CZ285980B6

CZ285980B6 - Derivát dipeptidu L-prolin-L-ergininaldehyd a farmaceutický prostředek,který ho obsahuje

Info

Publication number: CZ285980B6
Application number: CS912913A
Authority: CZ
Inventors: Paul David Gesellchen; Robert Theodore Shuman
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 1990-09-28
Filing date: 1991-09-23
Publication date: 1999-12-15
Also published as: IE913423A1; EP0837071A1; AU8478091A; DE69132884D1; JP3023019B2; NO309984B1; EP0684258A2; CS291391A3; EP0479489A2; NZ239907A; EP0684258A3; EP0479489B1; CN1060472A; NO913773D0; ATE211147T1; FI107733B; CA2052013C; BR9104181A; ATE234857T1; RU2077538C1

Abstract

Inhibitor thrombinu obecného vzorce I, kde znamená A(C=O) příkladně skupinu fenylglycylovou, cyklohexylglycylovou, cyklohexenylglycylovou, thienylglycylovou nebo naftylglycylovou, přičemž alfa-aminoskupina je s výhodou substituována alkylovou např. methylovou skupinou nebo alkoxykarbonylovou, cykloalkoxykarbonylovou nebo aryloxykarbonylovou např. t-butyloxykarbonylovou skupinou. A(C=O) znamená také alfa-substituovanou acetylovou skupinu jako alfa-methoxyfenylacetylovou skupinu nebo bicyklickou skupinu například tetrahydroisochinolin-1-oylovou skupinu; nebo 1-amino nebo/substituovanou amino/ cykloalkylkarbonylovou jako 1-aminocyklohexylkarbonylovou skupinu. Tento inhibitor brání vytváření krevních sraženin u lidí a zvířat, přičemž se podává ve formě farmaceutického prostředku.ŕ

Description

Derivát peptidu, způsob přípravy jeho sulfátové soli, farmaceutický prostředek sjeho obsahem

Oblast techniky

Vynález se týká derivátu peptidu, způsobu přípravy jeho sulfátové soli a farmaceutického prostředku sjeho obsahem. Jedná se o trombinové inhibitory, které jsou použitelné jakožto antikoagulanty pro lidi a zvířata. Zejména se týká derivátů peptidu L-prolin-L-angininaldehydů, který má antitrombickou účinnost.

Dosavadní stav techniky

Trombinové inhibice se běžně dosahují podáváním hepatitinů a kumarinů. Mechanismus, kterým tato činidla působí, byl pečlivě studován. Hepariny jsou podávatelné toliko orálně a jejich hladina musí být pečlivě monitorována. Kumariny působí blokováním nebo inhibici vytváření protrombinu a vyžadují určitou dobu k dosažení maximální účinnosti.

Ačkoliv jak hepariny, tak kumariny jsou účinnými antikoagulanty, je potřeba dalších antitrombinových činidel, která působí rychle jako prevence vytváření krevních sraženin a nenarušují plasmidové působení při rozpouštění vytvořených krevních sraženin.

Podstata vynálezu

Podstatou trombin inhibujících sloučenin podle předloženého vynálezu je derivát peptidu obecného vzorce I

A (R) nebo (SR)

NH

II

C--NH₂ (I) ve kterém symbol A znamená

1) skupinu obecného vzorce

Ri

I

R-CI

B ve kterém R znamená fenylovou skupinu obecného vzorce

- 1 CZ 285980 B6

ve kterém a a znamenají nezávisle na sobě atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, skupinu alkoxy s 1 až 4 atomy uhlíku, atom halogenu, trifluormethylovou skupinu, skupinu hydroxy, hydroxymethylovou skupinu, aminoskupinu nebo aminomethylovou skupinu; nebo R znamená skupinu thienylovou, skupinu furylovou nebo skupinu naftylovou nebo skupinu naftylovou monosubstituovanou nebo disubstituovanou alkylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, atomem halogenu, aminoskupinou, monoalkylaminoskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, dialkylaminoskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylových částech nebo skupinou hydroxy; nebo R znamená skupinu cyklohexadienylovou, cyklohexenylovou, cyklohexylovou nebo cyklopentylovou skupinu,

Ri představuje atom vodíku, methylovou nebo ethylovou skupinu,

B představuje alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, skupinu hydroxy nebo aminoskupinu obecného vzorce

-N-(R₂)(R₃) ve kterém R₂ a R₃ znamenají nezávisle na sobě atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo R₂ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku a R₃ skupinu acetylovou, halogenacetylovou nebo oxykarbonylovou obecného vzorce

R₄-0-C(0)ve kterém R4 znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkenylovou skupinu s 2 až 6 atomy uhlíku, cykloalkylovou skupinu s 3 až 7 atomy uhlíku, skupinu benzylovou, nitrobenzylovou, difenylmethylovou nebo fenylovou shora definovanou, za podmínky, že když Ri znamená methylovou nebo ethylovou skupinu, potom B neznamená methylovou nebo ethylovou skupinu nebo A znamená

2) 1-aminocyklohexylovou nebo 1-aminocyklopentylovou skupinu, přičemž aminoskupinou je skupina shora uvedeného a definovaného obecného vzorce

-N(R₂)(R₃) nebo symbol A znamená

3) bicyklickou skupinu obecného vzorce

-2CZ 285980 B6

ve kterém symbol C znamená atom uhlíku, na kterém je skupina vázána, symbol R₅ znamená atom vodíku nebo shora definovanou oxykarbonylovou skupinu a symbol Rů znamená atom vodíku, atom halogenu, skupinu hydroxy, alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku a jeho derivát s Boc-chránícími skupinami a jeho farmaceuticky vhodné soli. Symboly L, R a RS používané v obecném vzorci I označují asymetrický atom uhlíku a omezují sloučeniny na ty, které mají L, R a RS formu.

Peptidy obecného vzorce I jsou užitečnými antitrombickými činidly a může se jich používat spolu s tkáňovým plasminogenním aktivátorem (tPA), streptokinasovou nebo urokinasovou terapií.

Sloučeniny obecného vzorce I se připravují běžnými kopulačními způsoby. Například se kopuluje Boc-D-Phg s esterem L-prolinu za vzniku Boc-D-Phg-Pro esteru. Esterová skupina se odstraní a Boc-D-Phg-Pro se kopuluje s laktamovou formou L-argininu za vytvoření BocE>-Phg-Pro-Arg laktamu v aminochráněné formě. Arg laktamový kruh se otevře redukcí aargininová aminochráněná skupina se odstraní za vzniku Boc-D-Phg-Pro-Arg aldehydu. Peptidy se převádějí na vhodnou sůl, například acetáty a sulfáty. Vynález řeší předcházení vytváření krevních sraženin u lidí a zvířat a týká se farmaceutických prostředků vhodných pro tento účel. Sloučeninami podle vynálezu obecného vzorce I jsou tripeptidy, pokud symbol A znamená aminokyselinový zbytek, například fenylglycyl (Phg) a pokud A znamená jiný než aminokyselinový zbytek, například pokud B znamená jinou než aminoskupinu nebo alkylaminoskupinu, jsou sloučeninami N-acylové deriváty dipeptidu prolin a arginin aldehyd /Pro-Arg-H/. Jak je zřejmé z obecného vzorce I, asymetrické centrum A/C=O/ podílu je R nebo RS zatímco prolin a arginin aldehydového podílu je L.

Jednotlivé skupiny v obecném vzorci I mají tento význam:

Nižší alkylová skupina má přímý nebo rozvětvený řetězec s 1 až 4 atomy uhlíku a rozumí se jí například skupina methylová, ethylová, n-propylová, isopropylová, n-butylová skupina.

-3CZ 285980 B6

Nižší alkoxyskupina má 1 až 4 atomy uhlíku a rozumí se jí například methoxyskupina, ethoxyskupina, n-propoxyskupina, isopropoxyskupina, n-butoxyskupina, t-butoxyskupina.

Atomem halogenu se vždy míní atom fluoru, chloru nebo bromu.

Mono/nižší alkylovou/aminoskupinou nebo di/nižší alkylovou/ skupinou se míní například methylaminoskupina, ethylaminoskupina, dimethylaminoskupina, methylethylaminoskupina, diethylaminoskupina, n-butylaminoskupina, n-propylaminoskupina.

Výrazem „alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku“ se vždy míní alkylové skupiny s 1 až 4 atomy uhlíku s přímým nebo s rozvětveným řetězcem, shora definované, a dále například skupina npentylová, isopentylová, n-hexylová, isomemí hexylové skupiny. „Alkenylovou skupinou se 2 až atomy uhlíku“ se vždy míní olefínické skupiny, například skupina vinylová, allylová, butenylová a isomemí pentenylové nebo hexenylové skupiny. „Výrazem cykloalkylová skupina se 3 až atomy uhlíku“ se míní cyklické uhlovodíkové skupiny se 3 až 7 atomy uhlíku, jako je například skupina cyklopropylová, cyklobutylová, cyklopentylová, cyklohexylová a cykloheptylová skupina.

Jak uvedeno u obecného vzorce I, pokud A znamená skupinu vzorce /R//R1//B/C-, může R znamenat fenylovou skupinu, která může být monosubstituovaná nebo disubstituovaná. Jakožto příklady takových fenylových skupin se uvádí skupina fenylová /a a znamená atom vodíku/, 4methylfenylová, 3-ethylfenylová, 4-methoxyfenylová, 3-methoxyfenylová, 3-ethoxyfenylová, 2-methoxyfenyIová, 3-isopropoxyfenylová, 4-hydroxyfenylová, 4-chlorfenylová, 3-chlorfenylová, 2-fluorfenylová, 3-fluorfenylová, 3-bromfenylová, 4-fluorfenylová, 3-trifluormethylfenylová, 4-trífluormethylová, trifluormethylfenylová, 4-hydroxymethylfenylová, 2hydroxymethylfenylová, 3-aminofenylová, 4—aminofenylová, 3-amino-4—chlorfenylová, 3,4dichlorfenylová, 3-hydroxy-4-fluorfenylová, 3-hydroxy-4—methylfenylová, 3-methoxy—4hydroxyfenylová, 3-chlor-4-ethoxyfenylová a podobné monosubstituovaná a disubstituované fenylové skupiny.

Jakožto příklady skupin symbolu R, kdy R znamená naftylovou nebo monosubstituovanou nebo disubstituovanou naftylovou skupinu se příkladně uvádějí skupina 1-naftylová, 2-naftylová, 6methoxy-2-naftylová, 8-hydroxy-1-naftylová, 8-amino-2-naftylová, 4-methyl-1-naftylová, 6-chlor-2-naftylová, 4-hydroxy-6-ethoxy-2-naftylová, 8-methylamino-4-chlor-2-naftylová, 6,8-dimethoxy-2-naftylová, 6-ethyl-l-naftylová, 4-hydroxy-1-naftylová, 3-methoxy-lnaftylová a podobné naftylové skupiny.

Jakožto příklady skupin v obecném vzorci I, kdy B znamená aminoskupinu obecného vzorce -N/R2//R3/ se uvádějí aminoskupina /R₂ = R3 = atom vodíku/, methylaminoskupina, ethylaminoskupina, isopropylaminoskupina, dimethylaminoskupina a podobné aminoskupiny; a jestliže R₂znamená atom vodíku a R₃ oxykarbonylovou skupinu R4-O-C/O/, uvádějí se jakožto příklady takových skupin alkoxykarbonylaminoskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku v alkoxypodílu jako methoxykarbonylaminoskupina, ethoxykarbonylaminoskupina, t-butoxykarbonylaminoskupina, isoamyloxykarbonylaminoskupina a podobné skupiny; alkenyloxykarbonylaminoskupiny s 2 až 6 atomy uhlíku v alkoxypodílu jako vinyloxykarbonylaminoskupina, allyloxykarbonylaminoskupina, 2-butenyloxykarbonylaminoskupina a podobné skupiny; cykloalkoxykarbonylaminoskupiny s 3 až 7 atomy uhlíku v cykloalkoxypodílu jako cyklopropyloxykarbonylaminoskupina, cyklopentyloxykarbonylaminoskupina, cyklohexyloxykarbonylaminoskupina a podobné skupiny. Oxykarbonylaminoskupiny ve významu symbolu B dále zahrnují příkladně benzyloxykarbonylaminoskupinu, 4-nitrobenzyloxykarbonylaminoskupinu, difenylmethoxyoxykarbonylaminoskupinu, fenyloxykarbonylaminoskupinu nebo substituovanou fenyloxykarbonylaminoskupinu, přičemž substituovaný fenylový podíl je shora definován.

-4CZ 285980 B6

Jakožto příklady skupin A/C=O/ v obecném vzorci I, jestliže A znamená /R//R]//B/C- se uvádějí skupina fenylglycylová, 3-methoxyfenylglycylová, 4-methoxyfenylglycylová, 4-chlorfenylglycylová, 3,4-dichlorfenylglycylová, 3-trifluormethylglycylová, N-/t-butyloxykarbonyl/fenylglycylová, N-/t-butyloxykarbonyl-N-methyl/fenylglycylová, α-methylfenylacetylová, a-ethylfenylacetylová, a-methoxyfenylacetylová, α-isopropoxyfenylacetylová, 1-nafty Iglycylová, 2naftylglycylová, N-/t-butyloxykarbonyl/-2-naftylglycylová, 2-thienylglycylová, 3-thienylglycylová, N-/cyklopentyloxykarbonyl/-2-thienylglycylová, 3-thienylglycylová, N-/cyklopentyloxykarbonyl/-2-thienylglycylová, 2-furylglycylová, N-ethyl-2-ftirylglycylová, mendeloylová, 4-chlormantdeloylová, 3-methoxymandeloylová, α-hydroxy- a-/2-naftyl/acetylová, α-hydroxy- a-/2-thienyl/acetylová, 1,4-cyklohexadienylgIycylová, l-cyklohexenylglycylová, N-/t-butyloxykarbonyl/-l,4-cyklohexadienylglycylová, cyklohexyglycylová a podobné A/CO/ skupiny.

Peptidové sloučeniny obecného vzorce I, kde znamená A achirální 1-aminocyklopentylovou skupinu nebo 1-aminocyklohexylovou skupinu, mají strukturní vzorec

N/R2//R3/ kde znamená p vazbu uhlíku na uhlík nebo skupinu -CH₂- a R₂ a R₃ mají shora uvedený význam. Jakožto příklady takových tripeptidů se uvádějí N-/aminocyklohexynoyl/-Pro-Arg-H, N-/1 -am inocyklopentanoy 1/-Pro-Arg-H, N-/1 -methylam inocyklohexanoyl/-Pro-Arg-H, N/l-t-butyloxykarbonylaminocyklohexanoyl/-Pro-Arg-H a podobné tripeptidy.

Jakožto příklady peptidů obecného vzorce I, kde znamená A bicyklickou skupinu obecného vzorce II, se uvádějí D-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin-l-ylkarbonyl a D-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-ylkarbonyl N-acylový derivát Pro-Arg-H obecného vzorce

C/O/—L—Pro—L—Arg—H

C/O/—L—Pro—L—Arg—H dihydroisoindol-l-ylkarbonylové deriváty obecného vzorce

ReC/O/—L—Pro—L—Arg—H

-5CZ 285980 B6 oxoderiváty obecného vzorce

a jejich perhydroderiváty. Symboly R_s a mají shora uvedený význam. R₅ znamená s výhodou atom vodíku a R$ znamená s výhodou atom vodíku, methoxyskupinu, ethoxyskupinu, atom chloru nebo methylovou skupinu.

Farmaceuticky vhodnými solemi peptidů obecného vzorce I podle vynálezu jsou adiční soli s kyselinami, připravované za použití anorganických a organických kyselin. Jakožto příklady anorganických kyselin, vytvářejících soli, se uvádějí halogenovodíkové kyseliny, jako je kyselina chlorovodíková a bromovodíková, kyselina fosforečná a kyselina sírová. Pro vytváření adičních solí s organickými kyselinami se příkladně uvádí kyselina octová, propionová, malonová, maleinová, citrónová, jantarová, mléčná, benzoová, fumarová a podobné karboxylové kyseliny. Adiční soli s kyselinou se připravují o sobě známým způsobem, například neutralizací volné zásady sloučeniny obecného vzorce I kyselinou. Výhodnými adičními solemi s kyselinou jsou sulfáty a hydrochloridy.

Výhodnými sloučeninami obecného vzorce I jsou sloučeniny, kde znamená A skupinu obecného vzorce

Ri

I

R-CI

B kde znamená R fenylovou skupinu obecného vzorce

nebo naftylovou nebo substituovanou naftylovou skupinu, Ri atom vodíku a B aminoskupinu obecného vzorce -N/R₂//R₃/.

Dále jsou výhodnými sloučeniny obecného vzorce I, kde znamená R₂ atom vodíku a R₃oxykarbonylovou skupinu obecného vzorce

-6CZ 285980 B6

R4O-C/O/Dalšími výhodnými jsou sloučeniny obecného vzorce I, kde znamená A bicyklickou skupinu obecného vzorce II; v tomto případě jsou výhodnými sloučeniny obecného vzorce I, kde znamená A/C=O/ 1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-l-karbonylovou skupinu /obecného vzorce II, kde znamená Q skupinu -CHr-CH₂, Y skupinu -CH- a R₅ = = atom vodíku/ a 1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-ylkarbonylovou skupinu /obecného vzorce II, kde znamená Q skupinu vzorce

-ch₂-cI

H a Y skupinu -CHr-/.

Sloučeniny obecného vzorce I se připravují o sobě známým způsobem kopulace peptidů. Podle jednoho takového způsobu se kyselina obecného vzorce A-COOH, kde A má význam uvedený u obecného vzorce I, kopuluje s karboxy chráněným prolinem za vzniku dipeptidu /pokud A znamená aminokyselinu/ nebo N-acylprolinesteru /jestliže A znamená jinou než aminoskupinu/. Karboxy chránící esterová skupina prolinového podílu produktu se odstraní a forma volné kyseliny dipeptidu se kopuluje s laktamovou formou argininu. Uvedený reakční sled znázorňuje následující schéma:

ACOOH + prolinester

/a/ deesterifikace /a/ ---------► A—/0=0/—Pro—OH

/b/

Ib/ ⁺

A—/0=0/—Pro—Arg/P/laktam Icl

NHP kde znamená P skupinu chránící aminoskupinu.

Kopulovaný Arg/P/ laktamový produkt /c/ se redukuje aluminiumlithiumhydridem v inertním rozpouštědle k odštěpení laktamového kruhu a k vytvoření tripeptidu v argininaldehydové formě obecného vzorce

A/C=O/-Pro-Arg/P/-H kde znamená Arg/P/-H amino chráněný argininový aldehyd.

Laktamová forma argininu se získá intramolekulámí kopulací amino chráněného argininu /ArgOH/. Například Boc—Arg/Cbz/OH obecného vzorce

Boc-NH-CH-/CH₂/₃-NH-C/=NH/-NHCbz

I

COOH se nejdříve převádí na aktivní esterovou formu, například na aktivní směsný anhydrid, chloroformátovým esterem, například ethylchlorformátem na isobutylchlorformát. Vytváření esteru se provádí v přítomnosti terciárního aminu, například N-methylmorfolinu. Přísada silnější terciární aminové zásady, například triethylaminu, ovlivňuje vnitřní acylaci za vzniku laktamové formy di-amino chráněného argininu:

Před použitím ke kopulaci s A/C=0/-Pro-OH, jak shora uvedeno, se Boc chránící skupina selektivně odstraní trifluoroctovou kyselinou za vytvoření žádoucí volné aminoskupiny.

Kopulace sloučeniny ACOOH s prolinovým esterem, když A znamená aminokyselinový zbytek, se provádí tak, že se nejdříve chrání aminoskupina aminokyseliny. Používá se běžných skupin, chránících aminoskupinu, běžně používaných pro dočasnou ochranu nebo blokování aminoskupiny. Jakožto příklady takových skupin se uvádějí alkoxyskupina, alkenyloxyskupina, cykloalkoxyskupina a aryloxykarbonylová skupina, jako jsou například skupina ethoxykarbonylová, t-butyloxykarbonylová, cyklohexyloxykarbonylová, adamantyloxykarbonylová, trichlorethoxykarbonylová, benzyloxykarbonylová, difenylmethoxykarbonylová skupina. Esterovou skupinou, používanou ke chránění karboxyskupíny prolinu v průběhu kopulační reakce, může být jakákoliv běžně používaná a snadno odstranitelná esterová skupina; příkladně se uvádí skupina t-butylová, benzylová, p-nitrobenzylová, p-methoxybenzylová, difenylmethylová, trichlorethylová, fenacylová a trialkylsilylová skupina. Při provádění kopulační reakce se používá esterové skupiny pro prolin, která je odstranitelná za podmínek, kdy chránící skupina pro aminoskupinu je nedotčena. Aminoskupina chránící skupina acylace skupiny ACOOH tak zůstává na místě k ochraně aminoskupiny v průběhu následující kopulace s arginin laktamovou sloučeninou za vytvoření c.

Sloučeniny obecného vzorce I, kde znamená A skupinu obecného vzorce /R//R]//B/C- a B aminoskupinu obecného vzorce -N/R₂//R₃/, kde znamená R₂ atom vodíku a R₃ nižší alkylovou skupinu, se připravují s odpovídající sloučeninou, kde znamená B aminoskupinu za použití známých acylačních způsobů. Například N-methyl-D-fenylglycyl-L-prolyl-L-argininaldehyd se připravuje redukční acylaci následujícím způsobem: Cbz chráněný D-fenylglycin se kopuluje v dimethylformamidu s L-prolin T-butylesterem za použití dicyklohexylkarbodiimidu /DCC/ a hydroxybenzotriazolu /HOBt/ za vzniku dipeptidu Cbz-D-fenyl-glycyl-L-prolin t-butyl esteru. Peptid se hydrogenuje v alkoholu na paladiu na uhlí jakožto katalyzátoru k odstranění Cbz chránící skupiny, přidá se formaldehyd do redukční směsi a v hydrogenaci se pokračuje za vzniku N-methyl-D-fenylglycyl-L-prolin t-butylesteru. N-Methyl sekundární aminoskupina fenylglycylového podílu se chrání skupinou Cbz reakcí dipeptidu ve formě t-butylesteru s benzylchlorformátem v tetrahydrofuranu obsahujícím N-methylmorfolin za vzniku N-Cbz-Nmethyl-S-fenylglycyl-L-prolin t-butylesteru. t-Butylesterová skupina se odstraní při teplotě

-8CZ 285980 B6 místnosti v trifluoroctové kyselině obsahující anisol za vzniku N-Cbz-N-methyl-D-fenylglycyl-L-prolinu. Dále dipeptid se pak kopuluje na Cbz chráněný Arg laktam a laktamový kruh se redukčně otevře za vzniku Arg aldehydu, jak shora popsáno. Obě Cbz chránící skupiny tripeptidu se odstraní hydrogenací na katalyzátoru paladium na uhlí za vzniku N-methyl-Dfenylglycyl-L-prolyl-L-arginin aldehydu.

Sloučeniny obecného vzorce I, kde znamená A skupinu /R//R1//B/C- a R skupinu cyklohexadienylovou nebo cyklohexenylovou a B alkylaminoskupinu -N/R₂//R₃/ se mohou připravovat redukcí iminu vytvořeného s nižším alkylaldehydem a s natriumkyanoborhydridem. Podobně Nalkylace se může provádět s nižším alkyljodidem a hydridem sodíku.

Sloučeniny obecného vzorce I, kde znamená A bicykloskupinu obecného vzorce II, se připravují tímtéž kopulačním způsobem, jak shora uvedeno. Například peptid obecného vzorce I, kde znamená A 1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-l-ylovou skupinu, se získá acylací esteru prolinu, například benzylesteru, aktivním derivátem 1,2,3,4-tetrahydro-l-karboxyisochinolinu. Aktivní deriváty, kterých se může použít, zahrnují halogenidy kyselin, například chlorid nebo bromid, azid kyseliny a aktivní estery a anhydridy, vytvořené například s chlorformáty, jak bylo shora popsáno. Dusík v kruhu tetrahydroisochinolinu /obecného vzorce II, R₅ znamená atom vodíku/, se chrání alkylací v průběhu acylační kopulace. Například aktivní ester N-Boc-1,2,3,4tetrahydro-l-karboxyisochinolinu, vytvořený s isobutylchlorformátem, se používá při acylaci prolin esteru. Peptidový produkt N-boc-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin-l-ylkarbonylprolin ester se deesterifikuje, volná kyselina se převádí na aktivní ester a ten se kopuluje na laktamovou formu argininu. Laktamový produkt se pak převádí na aldehydovou formu shora popsaným způsobem za vzniku sloučeniny obecného vzorce I, totiž Boc-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-lylkarbonyl-Pro-Arg-H.

Perhydrobicykloskupina obecného vzorce II se připravuje hydrogenací buď parciálně redukovaných, nebo nenasycených kyselin o sobě známými způsoby. Například 1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-l-karboxylová kyselina se hydrogenuje na oxidu platiny v rozpouštědle, jako je ethanol nebo kyselina octová, za vzniku perhydro/dekahydro/isochinolin-l-karboxylové kyseliny. Perhydrokyseliny se pak používají shora popsaným způsobem při acylaci prolinového esteru. Jakožto příklady takových perhydroderivátů obecného vzorce I se uvádějí N-/Ddekahydroisochinolin-l-oyl/-L-prolyl-L-arginin aldehyd a N-/D-dekahydroisochinolin-3oyl/-L-prolyl-L-arginin aldehyd.

Shora uvedené kopulačni reakce se provádějí za chladu, s výhodou při teplotě přibližně -20 až +15 °C. Kopulačni reakce se provádějí v inertních organických rozpouštědlech, jako je například dimethylformamid, dimethylacetamid, tetrahydrofuran, methylenchlorid, chloroform. Obecně se pracuje v bezvodém prostředí, pokud se při kopulačni reakci používá aktivního esteru acylační kyseliny.

Sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu se nejlépe izolují ve formě adiční soli s kyselinou. Soli sloučenin obecného vzorce I, vytvořené s kyselinami, jako jsou například shora uvedeny pro farmaceuticky vhodné soli, jsou vhodné pro podávání antitrombotických činidel a pro přípravu farmaceutických prostředků, které je obsahují. Mohou se připravovat také jiné adiční soli s kyselinami a používat pro izolaci a čištění peptidů. Například soli, vytvořené se sulfonovými kyselinami, například s kyselinou methansulfonovou, n-butansulfonovou, p-toluensulfonovou a naftalensulfonovou, se také mohou používat.

Výhodný způsob izolace a čištění sloučenin obecného vzorce I podle vynálezu se stálé soli s anorganickými kyselinami, jako například sulfáty a hydrochloridové soli, získají preparativním čištěním Ci₈ reverzní fázovou chromatografií. Vodná fáze obsahuje kyselinu sírovou nebo chlorovodíkovou v koncentraci přibližně hmotnostně 0,01 % až 0,05 % a acetonitril, tetrahydrofuran, methanol nebo jiné vhodné rozpouštědlo sloužící jakožto organická složka. Hodnota pH

-9CZ 285980 B6 kyselého eluantu se upravuje na přibližně 4 až přibližně 6, přičemž přesná hodnota pH je funkcí příslušného peptidu, bazickou pryskyřicí například pryskyřicí Bio-Rad AG—1X8 v hydroxylové formě. Po upravení hodnoty pH roztoku tripeptidové soli, například sulfátu nebo hydrochloridu, se provede lyofilizace k získání vyčištěné soli ve formě suchého prášku. Podle příkladu takového způsobu se surový D-Phg-L-Pro-L-Arg-H sulfát, kontaminovaný epimemím D-Arg-H sulfátem, rozpustí v přibližně 0,01 % kyselině sírové a roztok se vnese na sloupec Vydac Ci₈RP-HPLC. Gradient 2 až 10% acetonitrilu v 0,01% kyselině sírové se použije keluování sloupce po dobu 10 hodin. Shromažďují se četné frakce a frakce obsahující žádaný produkt, jak stanoveno analytickou RP-HPLC, se uschová. Hodnota pH uschovávaných frakcí se nastaví přibližně na 4,0 až přibližně 4,5 pryskyřicí Βίο-Rad AG-1X8 v hydroxylovém cyklu. Po zfiltrování se roztok lyofílizuje, čímž se získá čistý D-Phg-L-Pro-L-Arg-H sulfát.

Sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu inhibují působení trombinu u lidí a zvířat. Inhibování trombinu se demonstruje in vitro inhibici amidázové aktivity trombinu. V následující tabulce I jsou zdánlivé rovnovážné konstanty /Kass/ pro vzájemné působení mezi zkoušenou sloučeninou /inhibitorem/ a trombinem. Hodnoty v tabulce I se získaly při zkoušce, při které se trombin hydrolyzuje v chromogenním substrátu N-benzoyl-D-fenylalanyl-L-valyl-L-arginylp-nitroanilidu.

Zkouška se provádí v 50 μΐ pufru /0,03 M Tris, 0,15 M chlorid sodný, hodnota pH 7,4/ s 25 μΐ trombinového roztoku /0,21 mg/ml trombostatového prášku v 0,06 M Tris, 0,3 M chloridu sodném o hodnotě pH 7,4/ a 150 μΐ vodného roztoku chromogeního substrátu o koncentraci 0,25 mg/ml. Roztoky zkoušené sloučeniny /25 μΐ/ o různých koncentracích se přidají. Měří se rychlost hydrolýzy substrátu monitorováním reakce při 405 nm pro uvolňování p-nitroanilinu. Konstruují se standardní křivky pro vynášení volné koncentrace trombinu proti rychlosti hydrolýzy. Rychlosti hydrolýzy se pozorují se zkoušenými sloučeninami a pak se převádějí na hodnoty „volného trombinu“ v příslušné zkoušce se použití standardních křivek. Vázaný trombin /vazba na zkoušenou sloučeninu/ se vypočítává odečtením množství volného trombinu, pozorovaného při každé zkoušce, od známého počátečního množství trombinu, použitého při zkoušce. Množství volného inhibitoru při každé zkoušce se vypočítává odečtením počtu mol vázaného trombinu od počtu mol přidaného inhibitoru /zkoušené sloučeniny/.

Hodnota Kass je hypotetická rovnovážná konstanta pro reakci mezi trombinem a zkoušenou sloučeninou obecného vzorce I podle vynálezu.

------------------------------------_>

Trombin +1 <--------------------------- trombin -1 /trombin 1/

Kass = --------------[/trombin/x/I/]

Kass se vypočte pro řadu koncentrací zkoušených sloučenin a střední hodnota se udává v jednotkách litr na mol.

V následující tabulce má poznámka ¹ tento význam: A/C=O/- se týká obecného vzorce I, pokud není jinak uvedeno, jsou zkoušené inhibitory ve formě acetátových solí.

-10CZ 285980 B6

Tabulka I

Inhibice trombinamidázové aktivity

Zkoušený inhibitor¹ A/C=O/~	Trombin amidáza Kass XI O⁶ /1/mol/
D-fenylglycyl	75,0
N-Boc-D-fenylglycyl	88,0
N-Boc-D-fenylglycyl	73,0
N-Boc-D-fenylglycyl /sulfátová sůl/	107,0
N-Boc-D-/4-hydroxy/fenylglycyl	115,0
N-Boc-D-/4-methoxy/fenylglycyl	75,0
N-Boc-DL-/3,4-dichlor/fenylglycyl	40,0
A-acetyl-D-/4-methoxy/fenylglycyl	15,5
N-Boc-D-1 -nafty lglycyl	52,0
N-Boc-D-2-naftylglycyl	22,2
N-Boc-DL-1-naftylglycyl	18,1
N-Boc-D-2-thienylglycyl	14,0
N-Boc-D-/6-methoxy/-2-naftylglycyl	6,1
N-Boc-D-cyklohexylglycyl	120,0
N-methyl-D-fenylglycyl	91,5
N-Boc-N-methyl-D-fenylglycyl	5,2
/R/-a-methylfenylacetyl	11,0
/R/-a-ethylfenylacetyl	7,5
/R/-a-methoxyfenylacetyl	4,2
/S/-a-methylfenylacetyl	0,2
N-Boc-DL-1,2,3,4—tetrahydroisochinolin-l-ylkarbonyl	3,8
DL-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin-l-ylkarbonyl	87,7

AntikoagulaČní účinnost sloučenin obecného vzorce I podle vynálezu stanovena standardními zkouškami. V následující tabulce II jsou hodnoty, získané s reprezentativními sloučeninami podle vynálezu ve zkouškách používaných pro stanovení protrombinové doby, trombinové doby a aktivované parciální tromboplastinové doby /APTT/. Číselnými hodnotami v tabulce jsou io koncentrace zkoušených sloučenin /ng/ml/ potřebné k prodloužení koagulace na dvojnásobek ve zkouškách. Hodnocení trombinové doby se provádí v plasmě a odděleně v pufrovém systému při hodnotě pH 7,5. V tabulce II se uvádí antikoagulační účinnost trombinových inhibitorů.

Tabulka Π

Zkušební inhibitor¹ A/C=O/-	Plasmová koagulační zkouška	Pufr (pH 7,5)²Trombinová doba
Protrombinová doba	APTT³	Trombinová doba
D-fenylglycyl	91	1139	91	NA⁴
N-Boc-D-fenylglycyl⁵	667	1169	110	118
N-Boc-D-(4-methoxy)fenylglycyl	NA	640	80	NA
N-Boc-D-(4-hydroxy)fenylglycyl	1636	1091	182	NA
N-Boc-DL-1-naftylglycyl	1136	2272	320	112
N-Boc-D-1-naftylglycyl	1225	3100	230	105
N-Boc-D-2-naftylglycyl	1200	1200	230	142

-11CZ 285980 B6

Tabulka II - pokračování

Zkušební inhibitor¹ A/C=O/~	Plasmová koagulační zkouška²	Pufr (pH 7,5)²Trombinová doba
Protrombinová doba	APTT³	Trombinová doba
N-Acetyl-D—(4-methoxy)fenylglycyl	900	2600	160	NA
N-Boc-D-(6-methoxy)-2-naftylglycyl	35489	2239	460	466
N-Boc-D-Cyklohexylglycyl	522	748	79	60
N-Boc-A-Methyl-D-fenylglycyl	300	4545	300	NA
N-Methyl-D-fenylglycyl	899	>909	92	67
(R)-a-Ethylfenylacetyl	700	2275	115	NA
(R)-a-Methoxyfenylacetyl	>909	>909	139	173

1/ A/C=O/ pro vzorec I

2/ koncentrace (ng/ml) zkoušené sloučeniny, potřebná k dvojnásobnému prodloužení koagulace

3/ APTT = aktivační parciální tromboplastinová doba

4/ NA = nedostupné

5/ střední hodnota 8 zkoušek

Hodnoty v tabulce II získány za použití zařízení CoaScreener společnosti Texan lne. při zkoušce podle uvedených protokolů:

Protrombinová doba:	50 μΐ plasmy 50 μΐ solanky 7 μΐ zkoušeného roztoku 50 μΐ tromboplastinu /Dade/
Trombinová doba:	50 μΐ plasmy 50 μΐ solanky 7 μΐ zkoušené sloučeniny 50 μΐ hovězího trombinu /2 NIH jednotek/ml/

Při trombinové době, stanovené v pufru o hodnota pH 7,4, se používá fibrinogenu místo plasmy.

APTT:

50 μΐ plasmy 50 μΐ actinu /Dade/ 7 μΐ zkoušeného roztoku 50 μΐ chloridu vápenatého /0,01 M/

Antitrombotická účinnost reprezentativních sloučenin obecného vzorce I podle vynálezu se stanovuje při zkouškách in vivo, prováděných na krysách. Používaná zkouška navozuje arteriální trombózu v hrdelní tepně krys a měří se infuzní dávka zkoušené sloučeniny, potřebná k udržení krevního toku po 50 minutách po době okluse. Zkouška se provádí tímto způsobem:

Navodí se arteriální trombóza u krysy v hrdelní tepně. K tomuto účelu se použije místně roztoku chloridu železitého. Sameček krysy Sprague-Dawley /o hmotnosti 375 až 450 g/ se anestetizuje xylazinem /20 mg/kg s.c./ a pak ketaminhydrochloridem /100 mg/kg, s.c./. Zvířata se pokládají na vodní podložku, v níž proudí voda, udržovaná na teplotě 37 °C. Hrdelní tepna se přiblíží osovou mozkovou incisí. K izolování cévy z pochvy hrdelní tepny se použije opatrné tupé pitvy. Pod tepnu se provlékne hedvábná nit ke zvednutí cévy, aby pod ni mohl být zasunut termočlánek. Změny teploty cévy se zaznamenávají na pásek inkoustovým zapisovačem. K namočení malých kotoučků /o průměru 3 mm/ filtračního papíru do roztoku chloridu železitého /35%/ se použije

-12CZ 285980 B6 malých lékařských kleštiček. Kotoučky se nařežou pomocí zaostřené nerezavějící trubičky s vnitřní světlostí 3 mm ve vrtacím lise. Nasycené kotoučky se položí na každou hrdelní tepnu nad termočlánkem. Časový interval mezi aplikací chloridu železitého a náhlým poklesem teploty se zaznamenává jakožto doba do okluze /TTO/ cévy. Průměrné doby, potřebné k okluzi obou cév se použije k vyjádření TTO pro každé zvíře.

Zkoušené sloučeniny se rozpustí v isotonické solance. Použije se injekční stříkačky k infuzi roztoků drog 15 minut před aplikací chloridu železitého a pokračuje se po 60 minut po aplikaci chloridu železitého. Vynese se křivka dávka - odezva ke stanovení vztahu mezi log₁₀ zavedené dávky a TTO příslušné hrdelní tepny. Stanoví se srovnávací index antitrombotické účinnosti z křivek výpočtem zavedené dávky potřebné k udržení krevního toku po 50 minut /ED 50 min/.

Spojení mezi okluzi cévy a příkrým poklesem teploty se stanovuje současným zaznamenáváním teploty a toku krve na témže zapisovači. V blízkosti termočlánku se kolem hrdelní tepny umístí sonda průtoku Doppler. Sonda zaznamenává změny rychlosti průtoku; proto se instaluje ve chvíli, kdy nedochází ke trombóze a vnitřní průměr cévy zůstává konstantní v důsledku naduření protékající krví. Před aplikací 35% roztoku chloridu železitého se zaznamenává teplota a rychlost toku /za použití zařízení Dirextional Pulsed Doppler průtokoměru, Model 545-C, University of Iowa Bioengineering/. Výsledky jsou uvedeny jako procentová změna počátečních hodnot /6 minut před okluzi/. Doba, kdy teplota cévy rychle klesne se hodnotí jako nula a teplota před okluzi a po okluzi a hodnoty průtoku se vztahují k tomuto bodu.

V tabulce ΠΙ jsou uvedeny výsledky pro zkoušené sloučeniny, získané při shora popsané zkoušce chemicky navozeného trombu u krysy.

Tabulka III

Antitrombotická účinnost na arteriální trombózu krysy

Zkoušená sloučenina A/C=O/ vzorce I	ED50¹ /mg/kg/h/
N-Boc-D-fenylglycyl	2,9
N-Boc-D-cyklohexylglycyl	11,3
N-Boc-D-1 -naftylglycyl	6,4
N-Boc-DL-1 -naftylglycyl	5,5
N-Boc-D-2-naftylglycyl	NA²

1/ ED₅o je infuzní dávka potřebná k udržení krevního toku po dobu 50 minut

2/ neúčinná při 4 mg/kg/h nebo 7 mg/kg/h, nejvyšší zkoušená dávka

Sloučeniny podle vynálezu obecného vzorce I inhibují vytváření sraženiny bez znatelného narušování přirozené tělesné schopnosti lyse sraženiny, sloučeniny mají například nízké inhibiční působení na fibrinolysu.

Vynález se také týká způsobu inhibice vytváření krevních sraženin u lidí a zvířat, při kterém se podává lidem nebo zvířatům účinné inhibiční, netoxické množství sloučeniny obecného vzorce I. Antikoagulační sloučenina se podává orálně, parenterálně například intravenózně /iv/, intramuskulámě /im/ nebo subkutáně /sc/. Výhodné podání je intravenózní /iv/ infuzi.

Účinná dávka proti vytváření krevních sraženin je přibližně 5 mg až přibližně 1000 mg. Dávka se může měnit například pro profylaktické použití se může podávat jedna denní dávka nebo je přiměřené podávat několik dávek 3 až 5 krát denně. V kritických situacích se sloučenina podává

-13CZ 285980 B6 intravenózně infuzí v dávce přibližně 1 mg/kg/h až 50 mg/kg/h a s výhodou v množství 2,5 mg/kg/h až přibližně 25 mg/kg/h.

Způsob podle vynálezu se může také prodávat spolu s podáváním činidel pro lysy sraženin například s tkáňovým plasminogením aktivátorem IHPfiJ, s modifikovaným tPa, se straptokinasou nebo urokinasou. V případech, kdy došlo k vytvoření sraženiny a tepna nebo céva je blokována buď částečně, nebo plně, podávají se současně činidla k lysi sraženiny. Sloučenina podle vynálezu se může podávat spolu s činidlem pro lysi nebo následně po jeho podání k prevenci opětného vytvoření sraženiny.

Při provádění způsobu podle vynálezu je žádoucí používat výhodné sloučeniny. Například se používá shora uvedených výhodných sloučenin. Výhodnými peptidy jsou N-Boc-D-fenylglycyl-L-prolyl-L-arginin aldehyd a N-methyl-D-fenylglycyl-L-proIyl-L-arginin aldehyd, které jsou ve formě soli, například sulfátů nebo hydrochloridů. Obzvláště výhodnou sloučeninou podle vynálezu pro uvedené účely je N-/D-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin-l-oyl/-2-prolyl-2arginin aldehydsulfát.

Vynález se také týká farmaceutických prostředků pro inhibici vytváření krevních sraženin. Farmaceutické prostředky podle vynálezu obsahují účinné, sraženiny inhibující množství sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu a farmaceuticky vhodný nosič. Pro orální podání antitrombotická sloučenina je formulována jako želatinová kapsle nebo jako tablety, které mohou obsahovat excipienty jako pojidla, mazadla, rozptylovací činidla a podobné přísady. Pro parenterální podání se antitrombotická sloučenina formuluje ve farmaceuticky vhodném ředidle, například ve fyziologickém roztoku /0,9%/, v 5% dextróze, v Ringerově roztoku a v podobných ředidlech.

Antitrombotická sloučenina podle vynálezu se může formulovat v jednotkové dávce obsahující přibližně 1 mg až přibližně 1000 mg účinné látky. S výhodou je sloučenina obecného vzorce I je formě farmaceuticky vhodné soli, například ve formě sulfátu, acetátu nebo fosfátu. Příkladně jednotková formulační dávka obsahuje 5 mg N-Boc-D-fenylglycyl-L-prolyl-L-arginin aldehydsulfátové soli v 10 ml sterilní skleněné ampuli. Jiným příkladem jednotkové dávky je 10 mg N-methyl-D-fenylglycyl-L-prolyl-L-arginin aldehydsulfátu ve 20 ml isotonickém fyziologickém roztoku obsaženém ve sterilní ampuli.

Výhodným prostředkem je jednotková dávkovači forma obsahující 5 až 50 mg N-/D-1,2,3,4tetrahydroisochinolin-l-oyl/-L-prolyl-L-arginin aldehydsulfátu ve sterilních ampulích.

Následující příklady praktického provedení vynález objasňují, nijak jej však neomezují.

Hodnoty Rf v následujících příkladech se stanovují silikagelovou chromatografií v tenké vrstvě za použití silikagelu Kieselgel 60F-254 /Měrek, Darmstadt/ v následujících rozpouštědlových systémech:

/A/chloroform - methanol - kyselina octová 135 : 15 : 1 /B/ ethylacetát - kyselina octová - absolutní alkohol 90 : 10 : 10 /C/ chloroform -methanol - kyselina octová 90:30:5 /poměry jsou míněny vždy objemově/

V příkladech se používá následujících analytických způsobů HPLC:

Způsob 1: Waters 600E za použití Vydac C_[g reverzního fázového sloupce 0,46 cm x 10 cm. Chromatogram se monitoruje na LDC při 220 nM za použití gradientu A = 0,01 M amoniumacetátu a B = acetonitril.

-14CZ 285980 B6

Způsob 2: Pharmacia FPLC za použití PepRPC o rozměru 0,5 cm x 5,0 cm. Monitorování se provádí na Pharmacia UV-M při 214 nm za použití gradientu buď A = 0,01 M amoniumacetát, nebo B = acetonitol.

Případně používané zkratky v příkladech mají následující význam:

aminokyseliny Arg = arginin, Pro = prolin, Phg - fenylglycin

Boc = t-butoxykarbonyl

Bzl = benzyl

Cbz = benzyloxykarbonyl

DCC = dicyklohexylkarbodiimid

DMF = dimethylformamid DMSO = dimethylsulfoxid

FAB-MS = hmotové spektrum bombardované rychlým atomem

FD-MS = „field desorption“ hmotové spektrum

THF = tetrahydrofuran

TLC = chromatografie v tenké vrstvě

Příklad 1

N-Boc-D-Fenylglycyl-L-prolyl-L-arginin aldehyd /Boc-D-Phg-Pro-Arg-H/ hemisulfát

1/ Boc-D-Phg-Pro-Obzl

Roztok Boc-D-fenylglycinu /15,0 g, 59,7 mmol/ a prolinbenzylesterhydrochloridu /14,43 g, 59,7 mmol/ v 60 ml dimethylformamidu se ochladí na teplotu 0 °C a přidá se nejdříve N,Ndiisopropylethylamin /10,3 ml, 59,7 mmol/ a pak 1-hydroxybenzotriazolhydrát /8,1 g, 59,7 mmol/ a dicyklohexylkarbodiimid /DCC/ /12,3 g, 59,7 mmol/. Reakční směs se míchá po dobu tří dnů při teplotě místnosti a pak se zfíltruje a filtrát se odpaří na olej ve vakuu. Olej se rozpustí ve 200 ml ethylacetátu a 150 ml vody a po vytřepání se organická vrstva oddělí, promyje se tři krát vždy 100 ml 0,lN kyseliny chlorovodíkové jednou 150 ml vody, tři krát vždy 100 ml 5% roztoku hydrogenuhličitanu sodného a opět 150 ml vody. Promytý organický roztok se vysuší síranem hořečnatým a pak se odpaří ve vakuu, čímž se získá 24,8 g Boc-D-Phg-Pro-OBzl ve formě pevné látky /95 % teorie/: TLC Rf /AJ 0,75; FAB-MS 439 /M+/.

2/ Boc-D-Phg-Pro-OH

Shora popsaným způsobem získaný produkt Boc-D-Phg-Pro-OBzl /24,5 g, 55,7 mmol/ se rozpustí ve 40 ml dimethylformamidu a 225 ml isopropylalkoholu a do roztoku se přidá 1,0 g 5% palladia na uhlí jakožto katalyzátoru. Disperzní trubkou pro plyn se reakční směsí probublává dusík a pak vodík po dobu 16 hodin a pak opět promývací dusík po dobu 5 minut. Katalyzátor se odfiltruje přes filtr hyflo a filtrát se odpaří k suchu ve vakuu, čímž se získá pevný zbytek. Tento zbytek se překrystaluje z diethyletheru obsahujícího malé množství ethylacetátu. Tak se získá 10,35 g deesterifikovaného produktu: Boc-D-Phg-Pro /2/, výtěžek 53 % teorie: TLC Rf /AJ 0,32; FAB-MS 349 /MH+/;

‘H NMR /DMSO-<M, 5 1,35 /s, 9H/, 1,71 - 2,10 /m, 4H/, 3,10 /m, 1H/, 3,74 /Μ, 1H/, 4,20 /m, 1H/, 5,45 /d, 1H/, 7,09 /d, 1H/, 7,25 - 7,40 /m, 5H/, 12,50 /bs, IH/.

-15CZ 285980 B6

3/ Boc-L-Arg/Cbz/-OH

N-Boc-arginin hydrochlorid /Boc-Arg-OH + HC1/ /82,1 g, 250 mmol/ se rozpustí ve 240 ml 5N roztoku hydroxidu sodného v tříhrdlé baňce s kulatým dnem. Roztok se ochladí na teplotu -5 °C a po kapkách se v průběhu 55 minut přidá benzylchloroformát /143 ml, 1,0 mol, 4 ekv./, přičemž se hodnota pH směsi udržuje na 13,2 až 13,5 5N roztokem hydroxidu sodného /250 ml/. Reakční směs se míchá po dobu jedné hodiny při teplotě -5 °C po ukončeném přidávání chloroformátu. Pak se reakční směs zředí 100 ml vody a 500 ml diethyletheru, vodná vrstva se oddělí a extrahuje se dvakrát vždy 40 ml diethyletheru. Vodná vrstva se pak okyselí na hodnotu pH 3,0 3N kyselinou sírovou /560 ml/ a extrahuje se 550 ml ethylacetátu. Oddělená vodná vrstva se extrahuje jednou ethylacetátem a extrakt se spojí s dříve získaným ethylacetátovým extraktem. Spojené extrakty se promyjí vodou, vysuší se síranem hořečnatým a odpaří se k suchu ve vakuu. Zbytek se trituruje s ethyletherem a vysrážený produkt se zfiltruje a vysuší. Tak se získá 66,1 g /3/ Boc-Arg/Cbz/-OH /65 % teorie/: TLC R_f/C/ 0,43; FD-MS 408 (MH+);

’H NMR /CDC1₃/, 5 1,42 /s, 9H/, 1,61 - 1,91 /m, 4H/, 3,23 - 3,41 /m, 2H/, 4,17 /d, 1H/, 5,21 /s, 2H/, 5,62 /d, 1H/, 7,30 - 7,42 /m, 6H/, 8,37 /m, 1H/.

4/ Boc-Arg/Cbz/-laktam

Roztok Boc-Arg/Cbz/-OH /3/, připraveného shora popsaným způsobem, /66,0 g, 0,162 mol/ ve 230 ml suchého tetrahydrofuranu se ochladí na teplotu -10 °C v lázni ledu a acetonu. Do studeného roztoku se přidá N-methylmorfolin /18,7 ml, 1,05 ekv./ a pak isobutylchlorformát /22,5 ml, 1,05 ekv./ a směs se míchá po dobu 5 minut při teplotě -10 °C. Pak se přidá triethylamin /23,5 ml, 1,05 ekv./, a směs se míchá po dobu jedné hodiny. Reakční směs se vlije do jednoho litru směsi ledu a vody a pak se produkt /4/ vysráží. Sraženina se odfiltruje, promyje se studenou vodou, vysuší se ve vakuu a překrystaluje se z ethylacetátu. Tak se získá 38,05 g /60 % teorie/produktu 4, Boc-Arg/Cbz/-laktam: TLC R_f/A/ 0,77; FD-MS 391 /MH+/.

’H NMR /CDC1₃/ δ 1,48 /s, 9H/, 1,78 - 1,98 /m, 2H/, 2,50 /m, 1H/, 3,41 /m, 1H/, 4,43 /m, 1H/, 4,90 /m, 1H/, 4,16 /s, 2H/, 5,27 /m, 1H/, 7,28 - 7,45 /m, 6H/, 9,41 /m, 1H/, 9,68 /m, 1ΗΛ

5/ Arg/Cbz/-laktam trifluoracetátová sůl

Boc-Arg/Cbz/laktam /4/ /38,0 g, 0,097 mol/ se smísí s 200 ml trifluoroctové kyseliny obsahující 20 ml anisolu a směs se míchá při teplotě 0 °C po dobu jedné hodiny. Reakční směs se odpaří ve vakuu bez zahřívání a do zbytku se přidá 400 ml diethyletheru. Získaná pevná látka se odfiltruje, promyje se diethyletherem a vysuší se ve vakuu. Tak se získá 40,5 g produktu /5/ ve formě trifluoracetátové soli: TLC R_f/C/ 0,29; FD-MS 291 /MH+/.

6/ Boc-D-Phg-Pro-Arg/Cbz/laktam

Do roztoku Boc-D-Phg-Pro /14,5 g, 41,6 mmol/, připraveného shora uvedeným způsobem, v části 2, v 80 ml dimethylformamidu, ochlazeného na teplotu -15 °C, se přidá 4,6 ml Nmethylmorfolinu a pak 5,4 ml isobutylchlorformátu a reakční směs se míchá při teplotě -15 °C po dobu dvou minut.

V oddělené nádobě se rozpustí TFA.Arg/Cbz/laktam /15,3 g, 37,8 mmol, připravený, jak shora uvedeno v části 5/ ve 30 ml dimethylformamidu, roztok se ochladí na teplotu 0 °C a přidá se 4,6 ml N-methylmorfolinu. Roztok se míchá při teplotě 0 °C po dobu dvou minut a pak se vlije do roztoku Boc-D-Phg-Pro, připraveného shora popsaným způsobem. Reakční směs se míchá po dobu 4 hodin při teplotě -15 °C a pak se nechá ohřát přes noc na teplotu místnosti. Přidá se 5% roztok hydrogenuhličitanu sodného /5 ml/ do reakční směsi, která se pak odpaří ve vakuu za

-16CZ 285980 B6 získání oleje. Olej se rozpustí ve 175 ml ethylacetátu a přidá se 150 ml vody. Po protřepání se organická vrstva oddělí, promyje se 5% roztokem hydrogenuhličitanu sodného a vodou, vysuší se síranem hořečnatým a odpaří se k suchu ve vakuu, čímž se získá 23,0 g Boc-D-Phg-ProArg/Cbz/laktamu /6/ ve formě amorfní pevné látky /98 % teorie/. TLC Rf/A/ 0,72, FAB-MS 621 /MH+/.

7/ Boc-D-Phg-Pro-Arg/Cbz/-H

Laktam /6/ /23,0 g, 37 mmol/, získaný způsobem podle části 6, se rozpustí ve 200 ml suchého tetrahydrofuranu a roztok se ochladí na teplotu -15 °C v prostředí dusíku. Do studeného roztoku se přidá po kapkách v průběhu 10 minut 1M roztok lithiumaluminiumhydridu v tetrahydrofuranu /37 ml, 37 mmol/ a reakční směs se udržuje na teplotě 0 °C a míchá se po dobu jedné hodiny, když je toto přidávání ukončeno. Pak se pomalu a po kapkách v průběhu 10 minut přidá roztok 12 ml tetrahydrofuranu a 12 ml 0,5N kyseliny sírové. Reakční směs se zředí 200 ml ethylacetátu a 200 ml vody a po protřepání se organická vrstva oddělí. Organická vrstva se promyje 3 krát vždy 150 ml vody, vysuší se síranem hořečnatým a odpaří se k suchu ve vakuu, čímž se získá 19,2 g /83 % teorie/ Boc-D-Phg-Pro-Arg/Cbz/-H.

FAB-MS 623 /MH+/. [a]o - -66,1°, C = 0,5, trichlormethan.

8/ Boc-D-Phg-Pro-Arg-H humisulfát

Boc-D-Phg-Pro-Arg/Cbz/-H /7/ /18,2 g, 29,2 mmol/ se rozpustí ve 100 ml tetrahydrofuranu a 100 ml vody a 29,2 ml IN kyseliny sírové a 2 g 10% palladia na uhlí se přidá do roztoku. Suspenzí se probublává dusík po dobu 5 minut za použití trubky disperguj ící plyn, načež se zavádí vodík po dobu 4 hodin. Když je redukce dokončena, opět se probublává dusík po dobu 5 minut. Reakční směs se zfiltruje vrstvou hyflo k odstranění katalyzátoru a filtrát se zkoncentruje na objem 100 ml odpařením ve vakuu. Do vodního koncentrátu se přidá 200 ml n-butanolu a organická vrstva se oddělí od vodné vrstvy. Vodná vrstva se extrahuje 3 krát vždy 100 ml nbutanolu a extrakty se spojí a přidají se do organické vrstvy. Organická vrstva se odpaří k suchu ve vakuu, zbytek se trituruje se systémem diethylether/diisopropylether v objemovém poměru 1:1, pevná látka se odfiltruje a vysuší se ve vakuu, čímž se získá 10,26 g surového produktu /8/. Surový produkt se rozpustí v 10% vodném roztoku acetonitrilu a roztok se vnese na 7,5 cm x 53 cm sloupec pryskyřice HP-20 předem zpracované systémem 10% acetonitrilu ve vodě. Produkt se eluuje za sloupců postupnou eluci vzrůstající koncentrací acetonitrilu ve vodě /10 % až 12 % až 15%/. Shromáždí se četné frakce a zkoušejí se na produkt reverzní fázovou chromatografií HPLC. Frakce, obsahující produkt, se shromáždí a odpaří se k suchu, čímž se získá 5,42 g čistého produktu. Boc-D-Phg-Pro-Arg-H hemisulfát /53 % teorie/ má následující charakteristiky: [a]_D= -125,6°, C = 0,5, trichlormethan; FAB-MS 489 /MH+/; retenční doba na RP-HPLC /způsob 2/ 10 až 50 % B po 45 min, doba 32,3 minut.

Příklad 2

N-/t-Butyloxykarbonyl/-D-fenylglycyl-L-prolyl-L-arginin aldehyd /Boc-D-Phg-Pro-Arg-H/ diacetátová sůl

Do roztoku Boc-D-Phg-Pro-Arg/Cbz/-H, připraveného podle části 7 příkladu 1, /38,0 g, 61 mmol/ v 500 ml isopropylalkoholu obsahujícího 7,1 ml /2 ekv./ kyseliny octové, se přidá 2,0 g 10% palladia na uhlí jakožto katalyzátoru. Směs se promyje dusíkem probubláváním dusíku trubkou k dispergaci plynu po dobu 5 minut a pak se směsí nechá po dobu 24 hodin procházet vodík. Když se reakce ukončena, vede se směsí opět po dobu 5 minut dusík. Reakční směs se zfiltruje vrstvou hyflo k odstranění katalyzátoru a filtrát se odpaří k suchu, čímž se získá 33,6 g

-17CZ 285980 B6 surového produktu ve formě amorfní pevné látky. Produkt se čistí v 5 g dávkách na 5 cm x 25 cm sloupci Vydac C]₈. Tripeptidový produkt se eluuje po dobu 8 hodin gradientem 10 až 30 % acetonitrilu/0,01M amoniumacetát. Četné frakce se shromáždí a frakce, obsahující produkt, jak doloženo reverzní fázovou chromatografií HPLC, se shromáždí a vysuší se vymrazováním. Tak se získá 11,7 g /35 % teorie/ žádaného tripeptidu s následujícími charakteristikami:

FAB-MS 489 /MH+/; aminokyselinová analýza: Phg = 1,07, Pro = 0,94; [a]_D= -108,9° /C = 0,5, trichlormethan/.

Elementární analýza vypočtená pro C₂₈H₄₄N₆O9 vypočteno C 55,25 H 7,29 N 13,81 nalezeno C 55,52 H 7,40 N 13,93

Retenční doba = 31,9 min prostřednictvím HPLC způsob 2 10 až 50 % B v průběhu 45 min.

Sloučeniny, charakterizované v následujících příkladech 3 a 4, se získají způsobem, popsaným v příkladu 1, přičemž se použije naftylglycinu a p-hydroxyfenylglycinu místo fenylglycinu jako podle příkladu 1.

Příklad 3

N-Boc-D-1 -nafty lglycy I-Pro-Arg-H-diacetát [a]_D = +18,87°, C = 0,5, 50% kyselina octová, FAB-Ms /MH+/ 539

HPLC, způsob 1, gradient: 20 % až 60 % B v průběhu 60 min retenční doba 42,0 min.

Příklad 4

N-Boc-D-2-naftylglycyl-Pro-Arg-H diacetát

HPLC, způsob 2, gradient 30 % až 60 % B v průběhu 60 minut retenční doba = 18,0 min

Elementární analýza vypočtená pro C₃₂H₄₆N₆O9 vypočteno C 58,35 H 7,04 N 12,76 nalezeno C 58,59 H 6,83 N 13,03

Příklad 5

N-Boc-D-/4-hydroxyfenylglycyl/-Pro-Arg-H diacetát

HPLC, způsob 2, gradient 20 % až 40 % H v průběhu 40 minut retenční doba = 26,5 minut aminokyselinová analýza: 4-hydroxyfenylglycin = 0,99, prolin =1,01

Příklad 6 a 23

Sloučeniny, uvedené v následující tabulce IV, se připravují kopulačními způsoby, popsanými v příkladu 1, přičemž se uvedenou aminokyselinou nebo substituovanou octovou kyselinou

-18CZ 285980 B6 [A/C=O/J nahradí D-fenylglycin, použitý podle příkladu 1. Všechny sloučeniny podle tabulky IV jsou ve formě acetátové soli.

Tabulka IV

A/C=O/-Pro-Arg-H

Příklad číslo	A/C=O/-	MS¹	HPLC způsob²Č./Gradient	Retenční doba (min)
6	A-Methyl-D-fenylglycyl	403	1/10%—50% B nad 60 min	44,2
7	A-Boc-DL-1-naftylglycyl	539	l/5%-50% B nad 30 min	27,9
8	A-Boc-D-(6-methoxy)-2-naftylglycyl	569	2/10%-50% B nad 45 min	42,4
9	R(+)-ct-Ethylfenylacetyl	402	l/5%—40% B nad 60 min	22,1
10	A-Boc-N-methyl-D-fenylglycyl	503	2/5%-50% B nad 40 min	36,9
11	R(+)-a-Methoxyfenylacetyl	404	2/10%-40% B nad 40 min	21,0
12	D-fenylglycyl	388	2/10%—50% B nad 45 min	13,6
13	A-Boc-D-(4-methoxy)fenylglycyl	519	2/10%-45% B nad 40 min	34,0
14	A-Acetyl-D-(4-methoxy)fenylglycyl	461	2/10%-40% B nad 40 min	19,0
15	A-Boc-D-cyklohexylglycyl	495	2/10%—50% B nad 45 min	36,5
16	A-Boc-DL-(3,4-dichloro)fenylglycyl	557	2/10%—70% B nad 60 min	40,5
17	R(+)-a-Methylfenylacetyl	388	2/10%—50% B nad 45 min	21,9
18	S(-)-a-Methylfenylacetyl	388	2/10%—50% B nad 45 min	22,6
19	A-Boc-D-2-thienylglycyl	495	1/10%—60% B nad 60 min	23,8
20	A-Boc-D-(4-fluoro)fenylglycyl	507	2/10%—50% B nad 60 min	38,4
21	A-Boc-DL-(4-fluoro)fenylglycyl	507	2/10%-50% B nad 60 min	37,3
22	A-Boc-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin-1 -y lkarbony 1	515	1/20% až 60% B nad 60 min.	49,0
23	D-1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-1ylkarbonyl	415	2/5% až 50% B nad 60 min.	30,6
24	D-l ,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-3ylkarbonyl	415	2/5% až 50% B nad 60 min.	26,4
25	D-Perhydroisochinolin-l-ylkarbonyl	421	2/5% až 50% B nad 60 min.	22,2
26	A-Boc-DL-(3-trifluormethyl)fenylglycyl	557	2/5% až 50% B nad 60 min.	51,5

1) FAB-MS (MH*)

2) HPLC způsob shora popsaný

Příklad 27

D-1,2,3,4-T etrahydroisochinolin- 1-oyl-L-proly 1-L-arginin aldehydsulfát

Do roztoku isochinolin-l-karboxylové kyseliny /12,5 g, 0,072 mol/ ve 185 ml ledové kyseliny octové se přidají 2 g oxidu platiny a suspenze se hydrogenuje při teplotě místnosti za tlaku vodíku 414 kPa v hydrogenační aparatuře Parr po dobu 24 hodin. Reakční směs se pak zfiltruje filtrační vrstvou /Celíte/ k odstranění katalyzátoru a filtrát se odpaří k suchu ve vakuu. Pevný zbytek se trituruje s vodou, zfiltruje se a vysuší se, čímž se získá 8 g /63 % teorie/ DL-1,2,3,4tetrahydroisochinolin-1-karboxylové kyseliny. FD hmotové spektrum 178 /MH7;

-19CZ 285980 B6 *H NMR /DMSO-de/: 2,80 - 3,00 /m, 3H/, 3,15 /m, IH/, 3,30 - 3,40 /m, 2H/, 7,05 - 7,25 /m, 4H/, 7,70 /m, IH/.

Produkt /7,08 g, 0,04 mol/ se rozpustí ve 2N roztoku hydroxidu sodného /40 ml, 0,08 mol/ a 40 ml t-butylalkoholu a 10,5 g /0,048 mol/ di-terc.-butyldikarbonátu se přidá do získaného roztoku. Míchá se po dobu 24 hodin při teplotě místnosti, pak se terc.-butylalkohol odpaří z reakční směsi. Získaný vodný roztok se extrahuje diethyletherem, vodná vrstva se oddělí, okyselí se 2N chlorovodíkovou kyselinou na hodnotu pH 2,0. Okyselená vodná fáze se extrahuje ethylacetátem, extrakt se vysuší síranem hořečnatým a odpaří se k suchu ve vakuu. Zbylý olej se rozpustí v diethyletheru a do roztoku se přidá 7,9 ml /0,04 mol/ dicyklohexylaminu. Nechá se stát při teplotě 4 °C po dobu 4 hodin, sraženina dicyklohexylaminové soli N-Boc-DL-1,2,3,4— tetrahydroisochonolin-l-karboxylové kyseliny se odfiltruje, promyje se diethyletherem a vysuší se ve vakuu. Tak se získá 15,7 g /86 % teorie/ čisté soli. FD hmotové spektrum 459 /MH+/.

Elementární analýza vypočtená pro C27H42N2O4 vypočteno C 70,71 H 9,23 N 6,11 nalezeno C 71,07 H 9,37 N 5,87

Boc chráněný derivát /73,4 g, 160 mmol/ se suspenduje ve 200 ml ethylacetátu a suspenze se promyje 1,5N kyselinou citrónovou a vodou, vysuší se síranem hořečnatým a odpaří se k suchu ve vakuu. Zbylý olej se rozpustí v ethylacetátu, roztok se ochladí na teplotu 0 °C a do suspenze se přidá 2,4,5-trichlorfenol /31,6 g, 160 mmol/ a pak dicyklohexylkarbodiimid /DCC/ /33 g, 160 mmol/. Reakční směs se míchá po dobu jedné hodiny při teplotě 0 °C a při teplotě místnosti po dobu 1,5 hodin. Reakční směs se ochladí na 0 °C a sraženina se odfiltruje a filtrát se odpaří k suchu ve vakuu. Zbylý olej se rozpustí ve 100 ml pyridinu a prolin /18, 42 g, 160 mmol/ a triethylamin /22,3 ml, 160 mmol/ se přidají do získaného roztoku. Míchá se při teplotě místnosti po dobu 24 hodin a pak se reakční směs odpaří k suchu ve vakuu. Zbytek se rozpustí v ethylacetátu, přidá se voda a hodnota pH se nastaví na 9,5 2N roztokem hydroxidu sodného. Vodná vrstva se oddělí, okyselí se na hodnotu pH 2,0 2N kyselinou chlorovodíkovou a extrahuje se ethylacetátem. Extrakt se vysuší síranem hořečnatým, zfiltruje se a odpaří se k suchu ve vakuu. Olejový zbytek se rozpustí v methylenchloridu a ethylacetátu. Nechá se stát při teplotě 4 °C po dobu 4 hodin, načež se sraženina, vytvořená v roztoku, odfiltruje, promyje se ethylacetátem a překrystaluje se ze systému methylenchlorid/ethylacetát. Pevný produkt, Boc-D1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-l-oyl-L-prolin /Boc-D-l-Tiq-Pro-OH/ se vysuší ve vakuu, čímž se získá 19,6 g, 33 % teorie čistého produktu; TLC Rf/A/ 0,44; FAB-MS 375 /MH+/;

elementární analýza vypočtená pro C₂oH₂6N₂05 vypočteno C 64,15 H 7,00 N 7,48 nalezeno C 63,26 H 6,98 N 7,62 [a]_D = +43,14°, C = 0,5, methanol.

V první baňce se rozpustí Boc-D-l-Tiq-Pro /17,8 g, 47,5 mmol/ ve 100 ml tetrahydrofuranu, roztok se ochladí na teplotu -15 °C a 5,3 ml /52,3 mmol/ N-methylmorfolinu a 6,2 ml /47,5 mmol/ isobutylchlorformátu se přidá. Směs se míchá při teplotě -15 °C po dobu 2 minut.

Ve druhé baňce se rozpustí Cbz chráněný argininlaktam ve formě trifluoracetátové soli [Arg/Z/laktam.TFA] /19,2 g, 47,5 mmol/ ve 40 ml dimethylformamidu, roztok se ochladí na teplotu 0 °C a přidá se 5,3 ml /52,3 mmol/ N-methylmorfolinu. Směs se míchá po dobu 3 minut při teplotě 0 °C před vnesením do první baňky. Reakční směs se míchá po dobu 4 hodin při teplotě -15 °C, pak se pomalu ohřeje na teplotu místnosti přes noc a přidá se 5 ml 5% roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Reakční směs se odpaří ve vakuu, čímž se získá olej. Olej se rozpustí ve

-20CZ 285980 B6

175 ml ethylacetátu a do roztoku se přidá 150 ml vody. Organická vrstva se oddělí, promyje se 5% roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou, 0,lN kyselinou chlorovodíkovou a opět vodou a pak se vysuší síranem hořečnatým. Promytý a vysušený roztok se odpaří ve vakuu k suchu, čímž se získá 24,3 g /79 % teorie/ produktu. Boc-D-l-Tiq-Pro-Arg/Z/ laktam je ve formě amorfní pevné látky.

TLC R_f/A/ 0,71; FAB-MS 647 /MH+/; [a]_D = -32,8°; C = 0,5, chloroform.

Arg/Z/ laktamový produkt, shora získaný, /23,4 g, 36,2 mmol/ se rozpustí v 300 ml suchého tetrahydrofuranu a roztok se udržuje v prostředí dusíku. Roztok se ochladí na teplotu -20 °C a po kapkách se přidá 37 ml lithiumaluminiumhydridu 1M v tetrahydrofuranu /37 mmol/ do chladného roztoku v průběhu 30 minut. Když je toto přidávání ukončeno, směs se míchá při teplotě -20 °C po dobu 30 minut a pak se po kapkách přidá roztok 20 ml tetrahydrofuranu a 20 ml 0,5N kyseliny sírové v průběhu 10 minut. Reakční směs se pak zředí 400 ml ethylacetátu a přidá se 400 ml vody. Organická vrstva se oddělí, promyje se dvakrát vždy 150 ml vody a vysuší se síranem hořečnatým. Promytá a vysušená organická vrstva se odpaří ve vakuu, čímž se získá 21 g /89 % teorie/ produktu, Boc-D-1-Tiq-Pro-Arg/Z/-H ve formě amorfní pevné látky.

TLC Rf/A/ 0,28

Shora popsaným způsobem získaný Arg/Z/-H produkt se hydrogenuje následujícím způsobem k odstranění Cbz chránící skupiny. Produkt /18,1 g, 27,9 mmol/ se rozpustí ve 200 ml tetrahydrofuranu a 80 ml vody 28 ml IN kyseliny sírové a 3,0 g 5% palladia na uhlí se přidá. Suspenzí se probublává dusík za použití trubky k dispergaci plynu po dobu 5 minut a pak vodík po dobu 5 hodin a nakonec opět dusík po dobu 5 minut. Katalyzátor se odfiltruje a filtrát se zkoncentruje na objem 100 ml. Koncentrát se zředí 200 ml n-butanolu a vrstvy se oddělí. Vodná vrstva se extrahuje 3 krát vždy 100 ml n-butanolu a extrakty se spojí s organickou vrstvou. Organická vrstva se odpaří ve vakuu a reakční produkt jakožto zbytek se trituruje se systémem diethylether: diisopropylether v objemovém poměru 1:1, pevná látka se odfiltruje a vysuší se ve vakuu, čímž se získá 11,08 g surového produktu.

Produkt se čistí a získá se ve formě sulfátové soli. Surový produkt, získaný shora popsaným způsobem, se rozpustí ve 20 ml vody a 20 ml 10N kyseliny sírové. Roztok se udržuje na teplotě 50 °C po dobu 25 minut, ochladí se na teplotu místnosti a hodnota pH roztoku se nastaví na 4,0 pryskyřicí Bio-Rad AG1-X8 /v hydroxidové formě/. Pryskyřice se oddělí od roztoku filtrací a roztok se lyofilizuje, čímž se získá 8,44 g surového produktu ve formě sulfátové soli, D-lTiq-Pro-Arg-H.H₂SO₄.

Sulfátová sůl /4,2 g/ se rozpustí v 0,01% kyselině sírové a roztok se nanese na dvě 5 cm x 25 cm HPLC reverzní fázové kolony /Vydac Cjg pryskyřice/ v sérii. Gradient vzrůstajících koncentrací acetonitrilu /2% až 10%/ se použije keluování produkované soli. Frakce se shromáždí a uchovávají se základě analytického RP-HPLC profilu. Hodnota pH spojených frakcí se upraví na 4,0 použitím pryskyřice AG1-X8 /Bio-Rad analytická anexová pryskyřice 50 - 100 mesh otvor ok síta 300 až 150 pm/ v hydroxycyklu. Roztok se zfiltruje k odstranění pryskyřice a filtrát se lyofilizuje. Tak se získá 2,4 g /58 % teorie/ vyčištěného produktu.

FAB-MS 415 /MH+/; [a]_D= -76,12°, C = 0,5/0,0 IN, kyselina sírová; aminokyselinová analýza: Pro 0,92, Tiq 1,00.

Elementární analýza vypočtená pro C₂iH₃₂N₆O7S vypočteno C 49,21 H 6,29 N 16,29 S 6,26 nalezeno C 51,20 H 6,17 N 16,88 S 5,37

-21CZ 285980 B6

Průmyslová využitelnost

Derivát dipeptidu L-prolin-L-argininaldehyd rychle účinný k prevenci vytváření krevních sraženin a nenarušující plasminové působení při rozpouštění vytvořených krevních sraženin a farmaceutické prostředky, které ho obsahují.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1) skupinu obecného vzorce

Ri

I

R-CI

B ve kterém R znamená fenylovou skupinu obecného vzorce ve kterém a a znamenají nezávisle na sobě atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, atom halogenu, trifluormethylovou skupinu, skupinu hydroxy, hydroxymethylovou skupinu, aminoskupinu nebo aminomethylovou skupinu; nebo R znamená skupinu thienylovou, fúrylovou nebo naftylovou nebo skupinu naftylovou monosubstituovanou nebo disubstituovanou alkylovou skupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, atomem halogenu, aminoskupinou, monoalkylaminoskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, dialkylaminoskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylových částech nebo skupinou hydroxy; nebo R znamená skupinu cyklohexadienylovou, cyklohexenylovou, cyklohexylovou nebo cyklopentylovou,

Ri představuje atom vodíku, methylovou nebo ethylovou skupinu,

-24CZ 285980 B6

B představuje alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, skupinu hydroxy nebo aminoskupinu obecného vzorce

-N(R₂)(R₃) ve kterém R₂ a R₃ znamenají nezávisle na sobě atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo R₂ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku a R₃ skupinu acetylovou, halogenacetylovou nebo oxykarbonylovou obecného vzorce ío R4-O-C(O)ve kterém

R4 znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkenylovou skupinu s 2 až 6 atomy 15 uhlíku, cykloalkylovou skupinu s 3 až 7 atomy uhlíku, skupinu benzylovou, nitrobenzylovou, difenylmethylovou nebo fenylovou shora definovanou, s podmínkou, že když Ri znamená methylovou nebo ethylovou skupinu, neznamená B methylovou nebo ethylovou skupinu

20 nebo A znamená

1) skupinu obecného vzorce

Ri

R-CI

B ve kterém R znamená fenylovou skupinu obecného vzorce ve kterém a a ϊ znamenají nezávisle na sobě atom vodíku, alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, skupinu alkoxy s 1 až 4 atomy uhlíku, atom halogenu, trifluormethylovou skupinu, skupinu hydroxy, hydroxymethylovou skupinu, aminoskupinu nebo aminomethylovou skupinu; nebo R znamená skupinu thienylovou, skupinu furylovou nebo skupinu naftylovou nebo skupinu naftylovou monosubstituovanou nebo disubstituovanou alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, alkoxyskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku, atomem halogenu, aminoskupinou, monoalkylaminoskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové části, dialkylaminoskupinou s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylových částech nebo skupinou hydroxy; nebo R znamená skupinu cyklohexadienylovou, cyklohexenylovou, cyklohexylovou nebo cyklopentylovou skupinu,

-22CZ 285980 B6

Ri představuje atom vodíku, methylovou nebo ethylovou skupinu,

-N(R₂)(R₃) ve kterém R₂ a R₃ znamenají nezávisle na sobě atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo R₂ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku a R₃ skupinu acetylovou, halogenacetylovou nebo oxykarbonylovou obecného vzorce

R4-O-C(O)ve kterém R4 znamená alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkenylovou skupinu s 2 až 6 atomy uhlíku, cykloalkylovou skupinu s 3 až 7 atomy uhlíku, skupinu benzylovou, nitrobenzylovou, difenylmethylovou nebo fenylovou shora definovanou, za podmínky, že když R_tznamená methylovou nebo ethylovou skupinu, potom B neznamená methylovou nebo ethylovou skupinu nebo A znamená

1. Derivát peptidu obecného vzorce I c=o I

A (R)nebo (SR) ve kterém symbol A znamená

25 -N(R₂)(R₃) nebo symbol A znamená

2. Derivát peptidu podle nároku 1 obecného vzorce I

I H

A (r) nebo (SR) ve kterém symbol A znamená

-N(R₂)(R₃) nebo symbol A znamená

3. Derivát peptidu podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém symbol A znamená skupinu obecného vzorce

Ri

I R-CI B ve kterém symboly R, R] a B a ostatní skupiny mají význam uvedený v nároku 1.

3) bicyklickou skupinu obecného vzorce o

ve kterém

35 symbol C znamená atom uhlíku, na kterém je skupina vázána, symbol R₅ znamená atom vodíku nebo shora definovanou oxykarbonylovou skupinu a symbol R$ znamená atom vodíku, atom halogenu, skupinu hydroxy, alkylovou skupinu s 1 až

40 4 atomy uhlíku nebo alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku, a jeho derivát s Boc-chránícími skupinami a jeho farmaceuticky vhodné soli.

-25CZ 285980 B6

3) bicyklickou skupinu obecného vzorce ve kterém symbol C znamená atom uhlíku, na kterém je skupina vázána,

-23CZ 285980 B6 symbol R₅ znamená atom vodíku nebo shora definovanou oxykarbonylovou skupinu a symbol R$ znamená atom vodíku, atom halogenu, skupinu hydroxy, alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku nebo alkoxyskupinu s 1 až 4 atomy uhlíku a jeho derivát s Boc-chránícími skupinami a jeho farmaceuticky vhodné soli.

4. Derivát peptidu podle nároku 3 obecného vzorce I, ve kterém symbol B znamená skupinu obecného vzorce

-N(R₂)(R₃) ve kterém symboly R₂, R₃ a ostatní skupiny mají význam uvedený v nároku 1.

5. Derivát peptidu podle nároku 4 obecného vzorce I, kterým je N-Boc-D-fenylglycyl-1prolyl-l-argininaldehyd a jeho farmaceuticky vhodné soli.

6. Derivát peptidu podle nároku 4 obecného vzorce I, kterým je N-methyl-D-fenylglycyl-1prolyl-l-argininaldehyd a jeho farmaceuticky vhodné soli.

7. Derivát peptidu podle nároku 1 obecného vzorce I, ve kterém symbol A znamená bicyklickou skupinu podle nároku 1 a jeho farmaceuticky vhodné soli.

8. Derivát peptidu podle nároku 7 obecného vzorce I, kterým je DL-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin-l-oyl-l-prolyl-l-argininaldehydsulfát.

9. Derivát peptidu podle nároku 7 obecného vzorce I, kterým je D-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin-l-oyl-l-prolyl-l-argininaldehydsulfát.

10. Derivát peptidu podle nároku 7 obecného vzorce I, kterým je sloučenina vzorce a její farmaceuticky vhodné soli.

-26CZ 285980 B6

11. Derivát peptidů podle nároku 7 obecného vzorce I, kteiým je sloučenina vzorce a její farmaceuticky vhodné soli.

12. Derivát peptidů podle nároku 7 obecného vzorce I, kterým je D-l,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-oyl-l-prolyl-l-argininaldehyd a jeho farmaceuticky vhodné soli.

13. Derivát peptidů nebo některá z jeho fyziologicky přijatelných solí podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 obecného vzorce I pro použití jako účinné látky pro přípravu farmaceuticky použitelného prostředku pro léčení trombóz.

14. Způsob přípravy sulfátové soli derivátu peptidů L-argininaldehydu podle nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že se derivát peptidů chromatografúje na reverzním fázovém vysokotlakém kapalinovém chromatografu gradientovým vymýváním, s gradientem při obsahu organické fáze v objemovém množství 2 až 10 % acetonitrilu jakožto elučního činidla ve vodné fázi obsahující kyselinu sírovou při hodnotě pH 2 až 3, hodnota pH eluátu se nastaví na 4 až 6 bazickou pryskyřicí nerozpustnou ve vodě a od eluátu se oddělí pryskyřice a voda.

15. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou látku derivát peptidů podle nároků 1 až 12, ve kterém jednotlivé symboly mají význam uvedený v nároku 1 až 12, společně s jedním nebo s několika farmaceuticky vhodnými nosiči, excipienty nebo ředidly.