes vor, wie beispielsweise dein Sulfatsalz, Acetatsalz oder Phosphatsalz.
Eine bevorzugte Formulierung ist eine Einheitsdosierungsform, die zwischen 5 mg und 50 mg N-(D-1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-1-oyl)-L-prolyl-L-argininsulfat in sterilen Ampullen enthält.
Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Beschreibung der Erfindung und sollen keine Beschränkungen darstellen.
Die R_f Werte in den folgenden Beispielen wurden mittels Silicageldünnschichtchromatographie mittels Kieselgel 60F-254 (Merck, Darmstadt) in den folgenden Lösemittelsystemen bestimmt:

(A) Chloroform – Methanol – Essigsäure, 135:15:1, V: V: V
(B) Ethylacetat – Essigsäure – absolutes Ethanol 90:10:10, V: V: V
(C) Chloroform – Methanol – Essigsäure 90:30:5, V: V: V

Die analytischen HPLC Verfahren, die in den Beispielen verwendet werden, sind folgende:
Verfahren 1: Waters 600E unter Verwendung einer Vydac C₁₈ Umkehrphasensäule mit 0,46 cm × 10 cm. Das Chromatogramm wird auf einem LDC bei 220 nm mittels eines Gradienten von A = 0,01 M Ammoniumacetat und B = Acetonitril verfolgt.
Verfahren 2: Pharmacia FPLC mittels einer PepRPC mit einer Größe von 0,5 × 5,0 cm. Die Verfolgung wird mit einem Pharmacia UV-M bei 214 mm mittels eines Gradienten aus entweder A = 0,01 M Ammoniumacetat oder B = Acetonitril ausgeführt.
Die in den Beispielen verwendeten Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen:
Aminosäuren: Arg = Arginin, Pro = Prolin, Phg = Phenylglycin
Boc = t-Butyloxycarbonyl
Bzl= Benzyl
Cbz = Benzyloxycarbonyl
DCC = Dicyclohexcylcarbodiimid
DMF = Dimethylformamid
DMSO = Dimethylsulfoxid
FAB-MS = Massenspektrum mittels schnellem Atombeschuß
FD-MS = Felddesorptionsmassenspektrum
THF = Tetrahydrofuran
DC = Dünnschichtchromatographie
Präparation 1
N-Boc-D-Phenylglycyl-L-Prolyl-L-Argininaldehyd (Boc-D-PFig-Pro-Arg-H) Hemisulfat
1) Boc-D-Phg-Pro-OBzl
Eine Lösung aus Boc-D-Phenylglycin (15,0 g, 59,7 mmol) und Prolinbenzylesterhydrochlorid (14,43 g, 59,7 mmol) in 60 ml DMF wird auf 0°C abgekühlt und N,N-Diisopropylethylamin (10,3 ml, 59,7 mmol) wird gefolgt von 1-Hydroxybenzotriazolhydrat (8,1 g, 59,7 mmol) und DCC (12,3 g, 59,7 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird für 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt, wonach es filtriert wird und das Filtrat wird unter Vakuum zu einem Öl eingedampft. Das Öl wird in 200 ml Ethylacetat und 150 ml Wasser gelöst und nach dem Ausschütteln wird die organische Phase abgetrennt, dreimal mit 100 ml Portionen an 0,1 N HCl, einmal mit 150 ml Wasser, dreimal mit 100 ml Portionen an 5 % Natriumbicarbonat und erneut mit 150 ml Wasser gewaschen. Die gewaschene organische Lösung wird über MgSO₄ getrocknet und dann unter Vakuum unter Bildung von 24,8 g Boc-D-Phg-Pro-OBzl als Feststoff eingedampft (95 % der Theorie): DC Rf (A) 0,75, FAB-MS 439 (M⁺).
2) Boc-D-Phg-Pro-OH
Das Boc-D-Phg-Pro-OBzl Produkt, das wie oben beschrieben erhalten wurde (24,5 g, 55,7 mmol) wird in 40 ml DMF und 225 ml Isopropylalkohol gelöst und 1,0 g 5 % Pd auf Kohle Katalysator werden zur Lösung gegeben. Es wird Stickstoff über ein Gasdispersionsrohr in das Reaktionsgemisch geblasen und dann wird Wasserstoff für 16 Stunden durchgeblasen, wonach eine Stickstoffspülung für 5 Minuten erfolgt. Der Katalysator wird durch ein Hyflofilterkissen filtriert und das Filtrat wird unter Bildung eines festen Rückstands im Vakuum bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Diethylether kristallisiert, der eine kleine Menge an Ethylacetat enthält. Man erhält 10,35 g des Produkts nach der Esterspaltung. Boc-D-Phg-Pro (2), 53 % Ausbeute: DC Rf (A) 0,32, FAB-MS 349 (MH⁺)
¹H NMR (DMSO-d₆) δ: 1,35 (s, 9H), 1,71-2,10 (m, 4H), 3,10 (m, 1H), 3,74 (m, 1H), 4,20 (m, 1H), 5,45 (d, 1H), 7,09 (d, 1H), 7,25-7,40 (m, 5H), 12,50 (bs, 1H).
3) Boc-L-Arg(Cbz)-OH
N-Boc-Argininhydrochlorid (Boc-Arg-OH × HCl) (82,1 g, 250 mmol) wird in 240 ml 5 N NaOH in einem Dreihalsrundbodenkolben gelöst. Die Lösung wird auf -5°C abgekühlt und Benzylchlorformiat (143 ml, 1,0 mol, 4 Äquivalente) wird tropfenweise über 55 Minuten zugegeben, während der pH des Gemisches mit 5 N NaOH (250 ml) auf 13,2-13,5 gehalten wird. Das Reaktionsgemisch wird für eine Stunde bei -5°C gerührt, nachdem die Zugabe des Chlorfomiats abgeschlossen ist. Das Reaktionsgemisch wird mit 100 ml Wasser und 500 ml Diethylether verdünnt und die wäßrige Phase wird abgetrennt und zweimal mit 40 ml Portionen Diethylether extrahiert. Die wäßrige Phase wird auf pH 3,0 mit 3 N H₂SO₄ (560 ml) angesäuert und mit 550 ml Ethylacetat extrahiert. Die abgetrennte wäßrige Phase wird einmal mit Ethylacetat extrahiert und der Extrakt wird mit dem vorherigen Ethylacetatextrakt vereinigt. Die vereinigten Extrakte werden mit Wasser gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Ether behandelt und das gefällte Produkt wird filtriert und getrocknet. Man erhält 66,1 g von (3) Boc-Arg(Cbz)-OH (65 % der Theorie): DC R_f (C) 0,43, FD-MS 408 (M⁺).
¹H NMR (CDCl₃), δ 1,42 (s, 9H), 1,61-1,91 (m, 4H), 3,23-3,41 (m, 2H), 4,17 (d, 1H), 5,21 (s, 2H), 5,62 (d, 1H), 7,30-7,42 (m, 6H), 8,37 (m, 1H).
4) Boc-Arg(Cbz)-Lactam
Eine Lösung von Boc-Arg(Cbz)-OH (3), das wie oben beschrieben hergestellt wurde, (66,0 g, 0,162 mol) in 230 ml trockenem THF wird in einem Eis-Acetonbad auf -10°C abgekühlt. Zu der kalten Lösung werden N-Methylmorpholin (18,7 ml, 1,05 Äquivalente) gefolgt von Isobutylchlorformiat (22,5 ml, 1,05 Äquivalente) gegeben und das Gemisch wird für 5 Minuten bei -10°C gerührt. Als nächstes wird Triethylamin (23,5 ml, 1,05 Äquivalente) zugegeben und das Gemisch wird für 1 h bei -10°C und für 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in einen Liter Eis-Wasser-Gemisch gegossen und das Produkt (4) wird ausgefällt. Das Präzipitat wird filtriert, mit kaltem Wasser gewaschen, unter Vakuum getrocknet und aus Ethylacetat kristallisiert. Man erhält 38,05 g (60 % der Theorie) des Produkts (4), Boc-Arg(Cbz)-Lactam: DC Rf (A) 0,77, FD-MS 391 (MH⁺).
¹H NMR (CDCl₃), δ 1,48 (s, 9H), 1,78-1,98 (m, 2H), 2,50 (m, 1H), 3,41 (m, 1H), 4,43 (m, 1H), 4,90 (m, 1H), 4,16 (s, 2H), 5,27 (m, 1H), 7,28-7,45 (m, 6H), 9,41 (m, 1H), 9,68 (m, 1H).
5) Arg(Cbz)-Lactamtrifluoracetatsalz
Das Boc-Arg(Cbz)-Lactam (4) (38,0 g, 0,097 mol) wird mit 200 ml Trifluoressigsäure gemischt, worin 20 ml Anisol enthalten sind, und das Gemisch wird bei 0°C für 1 Stunde gerührt. Das Reaktionsgemisch wird unter Vakuum ohne Erhitzen konzentriert und man gibt 400 ml Diethylether zum Rückstand. Der entstehende Feststoff wird filtriert, mit Dietylether gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält 40,5 g des Trifluoracetatsalzes des Produkts (5): DC Rf (C) 0,29, FD-MS 291 (MH⁺)
6) Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-Lactam
Zu einer Lösung aus Boc-D-Phg-Pro (14,5 g, 41,6 mmol), das wie oben in Teil 2 beschrieben hergestellt wurde, in 80 ml auf -15°C gekühltem DMF werden 4,6 ml N-Methylmorpholin gefolgt von 5,4 ml Isobutylchlorformiat gegeben und das Reaktionsgensch wird bei -15°C für 2 Minuten gerührt.
In einem getrennten Kolben wird TFA × Arg (Cbz)-Lactam (15,3 g, 37,8 mmol, wie oben in Teil 5 hergestellt) in 30 ml DMF gelöst, die Lösung wird auf 0°C abgeküht und 4,6 ml N-Methylmorpholin werden zugegeben.
Nachdem die Lösung für 2 Minuten bei 0°C gerührt wurde, wird sie in die wie oben beschrieben liergestellte Lösung aus Boc-D-Phg-Pro gegossen. Das erhaltene Gemisch wird für 4 h bei -15°C gerührt und kann sich dann über Nacht auf Raumtemperatur erwärmen. Eine 5 % Lösung aus NaHCO₃ (5 ml) wird dann zum Reaktionsgemisch gegeben, das dann unter Vakuum unter Bildung eines Öls eingedampft wird. Das Öl wird in 175 ml Ethylacetat gelöst und 150 ml Wasser werden zugegeben. Nach dem Ausschütteln wird die organische Phase abgetrennt, mit 5 % NaHCO₃ und Wasser gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum unter Bildung von 23,0 g Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-Lactam (6) als amorpher Feststoff getrocknet (98 % Ausbeute). DC Rf (A) 0,72. FAB-MS 621 (MH⁺).
7) Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-H
Das Lactam (6) (23,0 g, 37 mmol), das wie oben in Teil 6 beschrieben erhalten wurde, wird in 200 ml trokkenem THF gelöst und die Lösung wird unter einer Stickstoffatmosphäre auf -15°C abgekühlt. Zur kalten Lösung wird über 10 Minuten eine 1 M Lösung aus Lithiumaluininiumhydrid in THF (37 ml, 37 mmol) gegeben und nachdem die Zugabe vollständig ist, wird das Reaktionsgemisch auf 0°C erwärmt und für 1 h gerührt. Eine Lösung aus 12 ml THF und 12 ml 0,5 N H₂SO₄ wird langsam tropfenweise über 10 Minuten zum Gemisch gegeben. Das Reaktionsgemisch wird mit 200 ml Ethylacetat und 200 ml Wasser verdünnt und nach dein Ausschütteln wird die organische Phase abgetrennt. Die organische Phase wird dreimal mit 150 ml Portionen Wasser gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum unter Bildung von 19,2 g (83 % Ausbeute) an Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-H eingedampft. FAB-MS 623 (MH⁺). [α]_D = -66,1°, c = 0,5, CHCl₃.
8) Boc-D-Phg-Pro-Arg-H-Hemisulfat
Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-H (7) (18,2 g; 29,2 mmol) wird in 100 ml THF und 100 ml Wasser gelöst und 29,2 ml 1 N H₂SO₄ und 2 g 10 % Pd/C werden zur Lösung gegeben. Es wird Stickstoff für 5 Minuten über ein Gasdispersionsrohr gefolgt von Wasserstoff für 4 h durch die Suspension geblasen. Nachdem die Reduktion vollständig ist wird erneut Stickstoff für 5 Minuten durchgeblasen. Das Reaktionsgemisch wird durch ein Hyflo-Kissen zur Entfernung des Katalysators filtriert und das Filtrat wird durch eine Verdampfung unter Vakuum auf ein Volumen von 100 ml konzentriert. Zum wäßrigen Konzentrat werden 200 ml n-Butanol gegeben und die organische Phase wird von der wäßrigen Phase abgetrennt. Die wäßrige Phase wird dreimal mit 100 ml Portionen an n-Butano1 extrahiert und die Extrakte werden vereinigt und zur organischen Phase gegeben. Die organische Phase wird unter Vakuum bis zur Trockne eingedampft, der Rückstand wird mit Diethylether/Diisopropylether 1:1 V: V behandelt und der Feststoff wird abfiltriert und unter Vakuum unter Bildung von 10,26 g des Rohprodukts (8) getrocknet. Das Rohmaterial wird in 10 % Acetonitril – Wasser gelöst und die Lösung wird auf eine 7,5 cm x 53 cm Säule aus HP-20 Harz aufgetragen, die vorher in 10 % Acetontril – Wasser äquilibriert wurde. Das Produkt wird durch die schrittweise Elution mit steigenden Konzentrationen an Acetonitril in Wasser (10 % auf 12 % auf 15 %) von der Säule eluiert. Es werden mehrere Fraktionen gesammelt und durch Umkehrphasen-HPLC auf das Produkt getestet. Fraktionen, die das Produkt enthalten, werden vereinigt und unter Bildung von 5,42 g des reinen Produkts Boc-D-Phg-Pro-Arg-H-Hemisulfat zur Trockne eingedampft (Ausbeute 53 %): [α]_D = -125,6°, c = 0,5 CHCl₃, FAB-MS 489 (MH⁺), Retentionszeit auf RP-HPLC (Verfahren 2, 10-50 % B über 45 Minuten, Zeit = 32,3 Minuten).
Beispiele 1-3
Die in der folgenden Tabelle 4 aufgeführten Beispiele 1 bis 3 werden durch die in Präparation 1 beschriebenen Kupplungsverfahren hergestellt, wenn die angegebene Aminosäure oder substuierte Essigsäure [A(C=O)] anstelle des in Beispiel 1 verwendeten D-Phenylglycins verwendet wird. Alle Verbindungen in Tabelle 4 sind Acetatsalzformen. Tabelle 4 A(C=O)-Pro-Arg-H
Beispiel 4
DL-1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-1-oyl-L-prolyl-L-argininaldehydsulfat
Zu einer Lösung aus Isochinolin-1-carbonsäure (12,5 g, 0,072 mol) in 185 ml Eisessig werden 2 g Platinoxid gegeben und die Suspension wird bei Raumtemperatw für 24 Stunden unter einem Wasserstoffdruck von 60 psi in einem Parr Hydriergerät hydriert. Das Reaktionsgemisch wird durch ein Filterkissen (Celite) filtriert, um den Katalysator zu entfernen, und das Filtrat wird im Vakuum zur Tockne eingedampft. Der feste Rückstand wird mit Wasser behandelt, filtriert und unter Bildung von 8 g (63 % Ausbeute) an DL-1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-lcarbonsäwe getrocknet. FD-Massenspektrum 178 (MH⁺),¹H NMR (DMSO-d₆) δ 2,80-3,00 (m, 3H), 3,15 (m, 1), 3,30-3,40 (m, 2H), 7,05-7,25 (m, 4H), 7,70 (m, 1H).
Das Produkt (7,08 g, 0,040 mmol) wird in 2 N Natriumhydroxid (40 ml, 0,080 mol) und 40 ml t-Butylalkohol gelöst und 10,5 g (0,048 mol) Di-tert-butyldicarbonat werden zu Lösung gegeben. Nach dem Rühren für etwa 24 h bei Raumtemperatur wird der größe Teil des t-Butylalkohols aus dein Reaktionsgemisch verdampft. Die entstehende wäßrige Phase wird einmal mit Diethylether extrahiert, die wäßrige Phase wird abgetrennt und mit 2 N HCl auf pH 2,0 angesäuert. Die wäßrige Phase wird mit Ethylacetat extrahiert, der Extrakt wird über MgSO₄ getrocknet und im Vakuum zu Trockne eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird in Diethylether gelöst und 7,9 ml (0,04 mol) Dicyclohexylamin werden zur Lösung gegeben. Nach dem Stehen für 4 Stunden bei 4°C wird der Niederschlag des Dicyclohexylaminsalzes von N-Boc-DL-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-1-carbonsäure filtriert, mit Diethylether gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Man erhält 15,7 g (86 % Ausbeute) des reinen Salzes.
FD-MS 459 (MH⁺)
Elementaranalyse berechnet für C₂₇H₄₂N₂O₄;
Theorie: C 70,71, H 9,23, N 6,11
Gefunden: C 71,07, H 9,37, N 5,87
Das Boc-geschützte Derivat (73,4 g, 160 mmol) wird in 200 ml Ethylacetat suspendiert und die Suspension wird mit 1,5 N Citronensäure und Wasser gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird in Ethylacetat gelöst, die Lösung wird auf 0°C gekühlt und 2,4,5-Trichlorphenol (31,6 g, 160 mmol) wird gefolgt von DCC (33 g, 160 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird für 1 Stunde bei 0°C und bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wird auf 0°C abgekühlt, das Präzipitat wird filtriert und das Filtrat wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird in 100 ml Pyridin gelöst und Prolin (18,42 g, 160 mmol) und Triethylamin (22,3 ml, 160 mmol) werden zur Lösung gegeben. Das Reaktionsgemisch wird für 24 h bei Raumtemperatur gerührt und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Ethylacetat gelöst, Wasser wird zugegeben und der pH wird mit 2 N Natriumhydroxid auf 9,5 eingestellt. Die wäßrige Phase wird abgetrennt, mit 2 N HCl auf pH 2,0 angesäuert und mit Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wird über MgSO₄ getrocknet, filtriert und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird in Methylenchlorid und Ethylacetat gelöst. Nach dein Stehen bei 4°C für 4 Stunden bildet sich ein Niederschlag in der Lösung, dieser wird abfiltriert, mit Ethylacetat gewaschen und aus Methylenchlorid / Ethylacetat umkristallisiert. Das feste Produkt Boc-D-1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-1-oyl-L-Prolin (Boc-D-I-Tiq-Pro-OH) wird unter Vakuum unter Bildung von 19,6 g und 33 % Ausbeute des reinen Produkts getrocknet, DC Rf (A) 0,44, FAB-MS 375 (MH⁺).
Elementaranalyse berechnet für C₂₀H₂₆N₂O₅
Theorie: C 64,15, H 7,00, N 7,48
Gefunden: C 63,26, H 6,98, N 7,52
[α]_D = +43,14°, C = 0,5, Methanol
In einem ersten Kolben wird Boc-D-I-Tiq-Pro (17,8 g, 47,5 mmol) in 100 ml DMF gelöst, die Lösung wird dann auf -15°C abgekühlt und 5,3 ml (52,3 mmol) N-Methylmorpholin und 6,2 ml (47,5 mmol) Isobutylmorpholin und 6,2 ml (47,5 mmol) Isobutylchlorformiat werden zugegeben. Das Gemisch wird bei -15°C für 2 Minuten gerührt.
In einem zweiten Kolben wird das Cbz geschützte Argininlactam als Trifluoracetatsalz [Arg(Z)-Lactam × TFA] (19,2 g, 47,5 mmol) in 40 ml DMF gelöst, die Lösung wird auf 0°C abgekühlt und 5,3 ml (52,3 mmol) N-Methylmorpholin werden zugegeben. Das Gemisch wird für 2 Minuten bei 0°C gerührt, bevor es zum ersten Kolben gegeben wird. Das Reaktionsgemisch wird bei -15°C für 4 Stunden gerührt, dann langsam auf Raumtemperatur über Nacht erwärmt und es werden 5 ml 5 % NaHCO₃ zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird unter Vakuum unter Bildung eines Öls eingedampft. Das Öl wird in 175 ml Ethylacetat gelöst und 150 ml Wasser werden zur Lösung gegeben. Die organische Phase wird abgetrennt, mit 5 % NaHCO₃, Wasser, 0,1 N HCl und erneut mit Wasser gewaschen, bevor sie über MgSO₄ getrocknet wird. Die gewaschene und getrocknete Lösung wird unter Vakuum unter Bildung von 24,3 g (79 % Ausbeute) des Produkts, nämlich Boc-D-I-Tiq-Pro-Arg(Z)-Lactam als amorpher Feststoff bis zur Trockne eingedampft.
DC R_f (A) 0,71
FAB-MS 647 (MH⁺)
[α]_D = -32,8°, C = 0,5 Chloroform
Das oben erhaltene Arg(Z)-Lactamprodukt (23,4 g, 36,2 mmol) wird in 300 ml trockenem THF gelöst und die Lösung wird unter N₂ gestellt. Die Lösung wird auf -20°C abgekült und 37 ml 1 M Lithiumaluminiumhydrid in THF (37 mmol) wird tropfenweise zur kalten Lösung über 30 Minuten gegeben. Nachdem die Zugabe vollständig ist, wird das Gemisch bei -20°C für 30 Minuten gerührt und es wird eine Lösung aus 20 ml THF und 20 ml 0,5 N H₂SO₄ tropfenweise über 10 Minuten zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird mit 400 ml Ethylacetat verdünnt und es werden 400 ml Wasser zugegeben. Die organische Phase wird abgetrennt, zweimal mit 150 ml Portionen Wasser gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Die gewaschene und getrocknete organische Phase wird unter Vakuum unter Bildung von 21 g (89 % Ausbeute) des Produkts, nämlich Boc-D-I-Tiq-Pro-Arg(Z)-H als amorpher Feststoff eingedampft.
DC Rf (A) 0,28
Das Arg(Z)-H Produkt, die wie oben beschrieben erhalten wurde, wird folgendermaßen zur Entfernung der Cbz Schutzgruppe hydriert. Das Produkt (18,1 g, 27,9 mmol) wird in 200 ml THF gelöst und 80 ml Wasser und 28 ml 1 N H₂SO₄ und 3,0 g 5 % Pd-auf-Kohle werden zugegeben. Es wird Stickstoff durch die Suspension über ein Gasdispersionsrohr für 5 Minuten gefolgt von Wasserstoff für 5 Stunden und danach Stickstoff für 5 Minuten geblasen. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat wird auf ein Volumen von 100 ml konzentriert. Das Konzentrat wird mit 200 ml n-Butanol verdünnt und die Phasen werden getrennt. Die wäßrige Phase wird dreimal mit 100 ml Portionen n-Butanol extrahiert und die Extrakte werden mit der organischen Phase vereinigt. Die organische Phase wird unter Vakuum eingedampft und der Reaktionsproduktrückstand wird mit Diethylether : Diisopropylether 1:1 V: V behandelt, der Feststoff wird filtriert und unter Vakuum unter Bildung von 11,08 g Rohprodukt getrocknet.
Das Produkt wird gereinigt und folgendermaßen als Sulfatsalz erhalten. Das wie oben beschrieben erhaltene Rohprodukt wird in 20 ml Wasser und 20 ml 10 N H₂SO₄ gelöst. Die Lösung wird für 25 Minuten auf 50°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und der pH der Lösung wird mit Bio-Rad Agl-X8 Harz (Hydroxidfonn) auf 4,0 eingestellt. Das Harz wird durch Filtration aus der Lösung abgetrennt und die Lösung wird unter Bildung von 8,44 g des Rohprodukts als Sulfatsalz, nämlich D-1-Tiq-Pro-Arg-H × H₂SO₄, lyophilisiert.
Das Sulfatsalz (4,2 g) wird in 0,01 % H₂SO₄ gelöst und die Lösung wird auf zwei 5 cm × 25 cm HPLC Umkehrphasensäulen (Vydac C₁₈ Harz) in Reihe aufgetragen. Ein Gradient aus ansteigenden Konzentrationen von Acetonitril (2 % bis 10 %) wird zur Elution des Produktsalzes verwendet. Es werden Fraktionen gesammelt und auf der Grundlage eines analytischen RP-HPLC Profils vereinigt. Der pH der vereinigten Fraktionen wird mittels AG1-X8 Harz (Bio-Rad analytisches Anionenaustauscherharz mit 50-100 Mesh) im Hydroxyzustand auf 4,0 eingestellt. Die Lösung wird unter Entfernung des Harzes filtriert und das Filtrat wird lyophilisiert. Man erhält 2,4 g (57 % der Theorie) des gereinigten Produkts.
FAB-MS 415 (MH+)
[α]_D = -76,12°, C = 0,5 / 0,01 N H₂SO₄
Aminosäureanalyse: Pro 0,92, Tiq 1,00
Elementaranalyse berechnet für C₂₁H₃₂N₆O₇S:
Theorie: C 49,21, H 6,29, N 16,29, S 6,26
Gefunden: C 51,20, H 6,17, N 16,88, S 5,37

Claims

Verbindung der Formel
worin A für eine bicyclische Gruppe der folgenden Formel steht
worin Q für einen Rest mit einem Kohlenstoff steht, der dargestellt wird durch -CH₂- und
oder einen Rest mit zwei Kohlenstoffen, der dargestellt wird durch -CH₂-CH₂- oder
Y für einen Rest mit einem Kohlenstoff steht, der dargestellt wird durch -CH₂- oder
mit der Maßgabe, daß wenn Q für
oder
steht, Y dann für -CH₂- steht, und wenn Y für
steht, Q dann für -CH₂- oder -CH₂-CH₂- steht, R₅ für Wasserstoff oder eine Oxycarbonylgruppe der Formel R₄-OC(O)- steht, worin R₄ für C₁-C₆ Alkyl, C₂-C₆ Alkenyl, C₃-C₇ Cycloalkyl, Benzyl, Nitrobenzyl, Diphenylmethyl oder eine Phenylgruppe der folgenden Formel steht
worin a und a' unabhängig für Wasserstoff Niederalkyl, Niederalkoxy, Halogen, Trifluormethyl, Hydroxy, Hydromethyl, Amino oder Aminomethyl stehen und R₅ für Wasserstoff Halogen, Hydroxy, Niederalkyl oder Niederalkoxy steht und der gestrichelte Ring innerhalb des sechsgliedrigen Rings anzeigt, daß der Ring ein aromatischer Ring ist und pharmazeutisch annehmbare, nicht-toxische Salze hiervon.
Verbindung der Formel
worin A für eine bicyclische Gruppe der folgenden Formel steht
worin q für eine Kohlenstoff Kohlenstoff Bindung oder -CH₂- steht, Y für eine Kohlenstoff Stickstoff Bindung oder -CH(R₈)- steht und R₇ und R₈ für Wasserstoff oder >C=O stehen, mit der Maßgabe, daß wenn R, für >C=O steht, Y dann für eine Kohlenstoff-Stickstoff-Bindung oder -CH(R₈) steht und R₈ für Wasserstoff steht, und q für -CH₂- steht, R₅ für Wasserstoff Niederalkyl, Benzyl oder eine Oxycarbonylgruppe steht, wie es in Anspruch 1 definiert ist, und R₆ für Wasserstoff Halogen, Hydroxy, Niederalkyl oder Niederalkoxy steht, und pharmazeutisch annehmbare, nicht-toxische Salze hiervon.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung D,L-1,2,3,4-Tetralrydroisochinolin-1-oyl-L-prolyl-Largininaldehydsulfat ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung D-1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-1-oyl-L-prolyl-Largininaldehydsulfat ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung D-1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-3-oyl-L-prolyl-Largininaldehyd ist und pharmazeutisch annehmbare Salze hiervon.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1-5 zur Verwendung als antithrombotisches Mittel.
Pharmazeutische Formulierung, die als Wirkstoff eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1-5 zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Hilfsmitteln oder Verdünnungsmitteln hierfür enthält.