SK281731B6

SK281731B6 - Derivát peptidu, spôsob prípravy jeho sulfátovej soli, farmaceutický prostriedok s jeho obsahom

Info

Publication number: SK281731B6
Application number: SK2913-91A
Authority: SK
Inventors: Paul David Gesellchen; Robert Theodore Shuman
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 1991-09-23
Publication date: 2001-07-10
Also published as: IE913423A1; EP0837071A1; AU8478091A; DE69132884D1; JP3023019B2; NO309984B1; EP0684258A2; CS291391A3; EP0479489A2; NZ239907A; CZ285980B6; EP0684258A3; EP0479489B1; CN1060472A; NO913773D0; ATE211147T1; FI107733B; CA2052013C; BR9104181A; ATE234857T1

Abstract

Je opísaný derivát peptidu všeobecného vzorca (I) a jeho deriváty s Boc-chrániacimi skupinami a ich farmaceuticky vhodné soli. Tieto zlúčeniny účinne bránia tvoreniu krvných zrazenín a sú užitočné antitrombotické činidlá a môžu sa používať spolu s tkanivovým plazminogénnym aktivátorom (tPA), streptokinázovou a urokinázovou terapiou. Ďalej je opísaný spôsob prípravy sulfátovej soli derivátu peptidu všeobecného vzorca (I) a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom.ŕ

Description

SK 281731 Β6

Oblasť techniky

Vynález sa týka derivátu peptidu, spôsobu prípravy jeho sulfátovej soli a farmaceutického prostriedku s jeho obsahom. Jedná sa o trombínové inhibítory, ktoré sú použiteľné ako antikoagulanty pre ľudí a zvieratá. Hlavne sa týka derivátov peptidu L-prolín-L-arginínaldehydov, ktorý má antitrombotickú účinnosť.

Doterajší stav techniky

Trombínová inhibícia sa bežne dosahuje podávaním heparínov a kumarínov. Mechanizmus, ktorým tieto činidlá pôsobia, bol starostlivo študovaný. Heparíny sú podávateľné len orálne a ich hladina sa musí starostlivo monitorovať. Kumaríny spôsobujú blokovaním alebo inhibíciou vytváranie protrombínu a vyžadujú určitý čas na dosiahnutie maximálnej účinnosti.

Hoci ako heparíny, tak kumaríny sú účinné antikoagulanty, sú potrebné ďalšie antitrombínové činidlá, ktoré pôsobia rýchlo ako prevencia vytvárania krvných zrazenín a nenarušujú plazmínové pôsobenie pri rozpúšťaní vytvorených krvných zrazenín.

Podstata vynálezu

Podstatou trombín inhibujúcich zlúčenín podľa predloženého vynálezu je derivát peptidu všeobecného vzorca (I)

* Cs) alebo (s») v ktorom symbol A znamená

1. skupinu všeobecného vzorca

R.

I

R — C —

I

B v ktorom R znamená fenylovú skupinu všeobecného

v ktorom a a a' znamenajú nezávisle od seba atóm vodíka, alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka, skupinu alkoxy s 1 až 4 atómami uhlíka, atóm halogénu, trifluórmetylovú skupinu, skupinu hydroxy, hydroxymetylovú skupinu, aminoskupinu alebo aminometylovú skupinu; alebo R znamená skupinu tienylovú, skupinu furylovú alebo skupinu naftylovú alebo skupinu naftylovú monosubstituovanú alebo disubstituovanú alkylovou skupinou s 1 až atómami uhlíka, alkoxyskupinou s 1 až 4 atómami uhlíka, atómom halogénu, aminoskupinou, monoalkylaminoskupinou s 1 až 4 atómami uhlíka v alkylovej časti, dialkylaminoskupinou s 1 až 4 atómami uhlíka v alkylových častiach alebo skupinou hydroxy; alebo R znamená skupinu cyklohexadienylovú, cyklohexenylovú, cyklohexylovú alebo cyklopentylovú skupinu,

R] predstavuje atóm vodíka, metylovú alebo etylovú skupinu,

B predstavuje alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka, alkoxyskupinu s 1 až 4 atómami uhlíka, skupinu hydroxy alebo aminoskupinu všeobecného vzorca

-N(R₂)(R₃), v ktorom

R₂ a R₃ znamenajú nezávisle od seba atóm vodíka alebo alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka alebo R₂ znamená atóm vodíka alebo alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka a R₃ skupinu acetylovú, halogénacetylovú alebo oxykarbonylovú všeobecného vzorca

R4-O-C(O)-, v ktorom

R4 znamená alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, alkenylovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlíka, cykloalkylovú skupinu s 3 až 7 atómami uhlíka, skupinu benzylovú, nitrobenzylovú, difenylmetylovú alebo fenylovú definovanú, za podmienky, že keď R! znamená metylovú alebo etylovú skupinu, potom B neznamená metylovú alebo etylovú skupinu, alebo A znamená

2. 1-aminocyklohexylovú alebo 1-aminocyklopentylovú skupinu, pričom aminoskupinou je skupina uvedeného a definovaného všeobecného vzorca

-N(R₂)(R₃) alebo symbol A znamená

3. bicyklickú skupinu všeobecného vzorca ôa&x&tó' iftXČCÄyčô· o v ktorom symbol C znamená atóm uhlíka; na ktorom je skupina viazaná, symbol R₅ znamená atóm vodíka alebo definovanú oxykarbonylovú skupinu a symbol R^ znamená atóm vodíka, atóm halogénu, skupinu hydroxy, alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka alebo alkoxyskupinu s 1 až 4 atómami uhlíka a jeho derivát s Boc-chrániacimi skupinami a jeho farmaceutický vhodné soli. Symboly L, R a RS používané vo všeobecnom vzorci (I) označujú asymetrický atóm uhlíka a obmedzujú zlúčeniny na tie, ktoré majú L, R a RS formu.

Peptidy všeobecného vzorca (I) sú užitočné antitrombotické činidlá a môžu sa používať spolu s tkanivovým

SK 281731 Β6 plazminogénnym aktivátorom (tPA), streptokinázovou alebo urokinázovou terapiou,

Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) sa pripravujú bežnými kopulačnými spôsobmi. Napríklad sa kopuluje Boc-D-Phg s esterom L-prolínu za vzniku Boc-D-Phg-Pro esteru, Esterová skupina sa odstráni a Boc-D-Phg-Pro sa kopuluje s laktámovou formou L-arginínu za vytvorenia Boc-D-Phg-Pro-Arg laktámu v aminochránenej forme. Arg laktámový kruh sa otvorí redukciou a arginínová aminochránená skupina sa odstráni za vzniku Boc-D-Phg-Pro-Arg aldehydu. Peptidy sa prevádzajú na vhodnú soľ, napríklad acetáty a sulfáty. Vynález rieši predchádzanie vytvárania krvných zrazenín u ľudí a zvierat a týka sa farmaceutických prostriedkov vhodných na tento účel.

Zlúčeninami podľa vynálezu všeobecného vzorca (I) sú tripeptidy, pokiaľ symbol A znamená aminokyselinový zvyšok, napríklad fenylglycyly (Phg) a pokiaľ A znamená iný ako aminokyselinový zvyšok, napríklad pokiaľ B znamená inú ako aminoskupinu alebo alkylaminoskupinu, sú zlúčeninami N-acylové deriváty dipeptidu prolín a arginín aldehyd (Pro-Arg-H). Ako je zrejmé zo všeobecného vzorca (I), asymetrické centrum A(C=O) podielu je R alebo RS, zatiaľ čo prolín a arginín aldehydového podielu je L.

Jednotlivé skupiny vo všeobecnom vzorci (I) majú tento význam:

Nižšia alkylová skupina má priamy alebo rozvetvený reťazec s 1 až 4 atómami uhlíka a chápe sa pod ňou napríklad metylová, etylová, n-propylová, izopropylová, n-butylová skupina.

Nižšia alkoxyskupina má 1 až 4 atómy uhlíka a chápe sa ňou napríklad metoxyskupina, etoxyskupina, n-propoxyskupina, izopropoxyskupina, n-butoxyskupina, t-butoxyskupina.

Atómom halogénu sa vždy myslí atóm fluóru, chlóru alebo brómu. Mono/nižšou alkylovou/aminoskupinou alebo di/nižšou alkylovou/skupinou sa myslí napríklad metylaminoskupina, etylaminoskupina, dimetylaminoskupina, metyletylaminoskupina, dietylaminoskupina, n-butylaminoskupina, n-propylaminoskupina.

Výrazom „alkylová skupina s 1 až 6 atómami uhlíka“ sa vždy myslia alkylové skupiny s 1 až 4 atómami uhlíka s priamym alebo s rozvetveným reťazcom, definované a ďalej napríklad skupina n-pentylová, izopentylová, n-hexylová, izoméme hexylové skupiny. „Alkcnylovou skupinou s 2 až 6 atómami uhlíka“ sa vždy myslia olefinické skupiny, napríklad skupina vinylová, allylová, butenylová a izoméme pentenylové alebo hexenylové skupiny. Výrazom „cykloalkylová skupina s 3 až 7 atómami uhlíka“ sa myslia cyklické uhľovodíkové skupiny s 3 až 7 atómami uhlíka, ako je napríklad skupina cyklopropylová, cyklobutylová, cyklopentylová, cyklohexylová a cykloheptylová skupina.

Ako je uvedené pri všeobecnom vzorci (I), pokiaľ A znamená skupinu vzorca (R)(R!)(B)C-, môže R znamenať fenylovú skupinu, ktorá môže byť monosubstituovaná alebo disubstituovaná. Ako príklady takýchto fenylových skupín sa uvádza skupina fenylová (a a a' znamenajú atóm vodíka), 4-metylfenylová, 3-etylfenylová, 4-metoxyfenylová, 3-metoxyfenylová, 3-etoxyfenylová, 2-metoxyfenylová, 3-izopropoxyfenylová, 4-hydroxyfenylová, 4chlórfenylová, 3-chlórfenylová, 2-fluórfenylová, 3-fluórfenylová, 3-brómfenylová, 4-fluórfenylová, 3-trifluórmetylfenylová, 4-trifluórmetylová, trifluórmetylfenylová, 4-hydroxymetylfenylová, 2-hydroxymetylfenylová, 3-aminofenylová, 4-aminofenylová, 3-amino-4

-chlórfenylová, 3,4-dichlórfenylová, 3-hydroxy-4-fluórfenylová, 3-hydroxy-4-metylfenylová, 3-metoxy-4-hydroxyfenylová, 3-chlór-4-etoxyfenylová a podobné monosubstituované a disubstituovaná fenylové skupiny.

Ako príklady skupín symbolu R, kde R znamená naftylovú alebo monosubstituovanú alebo disubstituovanú naftylovú skupinu, sa napríklad uvádzajú skupina 1-naftylová, 2-naftylová, 6-metoxy-2-naftylová, 8-hydroxy-l-naftylová, 8-amino-2-naftylová, 4-metyl-l-naftylová, 6-chlór-2-naftylová, 4-hyďroxy-6-etoxy-2-naňylová, 8-metylamino-4-chlór-2-naftylová, 6,8-dimetoxy-2-naftylová, 6-etyl-l-naftylová, 4-hydroxy-1-naftylová, 3-metoxy-l-naftylová a podobné naftylové skupiny.

Ako príklady skupín vo všeobecnom vzorci (I), kde B znamená aminoskupinu všeobecného vzorca -N(R₂)(R₃), sa uvádzajú aminoskupina (R₂ = R₃ = atóm vodíka), metylaminoskupina, etylaminoskupina, izopropylaminoskupina, dimetylaminoskupina a podobné aminoskupiny; a ak R₂ znamená atóm vodíka a R₃ oxykarbonylovú skupinu RrO-CfO), uvádzajú sa ako príklady takýchto skupín alkoxykarbonylaminoskupiny s 1 až 6 atómami uhlíka v alkoxy podiele ako metoxykarbonylaminoskupina, etoxykarbonylaminoskupina, t-butoxykarbonylaminoskupina, izoamyloxykarbonylaminoskupina a podobné skupiny; alkenyloxykarbonylaminoskupiny s 2 až 6 atómami uhlíka v alkoxy podiele ako vinyloxykarbonylaminoskupina, allyloxykarbonylaminoskupina, 2-butenyloxykarbonylaminoskupina a podobné skupiny; cykloalkoxykarbonylaminoskupiny s 3 až 7 atómami uhlíka v cykloalkoxy podiele ako cyklopropyloxykarbonylaminoskupina, cyklopentyloxykarbonylaminoskupina, cyklohexyloxykarbonylaminoskupina a podobné skupiny. Oxykarbonylaminoskupiny vo význame symbolu B ďalej zahrnujú napríklad benzyloxykarbonylaminoskupinu, 4-nitrobenzyloxykarbonylaminoskupinu, difenylmetoxyoxykarbonylaminoskupinu, fenyloxykarbonylaminoskupinu alebo substituovanú fenyloxykarbonylaminoskupinu, pričom substituovaný fenylový podiel je definovaný.

Ako príklady skupín A(C=O) vo všeobecnom vzorci (I), ak A znamená (R)(R,)(B)C-, sa uvádzajú skupina fenylglycylová, 3-metoxyfenylglycylová, 4-metoxyfenylglycylová, 4-chlórfenylglycylová, 3,4-dichlórfenylglycylová, 3-trifluórmetylglycylová, N-(t-butyloxykarbonyl)fenylglycylová, N-(t-butyloxykarbonyl-N-metyl)fenylglycylová, alfa-metylfenylacetylová, alfa-etylfenylacetylová, alfa-metoxyfenylacetylová, alfa-izopropoxyfenylacetylová, 1-naftylglycylová, 2-naftylglycylová, N-(t-butyloxykarbonyl)-2-naftylglycylová, 2-tienylglycylová, 3-tienylglycylová, N-(cyklopentyloxykarbonyl)-2-tienylglycylová, 2-fúrylglycylová, N-etyl-2-fúrylglycylová, mendeloylová, 4-chlórmandeloylová, 3-metoxymandeloylová, alfa-hydroxy-alfa-(2-naftyl)acetylová, alfa-hydroxy-alfa-(2-tienyl)acetylová, 1,4-cyklohexadienylglycylová, 1-cyklohexenylglycylová, N-(t-butyloxykarbonyl)-l,4-cyklohexadienylglycylová, cyklohexylglycylová a podobné A(CO) skupiny.

Peptidové zlúčeniny všeobecného vzorca (I), kde znamená A achirálnu 1-aminocyklopentylovú skupinu alebo 1-aminocyklohexylovú skupinu, majú štruktúrny vzorec —C/O/-Pro-Arg-H ň/r₂//r₃/

SK 281731 Β6 kde znamená p väzbu uhlíka na uhlík alebo skupinu -CH₂- aR₂ a Rj majú uvedený význam. Ako príklady takýchto tripeptidov sa uvádzajú N-(aminocyklohexynoyl)-Pro-Arg-H, N-(l-aminocyklopentanoyl)-Pro-Arg-H, N-(l-metylaminocyklohexanoyl)-Pro-Arg-H, N-(l-t-butyloxykarbonylaminocyklohexanoyl)-Pro-Arg-H a podobné tripeptidy.

Ako príklady peptidov všeobecného vzorca (I), kde znamená A bicyklickú skupinu všeobecného vzorca (II), sa uvádzajú D-l,2,3,4-tetrahydroizochinoIín-l-ylkarbonyl a D-l,2,3,4-tetrahydroizochinolín-3-ylkarbonyl-N-acylový derivát Pro-Arg-H všeobecného vzorca

C/O/-L-?ro-L-Arg-E

dihydroizoindol-l-ylkarbonylové deriváty všeobecného vzorca

C/0/-L-Pro-L-Arg-H jantárová, mliečna, benzoová, fúmarová a podobné karboxylové kyseliny. Adičné soli s kyselinou sa pripravujú známym spôsobom, napríklad neutralizáciou voľnej zásady zlúčeniny všeobecného vzorca (I) kyselinou. Výhodnými adičnými soľami s kyselinou sú sulfáty a hydrochloridy.

Výhodnými zlúčeninami všeobecného vzorca (I) sú zlúčeniny, kde znamená A skupinu všeobecného vzorca kde znamená R fenylovú skupinu všeobecného vzorca

R.

I

R — C —

I

B alebo naftylovú alebo substituovanú naftylovú skupinu, R[ atóm vodíka a B aminoskupinu všeobecného vzorca -N(R₂)(R₃). Ďalej sú výhodné zlúčeniny všeobecného vzorca (I), kde znamená R₂ atóm vodíka a R₃ oxykarbonylovú skupinu všeobecného vzorca

R40-C(0)-.

Ďalšie výhodné zlúčeniny sú zlúčeniny všeobecného vzorca (I), kde znamená A bicyklickú skupinu všeobecného vzorca (II); v tomto prípade sú výhodné zlúčeniny všeobecného vzorca (I), kde znamená A(C=O) 1,2,3,4-tetrahydroizochinolín-l-karbonylovú skupinu (všeobecného vzorca (II), kde znamená Q skupinu -CH₂-CH₂, Y skupinu -CH- a R₅ = R^ = atóm vodíka) a 1,2,3,4-tetrahydroizochinolín-3-ylkarbonylovú skupinu (všeobecného vzorca (II), kde znamená Q skupinu vzorca oxoderiváty všeobecného vzorca

CHj-CH a Y skupinu -CH₂-).

Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) sa pripravujú známym spôsobom kopulácie peptidov. Podľa jedného takéhoto spôsobu sa kyselina všeobecného vzorca A-COOH, kde A má význam uvedený pri všeobecnom vzorci (I), kopuluje s karboxy chráneným prolínom za vzniku dipeptidu (pokiaľ A znamená aminokyselinu) alebo N-acylprolínesteru (ak A znamená inú ako aminoskupinu). Karboxy chrániaca esterová skupina prolínového podielu produktu sa odstráni a forma voľnej kyseliny dipeptidu sa kopuluje s laktámovou formou arginínu. Uvedený reakčný sled znázorňuje nasledujúca schéma:

C/O/-L-Pro—L-Ajg-H a ich perhydroderiváty. Symboly R5 a Rj majú uvedený význam. R₅ znamená výhodne atóm vodíka a R₆ znamená výhodne atóm vodíka, metoxyskupinu, etoxyskupinu, atóm chlóru alebo metylovú skupinu.

Farmaceutický výhodnými soľami peptidov všeobecného vzorca (I) podľa vynálezu sú adičné soli s kyselinami, pripravované s použitím anorganických i organických kyselín. Ako príklady anorganických kyselín, vytvárajúcich soli, sa uvádzajú halogenovodíkové kyseliny, ako je kyselina chlorovodíková a bromovodíková, kyselina fosforečná a kyselina sírová. Na vytváranie adičných solí s organickými kyselinami sa napríklad uvádza kyselina octová, propiónová, malónová, maleínová, citrónová,

ACOOH + prolítester

p) deesterifikáda A-(C^eO}-Pro-OH

i C s KS l

NĽP

C00 tster

-» A-(C»0>-Pro-Arg(P)taktám (c) (·) (b) kde znamená P skupinu chrániacu aminoskupinu.

Kopulovaný Arg(P) laktámový produkt (c) sa redukuje alumíniumlítiumhydridom v inertnom rozpúšťadle

SK 281731 Β6 kvôli odštiepeniu laktámového kruhu a kvôli vytvoreniu tripeptidu v arginínaldehydovej forme všeobecného vzorca

A(C=O) - Pro - Arg(P) - H, kde znamená Arg(P)-H amino chránený arginínový aldehyd.

Laktámová forma arginínu sa získa intramolekulárnou kopuláciou amino chráneného arginínu (Arg-OH). Napríklad Boc-Arg(Cbz)OH všeobecného vzorca

BooNH-CH - (CH^ - NH - C - (=NH) - NHCbz

I

COOH sa najprv prevádza na aktívnu esterovú formu, napríklad na aktívny zmesný anhydrid, chloroformátovým esterom, napríklad etylchlórformátom na izobutylchlórformát. Vytváranie esteru sa vykonáva v prítomnosti terciámeho amínu, napríklad N-metylmorfolínu. Prísada silnejšej terciámej amínovej zásady, napríklad trietylamínu, ovplyvňuje vnútornú acyláciu za vzniku laktámovej formy di-amino chráneného arginínu:

C = NH I

NH-Cbs

Pred použitím na kopuláciu s A(C=O)-Pro-OH, ako je uvedené, sa Boe chrániaca skupina selektívne odstráni trifluóroctovou kyselinou za vytvorenia žiaducej voľnej aminoskupiňy.

Kopulácia zlúčeniny ACOOH s prolínovým esterom, keď A znamená aminokyselinový zvyšok, sa vykonáva tak, že sa najprv chráni aminoskupina aminokyseliny. Používajú sa bežné skupiny, chrániace aminoskupinu, bežne používané na dočasnú ochranu alebo blokovanie aminoskupiny. Ako príklady takýchto skupín sa uvádzajú alkoxyskupina, alkenyloxyskupina, cykloalkoxyskupina a aryloxykarbonylová skupina, ako sú napríklad skupina etoxykarbonylová, t-butyloxykarbonylová, cyklohexyloxykarbonylová, adamantyloxykarbonylová, trichlóretoxykarbonylová, benzyloxykarbonylová, difenylmetoxykarbonylová skupina. Esterovou skupinou, používanou na chránenie karboxyskupiny prolínu v priebehu kopulačnej reakcie, môže byť akákoľvek bežne používaná a ľahko odstrániteľná esterová skupina; napríklad sa uvádza skupina t-butylová, benzylová, p-nitrobenzylová, p-metoxybenzylová, difenylmetylová, trichlóretylová, fenacylová a trialkylsilylová skupina. Pri vykonávaní kopulačnej reakcie sa používa esterová skupina pre prolín, ktorá sa najprv prevádza na aktívnu esterovú formu, napríklad na aktívny zmesný anhydrid, chloroformátovým esterom, napríklad etylchlórfonnátom na izobutylchlórformát. Vytváranie esteru sa vykonáva v prítomnosti terciámeho amínu, napríklad N-metyl-morfolínu. Prísada silnejšej terciámej amínovej zásady, napríklad trietylamínu, ovplyvňuje vnútornú acyláciu za vzniku laktámovej formy di-amino chráneného arginínu:

Pred použitím na kopuláciu s A(C=O)-Pro-OH, ako je uvedené, sa Boe chrániaca skupina selektívne odstráni trifluóroctovou kyselinou za vytvorenia žiaducej voľnej aminoskupiny.

Kopulácia zlúčeniny ACOOH s prolínovým esterom, keď A znamená aminokyselinový zvyšok, sa vykonáva tak, že sa najprv chráni aminoskupina aminokyseliny. Používajú sa bežné skupiny, chrániace aminoskupinu, bežne používané na dočasnú ochranu alebo blokovanie aminoskupiny. Ako príklady takýchto skupín sa uvádzajú alkoxyskupina, alkenyloxyskupina, cykloalkoxyskupina a aryloxykarbonylová skupina, ako sú napríklad skupina etoxykarbonylová, t-butyloxykarbonylová, cyklohexyloxykarbonylová, adamantyloxykarbonylová, trichlóretoxykarbonylová, benzyloxykarbonylová, difenylmetoxykarbonylová skupina. Esterovou skupinou, používanou na chránenie karboxyskupiny prolínu v priebehu kopulačnej reakcie, môže byť akákoľvek bežne používaná a ľahko odstrániteľná esterová skupina; napríklad sa uvádza skupina t-butylová, benzylová, p-nitrobenzylová, p-metoxybenzylová, difenylmetylová, trichlóretylová, fenacylová a trialkylsilylová skupina Pri vykonávaní kopulačnej reakcie sa používa esterová skupina pre prolín, ktorá je odstrániteľná za podmienok, keď chrániaca skupina pre aminoskupinu je nedotknutá. Aminoskupinu chrániaca skupina acyláciou kyseliny ACOOH tak zostáva na mieste kvôli ochrane aminoskupiny v priebehu nasledujúcej kopulácie s arginín laktámovou zlúčeninou za vytvorenia c.

Zlúčeniny všeobecného vzorca (1), kde znamená A skupinu všeobecného vzorca (R)(Ri)(B)C- a B aminoskupinu všeobecného vzorca -N(R₂)(R₃), kde znamená R₂atóm vodíka a R₃ nižšiu alkylovú skupinu, sa pripravujú so zodpovedajúcou zlúčeninou, kde znamená B aminoskupinu s použitím známych acylačných spôsobov. Napríldad N-metyl-D-fenylglycyl-L-prolyl-L-arginínaldehyd sa pripravuje redukčnou acyláciou nasledujúcim spôsobom: Cbz chránený D-fenylglycín sa kopuluje v dimetylformamide s L-prolín t-butylesterom s použitím dicyklohexyl-karbodiimidu (DCC) a hydroxybenzotriazolu (HOBt) za vzniku dipeptidu Cbz-D-fenyl-glycyl-L-prolín t-butylesteru. Peptid sa hydrogenuje v alkohole na paládiu na uhlí ako katalyzátore kvôli odstráneniu Cbz chrániacej skupiny, pridá sa formaldehyd do redukčnej zmesi a v hydrogenácii sa pokračuje za vzniku N-metyl-D-fenylglycyl-L-prolín t-butylesteru. N-metyl sekundárna aminoskupina fenylglycylového podielu sa chráni skupinou Cbz reakciou dipeptidu vo forme t-butylesteru s benzylchlórformátom v tetrahydrofuráne obsahujúcom N-metylmorfolín za vzniku N-Cbz-N-metyl-S-fenylglycyl-L-prolín t-butylesteru. t-Butylesterová skupina sa odstráni pri teplote miestnosti v trifluóroctovej kyseline obsahujúcej anizol za vzniku N-Cbz-N-metyl-D-fenylglycyl-L-prolínu. Ďalej dipeptid sa potom kopuluje na Cbz chránený Arg laktám a laktámový kruh sa redukčné otvorí za vzniku Arg aldehydu, ako je opísané. Obidve Cbz chrániace skupiny tripeptidu sa odstránia hydrogenáciou na katalyzátore paládium na uhlí za vzniku N-metylD-fenylglycyl-L-prolyl-L-arginín aldehydu.

Zlúčeniny všeobecného vzorca (I), kde znamená A skupinu (R)(R,)(B)C- a R skupinu cyklohexadienylovú alebo cyklohexenylovú a B alkylaminoskupinu -N(R₂)(R₃), sa môžu pripravovať redukciou imínu vytvoreného s nižším alkylaldehydom a s nátriumkyanobórhydridom. Podobne N-alkylácia sa môže vykonávať s nižším alkyljodidom a hydridom sodíka.

Zlúčeniny všeobecného vzorca (I), kde znamená A bicykloskupinu všeobecného vzorca (II), sa pripravujú tým istým kopulačným spôsobom, ako je uvedené. Na príklad peptid všeobecného vzorca (I), kde znamená A 1,2,3,4-tetrahydroizochinolín-l-ylovú skupinu, sa získa acyláciou esteru prolínu, napríklad benzylesteru, aktívnym derivátom 1,2,3,4-tetrahydro-l-karboxyizochinolínu. Aktívne deriváty, ktoré sa môžu použiť, zahrnujú halogenidy kyselín, napríklad chlorid alebo bromid, azid kyseliny a aktívne estery a anhydridy, vytvorené napríklad s chlórformátmi, ako bolo opísané. Dusík v kruhu tetrahydroizochinolínu (všeobecného vzorca (II), R_sznamená atóm vodíka), sa chráni alkyláciou v priebehu acylačnej kopulácie. Napríklad aktívny ester N-Boc-1,2,3,4-tetrahydro-l-karboxyizochinolínu, vytvorený s izobutylchlórformátom, sa používa pri acylácii prolín esteru. Peptidový produkt N-Boc-l,2,3,4-tetrahydroizochinolín-l-ylkarbonylprolínester sa deesterifikuje, voľná kyselina sa prevádza na aktívny ester a ten sa kopuluje na laktámovú formu arginínu. Laktámový produkt sa potom prevádza na aldehydovú formu opísaným spôsobom za vzniku zlúčeniny všeobecného vzorca (1), totiž Boc-1,2,3,4-tetrahydroizochinolín-1 -y lkarbonyl-Pro-Arg-H.

Perhydrobicykloskupina všeobecného vzorca (II) sa pripravuje hydrogenáciou buď parciálne redukovaných alebo nenasýtených kyselín známymi spôsobmi. Napríklad 1,2,3,4-tetrahydroizochinolín-l-karboxylová kyselina sa hydrogenuje na oxide platiny v rozpúšťadle, ako je etanol alebo kyselina octová, za vzniku perhydro/dekahydro/izochinolín-1 -karboxylovej kyseliny. Perhydrokyseliny sa potom používajú opísaným spôsobom pri acylácii prolínového esteru. Ako príklady takýchto perhydroderivátov všeobecného vzorca (I) sa uvádzajú N-(D-dekahydroizochinolín-l-oyl)-L-prolyl-L-arginin aldehyd a N-(D-dekahydroizochinolín-3-oyl)-L-prolyl-L-arginín aldehyd.

Uvedené kopulačné reakcie sa vykonávajú za chladu, výhodne pri teplote približne -20 až +15 °C. Kopulačné reakcie sa vykonávajú v inertných organických rozpúšťadlách, ako je napríklad dimetylformamid, dimetylacetamíd, tetrahydrofiirán, metylénchlorid, chloroform. Všeobecne sa pracuje v bezvodom prostredí, pokiaľ sa pri kopulačnej reakcii používa aktívny ester acylačnej kyseliny.

Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) podľa vynálezu sa najlepšie izolujú vo forme adičnej soli s kyselinou. Soli zlúčenín všeobecného vzorca (I), vytvorené s kyselinami, ako sú napríklad uvedené farmaceutický vhodné soli, sú vhodné na podávanie antitrombotických činidiel a na prípravu farmaceutických prostriedkov, ktoré ich obsahujú. Môžu sa pripravovať tiež iné adičné soli s kyselinami a používať na izoláciu a čistenie peptidov. Napríklad soli, vytvorené so sulfónovými kyselinami, napríklad s kyselinou metánsulfónovou, n-butánsulfónovou, p-toluénsulfónovou a naftalénsulfónovou, sa tiež môžu používať.

Výhodný spôsob izolácie a čistenia zlúčenín všeobecného vzorca (I) podľa vynálezu a prípravy požadovaných solí je opísaný v patentovom spise č. 5,455,229 (v súčasne podávanej prihláške vynálezu číslo 07/996,347). Podľa tohto spôsobu sa stále soli s anorganickými kyselinami, ako napríklad sulfáty a hydrochloridové soli, získajú preparatívnym čistením C_ls reverznou fázovou chromatografiou. Vodná fáza obsahuje kyselinu sírovú alebo chlorovodíkovú v koncentrácii približne hmotnostne 0,01 % až 0,05 % a acetonitril, tetrahydrofiirán, metanol alebo iné vhodné rozpúšťadla slúžiace ako organická zložka. Hodnota pH kyslého eluantu sa upravuje na približne 4 až približne 6, pričom presná hodnota pH je funkciou príslušného peptidu, bázickou živicou napríklad živicou Βίο-Rad AG-1X8 v hydroxylovej forme. Po upravení hodnoty pH roztoku tripeptidovej soli, napríklad sulfátu alebo hydrochloridu, sa vykoná lyofílizácia kvôli získaniu vyčistenej soli vo forme suchého prášku. Podľa príkladu takéhoto spôsobu sa surový D-Phg-L-Pro-L-Arg-H sulfát, kontaminovaný epimémym D-Arg-H sulfátom, rozpustí v približne 0,01 % kyseliny sírovej a roztok sa vnesie na stĺpec Vydac C₁₈ RP-HPLC. Gradient 2 až 10 % acetonitrilu v 0,01 % kyseline sírovej sa použije na eluovanie stĺpca počas 10 hodín. Zhromažďujú sa mnohé frakcie a frakcia obsahujúca požadovaný produkt, ako je stanovené analytickou RP-HPLC, sa uschová. Hodnota pH uschovávaných frakcií sa nastaví približne na 4,0 až približne 4,5 živicou Βίο-Rad AG-1X8 v hydroxylovom cykle. Po sfiltrovaní sa roztok lyofilizuje, čím sa získa čistý D-Phg-L-Pro-L-Arg-H sulfát.

Zlúčeniny všeobecného vzorca (I) podľa vynálezu inhibujú pôsobenie trombínu u ľudí a zvierat. Inhibovanie trombínu sa demonštruje in vitro inhibíciou amidázovcj aktivity trombínu. V nasledujúcej tabuľke (I) sú zdanlivé rovnovážne konštanty (Kass) na vzájomné pôsobenie medzi skúšanou zlúčeninou (inhibítorom) a trombínom. Hodnoty v tabuľke I sa získali pri skúške, pri ktorej sa trombín hydrolyzuje v chromogénnom substráte N-benzoyl-D-fenylalanyl-L-valyl-L-arginyl-p-nitroanilidu.

Skúška sa vykonáva v 50 pl pufra (0,03 M Tris, 0,15 M chlorid sodný, hodnota pH 7,4) s 25 μΐ trombínového roztoku (0,21 mg/ml trombostatového prášku v 0,06 M Tris, 0,3 M chloride sodnom s hodnotou pH 7,4) a 150 μΐ vodného roztoku chromogénneho substrátu s koncentráciou 0,25 mg/ml. Roztoky skúšanej zlúčeniny (25 μΐ) s rôznymi koncentráciami sa pridajú. Meria sa rýchlosť hydrolýzy substrátu monitorovaním reakcie pri 405 nm kvôli uvoľňovaniu p-nitroanilínu. Konštruujú sa štandardné krivky na vynášanie voľnej koncentrácie trombínu proti rýchlosti hydrolýzy. Rýchlosti hydrolýzy sa pozorujú so skúšanými zlúčeninami a potom sa prevádzajú na hodnoty „voľného trombínu“ v príslušnej skúške s použitím štandardných kriviek. Viazaný trombín (väzba na skúšanú zlúčeninu) sa vypočítava odpočítaním množstva voľného trombínu, pozorovaného pri každej skúške, od známeho počiatočného množstva trombínu, použitého pri skúške. Množstvo voľného inhibítora pri každej skúške sa vypočítava odpočítaním počtu mol viazaného trombínu od počtu mol pridaného inhibítora (skúšanej zlúčeniny).

Hodnota Kass je hypotetická rovnovážna konštanta na reakciu medzi trombínom a skúšanou zlúčeninou všeobecného vzorca (I) podľa vynálezu

Trombín +1 <- Trombín -1 (trombín I) [(trombín) x (í)]

Kass sa vypočíta pre rad koncentrácií skúšaných zlúčenín a stredná hodnota sa udáva v jednotkách liter na mol.

V nasledujúcej tabuľke má poznámka ¹ tento význam: A(C=O) sa týka všeobecného vzorca (I), ak nie je uvedené inak, sú skúšané inhibítory vo forme acetátových solí.

Tabuľka I

Inhibícia trombínamidázovej aktivity

SkútaiýkMWtor'AOO)	Trombfrwnidtai Kata X1(F (Vmói)
MxíWbM	75,0
N-8co-Minylgíyq4	88,0
N-Boo-Wwrytplycýl	73,0
N-Boc-D-fenytyycyl (cuttttovd aoľ)	107,0
N^oc-CH4-hy*oxy)í»nylglycyl	115,0
N-BoG-D^4-n»t®y)fenyl0ycyl	75.0
N-8aXM3,4-ächIó0fcíiyVycyf)	40,0
A^cMyHM4^rNtGBq^Mj1glyc)i1	15.5
N-8oc-0-1-n«ftyigtycyl	52,0
N-aooM-raftrtfycyl	224
N-Boo-DL-f-naftylgtycyl	15.1
Hfloo044tenylglycyl	14,0
N-Goe-D<6-imto)ty)-2-raftylglycyl	01
N-flo&-I>cyMohaxyigfyoy1	120,0
Nfletyi-D-fnyietycyt	»1.5
N^oe-MflwQMManylglycyl	6.2
	11.0
	7.5
	44
(S)-rfe-nwtylf»ryieoetyl	0,2
N-fioc-OL-1 ,2,3,4-taMydroiBKNMen- 1-yfcartonyl	3,8
OL-1 .Z.S.+ÄrrtjdraizodthcÄ	57.7

Antikoagulačná účinnosť zlúčenín všeobecného vzorca (I) podľa vynálezu je stanovená štandardnými skúškami. V nasledujúcej tabuľke II sú hodnoty, získané s reprezentatívnymi zlúčeninami podľa vynálezu v skúškach používaných na stanovenie protrombínového času, trombínového času a aktivovaného parciálneho tromboplastínového času (APTT). Číselnými hodnotami v tabuľke sú koncentrácie skúšaných zlúčenín (ng/ml) potrebné na predĺženie koagulácie na dvojnásobok v 3 skúškach. Hodnotenie trombínového času sa vykonáva v plazme a oddelene v pufrovom systéme pri hodnote pH 7,5. V tabuľke II sa uvádza antikoagulačná účinnosť trombínových inhibítorov.

Tabuľka II

SkúicanýŕWbta-AOO)	Ptawá tooaQdačné akútka'	Mm (pH i,Uf TfonNnový 6u
	rronnNMWva doba	ΑΡΓΓ	iromMnové dota
tMMiyVycyi	»1	1130	01	NA'
N Bcc D		1100	110	118
M£e&a<4-frMtoxy)ÍBnylQlyeyl	NA	640	80	NA
N-8cGO^4-hydraxy)fanyífltycyl	1836	1001	182	NA
McoOL-1-NlMofrcM	1136	2272	320	112
N4QOO>1*neftyVycyl	1225	3100	230	106
N-Bo&O-2-rwftyt^cyt	1200	1200	230	142
IMctM^4-matOK7Manylg\|ycyl	000	2600	100	NA
N-Boc-CH8-<n*to>ry>2-	35480	2230	480	466
N-Boc-OcyWahexyletycyl	522	748	7«	60
N-eoc-N-maly1-D-4ariytglyc»<	300	4545	300	NA
N-matyHMarMftcyl	888	>we	82	87
(FtyaMMylforyiKatyl	Τ»	3m	115	Ma
	>800	>000	ιϋ	173

1. A(C=O) pre vzorec I

2. koncentrácia (ng/ml) skúšanej zlúčeniny potrebná na dvojnásobné predĺženie koagulácie

3. APTT = aktivačný parciálny tromboplastínový čas

4. NA =nedostupné

5. stredná hodnota 8 skúšok

Hodnoty v tabuľke II získané s použitím zariadenia Coa-Screener spoločnosti Tecan Inc. pri skúške podľa ďalej uvedených protokolov:

Protrombínovaný čas:

μΐ plazmy μΐ soľanky μΐ skúšaného roztoku μΐ tromboplastínu (Dade) Trombínový čas:

μΐ plazmy μΐ soľanky μΐ skúšanej zlúčeniny μΐ hovädzieho trombínu (2 NIH jednotiek/ml)

Pri trombínovom čase, stanovenom v pufri s hodnotou pH 7,4, sa používa fibrinogén namiesto plazmy. APTT:

μΐ plazmy μΐ aktínu (Dade) μΙ skúšaného roztoku μΐ chloridu vápenatého (0,01 M).

Antitrombotická účinnosť reprezentatívnych zlúčenín všeobecného vzorca (I) podľa vynálezu sa stanovuje pri skúškach in vivo, vykonávaných na krysách. Používaná skúška navodzuje arteriálnu trombózu v hrdlovej tepne krýs a meria sa infúzna dávka skúšanej zlúčeniny, potrebnej na udržanie krvného toku po 5 minútach počas oklúzie. Skúška sa vykonáva týmto spôsobom:

Navodí sa arteriálna trombóza u krysy v hrdlovej tepne. Na tento účel sa použije miestne roztok chloridu železitého. Samček krysy Sprague-Dawley (s hmotnosťou 375 až 450 g) sa anestetizuje xylazínom (20 mg/kg s. c.) a potom ketamínhydrochloridom (100 mg/kg, s. c.). Zvieratá sa položia na vodnú podložku, v ktorej prúdi voda, udržiavaná na teplote 37 °C. Hrdlová tepna sa priblíži osovou mozgovou incíziou. Na izolovanie cievy z pošvy hrdlovej tepny sa použije opatrná tupá pitva. Pod tepnu sa prevlečie hodvábna niť na zdvihnutie cievy, aby pod ňu mohol byť zasunutý termočlánok. Zmeny teploty cievy sa zaznamenávajú na pásik atramentovým zapisovačom. Na namočenie malých kotúčikov (s priemerom 3 mm) filtračného papiera do roztoku chloridu železitého (35 %) sa použijú malé lekárske klieštičky. Kotúčiky sa narežú pomocou zaostrenej nehrdzavejúcej rúrky s vnútornou svetlosťou 3 mm vo vŕtacom lise. Nasýtené kotúčiky sa položia na každú hrdlovú tepnu nad termočlánkom. Časový interval medzi aplikáciou chloridu železitého a náhlym poklesom teploty sa zaznamenáva ako čas do oklúzie (TTO) cievy. Priemerný čas, potrebný na oklúziu oboch ciev, sa použije na vyjadrenie TTO pre každé zviera.

Skúšané zlúčeniny sa rozpustia v ízotonickej soľanke. Použije sa injekčná striekačka na infúziu roztokov drog 15 minút pred aplikáciou chloridu železitého a pokračuje sa 60 minút po aplikácii chloridu železitého. Vynesie sa krivka dávka - odozva na stanovenie vzťahu medzi log 10 zavedenej dávky a TTO príslušnej hrdlovej tepny. Stanoví sa porovnávací index antitrombotickej účinnosti z kriviek výpočtom zavedenej dávky potrebnej na udržanie krvného toku po 50 minút (ED 50 min.).

Spojenie medzi oklúziou cievy a príkrym poklesom teploty sa stanovuje súčasným zaznamenávaním teploty a toku krvi na tom istom zapisovači. V blízkosti termočlánku sa okolo hrdlovej tepny umiestni sonda prietoku Doppler. Sonda zaznamenáva zmeny rýchlosti prietoku; preto sa inštaluje vo chvíli, keď nedochádza k trombóze a vnútorný priemer cievy zostáva konštantný v dôsledku nadurenia pretekajúcej krvi. Pred aplikáciou 35 roztoku chloridu železitého sa zaznamenáva teplota a rýchlosť toku (s použitím zariadenia Directional Pulsed Doppler prietokomeru, Model 545-C, Universíty of lowa Bioengi

SK 281731 Β6 neering). Výsledky sú uvedené ako percentuálna zmena počiatočných hodnôt (6 minút pred oklúziou). Čas, kedy teplota cievy rýchlo klesla, sa hodnotí ako nula a teplota pred oklúziou a po oklúzii a hodnoty prietoku sa vzťahujú k tomuto bodu.

V tabuľke III sú uvedené výsledky pre skúšané zlúčeniny, získané pri opísanej skúške chemicky navodeného trombu u krysy.

Tabuľka III

Antitrombotická účinnosť na arteriálnu trombózu krysy

SKúíení ztiCerína A(C'O) vzorci i	ED_K'(WI
N-BoKMenyífllycyl	2,9
N-8oo-D-cyWotexylgtycy1	11.3
	M
N-Boc-Dt-1-fwft/glycý	5.5
r+floc-D-2-naftyl0yGyl	NA*

1. ED₅q je infúzna dávka potrebná na udržanie krvného toku počas 50 minút.

2. Neúčinná pri 4 mg/kg/h alebo 7 mg/kg/h, najvyššia skúšaná dávka.

Zlúčeniny podľa vynálezu všeobecného vzorca (I) inhibujú vytváranie zrazeniny bez badateľného narušovania prirodzenej telesnej schopnosti lýzie zrazeniny, zlúčeniny majú napríklad nízke inhibičné pôsobenie na fibrinolýzu.

Vynález sa tiež týka spôsobu inhibície vytvárania krvných zrazenín u ľudí a zvierat, pri ktorom sa podáva ľuďom alebo zvieratám účinné inhibičné netoxické množstvo zlúčeniny všeobecného vzorca (I). Antikoagulačná zlúčenina sa podáva orálne, parenterálne, napríklad intravenózne (iv), intramuskuláme (im) alebo subkutánne (sc). Výhodné podanie je intravenózne (iv) infúziou.

Účinná dávka proti vytváraniu krvných zrazenín je približne 5 mg až približne 1000 mg. Dávka sa môže meniť, napríklad pre profylaktické použitie sa môže podávať jedna denná dávka alebo primerane podávať niekoľko dávok 3 až 5 krát denne. V kritických situáciách sa zlúčenina podáva intravenózne infúziou v dávke približne 1 mg/kg/h až 50 mg/kg/h a výhodne v množstve

2,5 mg/kg/h až približne 25 mg/kg/h.

Spôsob podľa vynálezu sa môže tiež vykonávať spolu s podávaním činidiel na lýziu zrazenín, napríklad s tkanivovým plazminogénnym aktivátorom (tPA), s modifikovaným tPa, so streptokinázou alebo urokinázou. V prípadoch, keď došlo k vytvoreniu zrazeniny a tepna alebo cieva je blokovaná buď čiastočne alebo plne, podávajú sa súčasne činidlá na dýzu zrazeniny. Zlúčenina podľa vynálezu sa môže podávať spolu s činidlom na lýzu alebo následne po jeho podaní kvôli prevencii opätovného vytvorenia zrazeniny.

Pri vykonávaní spôsobu podľa vynálezu je žiaduce používať výhodné zlúčeniny. Napríklad sa používajú uvedené výhodné zlúčeniny. Výhodnými peptidmi sú N-Boc-D-fenylglycyl-L-prolyl-L-arginín aldehyd a N-metyl-D-fenylglycyl-L-prolyl-L-arginín aldehyd, ktoré sú vo forme soli, napríklad sulfátov alebo hydrochloridov. Obzvlášť výhodnou zlúčeninou podľa vynálezu na uvedené účely je N-(D-1,2,3,4-tetrahydroizochinolín-1 -oyl)-2-prolyl-2-arginín aldehydsulfát.

Vynález sa tiež týka farmaceutických prostriedkov na inhibíciu vytvárania krvných zrazenín. Farmaceutické prostriedky podľa vynálezu obsahujú účinné, zrazeniny inhibujúce množstvo zlúčeniny všeobecného vzorca (I) podľa vynálezu a farmaceutický vhodný nosič. Na orálne podanie antitrombotická zlúčenina je formulovaná ako želatínová kapsula alebo ako tablety, ktoré môžu obsahovať excipienty ako spojivá, mazadlá, rozptyľovacie činidlá a podobné prísady. Na parenterálne podanie sa antitrombotická zlúčenina formuluje vo farmaceutický vhodnom riedidle, napríklad vo fyziologickom roztoku (0,9 %), v 5 % dextróze, v Ringerovom roztoku a v podobných riedidlách.

Antitrombotická zlúčenina podľa vynálezu sa môže formulovať v jednotkovej dávke obsahujúcej približne 1 mg až približne 1000 mg účinnej látky. Výhodne je zlúčenina všeobecného vzorca (I) vo forme farmaceutický vhodnej soli, napríklad vo forme sulfátu, acetátu alebo fosfátu. Napríklad jednotková formulačná dávka obsahuje 5 mg N-Boc-D-fenylglycyl-L-prolyl-L-arginín aldehydsulfátovej soli v 10 ml sterilnej sklenenej ampulke. Iným príkladom jednotkovej dávky je 10 mg N-metyl-D-fenylglycyl-L-prolyl-L-arginín aldehydsulfátu v 20 ml izotonickom fyziologickom roztoku obsiahnutom v sterilnej ampulke.

Výhodným prostriedkom je jednotková dávkovacia forma obsahujúca 5 až 50 mg N-(D-1,2,3,4-tetrahydroizochinolín-l-oyl)-L-prolyl-L-arginín aldehydsulfátu v sterilných ampulkách.

Nasledujúce príklady praktického vyhotovenia vynález objasňujú, nijako ho však neobmedzujú.

Hodnoty R_f v nasledujúcich príkladoch sa stanovujú silikagélovou chromatografiou v tenkej vrstve s použitím silikagélu Kieselgel 60F-254 (Merck, Darmstadt) v nasledujúcich rozpúšťadlových systémoch.

A. chloroform - metanol - kyselina octová 135 :15:1

B. etylacetát - kyselina octová - absolútny alkohol 90 : : 10: 10

C. chloroform - metanol - kyselina octová 90:30:5 (pomery sú vždy myslené objemovo).

V príkladoch sa používajú nasledujúce analytické spôsoby HPLC:

Spôsob 1: Waters 600E s použitím Vydac C₁₈ reverzného fázového stĺpca 0,46 cm x 10 cm. Chromatogram sa monitoruje na LDC pri 220 nM s použitím gradientu A = 0,01 M amóniumacetátu a B = acetonitril.

Spôsob 2: Pharmacia FPLC s použitím PepRPC s rozmerom 0,5 cm x 5,0 cm. Monitorovanie sa vykonáva na Pharmacia UV-M pri 214 nM s použitím gradientu buď A = 0,01 M amóniumacetát alebo B = acetonitril.

Prípadne používané skratky v príkladoch majú nasledujúci význam: aminokyseliny

Arg = arginín Pro = prolín Phg = fenylglycín Boe = t-butoxykarbonyl Bzl = benzyl Cbz = benzyloxykarbonyl DCC = dicyklohexylkarbodiimid DMF = dimetylformamid DMSO = dimetylsulfoxid FAB-MS = hmotové spektrum bombardované rýchlym atómom

FD-MS = „field desorption“ hmotové spektrum THF = tetrahydrofurán

TLC = chromatografia v tenkej vrstve

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

N-Boc-D-fenylglycyl-L-prolyl-L-arginín aldehyd (Boc-D-Phg-Pro-Arg-H) hemisulfát

1. Boc-D-Phg-Pro-Obzl

Roztok Boc-D-fenylglycínu (15,0 g, 59,7 mmól) a prolínbenzylester hydrochloridu (14,43 g, 59,7 mmól) v 60 ml dimetylformamidu sa ochladí na teplotu 0 °C a pridá sa najprv N,N-diizopropyletylamín (10,3 ml,

59.7 mmól) a potom 1-hydroxy-benzotriazolhydrát (8,1 g, 59,7 mmól) a dicyklohexylkarbodiimid (DCC) (12,3 g, 59,7 mmól). Reakčná zmes sa mieša počas troch dní pri teplote miestnosti a potom sa sfiltruje a filtrát sa odparí na olej vo vákuu. Olej sa rozpustí v 200 ml etylacetátu a 150 ml vody a po vytrepaní sa organická vrstva oddelí, premyje sa trikrát vždy 100 ml 0,1 N kyseliny chlorovodíkovej, raz 150 ml vody, trikrát vždy 100 ml 5 % roztoku hydrogenuhličitanu sodného a opäť 150 ml vody. Premytý organický roztok sa vysuší síranom horečnatým a potom sa odparí vo vákuu, čím sa získa

24.8 g Boc-D-Phg-Pro-Obzl vo forme pevnej látky (95 % teórie): TLC R_f (A) 0,75; FAB-MS 439 (M+).

2. Boc-D-Phg-Pro-OH

Opísaným spôsobom získaný produkt Boc-D-Phg-Pro-Obzl (24,5 g, 55,7 mmól) sa rozpustí v 40 ml dimetylformamidu a 225 ml izopropylalkoholu a do roztoku sa pridá 1,0 g 5 % paládia na uhlí ako katalyzátora. Disperznou rúrkou na plyn sa reakčnou zmesou prebubláva dusík a potom vodík počas 16 hodín a potom opäť premývací dusík počas 5 minút Katalyzátor sa odfiltruje cez filter hyflo a filtrát sa odparí do sucha vo vákuu, čím sa získa pevný zvyšok. Tento zvyšok sa prekryštalizuje z dietyléteru obsahujúceho malé množstvo etylacetátu. Tak sa získa 10,35 g deesterifikovaného produktu: Boc-D-Phg-Pro (2), výťažok 53 % teórie: TLC R_f (A) 0,32; FAB-MS 349 (MH+).

Ή NMR (DMSO-ds): delta 1,35 (s, 9H), 1,71 - 2,10 (m, 4H), 3,10 (m, 1H) 3,74 (m, 1 H), 4,20 (m, 1 H), 5,45 (d, 1 H), 7,09 (d, 1 H), 7,25 - 7,40 (m, 5H), 12,50 (bs, 1 H).

3. Boc-L-Arg(Cbz)-OH

N-Boc-arginín hydrochlorid (Boc-Arg-OH + HCI) (82,1 g, 250 mmól) sa rozpustí v 240 ml 5N roztoku hydroxidu sodného v trojhrdlovej banke s guľatým dnom. Roztok sa ochladí na teplotu -5 °C a po kvapkách sa v priebehu 55 minút pridá benzylchloroformát (143 ml, 1,0 mól, 4 ekv.), pričom sa hodnota pH zmesi udržiava na

13,2 až 13,5 5N roztokom hydroxidu sodného (250 ml).

Reakčná zmes sa mieša počas jednej hodiny pri teplote -5 °C po skončenom pridávaní chloroformátu. Potom sa reakčná zmes zriedi 100 ml vody a 500 ml dietyléteru, vodná vrstva sa oddelí a extrahuje sa dvakrát vždy 40 ml dietyléteru. Vodná vrstva sa potom okyslí na hodnotu pH 3,0 3N kyselinou sírovou (560 ml) a extrahuje sa 550 ml etylacetátu. Oddelená vodná vrstva sa extrahuje raz etylacetátom a extrakt sa spoji so skôr získaným etylacetátovým extraktom. Spojené extrakty sa premyjú vodou, vysušia sa síranom horečnatým a odparia sa do sucha vo vákuu. Zvyšok sa trituruje s etyléterom a vyzrážaný produkt sa filtruje a vysuší. Tak sa získa 66,1 g (3) Boc

-Arg(Cbz)-OH (65 % teórie) : TLC Rf (C) 0,43; FD-MS 408 (M+).

’H NMR (CDClj): delta 1,42 (s, 9H), 1,61 -1,91 (m, 4H), 3,23 - 3,41 (m, 2H) 4,17 (d, 1 H), 5,21 (s, 2H), 5,62 (d, 1 H), 7,30 - 7,42 (m, 6H), 8,37 (m, 1 H).

4. Boc-Arg(Cbz)-laktám

Roztok Boc-Arg(Cbz)-OH (3), pripravený opísaným spôsobom (66,0 g, 0,162 mól) v 230 ml suchého tetrahydrofuránu sa ochladí na teplotu -10 °C v kúpeli ľadu a acetónu. Do studeného roztoku sa pridá N-metylmorfolín (18,7 ml, 1,05 ekv.) a potom izobutylchlórformát (22,5 ml, 1,05 ekv.) a zmes sa mieša počas 5 minút pri teplote -10 °C. Potom sa pridá trietylamín (23,5 ml, 1,05 ekv.) a zmes sa mieša počas jednej hodiny pri teplote -10 °C a potom pri teplote miestnosti počas jednej hodiny. Reakčná zmes sa vleje do jedného litra zmesi ľadu a vody a potom sa produkt (4) vyzráža. Zrazenina sa odfiltruje, premyje sa studenou vodou, vysuší sa vo vákuu a prekryštalizuje sa z etylacetátu. Tak sa získa 38,05 g (60 % teórie) produktu 4, Boc-Arg(Obz)laktám: TLC R_f (A) 0,77; FD-MS 391 (MH+).

‘H NMR (CDClj) delta: 1,48 (s, 9H), 1,78 - 1,98 (m, 2H), 2,50 (m, 1H), 3,41 (m, 1 H), 4,43 (m, 1 H), 4,90 (m, 1 H), 4,16 (s, 2H), 5,27 (m, 1 H), 7,28 - 7,45 (m, 6H), 9,41 (m, 1 H), 9,68 (m, 1 H).

5. Arg(Cbz)-laktám trifluóracetátová soľ

Boc-Arg(Cbz)laktám (4) (38,0 g, 0,097 mól) sa zmieša s 200 ml trifluóroctovej kyseliny obsahujúcej 20 ml anizolu a zmes sa mieša pri teplote Ó °C počas jednej hodiny. Reakčná zmes sa odparí vo vákuu bez zahrievania a do zvyšku sa pridá 400 ml dietyléteru. Získaná pevná látka sa odfiltruje, premyje sa dietyléterom a vysuší sa vo vákuu. Tak sa získa 40,5 g produktu (5) vo forme trifluóracetátovej soli: TLC Rf (C) 0,29; FD-MS 291 (MH+).

6. Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)laktám

Do roztoku Boc-D-Phg-Pro (14,5 g, 41,6 mmól), pripraveného uvedeným spôsobom, v časti 2, v 80 ml dimetylformamidu ochladeného na teplotu -15 °C, sa pridá

4,6 ml N-metylmorfolínu a potom 5,4 ml izobutylchlórformátu a reakčná zmes sa mieša pri teplote -15 °C dve minúty.

V oddelenej nádobe sa rozpustí TFA. Arg(Cbz)laktám (15,3 g, 37,8 mmól, pripravený, ako je uvedené v časti 5) v 30 ml dimetylformamidu, roztok sa ochladí na teplotu 0 °C a pridá sa 4,6 ml N-metylmorfolínu. Roztok sa mieša pri teplote 0 °C dve minúty a potom sa vleje do roztoku Boc-D-Phg-Pro, pripraveného opísaným spôsobom. Reakčná zmes sa mieša 4 hodiny pri teplote -15 °C a potom sa nechá ohriať cez noc na teplotu miestnosti. Pridá sa 5 % roztok hydrogenuhličitanu sodného (5 ml) do reakčnej zmesi, ktorá sa potom odparí vo vákuu za získania oleja. Olej sa rozpustí v 175 ml etylacetátu a pridá sa 150 ml vody. Po pretrepaní sa organická vrstva oddelí, premyje sa 5 % roztokom hydrogenuhličitanu sodného a vodou, vysuší sa síranom horečnatým a odparí sa do sucha vo vákuu, čím sa získa 23,0 g Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)laktámu (6) vo forme amorfnej pevnej látky (98 % teórie). TLC R_f (A) 0,72; FAB-MS 621 (MH+).

7. Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-H

Laktám (6) (23,0 g, 37 mmól), získaný spôsobom podľa časti 6, sa rozpustí v 200 ml suchého tetrahydrofuránu a roztok sa ochladí na teplotu -15 °C v prostredí dusíka. Do studeného roztoku sa pridá po kvapkách v priebehu 10 minút 1 M roztok lítiumalumíniumhydridu v tetrahydrofuráne (37 ml, 37 mmól) a reakčná zmes sa udržiava na teplote 0 °C a mieša sa jednu hodinu, keď sa toto pridávanie skončí. Potom sa pomaly a po kvapkách v priebehu 10 minút pridá roztok 12 ml tetrahydrofuránu a 12 ml 0,5 N kyseliny sírovej. Reakčná zmes sa zriedi 200 ml etylacetátu a 200 ml vody a po pretrepaní sa organická vrstva oddelí. Organická vrstva sa premyje 3 krát vody 150 ml vody, vysuší sa síranom horečnatým a odparí sa do sucha vo vákuu, čím sa získa 19,2 g (83 % teórie) Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-H. FAB-MS 623 (MH+). [alfa]_D = -66,1 °, c = 0,5, trichlórmetán.

8. Boc-D-Phg-Pro-Arg-H hemisulfát

Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-H (7) (18,2 g, 29,2 mmól) sa rozpustí v 100 ml tetrahydrofuránu a 100 ml vody a

29,2 ml 1 N kyseliny sírovej a 2 g 10 % paládia na uhlí sa pridá do roztoku. Suspenziou sa prebubláva dusík počas 5 minút s použitím rúrky dispergujúcej plyn, načo sa zavádza vodík počas 4 hodín. Keď je redukcia skončená, opäť sa prebubláva dusík počas 5 minút. Reakčná zmes sa sfiltruje vrstvou hyflo kvôli odstráneniu katalyzátora a filtrát sa skoncentruje na objem 100 ml odparením vo vákuu. Do vodného koncentrátu sa pridá 200 ml n-butanolu a organická vrstva sa oddelí od vodnej vrstvy. Vodná vrstva sa extrahuje 3 krát vždy 100 ml n-butanolu a extrakty sa spoja a pridajú sa do organickej vrstvy. Organická vrstva sa odparí do sucha vo vákuu, zvyšok sa trituruje so systémom dietyléter/diizopropyléter v objemovom pomere 1:1, pevná látka sa odfiltruje a vysuší sa vo vákuu, čím sa získa 10,26 g surového produktu (8). Surový produkt sa rozpustí v 10 % vodnom roztoku acetonitrilu a roztok sa vnesie na 7,5 cm x 53 cm stĺpec živice HP-20 vopred spracovanej systémom 10 % acetonitrilu vo vode. Produkt sa eluuje zo stĺpcov postupnou eluáciou narastajúcou koncentráciou acetonitrilu vo vode (10 % až 12 % až 15 %). Zhromaždia sa mnohé frakcie a skúšajú sa na produkt reverznou fázovou chromatografiou HPLC. Frakcie, obsahujúce produkt, sa zhromaždia a odparia sa do sucha, čím sa získa 5,42 g čistého produktu. Boc-D-Phg-Pro-Arg-H hemisulfát (53 % teórie) má nasledujúce charakteristiky: [alfa]_D = -125,6°, c = 0,5, trichlórmetán; FAB-MS 489 (MH+); retenčný čas na RP-HPLC (spôsob 2) 10 až 50 % B po 45 minút, čas 32,3 minút.

Príklad 2

N-(t-butyloxykarbonyl)-D-fenylglycyl-L-prolyl-L-arginín aldehyd (Boc-D-Phg-Pro-Arg-H) diacetátová soľ

Do roztoku Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-H, pripraveného podľa časti 7 príkladu 1 (38,0 g, 61 mmól) v 500 ml ízopropylalkoholu obsahujúceho 7,1 ml (2 ekv.) kyseliny octovej, sa pridá 2,0 g 10 % paládia na uhlí ako katalyzátora. Zmes sa premyje dusíkom prebublávaním dusíka rúrkou na dispergáciu plynu počas 5 minút a potom sa zmesou nechá počas 24 hodín prechádzať vodík. Keď sa reakcia skončí, vedie sa zmesou opäť počas 5 minút dusík. Reakčná zmes sa sfiltruje vrstvou hyflo kvôli odstráneniu katalyzátora a filtrát sa odparí do sucha, čím sa zís ka 33,6 g surového produktu vo forme amorfnej pevnej látky. Produkt sa čistí v 5 g dávkach na 5 cm x 25 cm stĺpci Vydac Ci₈. Tripeptidový produkt sa eluuje počas 8 hodín gradientom 10 až 30 acetonitrilu/0,01 M amóniumacetát. Mnohé frakcie sa zhromaždia a frakcie, obsahujúce produkt, ako je doložené reverznou fázovou chromatografiou HPLC, sa zhromaždia a vysušia vymrazovaním. Tak sa získa 11,7 g (35 % teórie) požadovaného tripeptidu s nasledujúcimi charakteristikami. FAB-MS 489 (MH+); aminokyselinová analýza:

Phg = 1,07, Pro = 0,94; [alfa]_D = -108,9° (c = 0,5, trichlórmetán).

Elementárna analýza vypočítaná pre C2₈H₄₄N₆O₉: Vypočítané: C 55,25 H 7,29 N 13,81

Nájdené: C 55,52 H 7,40 N 13,93

Retenčný čas = 31,9 minút prostredníctvom HPLC, spôsob 2,10 až 50 % B v priebehu 45 minút.

Zlúčeniny, charakterizované v nasledujúcich príkladoch 3 a 4, sa získajú spôsobom opísaným v príklade 1, pričom sa použije naftylglycín a p-hydroxyfenylglycín namiesto fenylglycínu ako podľa príkladu L

Príklad 3

N-Boc-D-1-naftylglycyl-Pro-Arg-H diacetát [alfa]_D = +18,87°, c = 0,5, 50 % kyselina octová, FAB-MS (MH+) 539.

HLC, spôsob 1, gradient: 20 % až 60 % B v priebehu 60 minút, retenčný čas 42,0 minút.

Príklad 4

N-Boc-D-2-naftylglycyl-Pro-Arg-H diacetát

HPLC, spôsob 2, gradient 30 % až 60 % B v priebehu 60 minút, retenčný čas = 18,0 minút. Elementárna analýza vypočítaná pre Vypočítané: C 58,35 H 7,04 N 12,76

Nájdené: C 58,59 H 6,83 N 13,03

Príklad 5

N-Boc-D-(4-hydroxyfenylglycyl)-Pro-Arg-H diacetát

HPLC, spôsob 2, gradient 20 % až 40 % B v priebehu 40 minút, retenčný čas = 26,5 minút.

Aminokyselinová analýza: 4-hydroxyfenylglycín = 0,99, prolín= 1,01.

Príklady 6 až 26

Zlúčeniny, uvedené v nasledujúcej tabuľke IV, sa pripravia kopulačnými spôsobmi, opísanými v príklade 1, pričom sa uvedenou aminokyselinou alebo substituovanou octovou kyselinou [A/C = 0] nahradí D-fenylglycln, použitý podľa príkladu 1. Všetky zlúčeniny podľa tabuľky IV sú vo forme acetátovej soli.

Tabuľka IV

A(C=O)-Pro-Arg-H

Pr. e.	A(C-O).	MÍ'	HFLCwíwť čJgradtent	Retirtný (m(dôl)
é	N-m«tyWManyi(frcyl	403	l/iO%-50%BnadOO min.	44í
l	N-ao&DL-l-fwftrtW	539	1/5 %· 50 % B nad 30 min.	27.9
8	H Boe D (Í irwtoxy>ŕnrtyij\|yQi1	889	2/10 %-50% B nad 45 mh.	412
8	R(+>cMtylfenyfa04ty1	402	i£%-40%Bnod60irin.	22,1
10	N-eoc-N-fnetjd-D-fcíiylglycyf	503	Í/5%-50% Bnad40 mu	»,«
11		404	2H0%-40%Bnad40 mh	21.0
12	DWohfcyi	380	2/10%-5Q%BnM46 mm.	13Λ
13	N 60c D (4-motey)terylal_?cy1	510	2/10%-45%Bnd4O nV	34.0
14		481	2/10%-40% B nad 40 irin.	19.0
16	N-eoc-D-ayktotMXftgfrcyl	405	2/10%-50% B nad 45 mm.	38,5
18		557	2/10%-70%Bnad80 min	40.5
17	R(*>«ltoHnatyllanytac8tyl	388	2/10%-50% B nad 45 rrin.	21.9
18	Sí-Mfc-matylbí'iylaealyi	381	2/10%.SOHBtwHŠ min	2W
ii	N 80c D 2 bwiylqiycyl	496	1/10%-00% BnadBO mh.	23.8
20	N-eoc^HMuomJfenylg^cyl	507	2/lO%-5O%8nadO0 min	38A
21	N-aooOL-fA^híorolíanyVytyi	W	2/10%-60% ftrwlOO mh.	374
22	N-fcc-1 AXtttihyMzMNnôlin1-ytarbonyt	515	4/20%-00% B nad 00 nwi.	49,0
23	1-ytaftonyt	416	2«%-Μ%βΑθ080 min.	30,e
24	0-1 j,3,4 Wafrydtuimliiiiullii 34kartonyl	415	2/5 %-50 % B nad 80 min.	26,4
25	O-RrfiydroiEQcHrtfn-1-ytartwnirl	421	2/5%-50%Bnad60 min.	22í 2£.S
28	N-Boc-DL-í34fl8uÓm^,ietyí)4anyi{ŕ>cyl	667	2/5 %-50 % B nad 80 min.	51.5

1. FAB-MS (MH+)

2. HPLC opísaný spôsob

Príklad 27

D-1,2,3,4-tetrahydroizochinolín-1 -oyl-L-prolyl-L-arginín-aldehydsulfát

Do roztoku izochinolín-1-karboxylovej kyseliny (12,5 g, 0,072 mól) v 185 ml ľadovej kyseliny octovej sa pridajú 2 g oxidu platiny a suspenzia sa hydrogenuje pri teplote miestnosti za tlaku vodíka 414 kPa v hydrogenovanej aparatúre Parr počas 24 hodín. Reakčná zmes sa potom sfiltruje filtračnou vrstvou (Celite) kvôli odstráneniu katalyzátora a filtrát sa odparí do sucha vo vákuu. Pevný zvyšok sa trituruje s vodou, sfiltruje sa a vysuší sa, čím sa získa 8 g (63 % teórie) DL-1,2,3,4-tetrahydroizochinolín-l-kart>oxylovej kyseliny. FD hmotové spektrum 178 (MH+);

'H NMR (DMSO-dí): delta 2,80 - 3,00 (m, 3H), 3,15 (m, 1H), 3,30 - 3,40 (m, 2H), 7,05 - 7,25 (m, 4H), 7,70 (m, 1H).

Produkt (7,08 g, 0,04 mól) sa rozpustí v 2N roztoku hydroxidu sodného (40 ml, 0,08 mól) a 40 ml t-butylalkoholu a 10,5 g (0,048 mól) diterc.butyldikarbonátu sa pridá do získaného roztoku. Mieša sa počas 24 hodín pri teplote miestnosti, potom sa terc.-butylalkohol odparí z reakčnej zmesi. Získaný vodný roztok sa extrahuje dietyléterom, vodná vrstva sa oddelí, okyslí sa 2N chlorovodíkovou kyselinou na hodnotu pH 2,0. Okyslená vodná fáza sa extrahuje etylacetátom, extrakt sa vysuší síranom horečnatým a odparí sa do sucha vo vákuu. Zvyšný olej sa rozpustí v dietylétere a do roztoku sa pridá 7,9 ml (0,04 mól) dicyklohexylamínu. Nechá sa stáť pri teplote 4 °C počas 4 hodín zrazenina dicyklohexylamínovej soli N-Boc-DL-1,2,3,4-tetrahydroizochinolín-1 -karboxylovej kyseliny sa odfiltruje, premyje sa dietyléterom a vysuší sa vo vákuu. Tak sa získa 15,7 g (86 % teórie) čistej soli. FD hmotové spektrum 459 (MH+).

Elementárna analýza vypočítaná pre C27H42N2O4

Vypočítané: C 70,71 H 9,23 N 6,11 Nájdené: C 71,07 H 9,37 N 5,87

Boe chránený derivát (73,4 g, 160 mól) sa suspenduje v 200 ml etylacetátu a suspenzia sa premyje 1,5 N kyselinou citrónovou a vodou, vysuší sa síranom horečnatým a odparí sa do sucha vo vákuu. Zvyšný olej sa rozpusti v etylacetáte, roztok sa ochladí na teplotu 0 °C a do suspenzie sa pridá 2,4,5-trichlórfenol (31,6 g, 160 mmól) a potom dicyklohexylkarbodiimid (DCC) (33 g, 160 mmól). Reakčná zmes sa mieša počas jednej hodiny pri teplote 0 °C a pri teplote miestnosti počas 1,5 hodiny. Reakčná zmes sa ochladí na 0 ⁰ a zrazenina sa odfiltruje a filtrát sa odparí do sucha vo vákuu. Zvyšný olej sa rozpustí v 100 ml pyridínu a prolín (18,42 g, 160 mmól) a trietylamín (22,3 ml, 160 mmól) sa pridajú do získaného roztoku. Mieša sa pri teplote miestnosti počas 24 hodín a potom sa reakčná zmes odparí do sucha vo vákuu. Zvyšok sa rozpustí v etylacetáte, pridá sa voda a hodnota pH sa nastaví na 9,5 2N roztokom hydroxidu sodného. Vodná vrstva sa oddelí, okyslí sa na hodnotu pH 2,0 2N kyselinou chlorovodíkovou a extrahuje sa etylacetátom. Extrakt sa vysuší síranom horečnatým, sfiltruje sa a odparí sa do sucha vo vákuu. Olejovitý zvyšok sa rozpustí v metylénchloride a etylacetáte. Nechá sa stáť pri teplote °C počas 4 hodín, načo sa zrazenina, vytvorená v roztoku, odfiltruje, premyje sa etylacetátom a prekryštalizuje sa zo systému metylénchlorid/etylacetát. Pevný produkt, Boc-D-1,2,3,4-tetrahydroizochinolín-1 -oy 1-L-prolín (Boc-D-l-Tiq-Pro-OH) sa vysuší vo vákuu, čím sa získa

19,6 g, 33 % teórie čistého produktu; TLC R_f (A) 0,44; FAB-MS 375 (MH+);

Elementárna analýza vypočítaná pre C₂oH₂₆N₂0₅Vypočítané: C 64,15 H 7,00 N 7,48 Nájdené: C 63,26 H 6,98 N 7,62 [alfa]_D = +43,14° (c = 0,5, metanol).

V prvej banke sa rozpustí Boc-D-1-Tiq-Pro (17,8 g, 47,5 mmól) v 100 ml tetrahydrofuránu, roztok sa ochladí na teplotu -15 ⁰ a pridá sa 5,3 ml (52,3 mmól) N-metylmorfolínu a 6,2 ml (47,5 mmól) izobutylchlórformátu. Zmes sa mieša pri teplote -15 °C 2 minúty.

V druhej banke sa rozpustí Cbz chránený arginínlaktám vo forme trifluóracetátovej soli [Arg/Z)-laktám. TFA] (19,2 g, 47,5 mmól) v 40 ml dimetylformamidu, roztok sa ochladí na teplotu 0 °C a pridá sa 5,3 ml (52,3 mmól) N-metylmorfolínu. Zmes sa mieša 3 minúty pri teplote Ó °C pred vnesením do prvej banky. Reakčná zmes sa mieša 4 hodiny pri teplote -15 °C, potom sa pomaly ohreje na teplotu miestnosti cez noc a pridá sa 5 ml % roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Reakčná zmes sa odparí vo vákuu, čím sa získa olej. Olej sa rozpustí v 175 ml etylacetátu a do roztoku sa pridá 150 ml vody. Organická vrstva sa oddelí, premyje sa 5 % roztokom hydrogenuhličitanu sodného, vodou, 0,1 N kyselinou chlorovodíkovou a opäť vodou a potom sa vysuší síranom horečnatým. Premytý a vysušený roztok sa odparí vo vákuu do sucha, čím sa získa 24,3 g (79 % teórie) produktu. Boc-D-l-Tiq-Pro-Arg(Z) laktám je vo forme amorfnej pevnej látky.

TLC R_f (A) 0,71; FAB-MS 647 (MH+); [alfa]_D = -32,8°, c = 0,5, chloroform.

Arg(Z) laktámový produkt, získaný (23,4 g,

36,2 mmól), sa rozpustí sa v 300 ml suchého tetrahydrofuránu a roztok sa udržiava v prostredí dusíka. Roztok sa ochladí na teplotu -20 °C a po kvapkách sa pridá 37 ml lítiumalumíniumhydridu 1 M v tetrahydrofuráne (37 mmól) do chladného roztoku v priebehu 3 minút. Keď sa toto pridávanie skončí, zmes sa mieša pri teplote

SK 281731 Β6

-20 °C počas 30 minút a potom sa po kvapkách pridá roztok 20 ml tetrahydrofuránu a 20 ml 0,5 N kyseliny sírovej v priebehu 10 minút. Reakčná zmes sa potom zriedi 400 ml etylacetátu a pridá sa 400 ml vody. Organická vrstva sa oddelí, premyje sa dvakrát vždy 150 ml vody a vysuší sa síranom horečnatým. Premytá a vysušená organická vrstva sa odparí vo vákuu, čím sa získa 21 g (89 % teórie) produktu, Boc-D-l-Tiq-Pro-Arg(Z)-H vo forme amorfnej pevnej látky.

TLC Rf(A) 0,28.

Opísaným spôsobom získaný Arg(Z)-H produkt sa hydrogenuje nasledujúcim spôsobom kvôli odstráneniu Cbz chrániacej skupiny. Produkt (18,1 g, 27,9 mmól) sa rozpustí v 200 ml tetrahydrofuránu a 80 ml vody a 28 ml 1 N kyseliny sírovej a 3,0 g 5 % paládia na uhlí sa pridá. Suspenziou sa prebubláva dusík s použitím rúrky na dispergáciu plynu počas 5 minút a potom vodík počas 5 hodín a nakoniec opäť dusík počas 5 minút. Katalyzátor sa odfiltruje a fíltrát sa skoncentruje na objem 100 ml. Koncentrát sa zriedi 200 ml n-butanolu a vrstvy sa oddelia. Vodná vrstva sa extrahuje 3 krát vždy 100 ml n-butanolu a extrakty sa spoja s organickou vrstvou. Organická vrstva sa odparí vo vákuu a reakčný produkt ako zvyšok sa trituruje so systémom dietyléter : diizopropyléter v objemovom pomere 1 :1, pevná látka sa odfiltruje a vysuší sa vo vákuu, čím sa získa 11,08 g surového produktu.

Produkt sa čistí a získa sa vo forme sulfátovej soli. Surový produkt, získaný opísaným spôsobom, sa rozpustí v 20 ml vody a 20 ml 10N kyseliny sírovej. Roztok sa udržiava na teplote 50 °C počas 25 minút, ochladí sa na teplotu miestnosti a hodnota pH roztoku sa nastaví na 4,0 živicou Bio-Rad AG1-X8 (v hydroxidovej forme). Živice sa oddelia od roztoku filtráciou a roztok sa lyofilizuje, čím sa získa 8,44 g surového produktu vo forme sulfátovej soli, D-1-Tiq-Pro-Arg-H.H₂S0₄.

Sulfátová soľ (4,2 g) sa rozpustí v 0,01 % kyseline sírovej a roztok sa nanesie na dve 5 cm x 25 cm HPLC reverzné fázové kolóny (Vydac C_]8 živica) v sérii. Gradient narastajúcich koncentrácií acetonitrilu (2 % až 10 %) sa použije na eluovanie produkovanej soli. Frakcie sa zhromaždia a uchovávajú na základe analytického RP-HPLC profilu. Hodnota pH spojených frakcií sa upraví na 4,0 použitím živice AG1-X8 (Bio-Rad analytická anexová živica 50 - 100 mesh - otvor ôk sita 300 až 150 gm) v hydroxycykle. Roztok sa sfiltruje kvôli odstráneniu živice a fíltrát sa lyofilizuje. Tak sa získa 2,4 g (57 % teórie) vyčisteného produktu.

FAB-MS 415 (MH+); [alfa]_D = -76,12°, c = 0,5/0,01N, kyselina sírová;

aminokyselinová analýza: Pro 0,92, Tiq 1,00. Elementárna analýza vypočítaná pre C₂iH₃₂N₆O₇S: Vypočítané: C 49,21 H 6,29 N 16,29 S 6,26

Nájdené: C 51,20 H 6,17 N 16,88 S 5,37.

Priemyselná využiteľnosť

Derivát dipeptidu L-prolín-L-arginínaldehyd je rýchlo účinný na prevenciu vytvárania krvných zrazenín a nenarúša plazmínové pôsobenie pri rozpúšťaní vytvorených krvných zrazenín. Používa sa vo farmaceutických prostriedkoch.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Derivát peptidu všeobecného vzorca (I)

A Cr) alebo (SK) v ktorom symbol A znamená

1. skupinu všeobecného vzorca v ktorom R znamená fenylovú skupinu všeobecného vzorca v ktorom a a a' znamenajú nezávisle od seba atóm vodíka, alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka, skupinu alkoxy s 1 až 4 atómami uhlíka, atóm halogénu, trifluórmetylovú skupinu, skupinu hydroxy, hydroxymetylovú skupinu, aminoskupinu alebo aminometylovú skupinu; alebo R znamená skupinu tienylovú, skupinu furylovú alebo skupinu naftylovú alebo skupinu naftylovú monosubstituovanú alebo disubstituovanú alkylovou skupinou s 1 až 4 atómami uhlíka, alkoxyskupinou s 1 až 4 atómami uhlíka, atómom halogénu, aminoskupinou, monoalkylaminoskupinou s 1 až 4 atómami uhlíka v alkylovej časti, dialkylaminoskupinou s 1 až 4 atómami uhlíka v alkylových častiach alebo skupinou hydroxy; alebo R znamená skupinu cyklohexadienylovú, cyklohexenylovú, cyklohexylovú alebo cyklopentylovú skupinu,

Rt predstavuje atóm vodíka, metylovú alebo etylovú skupinu,

-N(R₂)(R₃), v ktorom

R₂ a Rj znamenajú nezávisle od seba atóm vodíka alebo alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka alebo R₂ znamená atóm vodíka alebo alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka a R3 skupinu acetylovú, halogénacetylovú alebo oxykarbonylovú všeobecného vzorca

R4-O-C(O)-, v ktorom

R4 znamená alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, alkenylovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlíka, cykloalkylovú skupinu s 3 až 7 atómami uhlíka, skupinu benzylovú, nitrobenzylovú, difenylmetylovú alebo fenylovú definovanú, pod podmienkou, že keď R] znamená metylovú alebo etylovú skupinu, potom B neznamená metylovú alebo etylovú skupinu, alebo A znamená

-N(R₂)(R₃), alebo symbol A znamená

3. bicyklickú skupinu všeobecného vzorca v ktorom symbol C znamená atóm uhlíka, na ktorom je skupina viazaná, symbol R₅ znamená atóm vodíka alebo definovanú oxykarbonylovú skupinu a symbol R$ znamená atóm vodíka, atóm halogénu, skupinu hydroxy, alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka alebo alkoxyskupinu s 1 až 4 atómami uhlíka, a jeho derivát s Boc-chrániacimi skupinami a jeho farmaceutický vhodné soli.

2. Derivát peptidu podľa nároku 1 všeobecného vzorca (I)

I H (L) H NH —N -CH—(CHj),—N—C -NH, Ó-O i

H

A (ÍH) < I)» v ktorom symbol A znamená

1. skupinu všeobecného vzorca

Rt

I

R — C —

I v ktorom R znamená fenylovú skupinu všeobecného vzorca v ktorom a a a' znamenajú nezávisle od seba atóm vodíka, alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka, alkoxyskupinu s 1 až 4 atómami uhlíka, atóm halogénu, trifluórmetylovú skupinu, skupinu hydroxy, hydroxymetylovú skupinu, aminoskupinu alebo aminometylovú skupinu; alebo R znamená skupinu tienylovú, íurylovú alebo naftylovú alebo skupinu naftylovú monosubstituovanú alebo disubstituovanú alkylovou skupinou s 1 až 4 atómami uhlíka, alkoxyskupinou s 1 až 4 atómami uhlíka, atómom halogénu, aminoskupinou, monoalkylaminoskupinou s 1 až 4 atómami uhlíka v alkylovej časti, dialkylaminoskupinou s 1 až 4 atómami uhlíka v alkylových častiach alebo skupinou hydroxy; alebo R znamená skupinu cyklohexadienylovú, cyklohexenylovú, cyklohexylovú alebo cyklopentylovú,

R¹ predstavuje atóm vodíka, metylovú alebo etylovú skupinu,

-N(R₂)(R₃), v ktorom

RrO-C(O)-, v ktorom

R4 znamená alkylovú skupinu s 1 až 6 atómami uhlíka, alkenylovú skupinu s 2 až 6 atómami uhlíka, cykloalkylovú skupinu s 3 až 7 atómami uhlíka, skupinu benzylovú, nitrobenzylovú, difenylmetylovú alebo fenylovú definovanú, s podmienkou, že keď R₍ znamená metylovú alebo etylovú skupinu, potom B neznamená metylovú alebo etylovú skupinu, alebo A znamená

2. 1-aminocyklohexylovú alebo 1-aminocyklopentylovú skupinu, pričom aminoskupinou je skupina vedeného a definovaného všeobecného vzorca

-N(R₂) (R₃) alebo symbol A znamená

3. bicyklickú skupinu všeobecného vzorca

O v ktorom symbol C znamená atóm uhlíka, na ktorom je skupina viazaná, symbol R₅ znamená atóm vodíka alebo definovanú oxykarbonylovú skupinu a symbol R« znamená atóm vodíka, atóm halogénu, skupinu hydroxy, alkylovú skupinu s 1 až 4 atómami uhlíka alebo alkoxyskupinu s 1 až 4 atómami uhlíka, a jeho derivát s Boc-chrániacimi skupinami a jeho farmaceutický vhodné soli.

3. Derivát peptidu podľa nároku 1 všeobecného vzorca (I), v ktorom symbol A znamená skupinu všeobecného vzorca

Rt

I

R — C —

I

B

SK 281731 Β6 v ktorom symboly R, R_b a B a ostatné skupiny majú význam uvedený v nároku 1.

4. Derivát peptidu podľa nároku 3 všeobecného vzorca (I), v ktorom symbol B znamená skupinu všeobecného vzorca -N(R₂)(R₃) v ktorom symboly R₂, R₃ a ostatné skupiny majú význam uvedený v nároku 1.

5. Derivát peptidu podľa nároku 4 všeobecného vzorca (I), ktorým je N-Boc-D-fenylglycyl-l-prolyl-l-arginínaldehyd a jeho farmaceutický vhodné soli.

6. Derivát peptidu podľa nároku 4 všeobecného vzorca (I), ktorým je N-metyl-D-fenylglycyl-l-prolyl-1-argininaldehyd a jeho farmaceutický vhodné soli.

7. Derivát peptidu podľa nároku 1 všeobecného vzorca (I), v ktorom symbol A znamená bicyklickú skupinu podľa nároku 1 a jeho farmaceutický vhodné soli.

8. Derivát peptidu podľa nároku 7 všeobecného vzorca (I), ktorým je DL-l,2,3,4-tetrahydroizochinolín-1 -oyl-1 -prolyl-1 -arginínaldehydsulfát

9. Derivát peptidu podľa nároku 7 všeobecného vzorca (I), ktorým je D-l,2,3,4-tetrahydroizochinolín-l-oyl-l-prolyl-l-arginínaldehydsulfát.

10. Derivát peptidu podľa nároku 7 všeobecného vzorca (I), ktorým je zlúčenina vzorca

15. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje ako účinnú látku derivát peptidu podľa nárokov 1 až 12, v ktorom jednotlivé symboly majú význam uvedený v nárokoch 1 až 12, spoločne s jedným alebo s niekoľkými farmaceutický vhodnými nosičmi, excipientmi alebo rozpúšťadlami.

Koniec dokumentu a jej farmaceutický vhodné soli.

11. Derivát peptidu podľa nároku 7 všeobecného vzorca (I), ktorým je zlúčenina vzorca a jej farmaceutický vhodné soli.

12. Derivát peptidu podľa nároku 7 všeobecného vzorca (I), ktorým je D-l,2,3,4-tetrahydroizochinolín-3-oyl-l-prolyl-l-arginínaldehyd a jeho farmaceutický vhodné soli.

13. Derivát peptidu alebo niektorá z jeho fyziologicky prijateľných solí podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 12 všeobecného vzorca (I) na použitie ako účinné látky na prípravu farmaceutický použiteľného prostriedku na liečenie trombóz.

14. Spôsob prípravy sulfátovej soli derivátu peptidu L-arginínaldehydu podľa nárokov 1 až 12, vyznačujúci sa tým, že sa derivát peptidu chromatografuje na reverznom fázovom vysokotlakovom kvapalinovom chromatografe gradientovým vymývaním, s gradientom pri obsahu organickej fázy v objemovom množstve 2 až 10 % acetonitrilu ako elučného činidla vo vodnej fáze obsahujúcej kyselinu sírovú pri hodnote pH 2 až 3, hodnota ph eluátu sa nastaví na 4 až 6 bázickou živicou nerozpustnou vo vode a od eluátu sa oddelí živica a voda.