CN1036399C

CN1036399C - 三肽抗凝血酶剂的制备方法

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Publication number: CN1036399C
Application number: CN91109042A
Authority: CN
Inventors: P·D·格塞尔兴; R·T·舒曼
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 1991-09-27
Publication date: 1997-11-12
Anticipated expiration: 2006-09-27
Also published as: IE913423A1; EP0837071A1; AU8478091A; DE69132884D1; JP3023019B2; NO309984B1; EP0684258A2; CS291391A3; EP0479489A2; NZ239907A; CZ285980B6; EP0684258A3; EP0479489B1; CN1060472A; NO913773D0; ATE211147T1; FI107733B; CA2052013C; BR9104181A; ATE234857T1

Abstract

本发明公开了下式1的凝血酶抑制剂，其中各基团如说明书所示。还公开了一种抑制在人和动物体内形成血块的方法，包括给人和动物施用式1的凝血酶抑制剂。还公开了该方法所用的药物组合物。

Description

三肽抗凝血酶剂的制备方法

本发明涉及可用作人和动物抗凝血剂的凝血酶抑制剂。具体地讲，本发明涉及具有高的抗凝血酶活性的二肽L-脯氨酸-L-精氨醛的衍生物。

目前，对凝血酶的抑制是通过服用肝素和香豆素实现的。这些药剂的作用机理业已做了多方面的深入研究。肝素只能肠胃外给药，而且必须仔细控制给药量。香豆素的作用机理是阻止或抑制形成凝血酶原，而且需要一段时间才能获得最大药效。

虽然肝素和香豆素均是有效的抗凝血剂，但仍需要这样的抗凝血酶剂，它们可很快地防止形成血块，而且在溶解存在的血块时不干扰血纤维蛋白溶酶的作用。

下式1代表了本发明提供的凝血酶抑制化合物及其药用无毒盐：其中A是1)下式基团

式中R是下式的苯基

式中a和a′相互无关地是氢，低级烷基，低级烷氧基，卤素，三氟甲基，羟基，羟甲基，氨基或氨甲基；或R是噻吩基，呋喃基，萘基或由一个或二个低级烷基、低级烷氧基、卤素、氨基或一-或二-(低级烷基)氨基或羟基取代的萘基；或R是环己二烯基，环己烯基，环己烷基或环戊基；

R₁是氢，甲基或乙基；

B是低级烷基，低级烷氧基，羟基或下式的氨基：

-N(R₂)(R₃)式中R₂和R₃相互无关地是氢或低级烷基，或R₂是氢且R₃是乙酰基，卤乙酰基或下式的氧代羰基：

R₄-OC(O)-式中R₄是C₁-C₆烷基，C₂-C₆链烯基，C₃-C₇环烷基，苄基，硝基苄基，联苯甲基，或上述定义的苯基；条件是R₁为甲基或乙基时，B不为甲基或乙基；或A是

2)1-氨基环己基或1-氨基环戊基，其中该氨基是上述定义的-N(R₂)(R₃)基团；或A是

3)式2的双环基

式中Q是由、-CH₂-和

表示的一碳基团；或由-CH₂-CH₂-、

或

表示的二碳基团；Y是由-CH₂-、表示的一碳基团；或由

表示的二碳基团；条件是Q和Y之一(不是Q和Y这两者)为

或；另外，Q和Y中只有一个是二碳基团；

R₅是氢或上述定义的氧代羰基；以及，R₆是氢，卤素，羟基，低级烷基或低级烷氧基，在双环基的6-元环内，虚线的环代表芳环或全氢环。

式1代表的酞类是有效的抗凝血酶剂，而且可用作组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)、链激酶或尿激酶治疗用的助剂。

本发明的化合物是采用传统偶合法制备的。例如，Boc-D-Phg与L-脯氨酸偶合成Boc-D-Phg-Pro酯。除去酯基，Boc-D-Phg-Pro与内酰胺形式的L-精氨酸偶合，得到氨基被保护形式的Boc-D-Phg-Pro-Arg内酰胺。Arg内酰胺环经还原而打开，除掉精氨酸氨基保护基之后，得到Boc-D-Phg-Pro-Arg醛。使肽转化成合适的盐形式，如乙酸盐和硫酸盐。

本发明还提供了一种防止人和动物体内形成血块的方法，和该方法中所用的药物配方。

式1表示的本发明的化合物，是当A是氨基酸残基如苯基甘氨酰(Phg)时是三肽类；当A不是氨基酸残基，如当B是不为氨基或烷基氨基的基团时，化合物是二肽脯氨酸和精氨醛(Pro-Arg-H)的N-酰基衍生物。如式1所示，A(C＝0)部分的对称中心是R或RS，而脯氨酸和精氨醛部分的对称中心是L。

式1所用的术语定义如下：

低级烷基指的是直链或支链C₁-C₄烷基、如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基等等。

低级烷氧基指的是C₁-C₄烷氧基，如甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基等等。

卤素指的是氟，氯，溴或碘。

一或二-(低级烷基)氨基指的是诸如甲氨基，乙氨基，二甲氨基，甲基乙氨基，二乙氨基，正丁氨基，正丙氨基之类的基团。

术语“C₁-C₆烷基”指的是直链和支链的烷基，如以上定义的C₁-C₄烷基，除此之外，还有正戊基，异戊基，正己基，异己基等等。“C₂-C₆链烯基”指的是这样的烯基，如乙烯基，烯丙基，丁烯基，异丁烯基和己烯基。“C₃-C₇环烷基”指的是具有3-7个环碳原子的环烃基，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。

正如式1定义的那样，当A是(R)(R₁)(B)C-基时，R可以是被一或二取代基取代的苯基。这样的苯基的例子是苯基(a和a＇＝H)，4-甲基苯基，3-乙基苯基，4-甲氧基苯基，3-甲氧基苯基，3-乙氧基苯基，2-甲氧基苯基，3-异丙氧基苯基，4-羟基苯基，4-氯苯基，3-氯苯基，2-氟苯基，3-氟苯基，3-溴苯基，4-氟苯基，3-氟甲基苯基，4-三氟甲基苯基，4-羟基甲基苯基，2-羟基甲基苯基，3-氨基苯基，4-氨基苯基，3-氨基-4-氯苯基，3，4-二氯苯基，3-羟基-4-氟苯基，3-羟基-4-甲基苯基，3-甲氧基-4-羟基苯基，3-氯-4-乙氧基苯基，以及类似的一或二-取代的苯基。

当R是萘基或一或二-取代的萘基时，R基的例子是1-萘基，2-萘基，6-甲氧基-2-萘基，8-羟基-1-萘基，8-氨基-2-萘基，4-甲基-1-萘基，6-氯-2-萘基，4-羟基-6-乙氧基-2-萘基，8-甲氨基-4-氯-2-萘基，6，8-二甲氧基-2-萘基，6-乙基-1-萘基，4-羟基-1-萘基，3-甲氧基-1-萘基，和类似的萘基。

当B是氨基-N(R₂)(R₃)时，式1表示的基团的例子是氨基(R₂＝R₃＝H)，甲氨基，乙氨基，异丙氨基，二甲氨基，和类似的氨基；当R₂是氢且R₃是氧羰基R₄-O-C(O)-时，这样的基团的例子是C₁-C₆烷氧羰基氨基，如甲氧羰基氨基，乙氧羰基氨基，叔丁氧羰基氨基，异戊氧羰基氨基等等；C₂-C₆链烯氧羰基氨基，如乙烯氧羰基氨基，烯丙氧羰基氨基，2-丁烯氧羰基氨基等等；C₃-C₇环烷氧羰基氨基，如环丙氧羰基氨基，环戊氧羰基氨基，环己氧羰基氨基等等。术语B表示的氧羰基氨基还包括例如苄氧羰基氨基，4-硝基苄氧羰基氨基，二苯基甲氧羰基氨基，苯氧羰基氨基，或其中取代的苯基部分定义如上的取代的苯氧羰基氨基等等。

当A是1)式(R)(R₁)(B)C-基团时，式1的A(C＝0)基的例子是苯基甘氨酰，3-甲氧基苯基甘氨酰，4-甲氧基苯基甘氨酰，4-氯苯基甘氨酰，3，4-二氯苯基甘氨酰，3-三氟甲基苯基甘氨酰，N-(叔丁氧羰基)苯基甘氨酰，N-(叔丁氧羰基-N-甲基)苯基甘氨酰，α-甲基苯基乙酰，α-乙基苯基乙酰，α-甲氧基苯基乙酰α-异丙氧基苯基乙酰，1-萘基甘氨酰，2-萘基甘氨酰，N-(叔丁氧羰基)-2-萘基甘氨酰，2-噻吩基甘氨酰，3-噻吩基甘氨酰，N-(环戊基氧羰基)-2-噻吩基甘氨酰，2-呋喃基甘氨酰，N-乙基-2-呋喃基甘氨酰，扁桃酰，4-氯扁桃酰，3-甲氧基扁桃酰，α-羟基-α-(2-萘基)乙酰，α-羟基-α-(2-噻吩基)乙酰，1，4-环己二烯基甘氨酰，1-环己烯基甘氨酰，N-(叔丁氧羰基)-1，4-环己二烯基甘氨酰，环己基甘氨酰，以及类似的A(CO)基。

式1中A是一个非手性的1-氨基环戊基或1-氨基环己基所表示的肽化合物用以下结构式叙述：其中P是碳-碳键或-CH₂-；R₂和R₃有如上所限定的相同定义。这类三肽的例子是N-(1-氨基环己酰)-Pro-Arg-H，N-(1-氨基环己酰)-Pro-Arg-H；N-(1-甲氨基环己酰)-Pro-Arg-H，N-(1-叔丁氧羰基氨基环己酰)-Pro-Arg-H，等等。

由式1(其中A是由前式2表示的双环基)表示的肽的例子是下述Pro-Arg-H的D-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-基羰基和D-1，2，3，4-四氢异喹啉-3-基羰基N-酰基衍生物，

下述二氢异吲哚-1-基羰基衍生物，

下式表示的氧代衍生物，及其全氢衍生物。术语R₅和R₆定义如上。R₅优选是氢，R₆优选是氢，甲氧基，乙氧基，氯或甲基。

本发明的肽的药用盐包括无机酸和羧酸形成的酸加成盐。成盐无机酸的例子是氢囟酸，如氢氯酸和氢溴酸；磷酸和硫酸。羧酸盐是用以下的酸形成的，如乙酸、丙酸、丙二酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、苯甲酸、富马酸，以及类似的羧酸。这类酸加成盐是按照普通方式制备的，例如用酸中和化合物1的游离碱形式。优选酸加成盐是硫酸盐和盐酸盐。

本发明的优选实施例是这样的式1表示的化合物，其中A是

其中R是下式苯基

或萘基或取代的萘基，R₇是氢，且B是氨基-N(R₂)(R₃)。进一步优选的化合物是R₂氢且R₃是氧羰基R₄O-C(O)-时所表示的化合物。

本发明另一优选实施例包括这样的式1化合物，其中A是双环基(2)。8该实施例优选化合物是当A(C＝0)是1，2，3，4-四氢异喹啉-1-基羰基(式2，Q＝-CH₂-CH₂-，

，而R₅＝R₆＝H)和1，2，3，4-四氢异喹啉-3-基羰基(式2，

，Y＝-CH₂-)时式1所表示的化合物。

式1表示的化合物较好是采用肽偶合的公知方法加以制备。按照一种这样的方法，酸A-COOH(其中A按式1定义)与羧基被保护的脯氨酸偶合成二肽(当A是氨基酸时)或N-酰基脯氨酸酯(当A不是氨基酸时)。除去产物脯氨酸部分的羧基保护酯基，游离酸形式的二肽与内酰胺形式的精氨酸偶合。上述反应顺序用以下方案加以说明。

其中P代表氨基保护基。

偶合的Arg(P)内酰胺产物(C)在一隋性溶剂中用氢化铝锂还原以裂解内酰胺环，得到以下式表示的精氨醛形式的三肽

A(C＝0)-Pro-Arg(P)-H其中Arg(P)-H代表氨基被保护的精氨醛。

内酰胺形式的精氨酸是通过分子内偶合氨基被保护的精氨酸[ArgOH]得到的。例如，先使下式表示的Boc-Arg(Cbz)OH

转化成活性酯形式，如氯甲酸酯(如氯甲酸乙酯至氯甲酸异丁酯)的活性混合型酸酐。成酯作用是在N-甲基吗啉之类的叔胺存在下进行的。加入较强叔胺碱(如三乙胺)进行内酰化，得到以下内酰胺形式的二-氨基被保护的精氨酸。

如上方案所示，在用于与A(C＝0)-Pro-OH偶合之前，Boc保护基选择性地用三氟乙酸除去，得到所需的自由氨基。

当A是氨基酸残基时通过先保护氨基酸的氨基来进行ACOOH化合物与脯氨酸酯的偶合反应。所应用的是常用于临时保护或阻碍氨基的传统氨基保护基。这样的保护基的例子有烷氧基，烯氧基，环烷氧基和芳氧羰基，如乙氧羰基、叔丁氧羰基、环己基氧羰基、金刚烷氧羰基、三氯乙氧羰基、苄氧羰基、二苯基甲氧羰基和类似基团。在偶合反应中用于保护脯氨酸的羧基的酯基可以是任何常用的易于除去的酯基，如叔丁基、苄基、对硝基苄基、对甲氧基苄基、联苯甲基、三氯乙基、苯甲酰甲基或三烷基甲硅烷基的酯。在进行偶合反应中，使用一种在氨基保护基原封不动的条件下易除去的用于脯氨酸的酯基。因此，在后续的与精氨酸内酰胺化合物偶合而形成C的过程中，酰化酸ACOOH的氨基保护基原处不动用于保护氨基。

由式1表示的其中A是(R)(R₁)(B)C-且B是氨基-N(R₂)(R₃)(其中R₂是氢，R₃是低级烷基)的化合物，是按公知的烷基化法、使用其中B是氨基的相应化合物制备的。例如，采用以下还原性烷基化法制备N-甲基-D-苯基甘氨酰-L-脯氨酰-L-精氨醛。使用二环己基碳化二亚胺(DCC)和羟基苯并三唑(HOBt)，将Cbz保护的D-苯基甘氨酸在DMF中与L-脯氨酸叔丁酯偶合，以形成二肽Cbz-D-苯基甘氨酰-L-脯氨酸叔丁酯。肽在乙醇中用钯-碳催化剂氢化，以除去Cbz保护基，向还原混合物中加入甲醛并持续氢化以形成N-甲基-D-苯基甘氨酰-L-脯氨酸叔丁酯。通过使二肽叔丁酯与氯甲酸苄基酯在含N-甲基吗啉的T HF中反应以形成N-Cbz-N-甲基-D-苯基甘氨酰-L-脯氨酸叔丁酯，以便用Cbz基保护苯基甘氨酰的N-甲基仲氨基。在室温及含苯甲醚的三氟乙酸中除去叔丁酯基，以得到N-Cbz-N-甲基-D-苯基甘氨酰-L-脯氨酸。然后，将后面的二肽偶合到被Cbz-保护的Arg内酰胺上，而内酰胺环还原性地开环成上述Arg醛。通过Pd/C催化剂氢化除三肽的两个Cbz保护基，得到N-甲基-D-苯基甘氨酰-L-脯氨酰-L-精氨醛。

通过还原由低级烷基醛与氰基硼氢化钠形成的亚胺，可制备式1中A是(R)(R₁)(B)C-且R是环己二烯基或环己烯基以及B是烷氨基-N(R₂)(R₃)的化合物。类似地，可以用低级烷基碘和氢化钠进行这类N-烷基化反应。

式1中A是双环基(2)的化合物按上述同样偶合法制备。例如，通过用1，2，3，4-四氢-1-羧基异喹啉的活性衍生物酰化脯氨酸酯如苄基酯，可得到其中A代表1，2，3，4-四氢异喹啉-1-基的式1的肽。可使用的活性衍生物包括酰卤，如酰氯或酰溴，酰基叠氮，以及活性酯和酸酐，如那些用上述氯甲酸酯形成的酸酐。四氢异喹啉(式2，R＝H)的环氮在酰化偶合中被保护或烷基化。例如，在脯氨酸酯的酰化中，使用由氯甲酸异丁酯形成的N-Boc-1，2，3，4-四氢-1-羧基-异喹啉的活性酯。使肽产物N-Boc-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-基羰基脯氨酸酯脱酯化，游离酸转化为活性酯，后者再偶合成精氨酸的内酰胺形式。之后，使内酰胺产物转化为上述醛形式，以得到式1的化合物，即Boc-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-基羰基-Pro-Arg-H。

由式2代表的全氢双环基是用传统工序，进行部分还原的或不饱和酸的氢化作用制备的。例如，1，2，3，4-四氢异喹啉-1-羧酸在乙醇或乙酸之类的溶剂中用氧化铂氢化，得到全氢(十氢)异喹啉-1-羧酸。然后，如上所述在脯氨酸酯的酰化中使用全氢酸。这种用式1表示的全氢衍生物的例子是N-(D-十氢异喹啉-1-酰基)-L-脯氨酰-L-精氨醛和N-(D-十氢异喹啉-3-酰基)-L-脯氨酰-L-精氨醛。

上述偶合反应是在冷条件下进行，优选在约-20℃-约15℃下进行；而且在一惰性有机溶剂，如二甲基甲酰胺，二甲基乙酰胺，四氢呋喃，二氯甲烷，氯仿，和类似的普通溶剂中进行。一般来说，在偶合反应中使用酰化酸的活性酯时，采用无水条件。

本发明的化合物最好以酸加成盐的形式分离。式1化合物的盐是用例如前述酸形成的，作为抗凝血酶剂和制备这些药剂配方的药用盐施用。在分离和纯化肽中也可以制备和使用其它酸加成盐。例如，也可以如此使用由磺酸(如甲磺酸，正丁磺酸，对甲苯磺酸和萘磺酸)-制成的盐。

分离和纯化式1代表的化合物、同时制备所需稳定盐形式的优选方法在共同未决申请(申请号)中有说明。按照该方法，无机酸的稳定盐(如硫酸盐和盐酸盐)是利用C₁₈反相色谱法的制备性纯化提供的。水相含浓度约0.01％-约0.05％的硫酸或盐酸，乙腈、THF、甲醇或其它适合的溶剂则用作有机组分。酸性洗脱液的pH调节到约pH4-约pH6；对于碱性树脂，如羟基形式的Bio-Rad AG-1X8，精确的pH是具体肽的函数。pH调节之后，三肽盐(如硫酸盐或盐酸盐)的溶液被冻干，以得到纯化盐的干粉形式。在该方法的实例中，混杂有立体异构体D-Arg-H硫酸盐的粗的D-Phg-L-Pro-L-Arg-H硫酸盐溶于约0.01％硫酸，并将溶液载于Vydac C RP-HPLC柱上。在10小时内，用在0.01％硫酸中的2-10％乙腈来梯度洗脱柱子。收集多次级份，把那些含有按分析反相高效液体色谱法测定为所需的产物合并。用在羟基循环中的Bio-Rad AG＝1X8树脂将合并级份的pH值调节到约pH4，0-约4.5。过滤后，冻干溶液，得到纯的D-Phg-L-Pro-L-Arg-H硫酸盐。

本发明提供的化合物(式1)抑制了凝血酶在人和动物体内的作用，通过凝血酶的酰胺酶活性的体外抑制作用证明了凝向酶的抑制作用。下表1列出了试验化合物(抑制剂)和凝血酶之间的相互作用的表观平衡常数(Kass)。表中数据是以分析法得到的，其中凝血酶使显色物质--N-苯甲酰-D-苯基丙氨酰-L-缬氨酰-L-精氨酰-对-硝基酰苯胺水解。

该分析法是在50μl缓冲液(0.03M Tris，0.15M Nacl，pH7.4)和150μl显色底物的水溶液(浓度0.25mg/ml)中进行的，在缓冲液中具有25μl凝血酶溶液(0.21mg/ml凝血酶粉的0.06M Tris、0.3M Nacl、pH7.4的溶液)。加入不同浓度的试验化合物溶液(25μl)。通过检测在405nm释放的对硝基苯胺来测定底物的水解率。绘制游离凝血酶浓度对水解速率的曲线来建立标准曲线。之后，在各次分析中使用标准曲线将观察到的试验化合物的水解速率，转化成“游离的凝血酶”值。通过从分析法使用的已知初始量的凝血酶量中减去各次分析法中观察到的游离凝血酶的量，计算出结合的凝血酶(结合到试验化合物上)。在各次分析中游离抑制剂的量的计算方法是从所加抑制剂(试验化合物)的摩尔数中减去结合的凝血酶的摩尔数。

Kass值是凝血酶和试验化合物(I)之间反应的假想平衡常数。

计算试验化合物浓度范围内的Kass值，平均值以升/摩尔的单位报道。

表1

凝血酶酰胺酶活性的抑制

凝血酶酰胺酶试验抑制剂¹A(C＝0)- Kass×10⁶(升/摩尔)D-苯基甘氨酰 75N-Boc-D-苯基甘氨酰 88N-Boc-D-苯基甘氨酰 73N-Boc-D-苯基基氨酰(硫酸盐) 107N-Boc-D-(4-羟基)苯基甘氨酰 115N-Boc-D-(4-甲氧基)苯基甘氨酰 75N-Boc-DL-(3，4-二氯)苯基甘氨酰 40N-乙酰基-D-(4-甲氧基)苯基甘氨酰 15.5N-Boc-D-1-萘基甘氨酰 52N-Boc-DL-2-萘基甘氨酰 22.2N-Boc-DL-1-萘基甘氨酰 18.1

表1(续)

凝血酶酰胺酰活性的抑制

凝血酶酰胺酶试验抑制剂¹A(C＝0)- Kass×10⁶(升/摩尔)N-Boc-D-(6-甲氧基)-2-萘基甘氨酰 6.1N-Boc-D-2-噻吩基甘氨酰 14N-Boc-D-环己基甘氨酰 120N-甲基-D-苯基甘氨酰 91.5N-Boc-N-甲基-D-苯基甘氨酰 5.2(R)-α-甲基苯基乙酰 11.0(R)-α-乙基苯基乙酰 7.5(R)-α-甲氧基苯基乙酰 4.2(S)-α-甲基苯基乙酰 0.2N-Boc-DL-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-基羰基 3.8DL-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-基羰基 87.71/A(C＝0)指的是式1。除非另外注明，试验化合物呈乙酸盐形式。

在标准试验中，已测定了本发明化合物的抗血凝剂活性。下表2表示了在用于测定凝血酶原时间、凝血酶时间和活化部分的促凝血酶原激酶时间(APTT)的试验中用本发明的代表性化合物得到的数据。表中数据是三个试验中延长2倍絮凝时间所需的试验化合物的浓度(ng/ml)。凝血酶时间评定是在血浆中进行的，并单独在pH-7.5的缓冲系统中测定。

表2

凝血酶抑制剂的抗凝血剂活性

试验抑制剂¹ 血浆絮凝分析² 缓冲液(pH7.5)²

A(C＝0) 凝血酶原时间 APTT³ 凝血酶时间凝血酶时间D-苯基甘氨酰 91 1139 91 NA⁴N-Boc-D-苯基甘氨酰⁵ 667 1169 110 118N-Boc-D-(4-甲氧基)苯基甘氨酰 NA 640 80 NAN-Boc-D-(4-羟基)苯基甘氨酰 1636 1091 182 NAN-Boc-DL-1-萘基甘氨酰 1136 2272 320 112N-Boc-D-1-萘基甘氨酰 1225 3100 230 105N-Boc-D-2-萘基甘氨酰 1200 1200 230 142N-Acetyl-D-(4-甲氧基)苯基甘氨酰 900 2600 160 NAN-Boc-D-(6-甲氧基)-2-萘基甘氨酰 35489 2239 460 466N-Boc-D-环己基甘氨酰 522 748 79 60N-Boc-N-甲基-O-苯基甘氨酰 300 4545 300 NAN-甲基-D-苯基甘氨酰 899 ＞909 92 67(R)-α-乙基苯基乙酰 700 2275 115 NA(R)-α-甲氧基苯基乙酰＞909 ＞909 139 1731/A(C＝0)为式12/延长2倍絮凝时间所需的试验化合物的浓度(ng/ml)3/APTT＝活化的部分促凝血酶原激酶4/NA＝未得到5/这些值是8次分析的平均值

表2提供的数据是使用Tecan有限公司出售的CoaScreener仪器得到的，分析记要如下。

凝血酶原时间：50μl血浆

50μl盐水

7μl试验溶液

50μl促凝血酶原激酶(Dade)

凝血酶时间：50μl血浆

50μl盐水

7μl试验化合物

50μl牛凝血酶(2NIH单位/毫升)

在pH7.4的缓冲溶液中测定凝血酶时间，应用血纤维蛋白原代替血浆。

APTT：50μl血浆

50μl肌纤蛋白(Dade)

7μl试验溶液

50μl氯化钙(0.01M)

对大鼠进行体内试验，测定本发明代表性化合物的抗凝血酶剂活性。该试验是在大鼠的颈动脉中采用诱发的动脉血栓形成，并测定堵塞后55分钟维持血流所需的试验化合物的浸入剂量。该试验按以下方法进行。

在大鼠中通过伤害颈动脉诱发动脉血栓形成。用相关的氯化铁溶液损伤脉管。用甲苯噻嗪(20mg/kg)、然后用克他命盐酸化物(100mg/kg，s.c.)麻醉Sprague-Dawley雄鼠(375-450g)。把动物放在水外套中，其内循环水温保持在37℃。颈动脉趋近中线颈切口。用纯头解剖刀仔细从颈动脉外皮暴露和分离出血管。在动脉下，拉出丝缝合线以升起血管以提供在其下插入热电偶的间隙。在具有油墨书写记时器的条带图记录器上，监测血管温度的变化情况。用小镊子把Wha(man №1滤纸的盘形物(直径3mm)浸入FeCl₃溶液(35％)。采用卡在钻压机中的锐利的不锈钢管(3mm i.d.)，把盘形物切成等尺寸。把饱和盘形物放在热电偶上的各颈动脉上。施用FeCl₃和温度突然降低之间的时间记录为血管堵塞的时间(TTO)。用各血管堵塞所需的平均时间代表各动物的TTO。

将试验化合物溶于等渗盐水中。在施用FeCl₃之前15分钟开始，用注射泵注入药液，并在施用FeCl₃后持续60分钟。绘制药剂量-应答曲线，以确定注入的剂量(Log₁₀)与损伤的动脉的TTO之间的关系。通过计算维持50分钟血流(ED50分钟)所需的注入剂量，从曲线测定抗凝血酶活性的比较指数。

通过在同一记录器上同时记录温度和血流，建立血管堵塞和温度突降之间的联系。在最接近热电偶的颈动脉附近，放一个脉冲式Doppler探针。探针记录流速的变化情况，因此，它被安装在不形成血栓的点处，血管的内径因随血流膨胀而保持恒定。在施用35％氯化铁之前，记录基线温度和流速(用Iowa生物工程大学制造的Directional_PulsedDoppler Flower，Model 545-C测定)，从起始的基线值(阻塞前6分钟)以百分数变化的形式报道结果。血管温度突降的时间任意指定为0，堵塞之前和之后的温度与血流值以此点作参考。

下表3含有在大鼠体内用试验化合物以上述化学诱发的血栓试验所得的结果。

表3

大鼠体内抗凝血酶活性对动脉血栓形成

式1的试验化合物A(C＝0) ED₅₀ ¹(mg/kg/h)

N-Boc-D-苯基甘氨酰 2.9

N-Boc-D-环己基甘氨酰 11.3

N-Boc-D-1-萘基甘氨酰 6.4

N-Boc-DL-1-萘基甘氨酰 5.5

N-Boc-D-2-萘基甘氨酰 NA²

1/ED₅₀是维持50分钟血流所需的注入剂量。

2/在4mg/kg/h或在试验最高剂量7mg/kg/h不具活性。

本发明的化合物抑制了血块形成，而不会显著干扰天然血块溶解能力，例如这类化合物对血纤维蛋白溶解具有很低的抑制作用。

本发明的另一方面，提供了一种抑制人和动物体内形成血块的方法，该方法包括给所述人和动物服用一种能有效抑制血块的、无毒剂量的式1表示的化合物。抗凝血酶化合物可通过口服、肠胃外[如静脉注射(iv)，肌内注射(im)]或皮下给药(sc)。给药方式最好选择静脉注射(iv)。

抑制血块有效剂量为约5mg-约1000mg。剂量方案可以变化，例如对于预防用，可以每日一剂给药，也可以每日多剂给药，例如：每日3-5次都可能是合适的。对于危急治疗情况，本发明的化合物以约1mg/kg/h-约50mg/kg/h、优选约2.5mg/kg/h-约25mg/kg/h的速率，通过静脉注射(iv)而给药。

本发明的方法在实施上也可配合使用一种血块溶解剂，如组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)、改性tPA、链激酶或尿激酶。在血块已经形成，动脉或静脉部分或全部堵塞的情况下，一般使用一种血块溶解剂。本发明的化合物可与该溶解剂一起给药，或在之后给药以防止血块形成重复发生。

在实施本方法中，使用本发明优选化合物较为合意。举例来说，使用上述优选化合物。优选肽是N-Boc-D-苯基甘氨酰-L-脯氨酰-L-精氨醛和N-甲基-D-苯基甘氨酰-L-脯氨酰-L-精氨醛，它们呈盐形式，如硫酸盐或盐酸盐。本方法使用的特别优选的本发明化合物是N-(D-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-酰基)-2-脯氨酰-2-精氨醛硫酸盐。

本发明还提供了用于上述治疗方法的药物组合物。本发明的药物组合物包括一种抑制血块有效量的用式1表示的化合物和一种药用载体。对口服来说，抗凝血酶化合物配制在明胶囊或含有粘合剂、润滑剂、崩解剂之类的赋形剂的片剂中。对肠胃外给药，抗凝血酶化合物配制在药用稀释剂中，例如，生理盐水(0.9％)、5％葡萄糖、Ringer溶液等等。

本发明的化合物可以配成含剂量为约1mg-约1000mg的单位剂量配方的形式。化合物优选呈药用盐的形式，如硫酸盐、乙酸盐或磷酸盐。单位剂量配方的例子包括5mg N-Boc-D-苯基甘氨酰-L-脯氨酰-L-精氨醛硫酸盐于10ml无菌玻璃安瓿中。另一单位剂量配方的例子包括10mg N-甲基-D-苯基甘氨酰-L-脯氨酰-L-精氨醛硫酸盐于含有等渗盐水的20ml无菌安瓿中。

优选配方是在无菌安瓿中含有5mg-50mg N-(D-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-酰基-L-脯氨酰-L-精氨醛硫酸盐的单位剂量形式。

以下实施例旨在进一步说明本发明，而不是限制本发明。

在以下实施例中，Rf值是采用硅胶薄层色谱法，在以下溶剂系中用Kieselgel 60F-254(Merck，Darmstadt)测定的：

(A)氯仿-甲醇-乙酸，135∶15∶1(V∶V∶V)

(B)乙酸乙酯-乙酸-无水乙醇 90∶10∶10(V∶V∶V)

(C)氯仿-甲醇-乙酸90∶30∶5(V∶V∶V)

在实施例中所用的分析HPLC法如下：

方法1：使用Vydac C反相柱(0.46cm×10cm)的水600E。采用梯度为A＝0.01M乙酸铵和B＝乙腈，在200nM LDC上监测色谱。

方法2：采用PepRPC(测量为0.5cm×5.0cm)的Pharmacia FPLC。采用梯度为A＝0.01M乙酸铵或B＝乙腈，在214nM Pharmacia UV-M上进行监测。

在实施例中所用的缩略语意义如下。

氨基酸：Arg＝精氨酸，Pro＝脯氨酸，Phg＝苯基甘氨酸

Boc＝叔丁基氧羰基

Bzl＝苄基

Cbz＝苄氧羰基

DCC＝二环己基碳化二亚胺

DMF＝二甲基甲酰胺

DMSO＝二甲亚砜

FAB-MS＝快原子轰击质谱

FD-MS＝场解吸质谱

THF＝四氢呋喃

TLC＝薄层色谱

实施例1

N-Boc-D-苯基甘氨酰-L-脯氨酰-L-精氨醛(Boc-D-Phg-Pro-Arg-H)半硫酸盐

(1)Boc-D-Phg-Pro-OBzl

将Boc-D苯基甘氨酸(15.0g，59.7mmole)和脯氨酸苄基酯盐酸化物(14.43g，59.7mmole)的60ml DMF溶液冷却到0℃，并加入N，N-二异丙基乙胺(10.3ml，59.7mmole)，然后加入1-羟基苯并三唑水合物(8.1g，59.7mmole)和DCC(12.3g，59.7mmole)。室温搅拌反应混合物3天后，将其过滤，滤液在真空下蒸发成油状物。将后者溶于200ml乙酸乙酯和150ml水，摇动后分出有机层，将其用100ml份0.1NHCl洗三次，用150ml水洗一次，用100ml份5％碳酸氢钠洗三次，再用150ml水洗一次。洗过的有机溶液用硫酸镁干燥，然后真空蒸发得到24.8g Boc-D-Phg-Pro-OBzl固体(95％理论值)：TLC(Rf(A)0.75；FAB-MS439(M+)。

(2)Boc-D-Phg-Pro-OH

将上述得到的Boc-D-Phg-Pro-OBzl产物(24.5g，55.7mmole)溶于40ml DMF和225ml异丙醇，并经溶液中加入1.0g 5％钯、碳催化剂。借助于气体分散管，将氮鼓泡入反应混合物，然后氢鼓泡入混合物，历时16小时。再用氮清洗5分钟。通过hyflo滤器垫滤出催化剂，滤液真空蒸干，将到一固体残余物。用含少量乙酸乙酯的乙醚结晶残余物。得到10.35g脱酯产物。Boc-D-Phg-Pro(2)，53％产率：TLC Rf(A)0.32；FAB-MS 349(MH+)；(A)0.32；FAB-MS 349(MH+)；

¹H NMR(DMSO-d₆)，δ1.35(s，9H)，1.71-2.10(m 4H)，

3.10(m，1H)，3.74(M，1H)，4.20(m 1H)，

5.45(d，1H)，7.09(d，1H)，7.25-7.40(m，5H)，

12.50(bs，1H).

(3)Boc-L-Arg(Cbz)-OH

在一3-颈圆底烧瓶中，将N-Boc-精氨酸盐酸化物(Boc-Arg-OH·HCl)(82.1g，250mmole)溶于240ml 5N NaOH。溶液冷却到-5℃，在55分钟内，滴加氯甲酸苄基酯(143ml，1.0mole，4eq.)，同时用5N NaOH(250ml)将混合物的pH保持在13.2-13.5。氯甲酸盐加入完毕之后，于-5℃搅拌反应混合物1小时。反应混合物用100ml水和500ml乙醚稀释，分出水层，用40ml份乙醚萃取2次。水层用3N硫酸(560ml)酸至pH3.0，用550ml乙醚乙酯萃取。分出的水相用乙酸乙酯萃取一次，萃取液与前面乙酸乙酯萃取液合并。合并的萃取液用水洗，硫酸镁干燥，并真空蒸干。残余物用乙醚研制，过滤和干燥沉淀的产物，得到66.1g(3)Boc-Arg(Cbz)-OH(65％理论值)：TLC Rf(c)0.43；

FD-MS 408(M+).

¹H NMR(CDCl₃)，δ1.42(s，9H)，1.61-1.91(m，4H)，

3.23-3.41(m，2H)，4.17(d，1H)，5.21(s，2H)，

5.62(d，1H)，7.30-7.42(m，6H)，8.37(m，1H)，

(4)Boc-Arg(Cbz)-内酰胺

将上述制备的Boc-Arg(Cbz)-OH(3)(66.0g，0.162mole)的230ml无水THF溶液在冰丙酮浴中冷却到-10℃。往冷溶液中加入N-甲基吗啉(18.7ml，1.05eq)，然后加入氯甲酸异丁酯(22.5ml，1.05eq)，混合物于-10℃搅拌5分钟。接着，加入三乙胺(23.5ml，1.05eq)，并将混合物于-10℃搅拌1小时，在室温搅拌1小时。将反应混合物倒入1升冰冷混合物中，产物(4)沉淀出。沉淀物经过滤，冷水洗、真空干燥并用乙酸乙酯结晶。得到38.05一(60％理论值)产物4)，Boc-Arg(Cbz)-内酰胺：TLC Rf(A)0.77；FD-MS 391(MH+)。R_f(A)0.77；FD-MS 391(MH+).

¹H NMR(CDCl₃)δ1.48(s，9H)，1.78-1.98(m，2H)，

2.50(m，1H)，3.41(m，1H)，4.43(m，1H)，

4.90(m，1H)，4.16(s，2H)，5.27(m，1H)，7.28-7.45(m，

6H)，9.41(m，1H)，9.68(m，1H).

(5)Arg(Cbz)-内酰胺三氟乙酸盐

将Boc-Arg(Cbz)-内酰胺(4)(38.0g，0.097mole)与200ml三氟乙酸(含20ml苯甲醚)混合，混合物0℃搅拌1小时。不加热真空蒸发反应混合物，并往残余物中加入400ml乙醚。所得固体经过滤、乙醚洗和真空干燥后，得到40.5g产物(5)三氟乙酸盐：TLC Rf(C)0.29；FD-MS 291(MH+)。

(6)Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-内酰胺

往上述部分2制取的Boc-D-Phg-Pro(14.5g，41.6mmole)的80mlDMF溶液中(冷却到-15℃)加入4.6ml N-甲基吗啉，然后加入5.4ml氯甲酸异丁酯，并将反应混合物于-15℃搅拌2分钟。

在另一烧瓶中，将上述部分(5)制取的TFA·Arg(Cbz)内酰胺(15.3g，37.8mmole)溶于30ml DMF，溶液冷却到0℃并加入4.6ml N-甲基吗啉。溶液于0℃搅拌2分钟之后，把它倒入上述制取的Boc-D-Phg-Pro溶液中。所得反应混合物于-15℃搅拌4小时，然后让它升到室温过液。将5％碳酸氢钠溶液(5ml)加到反应混合物中，然后真空蒸发，得到一油状物。将后者溶于175ml乙酸乙酯，并加入150ml水。摇动之后，分出有机层，用5％碳酸氢钠和水洗，硫酸镁干燥，并真空蒸干，得到23.0g Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)内酰胺(6)无定形固体(98％产率)。TLC Rf(A)0.72。FAB-MS 621(MH+)。

(7)Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-H

将上述部分(6)得到的内酰胺(6)(23.0g，37mmole)溶于200ml无水THF，并在氮气气氛下将溶液冷却到-15℃。在10分钟内，往冷溶液中滴加1M氢化铝锂的THF溶液(37ml，37mmole)，加入完毕后，将反应混合物温升到0℃并搅拌1小时。往混合物中缓慢滴加12ml THF和12ml 0.5N硫酸溶液，历时10分钟。反应混合物用200ml乙酸乙酯和200ml水稀释，摇动后，分出有机层。有机层用150ml份水洗3次，经硫酸镁干燥和真空蒸干后，得到19.2g(83％产率)Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-H。TAB-MS 623(MH+)。[α]＝-66.1°，C＝0.5，CHCl₃。

(8)Boc-D-Phg-Pro-Arg-H半硫酸盐

将Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-H(7)(18.2g，29.2mmole)溶于100mlTHF和100ml水，并往溶液中加入29.2ml 1N硫酸和2g 10％Pd/C。通过气体分散管将氮气鼓泡入悬浮液中5分钟。然后氢气鼓入4小时。在还原反应完全后，再将氮气鼓入5分钟。将反应混合物通过hyflo垫过滤以除掉催化剂，真空蒸发浓缩滤液之后体积为100ml。往含水浓缩液中加入200ml正丁醇，并从水层中分出有机层。水层用100ml份正丁醇萃取3次，合并萃取液并加到有机层中。真空蒸干有机层，残余物用乙醚/二异丙醚研制(1∶1，V∶V)，滤出固体和真空干燥后，得到10.26粗产物(8)。将粗物质溶于10％乙腈-水，并将溶液加到一个以前加有发10％乙腈-水的7.5cm×53cm HP-20树脂柱中。采用逐步洗脱的方式，逐步提高乙腈在水中的浓度(10％-12％-15％)，从柱子中洗脱产物。收集多个级份，并通过反相HPLC法鉴定产物。合并含产物的级份并蒸干，得到5.42g纯产物-Boc-D-Phg-Pro-Arg-H半硫酸盐(53％产率)：[α]＝-125.6℃，C＝0.5 CHCl；FAB-MS 489(MH+)；在RP-HPLC上保持时间(方法2，在45分钟内梯度由10％B变到50％B)为32.3分钟。

实施例2

N-(叔丁氧羰基)-D-苯基甘氨酰-L-脯氨酰-L-精氨醛(Boc-D-Phg-Pro-Arg-H)二乙酸盐

往上述实施例1部分7制取的Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-H(38.0g，61mmole)的500ml异丙醇(含7.1ml(2eq.)乙酸)的溶液中加入2.0g10％Pd/C催化剂。通过气体分散管用氮气清洗混合物，然后将氢通入混合物，历时24小时。还毕反应完全后，再将氮气通入混合物5分钟。反应混合物通过Hyflo垫过滤，以除去催化剂，滤液蒸干后得到33.6g无定形固体状的粗产物。该产物分每批5克在5cm×25cm的Vydac C₁₈柱上纯化。在8小时内，用梯度为10-30％乙腈/0.01M乙酸铵洗脱三肽产物。收集多个级份，合并由反相HPLC法所示含产物的那些级份，并冻干。得到11.7g(35％产率)具有以下特征的标题三肽：

FAB-MS 489(MH+)

氨基酸分析：Phg＝1.07，Pro＝0.94

[α]_D＝-108.9°(C＝0.5，CHCl₃)

元素分析：C₂₈H₄₄N₆O₉

理论值：C55.25，H7.29，N13.81

实测值：C55.52，H7.40，N13.93

保留时间：借助于HPLC方法2为31.9分钟(梯度在45分钟内由10％B

到50％B)

按照实施例1所述工序，用所示的萘基甘氨酸和对羟基苯基甘氨酸替代实施例1的苯基甘氨酸，得到以下实施例3-4为特征的化合物。

实施例3

N-Boc-D-1-萘基甘氨酰-Pro-Arg-H＝乙酸盐

[α]_D＝+18.87°，C＝0.5，50％乙酸F AB-MS(MH+)539

HPLC法1，梯度：在60分钟内，由20％到60％B。

保留时间＝42.0分钟。

实施例4

N-Boc-D-2-萘基甘氨酰-Pro-Arg-H＝乙酸盐

HPLC法2，梯度：在60分钟内由30％到60％B。

保留时间＝18.0分钟。

元素分析：C₃₂H₄₆N₆O₉

理论值：C58.35，H7.04，N12.76

实测值：C58.59，H6.83，N13.04

实施例5

N-Boc-D-(4-羟基苯基甘氨酰)-Pro-Arg-H二乙酸酯

HPLC法2，梯度：在40分钟内由10％到40％B。

保留时间＝26.5分钟

氨基酸分析：4-羟基苯基甘氨酸＝0.99，脯氨酸＝1.01

实施例6-23

当所示氨基酸或取代的乙酸[A(C＝0)]替代实施例1用的D-苯基甘氨酸时，按照实施例1的偶合方法制备下表4所列化合物。表4中全部化合物呈乙酸盐形式。

表4

A(C＝0)-Pro-Arg-H

HPLC法² 保留时间实施例号 A(C＝0)- MS¹ 号/梯度 (分)6 N-甲基-D-苯基甘氨酰 403 1/10％-50％B 经过 60 分 44.27 N-Boc-DL-1-萘基甘氨酰 539 1/5％-50％B ″ 30 ″ 27.98 N-Boc-D-(6-甲氧基)-2-萘基甘氨酰 569 2/10％-50％B ″ 45 ″ 42.29 R(+)-α-乙基苯基乙酰 402 1/5％-40％B ″ 60 ″ 22.110 N-Boc-N-甲基-D-苯基甘氨酰 503 2/5％-50％B ″ 40 ″ 36.911 R(+)-α-甲氧基苯基乙酰 404 2/10％-40％B ″ 40 ″ 21.012 D-苯基甘氨酰 388 2/10％-50％B ″ 45 ″ 13.613 N-Boc-D-(4-甲氧基)苯基甘氨酰 519 2/10％-45％B ″ 40 ″ 34.014 N-乙酰-D-(4-甲氧基)苯基甘氨酰 461 2/10％-40％B ″ 40 ″ 19.015 N-Boc-D-环己基甘氨酰 495 2/10％-50％B ″ 45 ″ 36.516 N-Boc-DL-(3，4-二氯)苯基甘氨酰 557 2/10％-70％B ″ 60 ″ 40.517 R(+)-α-甲基苯基乙酰 388 2/10％-50％B ″ 45 ″ 21.918 s(-)-α-甲基苯基乙酰 388 2/10％-50％B ″ 45 ″ 22.619 N-Boc-D-2-噻吩基甘氨酰 495 1/10％-60％B ″ 60 ″ 23.820 N-Boc-D-(4-氟)苯基甘氨酰 507 2/10％-50％B ″ 60 ″ 38.421 N-Boc-DL-(4-氟)苯基甘氨酰 507 2/10％-50％B ″ 60 ″ 37.322 N-Boc-1，2，3，4-四氢异喹啉- ″ ″

1-基羰基 515 1/20％to 60％B ″ 60 ″ 49.023 D-1，2，3，4-四氢异喹啉- ″ ″

1-基羰基- 415 2/5％to 50％B ″ 60 ″ 30.624 D-1，2，3，4-四氢异喹啉-

3-基羰基 415 2/5％to 50％B ″ 60 ″ 26.425 D-全氢异喹啉-1-基羰基 421 2/5％to 50％B ″ 60 ″ 22.2

25.926 N-Boc-DL-(3-三氟甲基)-

苯基甘氨酰 557 2/5％to 50％B ″ 60 ″ 51.51/FAB-Ms(MH⁺) 2/HPLC法如上所述

实施例27

D-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-酰基-L-脯氨酰-L-精氨醛硫酸盐

往异喹啉-1-羧酸(12.5ml，0.072mole)的185ml冰醋酸溶液中加入2g氧化铂，在Parr氢化设备中，在60psi氢压下，于室温氢化悬浮液24小时。反应混合物通过过滤器垫(Celite)过滤以除去催化剂，滤液真空蒸干。固体残余物用水研制，过滤和干燥，得到8g(63％产率)DL-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-羧酸。FD-质谱178(MH)；H NMR(DMSO-d)：δ2.80-3.00(M，3H)，3.15(m，1H)，3.30-3.40(m，2H)，7.05-7.25(m，4H)，7.70(m，1H)。

将产物(7.08g，0.04mole)溶于2N NaOH(40ml，0.08mole)和40ml叔丁醇，并往溶液中加入10.5g(0.048mole))重碳酸二叔丁酯。室温搅拌24小时后，从反应混合物蒸掉大部分叔丁醇。所得水溶液用乙醚萃取，分出水层，并用2N HCl酸化到pH2.0。酸化的水相用乙酸乙酯萃取，萃取溶液用硫酸镁干燥并真空蒸干。将残余油状物溶于乙醚，并往溶液中加入7.9ml(0.04mole)二环己胺。在4℃静置4小时后，过滤N-Boc-DL-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-羧酸的二环己胺盐沉淀，用乙醚洗涤，并真空干燥。得到15.7g(8 6％产率)纯盐。FD-质谱459(MH⁺)。

元素分析：C₂₇H₄₂N₂O₄

理论值：C70.71，H9.23，N6.11

实测值：C71.07，H9.37，N5.87

将Boc被保护的衍生物(73.4g，160mmole)悬浮于200ml乙酸乙酯中，悬浮液用1.5N柠檬酸和水洗，用硫酸镁干燥并真空蒸干。将残油溶于乙酸乙酯，溶液冷却到0℃，将2，4，5-三氯苯酚(31.6g，160mmole)加到溶液中，然后加入DCC(33g，160mmole)。反应混合物于0℃搅拌1小时，再于室温搅拌1.5小时。将反应混合物冷却到0℃，滤出沉淀，并真空蒸干滤液。将残油溶于100ml吡啶，并往溶液中加入脯氨酸(18.42g，160mmole)和三乙胺(22.3ml，160mmole)。室温搅拌24小时之后，真空蒸干反应混合物。将残余物溶于乙酸乙酯，加水，并用2NNaOH将pH调到9.5。分出水相，同2N HCl酸化到pH2.0，并用乙酸乙酯萃取。萃取液用硫酸镁干燥，过滤和真空蒸干。将残油溶于二氯甲烷和乙酸乙酯。4℃静置4小时后，滤出溶液中形成的沉淀，用乙酸乙酯洗并用二氯甲烷/乙酸乙酯重结晶。真空干燥固体产物-Boc-D-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-酰基-L-脯氨酸(Boc-D-lTiq-Pro-OH)，得到19.6g(33％产率)纯产物，TLC Rf(A)0.44；FAB-MS，375(MH⁺)；

元素分析：C₂₀H₂₆N₂O₅

理论值：C64.15，H7.00，N7.48

实测值：C63.26，H6.98，N7.52

[α]＝+43.14°，C＝0.5，甲醇

在第一个烧瓶中，将Boc-D-1-Tiq-Pro(17.8g，47.5mmole)溶于100ml DMF，溶液冷到-15℃，并加入5.3ml(52.3mmole)N-甲基吗啉和6.2ml(47.5mmole)异丁基氯甲酸盐。混合物于-15℃搅拌2分钟。

在第二个烧瓶中，将Cbz被保护的精氨酸内酰胺三氟乙酸盐[Arg(z)-内酰胺，TFA](19.2g，47.5mmole)溶于40ml DMF，溶液冷却到0℃，加入5.3ml(52.3mmole)N-甲基吗啉。混合物在加到第一个烧瓶之前于0℃搅拌2分钟。反应混合物于-15℃搅拌4小时，然后缓慢温升到室温过液并加入4ml 5％碳酸氢钠。反应混合物真空蒸发后得到一油状物。将后者溶于175ml乙酸乙酯，并往溶液中加150ml水。分出有机层，用5％碳酸氢钠、水、0.1N HCl洗涤，再在硫酸镁干燥前用水洗涤。真空蒸干洗涤和干燥的溶液，得到24.3g(79％产率)产物，即无定形固体状Boc-D-l-Tiq-Pro-Arg(z)内酰胺。

TLC Rf(A)0.71

FAB-MS 647(MH⁺)

[α]＝-32.8°，C＝0.5氯仿

将以上得到的Arg(z)内酰胺(23.4g，36.2mmole)溶于300ml无水THF，并将溶液置于氮气中。将溶液冷却到-20℃，往冷溶液中滴加37ml氢化铝锂(1M)的THF(37mmole)溶液，历时30分钟。加入完毕后，混合物于-20℃搅拌30分钟，并在10分钟内滴加20ml THF和20ml 0.5N硫酸溶液。反应混合物用400ml乙酸乙酯稀释，并加入400ml水。分出有机层，用150ml份水洗2次，并用硫酸镁干燥。洗涤干燥过的有机层真空蒸发后，得到21g(98％产率)产物，即无定形固体状的Boc-D-l-Tiq-Pro-Arg(z)-H。

TLC Rf(A)0.28。

接着将上述得到的Arg(z)-H产物氢化以除去Cbz保护基。将产物(18.1g，27.9mmole)溶于200ml THF和80ml水中，加入28ml 1N硫酸和3.0g 5％Pd/C。借助于气体分散管将氮气鼓泡通入悬浮液5分钟，接着用氢气5分钟，再用氮气5分钟。滤出催化剂，滤液浓缩到100ml体积。浓缩使用200ml正丁醇稀释，并分层。水层用100ml份正丁醇萃取3次，苯取液与有机层合并。真空蒸发有机层，反应产物残余物用乙醚：二异丙醚(1∶1，V∶V)研制，滤出固体，真空干燥后，得到11.08g粗产物。

纯化产物后得到以下硫酸盐状的粗产物。将上述制取的粗产物溶于20ml水和20ml 10N硫酸。溶液于30℃加热25分钟，冷却到室温，并用Bio-Rad AG1-X8树脂(氢氧化物型)将溶液的pH调到4.0。用过滤的方法从溶液中分离出树脂，并冻干溶液，得到硫酸盐形式的粗产物-D-l-Tiq-Pro-Arg-H H₂SO₄。

将该硫酸盐(4.2g)溶于0.01％硫酸，并将溶液加到两个串联的5cm×25cm HPLC反相柱(Vydac C树脂)中。采用逐步提高乙腈浓度的梯度(2％-10％)洗脱产物盐。收集各级份并以分析RP-HPLC分布为基础合并各级份。使用AG1-X8树脂(50-100目Bio-Rad分析用阴离子树脂，呈羟基形式)将合并的级份的pH调节到4.0。过滤溶液以除去树脂，并将滤液冻干。得到2.4g(57％理论值)纯化的产物。

FAB-MS 415(MH⁺)

[α]_D＝-76.12°，C＝0.5/0.01M H₂SO₄

氨基酸分析：Pro 0.92；Tiq 1.00

元素分析：C₂₁H₃₂N₆O₇S

理论值：C49.21，H6.29，N6.26

实测值：C51.20，H6.17，N5.37

Claims

1.一种制备下式1的化合物及其无毒药用盐的方法，

其中A是1)下式基团

式中R是下式的苯基式中a和a′相互无关地是氢，低级烷基，低级烷氧基，卤素，三氟甲基，或羟基；或R是噻吩基，萘基或由一个或二个低级烷基、低级烷氧基或卤素取代的萘基；或R是环己烷基或环戊基；

R₁是氢，甲基或乙基；

P是氢；

B是低级烷基，低级烷氧基，羟基或下式的氨基：

-N(R₂)(R₃)式中R₂和R₃相互无关地是氢或低级烷基，或R₂是氢且R₃是乙酰基，或下式的氧代羰基：

R₄-OC(O)-式中R₄是C_1-6；其条件是R₁为甲基或乙基时，B不为甲基或乙基；或A是

2)全氢或四氢异喹啉，它们各以1-位或3-位连接，

该方法包括从其中P是氨基保护基的化合物1中除去保护基。

2.根据权利要求1的方法，其中A是下式基团：

式中R，R₁，和B的定义如权利要求1中所述

3.根据权利要求2的方法，其中B是式-N(R₂)(R₃)的氨基，式中R₂和R₃的定义如权利要求1中所述。

4.根据权利要求3的方法，其中制备N-Boc-D-苯基甘氨酰-L-脯氨酰-L-精氨醛及其无毒药用盐。

5.根据权利要求3的方法，其中制备N-甲基-D-苯基甘氨酰-L-脯氨酰-L-精氨醛及其无毒药用盐。

6.根据权利要求1的方法，其中A是1-或3-全氢或四氢异喹啉及其无毒药用盐。

7.根据权利要求6的方法，其中制备DL-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-酰基-L-脯氨酰-L-精氨醛硫酸盐。

8.根据权利要求6的方法，其中制备D-1，2，3，4-四氢异喹啉-1-酰基-L-脯氨酰-L-精氨醛硫酸盐。

9.根据权利要求6的方法，其中制备N(D-十氢异喹啉-3-酰基)-L-脯氨酰-L-精氨醛的无毒盐。

10.根据权利要求6的方法，其中制备N(D-十氢异喹啉-1-酰基)-L-脯氨酰-L-精氨醛的无毒盐。