KR20010083140A - 유로키나제 및 혈관 형성의 억제제 - Google Patents

유로키나제 및 혈관 형성의 억제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유로키나제의 활성 억제제를 가지고, 혈관 형성을 감소시키거나 또는 억제하는 신규한 화합물을 제공한다. 이들 화합물은 P1에서 아르기닌 또는 아르기닌 유사 알데히드 또는 아르기닌 케토아미드기를 가진다. 이들 화합물은 체외에서 플라스미노겐 활성화제 수준을 모니터하는데 유용하고, 체내에서 혈관 형성이 병리학상 증상과 관련이 있는 병리학적 질병의 치료 및 유로키나제의 활성을 억제하거나 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료에 유용하다.

Description

유로키나제 및 혈관 형성의 억제제{Inhibitors of Urokinase and Blood Vessel Formation}
<관련 출원의 상호 참조>
본 출원은 1998년 7월 24일자로 출원되어 통상적으로 양도되고 공동 계류 중인 미국 특허 출원 제09/121,921호의 일부 계속 출원이며, 이 문헌의 개시물은 본원에 참고로 포함된다.
뇨형 플라스미노겐 활성화제(uPA; 유로키나제)는 트립신/키모트립신 군에 속하는 세린 프로테아제이다. 그의 병리학적 상태에서, uPA는 3가지 형태로 발견된다: 단일 쇄 pro-uPA, 이중 쇄 uPA 및 저분자량 uPA (N-종결 도메인 결핍). 효소원, pro-uPA는 K158-I159에서 펩티드 결합의 분열에 의해 u-PA로 전환된다. 생성된 이중 쇄 uPA는 디술피드 다리에 의해 가교되며, 약 50 kD의 Mr을 가지고 C-종결 세린 단백질분해효소 도메인을 가진다.
uPA의 활성은 그의 수용체, uPAR로의 결합시 세포 표면에 집중된다. uPAR은 단일 쇄 글리코실 포스파티딜 이노시톨 (GPI)-고정 막 수용체이다. uPAR의 N-종결 92 아미노산은 uPA 및 pro-uPA로의 결합에 지배적인 역할을 한다. uPA에 대한 수용체는 T-세포, NK 세포, 단핵세포 및 호중구 뿐만 아니라, 혈관 내피 세포, 섬유아세포, 평활근 세포, 각질 세포, 태반 영양세포, 간세포 및 다양한 종양 세포 상에 위치하게 된다.
세포 표면 상에서 uPAR에 주로 발생하는 pro-uPA의 uPA로의 전환 후, uPA는 플라스미노겐을 플라스민으로 활성화시킨다. 활성화는 인간 플라스미노겐에 대한 잔류 PGR-VV에서, 또는 소의 플라스미노겐에 대한 잔류 SGR-IV에서 분열시 발생한다. 플라스미노겐은 또한 세포 표면 상에 존재하기 때문에, 상기 활성화 케스케이드는 혈장 막 상에서 u-PA 및 플라스민의 활성을 집중시킨다. 플라스민은 추가의 uPA 및 다른 효소의 활성화, 피브린의 소화, 및 세포외 기질(ECM)의 성분의 소화를 포함하여 많은 역할을 한다. 종양을 둘러싸는 ECM의 소화는 전이 세포에 대한 물리적 장벽으로서의 ECM이 제거되어, 전이 세포는 원발성 종양을 자유롭게 떠나 속발성 부위에 침입한다. 암 전이에서 uPA/uPAR 시스템의 역할에 대해 개관이 문헌 ["The Urokinase-type Plasminogen Activator System in Cancer Metastasis: A Review", Andreasen 등, Int. J. Canc. 72: 1-22 (1997)]에 제공되어 있다.
uPA의 고함량 및 전이의 높은 속도와 빈약한 예후의 상관 관계가 특정 종양, 특히 유방암에서 주목되어 왔다 [Quax 등, J. Cell Biol. 115: 191-199 (1991); Duffy 등, Cancer Res. 50: 6827-6829 (1990)]. 예를 들어, 폐 종양 [Oka 등, Cancer Res. 51: 3522-3525 (1991)], 방광 종양 [Hasui 등, Int. J. Cancer 50: 871-873 (1992)], 위 종양 [Nekarda 등, Lancet 343: 117 (1994)], 자궁경부암 [Kobayashi 등, Cancer Res. 54: 6539-6548 (1994)], 난소 종양 [Kuhn 등, Gynecol. Oncol. 55: 401-409 (1994)], 신장 종양 [Hofmann 등, Cancer 78: 487-492 (1996)], 뇌 종양 [Bindahl 등, J. Neuro-Oncol. 22: 101-110 (1994)] 및 연조직 육종 [Choong 등, Int. J. Cancer (Pred. Oncol.) 69: 268-272 (1996)]은 높은 수준의 uPA 및(또는) uPA 활성 및 높은 속도의 전이를 나타내었다. uPA의 과생산은 생체 내에서 전립선 암 세포에 의한 증가된 골격 전이를 유발하는 것으로 보고되고 있다 [Achbarou 등, Cancer Res. 54: 2372-2377 (1994)].
uPA 활성의 억제 또는 저하, 또는 uPA와 그의 수용체 (uPAR) 사이의 상호 작용의 방해/억제는 전이에 대한 억제 작용 및 세포외 기질의 유지에 대한 긍정적인 효과를 가지는 것으로 보고되고 있다 [Ossowski and Reich, Cell 35: 611-619 (1983); Ossowski, Cell 52: 321-328 (1988); Ossowski, J. Cell Biol. 107: 2437-2445 (1988); Wilhelm 등, Clin. Exp. Metastasis 13: 296-302 (1995); Achbarou 등, Cancer Res. 54: 2372-2377 (1994); Crowley 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5021-5025 (1993); Kook 등, EMBO J. 13: 3983-3991 (1994)]. 상기 실험 연구 결과는 uPA로 촉매된 플라스미노겐 활성화는 종양 진행, 국부 종양 침입 및(또는)원격 전이의 형성에 대한 속도를 제한한다는 것을 제안한다 [Andreasen 등, Int. J. Canc. 72: 1-22 (1997)].
세포 이동 및 침입에 대한 uPA 시스템의 효과는 세포외 기질의 플라스민 매개성 퇴화의 단백질분해 효과 뿐만 아니라, 세포외 기질의 성분과의 uPA 수용체의 보다 적접적인 상호 작용 둘다 때문이라 생각된다. 세포외 기질의 퇴화는 전이 세포의 기질로의 침입을 허용하는 반면, uPA 수용체와 기질 자체 사이의 상호 작용은 그의 이동에 대해 세포를 조력한다. 세포 표면 상 또는 전이 세포의 선도연에서의 uPA/플라스민 시스템의 위치 결정은 전이에서 uPA의 가상 역할과 일관된다 [Plesner 등, Stem Cells 15: 398-408 (1997)].
비트로넥틴, 세포외 기질의 성분과의 uPAR의 상호 작용은 세포 유착을 매개하고 uPAR이 uPA에 결합되어 있을 경우 강화될 수 있다. 세포 표면 유착 분자, 인테그린, 특히 베타-1 및 베타-2 인테그린은 또한 이러한 유착 기능과 연관이 있는 것으로 보인다 [Paysant 등, Br. J. Haematol. 100: 45-51 (1998); Simon 등, Blood 88: 3185-3194 (1996)]. CD11b/CD18 인테그린은 uPA-uPAR 착물과 회합할 수 있고, 예를 들어 호중구, 단핵세포와 같은 이들 수용체를 함유하는 세포의 유착을 촉진할 수 있다.
uPA/uPAR 시스템은 또한 새로운 맥관계의 수립 또는 혈관 신생과 연관이 있다.
새로운 맥관계의 수립은 원발성 및 전이 종양 성장을 유지시키기 위하여 필요하다. 병리학적 혈관 신생은 또한 망막 질환, 홍채 홍색증, 증식성 초자체 망막증, 염증성 질환, 당뇨성 망막증, 만성 포도막염, 푸크스 이색성홍채모양체염, 혈관 신생 녹내장, 각막 또는 시신경 혈관 신생, 혈관 질환, 익상편, 녹내장 수술 수포 장애, 과각화증, 켈로이드 및 폴립 형성의 특징이다 (유럽 특허 제451,130호 참조). 바람직하지 못한 혈관 형성은 또한 미국 특허 제5,712,291호에 인용되어 있는, 하기 증상에서 발생하거나 또는 하기 활성의 결과일 수 있다: 황반 변성, 미숙아 망막증, 각막 이식편 거부, 수정체후부섬유증식증, 유행성 각결막염, 비타민 A 결핍증, 콘텍트 렌즈 과도 착용증, 아토피성 각막염, 상윤부각막염, 익상편 건성 각막염, 소그렌스 질환(sogrens disease), 주사성 여드름, 필렉테눌로시스(phylectenulosis), 매독, 나병 이외의 미코박테리아 감염, 지질 변성, 화학약품 화상, 박테리아 또는 진균 궤양, 단순 포진 또는 대상 포진 감염, 원충류 감염, 카포시 육종, 무렌 궤양, 테리엔스(Terrien's) 변연 변성, 변연 각질 박리, 외상, 류마티스성 관절염, 전신성 낭창, 다발성 동맥염, 베게너스 유육종증, 슬레리티스(sleritis), 스티븐스 존스 질환, 방사상 각막절개술, 겸상 적혈구 빈혈증, 유육종증, 탄성섬유가황색종, 파제트 질환, 정맥 또는 동맥 폐색, 경동맥 폐색 질환, 만성 포도막염, 만성 초자체염, 라임 질환, 이알레스 질환, 베케츠 질환, 근시, 눈 소와, 스타르가르츠 질환, 편평부염, 만성 망막 박리, 고점도 증후군, 주혈원충병, 레이저 수술후 합병증, 섬유혈관 조직의 이상 증식, 혈관종, 오슬러-웨버-랑뒤병, 고상 종양, 혈액 매개 종양, AIDS, 안구 혈관 신생 질환, 골관절염, 만성 염증, 크론 질환, 궤양성 대장염, 횡문근육종의 종양, 망막아세포종의 종양, 유잉 육종의 종양, 신경아세포종의 종양, 골육종의 종양, 백혈병, 건선, 아테롬성 동맥경화증, 유천포창.
uPA/uPAR 결합의 길항제 (IgG의 Fc에 융합된 uPA의 EGF 유사 도메인)는 혈관 신생 및 쥐의 B16 흑색종의 성장을 억제하는 것으로 보고되었다 [Min 등, Cancer Res. 56: 2428-2433 (1996)]. 유방 암종에서 미세혈관 밀도, 혈관 침입과 uPA 함량 사이에 주시된 상관 관계와 상기 발견과는 일치한다 [Hildenbrand 등, Brit. J. Cancer 72: 818-823 (1995)]. 공지된 uPA 억제제 아밀로라이드는 또한 다양한 혈관 신생 병변을 억제하는 것으로 보고되었다 [Glaser 등, 유럽 특허 제451,130호; Avery 등, Arch. Ophthalmol. 108: 1474-1476 (1990)].
uPA의 2가지 주요 생리적 억제제, 즉 단백질분해효소 억제제의 세르핀 군의 구성원인 PAI-1 및 PAI-2가 있다. 세르핀의 그의 동류 프로테아제로의 결합은 세르핀 반응 루프 (PAI-1의 경우 Ser-Ala-Arg-Met-Ala (SEQ. ID. NO. 1), PAI-2의 경우 Thr-Gly-Arg-Thr-Gly (SEQ. ID. NO. 2))에서의 것들을 포함하는 각 단백질의 아미노산 사이의 수많은 상호 작용을 포함한다. 실험 동물로의 외인성 PAI-2의 도입은 폐 전이의 속도를 억제하는 것으로 보고되었다 [Evans and Lin, Amer. Surg. 61: 692-697 (1995); Mueller 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 205-209 (1995)]. 전이를 억제하는 PAI-1의 능력은 아직까지 시종 일관되게 나타나지 않고 있다. PAI-1의 유전자, 및 그의 재조합 발현 수단이 로스쿠토프(Loskutoff) 등의 미국 특허 제4,952,512호에 개시되어 있다. 재조합 및 천연 인간 PAI-2는 스티븐스(Stephens) 등의 미국 특허 제5,422,090호에 개시되어 있다.
가장 널리 연구된 uPA 억제제는 B428 (4-요오도-벤조[b]티오펜-2-카르복사미딘) 및 B623이 구성원인 억제제의 4-치환 벤조[b]티오펜-2-카르복사미딘 부류에 들 수 있다 [Towle 등, Cancer Res. 53: 2553-2559 (1993); Bridges 등, Bioorg. Med. Chem. 1: 403-410 (1993); Bridges 등, 미국 특허 제5,340,833호]. 종양 세포를 접종시킨 실험 래트로의 B428의 주입은 uPAR 유전자 발현을 억제하고 원발성 종양 부피를 감소시키고 전이를 감소시킨다고 보고되었다 [Xing 등, Cancer Res. 57: 3585-3593 (1997)]. B428 또는 B623으로 종양이 있는 마우스를 매일 복강내 처리하면 근육 및 지방으로의 전이를 막을 수 있으나, 종양 유발 혈관 형성을 억제하지 못하거나 또는 자발적인 폐 전이 속도를 감소시키지 못하였다고 보고되었다. 사실, B623은 폐 전이의 형성을 강화하였다 [Alonso 등, Breast Cancer Res. Treat. 40: 209-223 (1996)]. 래트 전립선 암의 선천성 모델에서 B428의 주입은 또한 원발성 종양 부피 및 종양 중량의 감소, 및 전이의 감소를 유발한다 [Rabbani 등, Int. J. Cancer 63: 840-845 (1995)].
uPA의 다른 공지된 억제제는 uPA의 경쟁적 억제제인 p-아미노벤자미딘, 및 아밀로라이드를 포함한다. 두 화합물은 실험 동물에서 종양 크기를 감소시키는 것으로 보고되고 있다 [Jankan 등, Cancer Res. 57: 559-563 (1997); Billstrom 등, Int. J. Cancer 61: 542-547 (1995)]. 최근에, 에피갈로-카테신-3 갈레이트 (EGCG), 녹차에서 발견된 폴리페놀은 uPA와 결합하여 그의 활성을 억제한다고 보고되었다 [Jankun 등, Nature 387: 561 (1997)]. 이들 연구자들은 EGCG는 아밀로라이드보다 약한 uPA 억제제라고 결론을 내렸으나, EGCG는 독성 효과없이 아밀로라이드보다 많은 투여량으로 소비될 수 있다고 제안하였다. uPA의 경쟁적 억제제, α-N-벤질술포닐-p-아미노페닐알라닌은 파이(Pye) 등의 미국 특허 제4,165,258호에 개시되어 있다.
uPA/uPAR 시스템을 억제하는 다른 접근법으로는 체외에서 uPA를 억제하고 uPAR과 결합하는 것으로 보고된 PAI-2 및 uPA의 uPAR 결합 도메인으로 이루어진 2관능성 하이브리드 분자의 개발이 있다 [Ballance 등, Eur. J. Biochem. 207: 177-183 (1992)]. uPAR의 길항제는 또한 uPA와 상보성인 안티센스 올리고뉴클리오티드 [Wilhelm 등, Clin. Exp. Metast. 13: 296-302 (1995); Iversen and Scholar, 미국 특허 제5,552,390호]를 갖는 것으로 연구되고 있다 [Doyle and Rosenberg, 미국 특허 제5,656,726호; Min 등, Cancer Res. 56: 2428-2433 (1996)]. uPAR에 대한 uPA의 결합을 억제하는 것으로 보고되어 있는 uPAR에 대한 항체가 다노(Dano) 등의 미국 특허 제5,519,120호에 개시되어 있다. 다양한 다른 세린 프로테아제와 함께 유로키나제를 억제하는 것으로 보고된 작은 분자로는 아베(Abe) 등의 미국 특허 제5,508,385호 및 미국 특허 제5,153,176호, 및 문헌 [Takano 등, J. Pharmacol. Exp. Therapeut. 271: 1027-1033 (1994)]에 개시되어 있는 것이 있다.
화합물은 uPAR에 대한 uPA의 결합을 직접 억제하도록 개발되고 있다 [Crowley 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5021-5025 (1993); Goodson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7129-7133 (1994); Kobayashi 등, Brit. J. Cancer 67: 537-544 (1993), 및 Int. J. Cancer 57: 727-73f3 (1994), 및 J. Biol. Chem. 270: 8361-8366 (1995); Lu 등, FEBS Lett. 356: 56-59 (1994) 및 FEBS Lett. 380: 21-24 (1996)].
또한, pro-간세포 성장인자(HGF), 세포 이동 자극 단백질은 uPA의 기질이다 [Naldinie 등, EMBO J. 11: 4825-4833 (1992)]. uPA에 의한 66kDa 세포외 기질 단백질 및 피브로넥틴의 직접적인 분열이 또한 보고되고 있으며, 세포 이동을 용이하게 하는 uPA의 보다 직접적인 역할을 제안한다 [Quigley 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 2776-2780 (1987)]. 따라서, uPA의 억제는 또한 이들 활성에 영향을 미칠 수 있다.
<발명의 요약>
본 발명은 신규한 펩티드 알데히드 및 케토아미드 화합물에 관한 것이다. 펩티드 알데히드 화합물은 P1에서 아르기닌 또는 아르기닌 유사체를 가진다. 케토아미드 화합물은 P1에서 아르기닌 케토아미드기를 가진다. 이들 화합물은 유로키나제의 효능있는 억제제로서의 활성을 가지며, 이로 인해 그의 유해한 효과를 감소시키는 데 유용하다. 본 발명의 화합물은 특히 병리학적 질병과 관련된 혈관 형성을 억제하는 활성이 있다.
따라서, 본 발명의 일 면은 하기 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용가능한 염에 관한 것이다.
상기 화학식에서,
(a) X는 -S(O)2-, -N(R')-S(O)2-, -(C=O)-, -OC(=O)-, -NH-C(=O)-, -P(O)(R')- 및 직접 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 R'는 독립적으로 수소, 탄소 원자수 1 내지 약 4의 알킬, 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴, 또는 탄소 원자수 약 7 내지 약 16의 아랄킬이되, 단 X가 -P(O)(R')-일 경우 R'는 수소가 아니며,
(b) R1은
(1) 임의로는 Y1이 치환되는 탄소 원자수 1 내지 약 12의 알킬,
(2) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 5 내지 약 8의 시클로알킬로 치환된 탄소 원자수 1 내지 약 3의 알킬,
(3) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 3 내지 약 15의 시클로알킬,
(4) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 S(O)i(여기서, i는 0, 1 또는 2임)로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 4 내지 약 10의 헤테로시클로알킬,
(5) 임의로는 고리 탄소에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되고, 고리 탄소 원자수 3 내지 6의 5 내지 7원 헤테로사이클인(여기서, V는-CH2-, -O-, -S(=O)-, -S(O)2- 또는 -S-임)를 포함하는, 산소, 질소 및 S(O)i(여기서, i는 0, 1 또는 2임)로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 4 내지 약 10의 헤테로시클로,
(6) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 5 내지 약 8의 시클로알킬로 임의로 치환되는 탄소 원자수 2 내지 약 6의 알케닐,
(7) 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴,
(8) 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아릴,
(9) 임의로는 아릴 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 7 내지 약 15의 아랄킬,
(10) 임의로는 알킬 사슬에 히드록시 또는 할로겐이 치환되고, 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아랄킬,
(11) 임의로는 아릴 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 8 내지 약 16의 아랄케닐,
(12) 임의로는 고리 탄소에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아랄케닐,
(13),
(14),
(15),
(16),
(17) 탄소 원자수 약 9 내지 약 15의 융합 카르보시클릭 알킬,
(18) 디플루오로메틸 또는 탄소 원자수 1 내지 약 12의 퍼플루오로알킬,
(19) 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 퍼플루오로아릴,
(20) 탄소 원자수 약 7 내지 약 15의 퍼플루오로아랄킬, 및
(21) 수소(X가 직접 결합일 경우)로 이루어진 군으로부터 선택되며,
여기서, Y1, Y2및 Y3각각은 독립적으로 선택되고,
(i) 할로겐, 시아노, 니트로, 테트라졸릴, 구아니디노, 아미디노, 메틸구아니디노, -CF3, CF2CF3, -CH(CF3)2, -C(OH)(CF3)2, -OCF3, -OCF2H, -OCF2CF3, -OC(O)NH2, -OC(O)NHZ1, -OC(O)NZ1Z2, -NHC(O)Z1, -NHC(O)NH2, -NHC(O)NZ1, -NHC(O)NZ1Z2, -C(O)OH, -C(O)OZ1, -C(O)NH2, -C(O)NHZ1, -C(O)NZ1Z2, P(O)3H2, -P(O)3(Z1)2, -S(O)3H, -S(O)mZ1, -Z1, -OZ1, -OH, -NH2, -NHZ1, -NZ1Z2, -N-모르폴리노, -S(CF2)qCF3및 -S(O)m(CF2)qCF3로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 m은 0, 1 또는 2이고, q는 0 내지 5의 정수이고, Z1및 Z2는 독립적으로 탄소 원자수 1 내지 약 12의 알킬, 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴, 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아릴, 탄소 원자수 약 7 내지 약 15의 아랄킬, 및 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아랄킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는
(ii) Y1및 Y2는 -O[C(Z3)(Z4)]rO-가 되도록 함께 선택되며, 여기서 r은 1 내지 4의 정수이고, Z3및 Z4는 독립적으로 수소, 탄소 원자수 1 내지 약 12의 알킬, 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴, 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아릴, 탄소 원자수 약 7 내지 약 15의 아랄킬, 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아랄킬로 이루어진 군으로부터 선택되며,
(c) R2는 H, -CH3, -C2H5, -(CH2)2OH, -(CH2)2OA2, -CH(R6)OH, -CH(R6)OA2및 -CH2NH-X'-R6으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 A2는 -C(=O)OR9또는 -C(=O)R9이고, X'는 -S(O)2-, -S(O)2-N(R")-, -(C=O)-, -C(=O)-O-, -C(=O)-NH-, P(O)(R")-(여기서, R"는 수소, 탄소 원자수 1 내지 약 4의 알킬, 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴 또는 탄소 원자수 약 7 내지 약 16의 아랄킬이되, 단 X'가 -P(O)(R")-일 경우 R"는 수소가 아님) 및 직접 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
R6은
(1) 임의로는 Y1이 치환되는 탄소 원자수 1 내지 약 12의 알킬,
(2) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 5 내지 약 8의 시클로알킬로 치환된 탄소 원자수 1 내지 약 3의 알킬,
(3) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 3 내지 약 15의 시클로알킬,
(4) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 S(O)i(여기서, i는 0, 1 또는 2임)로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 4 내지 약 10의 헤테로시클로알킬,
(5) 임의로는 고리 탄소에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되고, 고리 탄소 원자수 3 내지 6의 5 내지 7원 헤테로사이클인(여기서, V는 -CH2-, -O-, -S(=O)-, -S(O)2- 또는 -S-임)를 포함하는, 산소, 질소 및 S(O)i(여기서, i는 0, 1 또는 2임)로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 4 내지 약 10의 헤테로시클로,
(6) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 5 내지 약 8의 시클로알킬로 임의로 치환되는 탄소 원자수 2 내지 약 6의 알케닐,
(7) 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴,
(8) 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아릴,
(9) 임의로는 아릴 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 7 내지 약 15의 아랄킬,
(10) 임의로는 알킬 사슬에 히드록시 또는 할로겐이 치환되고, 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아랄킬,
(11) 임의로는 아릴 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 8 내지 약 16의 아랄케닐,
(12) 임의로는 고리 탄소에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아랄케닐, 및
(13) 수소로 이루어진 군으로부터 선택되고,
R9는
(1) 임의로는 Y1이 치환되는 탄소 원자수 1 내지 약 12의 알킬,
(2) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 5 내지 약 8의 시클로알킬로 치환된 탄소 원자수 1 내지 약 3의 알킬,
(3) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 3 내지 약 15의 시클로알킬,
(4) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 S(O)i(여기서, i는 0, 1 또는 2임)로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 4 내지 약 10의 헤테로시클로알킬,
(5) 임의로는 고리 탄소에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되고, 고리 탄소 원자수 3 내지 6의 5 내지 7원 헤테로사이클인(여기서, V는 -CH2-, -O-, -S(=O)-, -S(O)2- 또는 -S-임)를 포함하는, 산소, 질소 및 S(O)i(여기서, i는 0, 1 또는 2임)로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 4 내지 약 10의 헤테로시클로,
(6) 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴,
(7) 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아릴,
(8) 임의로는 아릴 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 7 내지 약 15의 아랄킬,
(9) 임의로는 알킬 사슬에 히드록시 또는 할로겐이 치환되고, 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아랄킬, 및
(10) 수소로 이루어진 군으로부터 선택되되, 단 A2가 -C(=O)OR9일 경우 R9는 수소가 아니고,
(d) R3은 H 또는 메틸로부터 선택되거나, 또는 R3및 R4는 (f)에 설명된 것과 같이 함께 선택되고,
(e) R4는 S 배위로 존재하고, H, -CH2-S-CH3, -CH2OH, -CH2CN, 탄소 원자수 1 내지 약 3의 저급 알킬, -CH2C≡CH, -CH2CH=CH2및 -CH=CH2로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3및 R4는 (f)에 설명된 것과 같이 함께 선택되고,
(f) 또는, R3및 R4는 S 배위로 존재하여 프롤릴, 피페콜릴, 아제티딘-2-카르보닐, 4-히드록시프롤릴, 3-히드록시프롤릴 및 3,4-데히드로프롤릴로 이루어진 군으로부터 선택된 P2에서 기를 가지도록 함께 선택되며,
(g) R5는및로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 R7은,,,및(여기서, d는 1 내지 3의 정수이고, W는 -N- 또는 -CH-임)로부터 선택되고,
(h) A1은 -NHR8이고, 여기서 R8은 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 탄소 원자수 1 내지 약 12의 알킬, 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴 또는 탄소 원자수 약 6 내지 약 15의 아랄킬이거나, 또는 수소이다.
본 발명의 화합물은 하기 화학식 Ia 및 Ib로 나타낸 바와 같이 P1', P1, P2, P3및 P4로 언급된 부분으로 나누어질 수 있다.
상기 식에서,
X, R1, R2, R3, R4, R7및 A1은 화학식 I에 관련하여 정의된 바와 같다. 따라서, P1또는 P1로 언급된 화학식 I의 화합물의 일부는또는잔기이다.
P2또는 P2로 언급된 화학식 I의 화합물의 일부는잔기이다.
P3또는 P3으로 언급된 화학식 I의 화합물의 일부는잔기이다.
펩티딜 아르기닌 알데히드는 수용액에서 평형 상태 구조로 존재하는 것으로 보고되고 있다 [Bajusz, S. 등, J. Med. Chem. 33: 1729 (1990)]. 하기에 나타낸 바와 같이 이들 구조는 아르기닌 알데히드, A, 알데히드 히드레이트, B 및 두 아미노 시클롤 형태, C 및 D를 포함한다. R기는 본 발명에 포함되는 소정의 화합물의 나머지를 나타낼 것이다. 본 발명의 펩티드 알데히드는 그의 정의 내에 모든 평형 상태 형태를 포함한다.
특히, 본 발명은 본 발명의 신규 화합물이 유로키나제의 억제제로서 활성이라는 발견에 기초한다. 본 발명의 화합물은 혈관 형성 억제에 대한 활성을 나타낸다.
본 발명의 다른 면은 치료 유효량의 본 발명의 화합물 및 제약상 허용가능한 담체를 포함함을 특징으로 하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 면은 유로키나제의 억제를 위해 본 발명의 화합물 및 제약 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
<정의>
본 발명에 따라 그리고 본원에서 사용되는 하기 용어는 명백히 다른 언급이 없는 한, 하기 의미를 가지는 것으로 정의된다.
"알케닐"이란 용어는 1개 이상의 이중 결합을 가지는 불포화 지방족 기를 의미한다.
"알킬"이란 용어는 직쇄, 분지쇄 및 시클릭(폴리시클릭 포함) 기를 포함하는 포화 지방족 기를 의미한다.
"알콕시" 및 "알콕실"이란 용어는 화학식 R-O- (여기서, R은 알킬기임)의 기를 의미한다.
"알콕시카르보닐"이란 용어는 -C(O)OR (여기서, R은 알킬임)을 의미한다.
"아랄케닐"이란 용어는 아릴기로 치환된 알케닐기를 의미한다. 바람직하게는, 알케닐기는 2 내지 약 6의 탄소 원자를 가진다.
"아랄킬"이란 용어는 아릴기로 치환된 알킬기를 의미한다. 적합한 아랄킬기는 벤질, 펜에틸 등을 포함하며, 상기 모두는 임의로 치환될 수 있다. 바람직하게는, 알킬기는 1 내지 약 6의 탄소 원자를 가진다.
"아릴"이란 용어는 공액 파이 전자 시스템을 가지는 1개 이상의 고리를 가지는 방향족 기를 의미하는 것으로, 임의로 치환될 수 있는, 카르보시클릭 아릴, 헤테로시클릭 아릴 및 비아릴기가 있다.
"아릴록시"라는 용어는 화학식 R-O- (여기서, R은 아릴기임)의 기를 의미한다.
"아랄콕시"라는 용어는 화학식 R-O- (여기서, R은 아랄킬기임)의 기를 의미한다.
"아미노산"이란 용어는 그의 구조가 입체 이성질체 형태를 허용할 경우 그의 D 및 L 입체 이성질체로서의 천연, 비천연 아미노산 둘다 및 그의 유사체를 의미한다. 천연 아미노산은 알라닌(Ala), 아르기닌(Arg), 아스파라긴(Asn), 아스파르트산 (Asp), 시스테인(Cys), 글루타민(Gln), 글루탐산(Glu), 글리신(Gly), 히스티딘(His), 이소류신(Ile), 류신(Leu), 리신(Lys), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 프롤린(Pro), 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 트립토판(Trp), 티로신(Tyr) 및 발린(Val)을 포함한다. 비천연 아미노산은 아제티딘카르복실산, 2-아미노아디프산, 3-아미노아디프산, 베타-알라닌, 아미노프로피온산, 2-아미노부티르산, 4-아미노부티르산, 6-아미노카프로산, 2-아미노헵탄산, 2-아미노이소부티르산, 3-아미노이소부티르산, 2-아미노피멜산, 2,4-디아미노이소부티르산, 데모신, 2,2'-디아미노피멜산, 2,3-디아미노프로피온산, N-에틸글리신, N-에틸아스파라긴, 히드록실리신, 알로-히드록실리신, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린, 이소데스모신, 알로-이소류신, N-메틸글리신, N-메틸이소류신, N-메틸발린, 노르발린, 노르류신, 오르니틴 및 피페콜산을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 아미노산유사체는 그의 N-종결 아미노기 또는 측쇄기가 가역적 또는 비가역적으로 화학적으로 블록킹되거나, 또는 변성된 천연 및 비천연 아미노산을 포함하며, 예로는 메티오닌 술폭사이드, 메티오닌 술폰, S-(카르복시메틸)-시스테인, S-(카르복시메틸)-시스테인 술폭사이드 및 S-(카르복시메틸)-시스테인 술폰이 있다.
"아미노산 유사체"라는 용어는 C-종결 카르복시기, N-종결 아미노기 또는 측쇄 관능기 중 하나가 화학적으로 다른 관능기로 변성된 아미노산을 의미한다. 예를 들면, 아스파르트산-(베타-메틸 에스테르)는 아스파르트산의 아미노산 유사체이고, N-에틸글리신은 글리신의 아미노산 유사체이고, 또한 알라닌 카르복사미드는 알라닌의 아미노산 유사체이다.
"아미노산 잔류물"이란 용어는 (1) -C(O)-R-NH- (여기서, R은 통상적으로 -CH(R')- (R'는 H 또는 치환체를 함유하는 탄소임)임), 또는 (2)(여기서, p는 각각 아제티딘카르복실산, 프롤린 또는 피페콜산 잔류물을 나타내는, 1, 2 또는 3임)의 라디칼을 의미한다.
"비아릴"이란 페닐 고리의 오르토, 메타 또는 파라 부착 위치에서 본원에서 정의된 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 아릴이 치환된 페닐을 의미한다.
"염수"는 염화나트륨의 포화 수용액을 의미한다.
"카르보시클릭 아릴"이란 방향족 고리의 고리 원자가 탄소 원자인 방향족 기를 의미한다. 카르보시클릭 아릴기는 모노시클릭 카르보시클릭 아릴기 및 나프틸기를 포함하며, 상기 모두는 임의로 치환될 수 있다. 적합한 카르보시클릭 아릴기는 페닐 및 나프틸을 포함한다. 적합한 치환된 카르보시클릭 아릴기는 유리하게는 저급 알킬, 히드록시, 저급 알콕시, 저급 알콕시카르보닐, 할로겐, 트리플루오로메틸, 디플루오로메틸, 니트로 및 시아노와 같은 치환체 1개 내지 2개가 치환된 인덴 및 페닐을 포함한다. 치환된 나프틸은 상기 화학식 I와 관련하여 정의된 바와 같이 Y1, Y2및(또는) Y3이 치환된 나프틸, 보다 바람직하게는 1- 또는 2-나프틸을 의미한다.
"시클로알케닐"이란 시클릭 알케닐기를 의미한다. 적합한 시클로알케닐기는 예를 들어 시클로펜테닐 및 시클로헥세닐을 포함한다.
"시클로알킬"이란 1개 이상의 고리를 가지는 시클릭 알킬기를 의미하며 융합 고리 시클릭 알킬기를 포함한 폴리시클릭기를 포함한다. 적합한 시클로알킬기는 예를 들면 시클로헥실, 시클로프로필, 시클로펜틸 및 시클로헵틸을 포함한다.
"시클로헥실메틸"은 CH2에 부착된 시클로헥실기를 의미한다.
"융합 카르보시클릭"이란 방향족 및 비방향족 고리 둘다를 가지는 멀티시클릭 융합 카르보시클릭 고리를 의미한다. 적합한 융합 카르보시클릭 고리는 플루오레닐, 테트랄린 등을 포함한다.
"융합 카르보시클릭 알킬"이란 융합 카르보시클릭 고리 잔기, 바람직하게는 방향족 및 비방향족 고리 둘다를 포함하는 멀티시클릭 융합 카르보시클릭 고리로 치환된 알킬기를 의미한다. 적합한 융합 카르보시클릭 알킬기는 플루오레닐메틸 등을 포함한다.
"할로겐"이란 용어는 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 의미한다.
"헤테로아랄케닐"이란 헤테로아릴로 치환된 알케닐기를 의미하며, 문헌 ["Handbook of Chemistry and Physics", 49th edition, 1968, R.C. Weast, editor; The Chemical Rubber Co., Cleveland, OH, 특히 Section C, Rules for Naming Organic Compounds, B. Fundamental Heterocyclic Systems]에 기술되어 있는 이들 헤테로시클릭 시스템을 포함한다. 바람직하게는, 알케닐기는 2 내지 약 6의 탄소 원자를 가진다.
"헤테로아랄킬"이란 피콜릴과 같은 헤테로아릴로 치환된 알킬기를 의미하며, 문헌 ["Handbook of Chemistry and Physics", 49th edition, 1968, R.C. Weast, editor; The Chemical Rubber Co., Cleveland, OH, 특히 Section C, Rules for Naming Organic Compounds, B. Fundamental Heterocyclic Systems]에 기술되어 있는 이들 헤테로시클릭 시스템을 포함한다. 바람직하게는, 알킬기는 1 내지 약 6의 탄소 원자를 가진다.
"헤테로아릴"이란 탄소 원자수 1 내지 14의 방향족기를 의미하며, 고리 원자의 나머지는 헤테로원자이며, 문헌 ["Handbook of Chemistry and Physics", 49th edition, 1968, R.C. Weast, editor; The Chemical Rubber Co., Cleveland, OH, 특히 Section C, Rules for Naming Organic Compounds, B. Fundamental Heterocyclic Systems]에 기술되어 있는 이들 헤테로시클릭 시스템을 포함한다. 적합한 헤테로원자는 산소, 질소 및 S(O)i(여기서, i는 0, 1 또는 2임)를 포함하며, 적합한 헤테로시클릭 아릴은 푸라닐, 티에닐, 피리딜, 피롤릴, 피리미딜, 피라지닐, 이미다졸릴 등을 포함한다.
"헤테로시클로"란 탄소, 질소, 산소 및(또는) 황 원자로 이루어진 환원된 헤테로시클릭 고리 시스템을 의미하며, 문헌 ["Handbook of Chemistry and Physics", 49th edition, 1968, R.C. Weast, editor; The Chemical Rubber Co., Cleveland, OH, 특히 Section C, Rules for Naming Organic Compounds, B. Fundamental Heterocyclic Systems]에 기술되어 있는 이들 헤테로시클릭 시스템을 포함한다.
"헤테로시클로알킬"이란 헤테로시클로기로 치환된 알킬기를 의미하며, 문헌 ["Handbook of Chemistry and Physics", 49th edition, 1968, R.C. Weast, editor; The Chemical Rubber Co., Cleveland, OH, 특히 Section C, Rules for Naming Organic Compounds, B. Fundamental Heterocyclic Systems]에 기술되어 있는 이들 헤테로시클릭 시스템을 포함한다. 바람직하게는, 알킬기는 약 1 내지 약 6의 탄소 원자를 가진다.
본원에서 유기 라디칼 또는 기와 관련되어 언급되는 "저급"이란 용어는 탄소 원자수가 1 내지 5, 바람직하게는 탄소 원자수가 1 내지 4, 유리하게는 탄소 원자수가 1 또는 2인 상기 라디칼 또는 기를 의미한다. 이러한 라디칼 또는 기는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있다.
"퍼플루오로알킬"이란 모든 수소가 불소로 대체된 알킬기를 의미한다.
"퍼플루오로아릴"이란 모든 수소가 불소로 대체된 아릴기를 의미한다.
"퍼플루오로아릴알킬"이란 아릴 잔기의 모든 수소가 불소로 대체된 아랄킬기를 의미한다.
"제약상 허용가능한 염"은 본 발명의 화합물과 유기 또는 무기 산의 결합으로부터 유도된 본 발명의 화합물의 염을 포함한다. 사실상, 염 형태의 사용은 염기 형태의 사용에 해당된다. 본 발명의 화합물은 유리 염기 및 염 형태 둘다에서 유용하고, 두 형태는 본 발명의 범위 내로 간주된다.
"Arg-al"이란 용어는 화학식의 L-아르기니날의 잔류물을 의미한다.
"Arg-ol"이란 용어는 화학식의 L-아르기니놀의 잔류물을 의미한다.
"(S)-Ng-니트로알기놀 히드로클로라이드"란 화학식의 화합물을 의미한다.
"N-t-부톡시카르보닐-Ng-니트로-L-아르기닌"이란 용어는 화학식의 화합물을 의미한다.
"L-Ng-니트로알기날 에틸 시클롤"이란 용어는 화학식의 기를 의미한다.
또한, 미국 특허 제5,514,777호를 참조하기 바란다.
"Bn"은 벤질을 의미한다.
"Boc"는 t-부톡시카르보닐을 의미한다.
"BzlSO2"는 벤질술포닐을 의미한다.
"Cbz" 또는 "CBz"란 벤질옥시카르보닐을 의미한다.
"DCA"란 디클로로아세트산을 의미한다.
"DCC"는 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드를 의미한다.
"DCM"은 디클로로메탄을 의미한다.
"DMF"는 N,N-디메틸포름아미드를 의미한다.
"DMSO"는 디메틸 술폭사이드를 의미한다.
"DMAP"는 4-N,N-디메틸아미노피리딘을 의미한다.
"EDC"는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드염을 의미한다.
"Et3N"은 트리에틸아민을 의미한다.
"EtOH"는 에탄올을 의미한다.
"HBTU"는 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트를 의미한다.
"HCl"은 염산을 의미한다.
"HOAc"는 아세트산을 의미한다.
"HPLC"는 고압 액체 크로마토그래피를 의미한다.
"HOBt"는 1-히드록시벤조트리아졸 모노히드레이트를 의미한다.
"i-BuOCOCl"은 이소부틸클로로포르메이트를 의미한다.
"LiAlH4"는 리튬 알루미늄 히드리드를 의미한다.
"LiAlH2(OEt)2"는 리튬 알루미늄 히드리드 디에톡시드를 의미한다.
"Me"는 메틸을 의미한다.
"NMM"은 N-메틸모르폴린을 의미한다.
"PhB(OH)2"는 페닐보론산을 의미한다.
"PyBOP"는 벤조트리아졸-ly-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트를 의미한다.
"TFA"는 트리플루오로아세트산을 의미한다.
"THF"는 테트라히드로푸란을 의미한다.
"TLC"는 박층 크로마토그래피를 의미한다.
유로키나제는 종양 세포의 전이, 혈관 신생 및 다른 활성과 관련된 효소이다. 본 발명의 일 목적은 유로키나제의 활성을 억제하여 그의 유해한 효과를 감소시키는데 사용될 수 있는 유로키나제의 억제제로서 활성이 있는 신규한 화합물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 혈관 형성, 특히 병리학적 질병과 관련이 있는 혈관 형성을 억제하는 신규한 화합물을 제공하는 것이다.
도 1은 P1에서 아르기니날을 가지는 본 발명의 화합물의 고상 합성에서 유용한 중간체의 합성에 대한 반응식을 나타낸 것이다. 상기 도면에서, "i" 내지 "vii"는 i) 무수 아세토니트릴 중의 4-메틸모르폴린, EDC 및 1-히드록시벤조트리아졸, 실온에서 16 시간 교반, 마무리 처리 후 78% 회수, ii) 1 시간 동안 -78℃ N2하의 리튬 알루미늄 히드리드/테트라히드로푸란, 실온으로 가온, -78℃로 냉각 및 중황산나트륨으로 퀀칭, 마무리 처리 후 수율 76%, iii) 아세토니트릴 중의 에틸 6-히드록시헥사노에이트, 수성 HCl, 아세트산 무수물 및 피리딘으로 과량의 에틸 6-히드록시헥사노에이트 캡핑, 마무리 처리 후 수율 93.7%, iv) 에탄올/물/아세트산 (4:1:1), 탄소 상의 10% 팔라듐, 16 시간 동안 2.72 atm (40 psi) H2로 처리, 마무리 처리 후 수율 94.4%, v) DCM, 1N NaOH, pH 11-13, 알릴클로로포르메이트, 마무리 처리 후 수율 80%, vi) 에탄올, 3N LiOH, pH 2-3으로의 1N HCl, 마무리 처리 후 수율 83%, 및 vii) DMF 중의 아미노 메틸화된 폴리스티렌 수지 ("AM 수지"), PyBOP, 디이소프로필에틸아민, 카이저(Kaiser) 시험으로 커플링 검사, DMF/아세트산/트리에틸아민 (8:1:1)으로 캡핑, 마무리 처리 후 수율 92%를 나타낸다. 또한, 실시예 1 내지 7을 참조하기 바란다.
도 2는 수지 1 내지 9 (도 1 참조)를 사용하여 본 발명의 화합물의 고상 합성에 대한 반응식을 나타낸 것이다. 상기 도면에서, "i" 내지 "viii"는 i) DCM,TFA 및 티오아니솔, ii) DMF 중의 Fmoc-알라닌, 1-히드록시벤조트리아졸, TBTU 및 디이소프로필에틸아민, 커플링 효율 99.5%, iii) DMF 중의 50% 피페리딘, iv) DMF, N-α-Fmoc-D-세린 (O-t-부틸), 1-히드록시벤조트리아졸, TBTU, 이소프로필에틸아민, v) DMF 중의 50% 피페리딘, vi) DMF 중의 이소부틸클로로포르메이트, 디이소프로필에틸아민, vii) 메틸술폭사이드, 테트라히드로푸란, 1N HCl, 모르폴린, 테트라키스 트리페닐포스핀 팔라듐, 및 viii) TFA/DCM/H2O (6:3:1), 반-예비 역상 HPLC에 의한 정제를 나타낸다. 또한, 실시예 8를 참조하기 바란다.
도 3은 L-Ng-니트로아르기니날 에틸 시클롤 중간체를 사용하여 P1에서 아르기니날이 있는 본 발명의 반응 화합물의 고상 합성에 대한 반응식을 나타낸 것이다. 화합물 3-1은 N-α-Cbz-D-세린(O-t-부틸)이고, 화합물 3-2는 알라닌 메틸 에스테르, 히드로클로라이드 염이다. 상기 도면에서, "i" 내지 "vii"는 i) EDC, 1-히드록시벤조트리아졸 및 아세토니트릴, 디이소프로필에틸아민으로 처리하여 Cbz-D-Ser (O-t-부틸)-Ala-OMe 수득, ii) 2 시간 동안 3.06 atm (45 psi) H2에서 에틸/아세트산/물 (4:1:1), 탄소 상의 10% Pd로 처리하여, 마무리 처리 후 수율 95%, iii) 아세토니트릴, 벤젠술포닐 클로라이드, 디이소프로필에틸아민, 마무리 처리 후 수율 43%, iv) 메탄올, 1.0 M 리튬 히드록사이드, 메탄올/물로 용출하는 도웩스 이온 교환수지 상의 산성화, 마무리 처리 후 수율 95%, v) 1-히드록시벤조트리아졸, 아세토니트릴, 디이소프로필에틸아민, 마무리 처리 후 수율 95%, vi) 3.4 atm (50 psi)에서 에탄올/아세트산/물 (4:1:1) 중의 탄소 상 10% Pd 상의 수소화, 벤질술포닐-D-Ser(O-t-Bu)-L-Ala-L-아르기니날 에틸 시클롤의 단리, 및 vii) 교반과 함께 6 M HCl, pH 4로의 6.5 M 암모늄 아세테이트, 예비 역상 HPLC에 의한 정제, 3 (v-vii) 단계에 대한 수율 15%를 나타낸다. 또한, 실시예 17 내지 20을 참조하기 바란다.
도 4는 P1에서 아르기닌 케토아미드기가 있는 본 발명의 화합물의 합성에 대한 반응식을 나타낸 것이다. 상기 도면에서, "i" 내지 "ix"는 i) 펜에틸아민, BOP 및 1-히드록시벤조트리아졸, DMF, 4-메틸모르폴린, 마무리 처리 후 수율 89%, ii) 에틸 아세테이트 중의 HCl, Ng-니트로Arg-COH-펜에틸아미드 히드로클로라이드 염 수득; iii) t-부톡시카르보닐-Ala-OH, EDC, 1-히드록시벤조트리아졸 및 아세토니트릴, 디이소프로필에틸아민, 마무리 처리 후 수율 95%, iv) 에틸 아세테이트 중의 HCl, 마무리 처리 후 수율 98%, v) t-부톡시카르보닐세린 벤질 에테르 EDC 및 1-히드록시벤조트리아졸, 아세토니트릴, 디이소프로필에틸아민, 마무리 처리 후 수율 92%, vi) 에틸 아세테이트 중의 HCl, 마무리 처리 후 수율 98%, vii) 아세토니트릴, 이소부틸 클로로포르메이트, 디이소프로필에틸아민, 마무리 처리 후 수율 85%, viii) EDC, 메틸술폭사이드 및 디클로로아세트산, 마무리 처리 후 수율 68%, ix) -20℃에서 아니솔, HF, 마무리 처리 후 수율 26%, 및 예비 역상 HPLC에 의한 정제를 나타낸다. 또한, 실시예 27 내지 34를 참조하기 바란다.
도 5는 화합물 1 (도 2에 예시되어 있는 화합물) L-Ng-니트로아르기니날 에틸 시클롤 중간체를 제조하기 위한 대안인 용액 상 합성 경로에 대한 반응식을 나타낸 것이다. 상기 도면에서, "i" 내지 "vi"는 i) 이소부틸 클로로포르메이트, 탄산나트륨, 물, 마무리 처리 후 수율 99.5%, ii) 알라닌 t-부틸 에스테르, 히드로클로라이드 염, EDC, 및 아세트니트릴 중의 히드록시벤조트리아졸, 디이소프로필에틸아민, 마무리 처리 후 정량적 수율, iii) TFA, DCM, 마무리 처리 후 정량적 수율, iv) Ng-니트로아르기니날 에틸 시클롤, HCl 염, EDC, 및 아세토니트릴 중의 히드록시벤조트리아졸, 디이소프로필에틸아민, 마무리 처리 후 수율 50%, v) 4 시간 동안 3.4 atm (50 psi) H2에서 에탄올/아세트산/물 (4:1:1), 탄소 상의 10% 팔라듐, vi) 3.0 M HCl, 예비 역상 HPLC, 2 (v 및 vi) 단계에 대한 화합물 1의 수율 62%를 나타낸다. 또한, 실시예 54 내지 59를 참조하기 바란다.
도 6은 P1에서 아르기니날이 있는 본 발명의 화합물의 고상 합성에서 사용되는 보호된 아르기니날 히드라조닐카르보닐 아미노메틸화된 폴리스티렌 수지의 합성에 대한 반응식을 나타낸 것이다. 화합물 6-1은 N-α-플루오레닐메틸옥시카르보닐-ω,ω-디-N-t-부톡시카르보닐-아르기닌이다. 상기 도면에서, "i" 내지 "iv"는 i) 아세토니트릴, 탄산칼륨, 요오드화메틸, 50℃, 에틸 아세테이트, ii) THF 및 메탄올, 염화칼슘, 얼음 조, 소듐 보로히드리드, 교반, 마무리 처리 후 수율 71%, iii) 메틸술폭사이드, 및 톨루엔, 얼음 조, EDC 및 디클로로아세트산, 및 iv) 16 내지 24 시간 동안 주위 온도에서 DCM, HCAM 수지를 나타낸다. 또한, 실시예 41 내지 45를 참조하기 바란다.
도 7은 도 6의 중간체를 사용하여 P1에서 아르기니날이 있는 본 발명의 화합물의 고상 합성에 대한 반응식을 나타낸 것이다. 상기 도면에서, "i" 내지 "ix"는 i) 30% 피페리딘/DMF, ii) N-α-Fmoc-아제티딘-2-카르복실산, 1-히드록시벤조트리아졸, TBTU, 및 DMF 중의 디이소프로필에틸아민, iii) 30% 피페리딘/DMF, iv) N-α-Fmoc-D-세린-t-부틸 에테르, 1-히드록시벤조트리아졸, TBTU, 및 DMF 중의 디이소프로필에틸아민, v) 이중 커플링, N-α-Fmoc-세린-o-t-부틸 에테르, 1-히드록시벤조트리아졸, TBTU 및 DMF 중의 디이소프로필에틸아민, 마무리 처리 후 커플링 효율 97%, vi) 30% 피페리딘/DMF, vii) DMF 중의 벤젠술포닐 클로라이드 및 디이소프로필에틸아민, viii) 이중 커플링, DMF 중의 벤젠술포닐 클로라이드 및 디이소프로필에틸아민, 마무리 처리 후 커플링 효율 96%, 및 ix) TFA/물 (9:1), 반-예비 역상 HPLC에 의한 정제 후 수율 26%를 나타낸다. 또한, 실시예 46 내지 53을 참조하기 바란다.
도 8은 P1에서 3-피페리디닐-(N-구아니디노) 알라니날이 있는 본 발명의 화합물의 합성에서 사용되는 중간체의 제조에 대한 반응식을 나타낸 것이다. 상기 도면에서, "i" 내지 "vi"는 i) 티오닐 클로라이드, 메탄올, ii) 디-tert-부틸 디카르보네이트, pH 7 내지 8, iii) 수소 가스, 에탄올 중의 산화백금, 물 및 아세트산, iv) 비스-벤질옥시카르보닐 S-메틸이소티오우레아, 염기, 테트라히드로푸란, v) 염화칼슘, 테트라히드로푸란과 에탄올 중의 소듐 보로히드리드, vi) HCl, 에틸 아세테이트를 나타낸다. "★"는 비대칭 탄소 원자의 위치를 나타낸다. 또한, 실시예 60 내지 64를 참조하기 바란다.
도 9는 P1에서 3-아미디노페닐알라니날이 있는 본 발명의 화합물의 합성에서사용되는 중간체의 제조에 대한 반응식을 나타낸 것이다. 상기 도면에서, "i" 내지 "xi"는 i) 포타슘 요오다이드, 디옥산, 에탄올 중의 2.5 M 소듐 에톡사이드, 아르곤 분위기, 6 시간 환류, 마무리 처리 후 수율 60%, ii) 피리딘, 트리에틸아민, H2S(g), 실온에서 16 시간 교반, 마무리 처리 후 수율 98%, iii) 아세톤, 요오도메탄, 30 분 환류, 여과, 메탄올, iv) 암모늄 아세테이트, 1 시간 환류, 여과 및 건조, v) 진한 HCl, 3 시간 환류, 마무리 처리 후 수율 30%, vi) 디옥산, 중탄산나트륨, 디-t-부틸 디카르보네이트, 실온에서 18 시간 교반, vii) 4℃, pH 12로의 4.0N NaOH, 디옥산 중의 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠 술포닐 클로라이드, pH 7 내지 8로의 1.0N HCl, 마무리 처리 후 수율 68%, viii) O, N-디메틸히드록시아민 히드로클로라이드, 히드록시벤조트리아졸 히드레이트, 4-메틸모르폴린, THF, 2 시간 교반, 마무리 처리 후 수율 69%, ix) LiAlH4, THF, -78℃, 수성 중황산칼륨, 마무리 처리 후 수율 86%, x) 4-벤즈히드릴세미카르비지드 트리플루오로아세테이트 염 (실시예 65의 화합물), 에탄올 중의 소듐 아세테이트 트리히드레이트, 환류, 마무리 처리 후 수율 89%, 및 xi) 50% TFA/DCM, 에테르로의 첨가, 마무리 처리 후 수율 79%를 나타낸다. 또한, 실시예 65 내지 72를 참조하기 바란다.
도 10은 P1에서 4-피페리디닐-(N-구아니디노) 알라니날이 있는 본 발명의 화합물의 합성에서 사용되는 중간체의 제조에 대한 반응식을 나타낸 것이다. 상기 도면에서, "i" 내지 "vi"는 i) 티오닐 클로라이드, 메탄올, ii) 디-tert-부틸 카르보네이트, pH 7 내지 8, iii) 수소 가스, 에탄올 중의 산화백금, 물 및 아세트산,iv) 비스-벤질옥시카르보닐 S-메틸이소티오우레아, 염기, 테트라히드로푸란, v) 염화칼슘, 테트라히드로푸란과 에탄올 중의 소듐 보로히드리드, 및 vi) 에틸 아세테이트 중의 HCl를 나타낸다. "★"는 비대칭 탄소 원자의 위치를 나타낸다. 실시예 73을 참조하기 바란다.
도 11은 도 8의 8-6과 같은 중간체를 사용하여 P1에서 3-구아니디노-피페리디날 기가 있는 본 발명의 화합물의 합성에 대한 반응식을 나타낸 것이다. 상기 도면에서, "i" 내지 "ix"는 i) 이소부틸클로로포르메이트, 중탄산나트륨, 수성 디옥산, ii) 알라닌 t-부틸 에스테르, EDC, HOBt, NMM, iii) H2, Pd/C, iv) 피리딘, 페닐 클로로포르메이트, v) TFA/DCM, vi) EDC, HOBt, NMM, vii) H2, Pd/C, viii) EDC, DCA, DMSO, 톨루엔, 및 ix) H2O, pH 7, 예비 역상 HPLC를 나타낸다. 실시예 74를 참조하기 바란다.
도 12는 도 9의 9-10과 같은 중간체를 사용하여 P1에서 아미디노페닐알라니날이 있는 본 발명의 화합물의 합성에 대한 반응식을 나타낸 것이다. 상기 도면에서, "i" 내지 "iii"는 i) EDC, HOBt, NMM, ii) HF, 아니솔, 및 iii) 90% 수성 TFA, 예비 역상 HPLC를 나타낸다. 실시예 75를 참조하기 바란다.
도 13은 중간체 13-1 (도 5의 5-5 (실시예 57))을 사용하여, R2가 -CH2OA2(여기서, A2는 -C(=O)R9임)인 본 발명의 화합물의 합성에 대한 반응식을 나타낸 것이다. 상기 도식에서, "i" 내지 "iii"는 i) 피리딘, R9COCl, ii) H2, 10% Pd/C,EtOH, H2O, iii) 수성 HPF6, 아세토니트릴을 나타낸다.
1. 바람직한 화합물
하기 화학식 I을 가지는 본 발명의 화합물 및 그의 제약상 허용가능한 염.
<화학식 I>
상기 화학식에서,
(a) X는 -S(O)2-, -N(R')-S(O)2-, -(C=O)-, -OC(=O)-, -NH-C(=O)-, -P(O)(R')- 및 직접 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 R'는 독립적으로 수소, 탄소 원자수 1 내지 약 4의 알킬, 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴, 또는 탄소 원자수 약 7 내지 약 16의 아랄킬이되, 단 X가 -P(O)(R')-일 경우 R'는 수소가 아니며,
(b) R1은
(1) 임의로는 Y1이 치환되는 탄소 원자수 1 내지 약 12의 알킬,
(2) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 5 내지 약 8의 시클로알킬로 치환된 탄소 원자수 1 내지 약 3의 알킬,
(3) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 3 내지 약 15의 시클로알킬,
(4) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 S(O)i(여기서, i는 0, 1 또는 2임)로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 4 내지 약 10의 헤테로시클로알킬,
(5) 임의로는 고리 탄소에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되고, 고리 탄소 원자수 3 내지 6의 5 내지 7원 헤테로사이클인(여기서, V는 -CH2-, -O-, -S(=O)-, -S(O)2- 또는 -S-임)를 포함하는, 산소, 질소 및 S(O)i(여기서, i는 0, 1 또는 2임)로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 4 내지 약 10의 헤테로시클로,
(6) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 5 내지 약 8의 시클로알킬로 임의로 치환되는 탄소 원자수 2 내지 약 6의 알케닐,
(7) 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴,
(8) 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아릴,
(9) 임의로는 아릴 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 7 내지 약 15의 아랄킬,
(10) 임의로는 알킬 사슬에 히드록시 또는 할로겐이 치환되고, 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아랄킬,
(11) 임의로는 아릴 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 8 내지 약 16의 아랄케닐,
(12) 임의로는 고리 탄소에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아랄케닐,
(13),
(14),
(15),
(16),
(17) 탄소 원자수 약 9 내지 약 15의 융합 카르보시클릭 알킬,
(18) 디플루오로메틸 또는 탄소 원자수 1 내지 약 12의 퍼플루오로알킬,
(19) 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 퍼플루오로아릴,
(20) 탄소 원자수 약 7 내지 약 15의 퍼플루오로아랄킬, 및
(21) 수소(X가 직접 결합일 경우)로 이루어진 군으로부터 선택되며,
여기서, Y1, Y2및 Y3각각은 독립적으로 선택되고,
(i) 할로겐, 시아노, 니트로, 테트라졸릴, 구아니디노, 아미디노, 메틸구아니디노, -CF3, CF2CF3, -CH(CF3)2, -C(OH)(CF3)2, -OCF3, -OCF2H, -OCF2CF3, -OC(O)NH2, -OC(O)NHZ1, -OC(O)NZ1Z2, -NHC(O)Z1, -NHC(O)NH2, -NHC(O)NZ1, -NHC(O)NZ1Z2, -C(O)OH, -C(O)OZ1, -C(O)NH2, -C(O)NHZ1, -C(O)NZ1Z2, P(O)3H2, -P(O)3(Z1)2, -S(O)3H, -S(O)mZ1, -Z1, -OZ1, -OH, -NH2, -NHZ1, -NZ1Z2, -N-모르폴리노, -S(CF2)qCF3및 -S(O)m(CF2)qCF3로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 m은 0, 1 또는 2이고, q는0 내지 5의 정수이고, Z1및 Z2는 독립적으로 탄소 원자수 1 내지 약 12의 알킬, 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴, 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아릴, 탄소 원자수 약 7 내지 약 15의 아랄킬, 및 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아랄킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는
(ii) Y1및 Y2는 -O[C(Z3)(Z4)]rO-가 되도록 함께 선택되며, 여기서 r은 1 내지 4의 정수이고, Z3및 Z4는 독립적으로 수소, 탄소 원자수 1 내지 약 12의 알킬, 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴, 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아릴, 탄소 원자수 약 7 내지 약 15의 아랄킬, 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아랄킬로 이루어진 군으로부터 선택되며,
(c) R2는 H, -CH3, -C2H5, -(CH2)2OH, -(CH2)2OA2, -CH(R6)OH, -CH(R6)OA2및 -CH2NH-X'-R6으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 A2는 -C(=O)OR9또는 -C(=O)R9이고, X'는 -S(O)2-, -S(O)2-N(R")-, -(C=O)-, -C(=O)-O-, -C(=O)-NH-, P(O)(R")-(여기서, R"는 수소, 탄소 원자수 1 내지 약 4의 알킬, 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴 또는 탄소 원자수 약 7 내지 약 16의 아랄킬이되, 단 X'가 -P(O)(R")-일 경우 R"는 수소가 아님) 및 직접 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
R6은
(1) 임의로는 Y1이 치환되는 탄소 원자수 1 내지 약 12의 알킬,
(2) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 5 내지 약 8의 시클로알킬로 치환된 탄소 원자수 1 내지 약 3의 알킬,
(3) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 3 내지 약 15의 시클로알킬,
(4) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 S(O)i(여기서, i는 0, 1 또는 2임)로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 4 내지 약 10의 헤테로시클로알킬,
(5) 임의로는 고리 탄소에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되고, 고리 탄소 원자수 3 내지 6의 5 내지 7원 헤테로사이클인(여기서, V는 -CH2-, -O-, -S(=O)-, -S(O)2- 또는 -S-임)를 포함하는, 산소, 질소 및 S(O)i(여기서, i는 0, 1 또는 2임)로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 4 내지 약 10의 헤테로시클로,
(6) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 5 내지 약 8의 시클로알킬로 임의로 치환되는 탄소 원자수 2 내지 약 6의 알케닐,
(7) 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴,
(8) 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아릴,
(9) 임의로는 아릴 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 7 내지 약 15의 아랄킬,
(10) 임의로는 알킬 사슬에 히드록시 또는 할로겐이 치환되어 있고, 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아랄킬,
(11) 임의로는 아릴 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 8 내지 약 16의 아랄케닐,
(12) 임의로는 고리 탄소에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아랄케닐, 및
(13) 수소로 이루어진 군으로부터 선택되고,
R9는
(1) 임의로는 Y1이 치환되는 탄소 원자수 1 내지 약 12의 알킬,
(2) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 5 내지 약 8의 시클로알킬로 치환된 탄소 원자수 1 내지 약 3의 알킬,
(3) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 3 내지 약 15의 시클로알킬,
(4) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 S(O)i(여기서, i는 0, 1 또는 2임)로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 4 내지 약 10의 헤테로시클로알킬,
(5) 임의로는 고리 탄소에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되고, 고리 탄소 원자수 3 내지 6의 5 내지 7원 헤테로사이클인(여기서, V는 -CH2-, -O-, -S(=O)-, -S(O)2- 또는 -S-임)를 포함하는, 산소, 질소 및 S(O)i(여기서, i는 0, 1 또는 2임)로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 4 내지 약 10의 헤테로시클로,
(6) 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴,
(7) 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아릴,
(8) 임의로는 아릴 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 7 내지 약 15의 아랄킬,
(9) 임의로는 알킬 사슬에 히드록시 또는 할로겐이 치환되고, 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아랄킬, 및
(10) 수소로 이루어진 군으로부터 선택되되, 단 A2가 -C(=O)OR9일 경우 R9는 수소가 아니고,
(d) R3은 H 또는 메틸로부터 선택되거나, 또는 R3및 R4는 (f)에 설명된 것과 같이 함께 선택되고,
(e) R4는 S 배위로 존재하고, H, -CH2-S-CH3, -CH2OH, -CH2CN, 탄소 원자수 1 내지 약 3의 저급 알킬, -CH2C≡CH, -CH2CH=CH2및 -CH=CH2로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3및 R4는 (f)에 설명된 것과 같이 함께 선택되고,
(f) 또는, R3및 R4는 S 배위로 존재하여 프롤릴, 피페콜릴, 아제티딘-2-카르보닐, 4-히드록시프롤릴, 3-히드록시프롤릴 및 3,4-데히드로프롤릴로 이루어진 군으로부터 선택된 P2에서 기를 가지도록 함께 선택되며,
(g) R5는및로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 R7은,,,및(여기서, d는 1 내지 3의 정수이고, W는 -N- 또는 -CH-임)로부터 선택되고,
(h) A1은 -NHR8이고, 여기서 R8은 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 탄소 원자수 1 내지 약 12의 알킬, 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴 또는 탄소 원자수 약 6 내지 약 15의 아랄킬이거나, 또는 수소이다.
바람직한 X기는 -S(O)2-, -OC(=O)-, -NH-C(=O)-, 및 직접 결합을 포함한다. -S(O)2- 및 -OC(=O)-이 특히 바람직하다.
바람직한 R1기는 알킬, 특히 이소부틸, 2-에틸헥실, 메틸, 부틸, 이소프로필, 시클로헥실메틸 및 시클로헥실프로필, 시클로알킬, 특히 (-)멘틸, (+)멘틸 및 시클로헥실, 아릴, 특히 나프틸 및 페닐, 아랄킬, 특히 벤질, 3-페닐프로필 및 2-페닐에틸, 및 융합 카르보시클릭 알킬, 특히 플루오레닐메틸을 포함한다. 특히 바람직한 R1기는 페닐, 벤질, 2-페닐에틸, 이소부틸 및 3-페닐프로필을 포함한다.
R1-X-의 바람직한 조합은 페닐-S(O)2-, 벤질-S(O)2-, 2-페닐에틸-S(O)2-, 3-페닐프로필-S(O)2-, 벤질-OC(=O)-, 및 이소부틸-OC(=O)-를 포함한다.
바람직한 R2기는 H, -CH3, -C2H5, -CH2NH-X'-R6및 -CH(R6)OH(여기서, R6은 수소, 알킬, 특히 메틸 또는 아랄킬임)를 포함한다. 알파 탄소에서 바람직한 키랄성은 R이다. 키랄인 경우, 베타 탄소에서 바람직한 키랄성은 R이다. 바람직한 R2기는 글리신, d-세릴(-CH(R6)OH(여기서, R6는 H임)), (R,R)d-알로트레오닐(-CH(R6)OH(여기서, R6는 메틸임)), d-2-아미노부티릴, N-β-메틸옥시카르보닐-d-2,3-디아미노프로피오닐(-CH2NH-X'-R6(여기서, R6는 CH3이고, X'는 (-C=O)O-임)), N-β-(2-페닐에틸카르보닐)-d-2,3-디아미노프로피오닐(-CH2NH-X-R6(여기서, R6는 2-페닐에틸이고, X'는 (-C=O)-임)), 및 N-β-벤질옥시카르보닐-d-2,3-디아미노프로피오닐(-CH2NH-X'-R6(여기서, R6는 벤질이고, X'는 -(C=O)O-임))으로서 P3위치를 정의하는 기이다. 특히 바람직한 R2기는 d-세릴(R6는 H임) 또는 (R,R)d-알로트레오닐(R6는 메틸임)로서 P3를 정의하는 기이다.
또다른 바람직한 R2기는 -(CH2)2OA2및 -CH(R6)OA2, 특히 바람직하게는 -CH(R6)OA2(바람직하게는 R6는 H임)를 포함한다. 더욱 바람직하게는, R2는 P3가 d-세릴의 아실 또는 카르보네이트 에스테르로서 정의되도록 선택된다. R2가 -(CH2)2OA2또는 -CH(R6)OA2인 화합물이 프로드러그(prodrug)로서 작용할 수 있다.
R3및 R4가 함께 선택되지 않는 경우 바람직한 R3기는 수소이다. R3및 R4가 함께 선택되지 않는 경우 바람직한 R4기는 메틸 또는 프로파르길이다. R3및 R4가 함께 선택되는 경우 프롤릴, 4-시스-히드록시프롤릴, 3,4-데히드로프롤릴 및 아제티딘-2-카르보닐-이 P2에서의 기를 정의하는데 바람직하게 선택된다.
바람직한 R5기는 P1에서 아르기닌 알데히드를 제공하는 -CH((CH2)3NHC(=NH)NH2)CHO이다.
청구된 화합물중에서, d-세린 또는 d-알로트레오닌을 화합물의 그 위치에서 정의하는 R2요소를 가지며 R5에서 아르기닌 알데히드를 갖는 화합물이 바람직하다. 특히 바람직한 화합물은 i) R3에서 수소를 가지며 R4에서 메틸을 갖거나(P2가 알라닌임), 또는 ii) P2가 프롤릴, 아제티딘-2-카르보닐 또는 3,4-데히드로프롤릴이도록 R3및 R4가 함께 선택되는 화합물이다.
본 발명의 바람직한 화합물은 하기 화학식의 화합물을 포함한다:
, 및
2. 바람직한 화합물의 제조
도 1 내지 12는 본 발명의 특정한 바람직한 화합물의 제조를 위한 합성 반응식을 나타낸다.
도 1은 P1에서 아르기닌 알데히드를 갖는 본 발명의 화합물의 고상 합성에 유용한 N-α-t-부톡시카르보닐-N-ω-알릴옥시카르보닐-아르기니날(6-헥사노일-아미노-메틸화 폴리스티렌 수지)시클롤의 합성을 나타낸다. 이러한 합성은 실시예 1 내지 7에 의해 더욱 상세히 기재된다.
도 2는 도 7에 나타낸 수지를 사용한 본 발명의 화합물의 고상 합성을 나타낸다. 이 합성은 실시예 8에서 더 기재되어 있다.
도 3은 L-Ng-니트로아르기니날 에틸 시클롤 중간체를 사용한 본 발명의 화합물의 용액상 합성을 나타낸다(또한, 실시예 17 내지 21 및 22 내지 26을 참조).
도 4는 P1에 아르기닌 케토아미드기를 갖는 본 발명의 화합물의 합성 반응식을 나타낸다. 그러한 화합물의 합성은 실시예 27 내지 34에 의해 더욱 상세히 기재된다.
실시예 35 내지 40은 L-Ng-니트로아르기니날 에틸 시클롤 중간체를 사용한 본 발명의 바람직한 화합물의 용액상 합성을 기재하고 있다.
도 5는 용액상 합성 및 L-Ng-니트로아르기니날 에틸 시클롤 중간체를 사용하여 도 2에 나타낸 화합물을 제조하는 또다른 합성 경로를 나타낸다(또한, 실시예 54 내지 59를 참조).
도 6은 합성 반응식을 나타내고, 실시예 41 내지 45는 본 발명의 화합물을 제조하는데 사용될 수 있는 아르기니날-히드라조닐카르보닐 아미노메틸화 수지의 합성을 더욱 상세히 기재한다.
도 7은 실시예 45의 수지를 사용한 본 발명의 화합물의 고상 제조를 위한 합성 반응식을 나타낸다. 실시예 46 내지 53은 그러한 고상 합성을 더욱 상세히 기재한다.
도 8은 P1에서 3-피페리디닐-(N-구아니디노)-알라니날 기를 갖는 본 발명의 화합물을 합성하는데 사용되는 중간체의 제조를 위한 합성 반응식을 나타낸다. 실시예 60 내지 64는 그러한 제조를 더욱 상세히 기재한다.
도 9는 P1에서 3-아미디노페닐알라니날 기를 갖는 본 발명의 화합물을 합성하는데 사용되는 중간체의 제조를 위한 반응식을 나타낸다. P1에서 4-아미디노페닐알라니날기를 갖는 화학식 I의 화합물의 제조에 사용되는 중간체는 적절한 α-브로모-파라-톨루니트릴 출발 물질을 사용하여 도 9에 나타내며 실시예 65 내지 72에 기재된 반응식에 따라 제조될 수 있다.
도 10은 P1에 4-피페리디닐-(N-구아니디노)-알라니날기를 갖는 본 발명의 화합물을 합성하는데 사용되는 중간체의 제조를 위한 반응식을 나타낸다. 이러한 중간체는 실시예 60 내지 64에 기재된 절차와 유사한 절차 및 적절한 출발 물질을 사용하여 제조된다.
도 11은 도 8의 8-6과 같은 중간체를 사용하여 P1에서 3-피페리디닐-(N-구아니디노)-알라니날기를 갖는 본 발명의 화합물을 제조하기 위한 반응식을 나타낸다.
도 12는 도 9의 9-10과 같은 중간체를 사용하여 P1에서 3-아미디노페닐알라니날기를 갖는 본 발명의 화합물을 제조하기 위한 반응식을 나타낸다.
도 13은 P3에서 에스테르화 히드록실을 갖는 본 발명의 화합물을 제조하기 위한 반응식을 나타낸다.
화학적 커플링(예를 들어, 아미드 결합)의 바람직한 수단은 당업계에 공지된 통상의 커플링제를 사용하여 펩티드 결합을 형성하는 것을 포함한다(참조, 문헌(Bodanszky, N. Peptide Chemistry, 55-73 페이지, Springer-Verlag, New York(1988)) 및 그 안에 인용된 문헌). 화학 커플링은 1 단계 또는 2 단계 커플링에 의해 수행될 수 있다. 1 단계 커플링에서, 2개의 커플링 파트너가 직접 커플링된다. 1 단계 커플링을 위한 바람직한 커플링제는 DCC와 HOBt, EDC와 HOBt, EDC와 HOAt, HBTU 또는 TBTU를 포함한다. 2 단계 커플링에서, 한개의 커플링 파트너의 C-종결 카르복시기의 활성화된 에스테르 또는 무수물이 상기 커플링 파트너가 다른커플링 파트너에 커플링되기 전에 형성된다.
수소화 민감성 치환기를 갖는 특정 화합물을 제조를 위해, 탄소상 팔라듐과 함께 수소 기체를 사용하는 것을 피하는 것이 바람직하다. 할로겐, 시아노, 니트로 또는 -S-Z1로 치환된 알케닐 또는 아릴 잔기와 같은 수소화 민감성 기를 함유하는 본 발명의 화합물을 제조하기 위한 또다른 바람직한 방법은 보론 트리스(트리플루오로아세테이트), B(OCOCF3)3를 사용하여 아르기닌기의 Ng-니트로를 절단하는 것이다. 시약은 0℃에서 디클로로메탄중의 BBr3와 CF3COOH의 반응에 의해 제조한다. 시약은 또한 상업적으로 시판된다. 일반적으로, Ng-니트로 화합물은 0℃에서 트리플루오로아세트산중의 보론 트리스(트리플루오로아세테이트)로 처리된다(예를 들어, 문헌(Fieser, M. 및 Fieser, L.F., Reagent for Organic Synthesis, 46 페이지, John Wiley & Sons, New York(1974); Pless, J., 및 Bauer, W. Angew. Chem., Internat. Ed., 12, 147(1973)) 참조).
또한, 선택적인 니트로기 분열을 위한 또다른 바람직한 시약은 삼염화티타늄이다. 이 시약은 상업적으로 시판된다. Ng-니트로 화합물은 암모늄 아세테이트 완충제를 함유하는 수성 메탄올중에 삼염화티타늄으로 처리한 후, 반응 혼합물을 공기 또는 디메틸 술폭사이드에 노출시킨다(예를 들어, 문헌(Freidinger, R.M., Hirschmann, R., 및 Veber, D.F., J.Org.Chem.,43,4800(1978)) 참조).
L-아르기니날 잔기를 갖는 이러한 화합물을 합성하기 위한 또다른 바람직한방법은 탄소상 팔라듐을 사용한 수소화와 비상용적인 기에 대해 L-아르기니날 잔기용 디-N-t-부톡시카르보닐 보호기를 사용하는 것이다. 예를 들어, α-N- 벤질옥시카르보닐-ω,ω'-디-N-t-부톡시카르보닐아르기닌을 아세토니트릴중에 용해시키고, 히드록시벤조트리아졸 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필)카르보디이미드 HCl 염으로 처리하여 α-N-벤질옥시카르보닐-ω,ω'-디-N-t-부톡시카르보닐-L-아르기닌 락탐을 형성한다. 이 락탐을 -70℃에서 THF중의 LiAlH4로 처리하여 환원시켜 α-N-벤질옥시카르보닐-ω,ω'-디-N-t-부톡시카르보닐-L-아르기니날을 제공한다. 이 알데히드는 에탄올 및 HCl로 처리하여 디에틸 아세탈로서 보호된다. N-벤질옥시카르보닐 보호기는 수소 기체 및 탄소상 팔라듐을 사용한 처리에 의해 제거되어 ω,ω'-디-N-t-부톡시카르보닐-L-아르기니날 디에틸 아세탈, HCl 염을 제공한다. 그 후, 이 보호된 L-아르기니날 잔기는 N-히드록시벤조트리아졸 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노-프로필)카르보디이미드 HCl 염으로 처리되어 목적하는 카르복실산에 커플링될 수 있다. 디에틸 아세탈 및 디-Boc 보호기는 0℃에서 아세토니트릴중의 헥사플루오로인산으로 처리되어 제거된다. 반응 혼합물은 pH 4에 도달할 때까지 2.5 M 수성 소듐 아세테이트를 첨가하여 퀀칭된다. 혼합물은 2 ㎛ 여과기를 통해 여과된다. 10 내지 40% 수성 아세토니트릴중의 0.1% CF3COOH를 사용한 예비 HPLC를 통해 목적하는 치환된 L-아르기니날 화합물의 트리플루오로아세테이트 염이 수득된다.
도 13은 본 발명의 화합물(식중, R2는 -CH2OA2이고, A2는 -C(=O)R9임)의 합성을 위한 반응식을 나타낸다. 13-1(실시예 57)과 같은 중간체는 피리딘과 같은 염기의 존재하에 산 염화물 R9COCl과 반응된다. 중간체 13-2는 수소화(H2, 에탄올:물:아세트산중의 10% Pd/C)된 후, 수성 HPF6및 아세토니트릴로 처리되어 R2에서 에스테르의 가수분해없이 보호기가 제거된다. 화합물(식중, R2는 -(CH2)2OA2또는 -CH(R6)OA2이고, 여기서, A2는 -C(=O)R9임)은 13-1에 상응하는 적절한 중간체를 적절한 산 염화물 유도체인 R9COCl과, 바람직하게는 피리딘과 같은 염기의 존재하에 반응시킴으로써 편리하게 제조될 수 있다. 그 후, 화합물(식중, R5는 아르기니날기임)의 제조시, 생성물은 수소화되고, 수성 HPF6및 아세토니트릴로 처리되어 R2에서 에스테르의 가수분해없이 아르기니날 생성물이 수득된다.
화합물(식중, R2는 -(CH2)2OA2또는 -CH(R6)OA2이고, 여기서, A2는 -C(=O)OR9임)은 상응하는 화합물(식중, R2는 -(CH2)2OH 또는 -CH(R6)OH임)을 적절한 클로로포르메이트 유도체로 처리함으로써 편리하게 제조될 수 있다. 화합물(식중, P1은 아르기니날임)의 제조시, 아르기닌 측쇄를 탈보호하기전에 카르보네이트기로 캡핑시키는 것이 바람직하다. 따라서, 상응하는 Ng-니트로아르기니날-에틸시클롤 중간체를 클로로포르메이트 유도체로 처리하는 것이 바람직하다(예를 들어, 실시예 76 참조). 그 후, 생성물을 수소화시키고, 가수분해 조건하에 처리하여 아르기니날 생성물을 수득한다(예를 들어, 실시예 77 내지 78 참조).
3. 바람직한 화합물의 선택
본 발명의 한 측면에 따라, 본 발명의 바람직한 화합물은 세린 프로테아제, 특히, 유로키나제의 억제에 대한 그의 효능 및 선택성에 대해 선택된다. 그러한 평가는 실시예 A에 나타낸 것과 같은 절차에 따라 통상 체외로 수행된다. 본원 명세서에 기재되며 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이, 목표 세린 프로테아제 및 그의 기질은 프로테아제와 그의 기질의 반응을 허용하는 분석 조건하에 합쳐진다. 분석은 시험 화합물의 부재 및 시험 화합물의 증가하는 농도의 존재하에 수행된다. 50%의 세린 프로테아제 활성이 시험 화합물에 의해 억제되는 시험 화합물의 농도는 시험 화합물에 대한 IC50값(억제 농도) 또는 EC50(유효 농도) 값이다. 시험 화합물의 계열 또는 군 중에, 보다 낮은 IC50또는 EC50값을 갖는 화합물이 보다 높은 IC50또는 EC50값을 갖는 화합물보다 큰 효능의 세린 프로테아제 억제제인 것으로 간주된다. IC50측정은 종종 단순한 분석에 사용되는 반면, EC50은 세포를 사용하는 것과 같은 복잡한 분석에 종종 사용된다.
본 발명의 상기 측면에 따른 바람직한 화합물은 유로키나제 활성의 억제에 대해 체외 분석에서 측정하였을 때 100 nM 이하의 IC50값을 갖는다. 특히 바람직한 화합물은 30 nM 미만의 IC50값을 갖는다.
시험 화합물은 또한 세린 프로테아제에 대한 선택성에 대해 평가된다. 실시예에 기재되며 일반적으로 공지된 바와 같이, 시험 화합물은 세린 프로테아제 및다른 효소의 패널에 대한 그의 효능에 대해 분석되고, IC50값 또는 EC50값은 각 분석 시스템에서 각 시험 화합물에 대해 측정된다. 시험 패널(예를 들어, 조직 플라스미노겐 활성인자, 트롬빈, 인자 Xa)내에서 목표 효소, 예를 들어, 유로키나제에 대해 낮은 IC50값 또는 EC50값 및 다른 효소에 대해 높은 IC50값 또는 EC50값을 나타내는 화합물은 목표 효소에 대해 선택적인 것으로 여겨진다. 일반적으로, 목표 효소 분석의 IC50값 또는 EC50값이 효소의 선택성 패널에서 측정된 두번째로 가장 작은 IC50값 또는 EC50값보다 10배 이상 작은 경우 화합물은 선택성인 것으로 간주된다.
본 발명의 바람직한 화합물은 유로키나제 활성 억제에 대해 체외 분석에서 측정되었을 때 100 nM 이하의 IC50값을 갖는다. 특히 바람직한 화합물은 체외 tPA 억제 분석에서 측정된 IC50값보다 10배 이상 작은 체외 유로키나제 억제 분석의 IC50값을 갖는다. IC50tPA 분석: IC50유로키나제 분석의 선택도 비가 100보다 큰 화합물이 특히 바람직하다.
본 발명의 화합물은 또한 체내 활성에 대해 평가된다. 시험 화합물의 평가를 위해 선택되는 분석 유형은 화합물의 사용에 의해 치료 또는 예방될 병리학상 증상뿐만 아니라, 시험 화합물에 대해 평가되는 투여 경로에 따라 달라질 수 있다.
예를 들어, 유로키나제의 억제를 통한 종양 성장을 감소시키는 본 발명의 화합물의 활성을 평가하기 위해, PAI-1을 평가하는 문헌(Jankun 등, Canc. Res. 57:559-563, 1997)에 기재된 절차를 사용할 수 있다. 간략히, 높은 수준의 uPA를 발현하는 ATCC 세포계 DU145 및 uPA를 발현하지 않는 LnCaP를 SCID 마우스에 주사한다. 종양이 이루어진 후, 마우스를 화합물의 체외 특성으로부터 결정된 투여 지침에 따라 시험 화합물을 공급한다. 물중 잰컨(Jankun) 등의 화합물을 투여하였다. 종양 부피 측정을 약 5주 동안 일주일에 2번 수행한다. 화합물이 투여된 동물이 적절한 대조 화합물을 수용한 동물과 비교하여 감소된 종양 부피를 나타내는 경우 화합물이 활성인 것으로 간주된다. 또한, DU145 세포 대 LnCaP 세포를 주사한 동물에서 화합물 효과의 비교는 화합물의 효과가 유로키나제의 억제로 인한 것인지를 나타낼 수 있다.
공지된 유로키나제 억제 화합물인 p-아미노벤자미딘의 종양 부피를 감소시키는 효과를 평가하도록 고안된 또다른 체내 실험 모델은 문헌(Billstroem 등, Int. J. Cancer 61: 542-547, 1995)에 기재되어 있다.
전이의 발생을 감소시키거나 억제하는 본 발명의 화합물의 능력을 평가하기 위해, 문헌(Kobayashi 등, Int. J. Canc. 57: 727-733d, 1994)에 기재된 절차를 사용할 수 있다. 간략히, 폐 전이증식의 높은 잠재성에 대해 선택된 마우스 이종이식편을 C57B1/6 마우스에 정맥내(실험적 전이) 또는 복벽에 피하내(자발적 전이) 주사한다. 다양한 농도의 시험 화합물을 주사전에 매트리겔(Matrigel)에서 종양 세포와 혼합할 수 있다. 시험 화합물의 일일 복강내 주사를 종양 접종후 1 내지 6일 또는 7 내지 13일에 수행한다. 종양 접종후 3주 또는 4주후 동물을 죽이고, 폐 종양 콜로니를 계수한다. 얻어진 자료의 평가를 통해 시험 화합물의 효능, 최적투여량 및 투여 경로가 결정된다.
종양 부피 및 전이를 감소시키는 본 발명의 화합물의 활성은 그의 억제제를 평가하기 위해 문헌(Rabbani 등, Int. J. Cancer 63: 840-845, 1995)에 기재된 모델로 평가될 수 있다. uPA를 과도하게 발현하는 매트 라이루(Mat LyLu) 종양 세포를 코펜하겐(Copenhagen) 래트의 측복부에 주사하였다. 동물에 삼투압 미니펌프를 이식하여 다양한 투여량의 시험 화합물을 3주 이하동안 계속하여 투여하였다. 실험 및 대조 동물의 전이성 성장으로서의 종양 질량 및 부피를 실험동안 평가하였다. 얻어진 자료의 평가를 통해 시험 화합물의 효능, 최적 투여량 및 투여 경로가 결정된다. 몇몇 저자가 문헌(Xing 등, Canc. Res. 57: 3585-3593, 1997)에서 관련 프로토콜을 기재하였다.
혈관 신생에 대한 본 발명의 화합물의 억제 활성을 평가하기 위해, 토끼 각막 혈관 신생 모델을 사용할 수 있다. 문헌(Avery 등, Arch. Ophthalmol. 108: 1474-1475, 1990)에는 뉴질랜드 백색 토끼를 마취한 후, 중심 각막을 절개하여 외측 각막 포켓을 형성하는 것이 기재되어 있다. 서방형 프로스타글란딘 펠렛을 포켓에 두어 혈관 신생을 유도하였다. 시험 화합물을 5일 동안 복강내 투여하고, 그 후, 동물을 죽였다. 시험 화합물의 효과는 윤부를 찍은 주기적 사진을 검토하여 평가되며, 이 사진은 혈관 신생 반응의 면적, 따라서, 윤부 혈관 신생을 계산하는데 사용될 수 있다. 적절한 대조물과 비교한 혈관 신생의 감소된 면적은 시험 화합물이 혈관 신생을 감소시키거나 또는 억제하는데 효과적이라는 것을 나타낸다.
혈관 형성을 방지하는 시험 화합물의 효과를 평가하는데 사용되는 혈관 형성모델은 문헌(Min 등, Canc. Res. 56: 2428-2433, 1996)에 기재되어 있다. C57BL6 마우스는 시험 화합물의 유무와 함께, 혈관 형성 유도제로서 bFGF를 함유하는 매트리겔 혼합물의 피하 주사액을 수용한다. 5일 후, 동물을 죽이고, 혈관 신생을 가시화할 수 있는 매트리겔 플러그의 사진을 찍는다. 매트리겔 및 유효 투여량의 시험 화합물을 수용한 실험 동물은 더 적거나 비효과적인 투여량의 화합물을 수용하는 대조 동물 또는 실험 동물보다 덜한 혈관화를 나타낼 것이다.
원발성 종양의 확산을 제한하는 화합물의 능력을 시험하도록 고안된 체내 시스템이 문헌(Crowley 등, Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5021-5025, 1993)에 기재되어 있다. 누드 마우스에 CAT(클로람페니콜 아세틸트랜스페라제)를 발현하도록 고안된 종양 세포(PC3)를 주사한다. 세포는 대량의 uPA를 분비하고, 세포 표면상에서 uPAR에 결합되는 uPA 활성 포화량을 나타낸다. 종양 크기 및(또는) 전이를 감소시키는 능력에 대해 시험되는 화합물을 동물에 투여하고, 이어서, 종양 크기 및(또는) 전이성 성장을 측정한다. 또한, 다양한 장기에서 검출되는 CAT의 수준은 전이를 억제하는 시험 화합물의 능력의 척도를 나타내고, 즉, 대조 동물에 대해 치료될 동물의 조직에서 CAT가 더 적게 검출되는 것은 상기 조직으로 이동하는 CAT-발현 세포가 더 적다는 것을 나타낸다.
고도 침입성인 것으로 알려져 있는 종양 세포계 F3II를 사용하여 시험 화합물의 유로키나제 억제 포텐셜을 평가하도록 고안된 체내 실험 모델이 문헌(Alonso 등, Breast Canc. Res. Treat. 40: 209-223, 1996)에 기재되어 있다. 이 문헌에는 독성 측정, 종양 성장, 침입성, 자발적 전이, 실험적 폐 전이 및 혈관 형성 분석에대한 체내 연구가 기재되어 있다.
문헌(L.Ossowski, J. Cell Biol. 107: 2437-2445, 1988)에 처음 기재된 CAM 모델(병아리 태아 융모요막 모델)은 시험 화합물의 유로키나제 억제 활성을 평가하는 또다른 방법을 제공한다. CAM 모델에서, 융모요막을 통한 종양 세포의 침입성은 촉매 활성인 uPA의 존재에 따라 달라진다. 유로키나제 억제제의 존재하에 CAM을 종양 세포와 접촉시킴으로써 융모요막을 통한 종양 세포의 침입성이 덜하거나 없어진다. 따라서, CAM 분석은 다양한 농도의 시험 화합물의 존재 및 부재하에 CAM 및 종양 세포를 사용하여 수행된다. 종양 세포의 침입성이 그러한 조건하에 측정되어 시험 화합물의 유로키나제 억제 활성의 척도를 제공한다. 유로키나제 억제 활성을 갖는 화합물은 종양 침입성과 덜 관련된다.
CAM 모델이 또한 혈관 형성의 표준 분석(즉, 새로운 혈관의 형성에 대한 효과)에 사용된다(Brooks, P. C., Montgomery, A.M.P. 및 Cheresh, D.A., Methods in Molecular Biology 129, 257-269, 1999). 이 모델에 따라, 기초 섬유아세포 성장인자 (bFGF)와 같은 혈관 형성 유도인자를 함유하는 여과기 디스크를 CAM상에 위치시킨다. 시토킨의 CAM중으로의 확산은 국소적 혈관 형성을 유도하며, 이는 여과기 디스크 바로 밑의 CAM내의 혈관 분지점의 수를 계수하는 것과 같은 몇가지 방식으로 측정될 수 있다. 시토킨 유도 혈관 형성을 억제하는 본 발명의 화합물의 능력은 상기 모델을 사용하여 시험될 수 있다. 시험 화합물은 혈관 형성 유도인자를 함유하는 여과기 디스크에 가해지거나, 막상에 직접 위치시키거나 전신 투여될 수 있다. 시험 화합물의 존재 및(또는) 부재하에 새로운 혈관 형성의 정도는 상기 모델을 사용하여 비교될 수 있다. 시험 화합물의 존재하에 새로운 혈관이 더 적게 형성되는 것은 항-혈관 형성 활성을 나타내는 것이다. 특정한 본 발명의 화합물이 유로키나제의 억제제로서 활성이기 때문에, 그러한 화합물에 대한 항-혈관 형성 활성은 유로키나제가 혈관 형성에 중요한 역할을 한다는 것을 암시할 수 있다.
4. 제약 조성물
또다른 측면에서, 본 발명은 제약상 허용가능한 담체중에 본 발명의 화합물 치료 유효량을 포함하며 저장 또는 투여용으로 제조되는 제약 조성물을 포함한다.
본 발명의 화합물의 치료 유효량은 투여 경로, 치료될 포유 동물의 종류 및 고려되는 특정 포유 동물의 물리적 특성에 따라 달라질 수 있다. 이러한 양을 결정하는 이러한 인자 및 그의 관계성은 의약 업계의 숙련자에 널리 공지되어 있다. 상기 양 및 투여 방법은 최적의 효능을 달성하도록 정해질 수 있으나 체중, 다이어트, 병행 요법 및 의약 업계에 공지된 기타 인자에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 화합물의 치료 유효량은 목적하는 효과 및 치료 척도에 따라 광범위하게 변할 수 있다. 통상, 투여량은 체중 1 kg당 약 0.01 내지 100 mg, 바람직하게는 체중 1 kg당 약 0.01 내지 10 mg인 것이다.
치료 용도를 위해 제약상 허용가능한 담체는 제약 업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., A.R.Gennaro edit. 1985)에 기재되어 있다. 예를 들어, 생리적 pH의 멸균 식염수 및 인산염 완충 식염수가 사용될 수 있다. 방부제, 안정화제, 염료 및 심지어 향미제가 제약 조성물에 제공될 수 있다. 예를 들어, 벤조산나트륨, 소르브산 및 p-히드록시벤조산의 에스테르가 방부제로서 첨가될 수 있다. 또한, 산화방지제 및 현탁화제가 사용될 수 있다(Id. 1449).
본 발명의 제약 조성물은 경구 투여용 정제, 캡슐 또는 엘릭서; 직장 투여용 좌약; 주사 투여용 멸균 용액 및 현탁액 등으로서 제조되고 사용될 수 있다. 투여량 및 투여 방법은 최적 효능을 달성하도록 조절될 수 있으나 체중, 다이어트, 병행 요법 및 의약 업계에 공지된 기타 인자에 따라 달라질 수 있다.
투여가 일일 기준으로 정맥내 투여와 같은 비경구인 경우, 주사용 제약 조성물은 액체 용액 또는 현탁액, 주사전에 액체중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태, 또는 에멀젼과 같은 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 적합한 부형제는, 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 만니톨, 락토스, 레시틴, 알부민, 글루탐산나트륨 등이다. 또한, 원할 경우, 주사용 제약 조성물은 미량의 비독성 보조물, 예를 들어, 습윤제, pH 완충제 등을 함유할 수 있다. 원할 경우, 흡수 증진제(예를들어, 리포솜)가 사용될 수 있다.
5. 유용성
유로키나제 억제 활성 및(또는) 혈관 형성 및 혈관 신생을 포함하는 혈관 형성을 감소시키거나 억제하는 활성을 갖는 본 발명의 화합물은 많은 용도로 체외 및 체내에서 사용될 수 있으며, 이들 몇몇이 하기 기재되어 있다.
본 발명의 화합물이 유로키나제, 특히 결합 유로키나제의 억제제로서 활성이다. 따라서, 고체/겔 지지체에 연결시키는데 적합한 부위를 함유하는 그러한 화합물이 친화성 크로마토그래피에 체외로 사용됨으로써 통상적인 친화성 크로마토그래피 절차를 이용하여 시료로부터 유로키나제를 정제하거나 시료로부터 유로키나제를 제거할 수 있다. 이러한 화합물은 통상적인 방법을 사용하여 직접 또는 적합한 연결 지지체를 통해 친화성 크로마토그래피에 부착되거나 커플링된다(예를 들어, 문헌(Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, J.E. Coligan 등, eds, 1997 및 Protein Purification Protocols, Humana Press, S. Doonan, ed., 1966) 및 그에 포함된 문헌 참조).
유로키나제 억제 활성을 갖는 본 발명의 화합물은 시료에서 tPA 활성을 측정하는 체외 분석에 유용하다. 혈액 시료에서 총 플라스미노겐 활성화 활성을 측정하는 분석에서, 유로키나제 억제 활성을 갖는 본 발명의 화합물은 uPA로 인한 플라스미노겐 활성화 부분을 억제할 수 있으며, 이는 uPA 활성으로 인한 플라스미노겐 활성화 부분뿐만 아니라, tPA 활성으로 인한 총 플라스미노겐 활성화 부분을 계산할 수 있게 한다. tPA 활성을 모니터하는 상기 분석을 이용함으로써 tPA를 수용한 환자에 있어 투여량을 보다 우수하게 조절할 수 있다. 또한, 이러한 분석은, 예를 들어 생체검사으로부터 조직 시료에서 uPA 활성 수준을 모니터하거나 플라스미노겐 활성화 활성의 측정이 유용한 임의의 임상적 상황에 대해 uPA/tPA 활성을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 또한, 이러한 분석은 환자가 스트렙토키나제 (streptokinase) 및 스타플리오키나제 (staphlyokinase)와 같은 플라스미노겐 활성화제 활성을 갖는 비내인성 화합물로 처리되는 경우 플라스미노겐 활성화제 활성을 모니터하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 감소된 유로키나제 활성에 의해 향상될 수 있는 병리학상 증상의 체내 치료에 유용하다. 예를 들어, 이러한 화합물은 윤활액에서 uPA-플라스민 캐스케이드에 의한 메탈로프로테아제의 활성화를 억제할 수 있고, 따라서, 관절염의 치료에 사용될 수 있다.
이러한 화합물은 전이, 혈관 신생, 및 종양 및 기타 신생물에서의 세포외 기질의 퇴화를 감소시키거나 억제하는데 유용할 것이다. 이러한 화합물은 본 발명의 배경 및 도입부에서 상기 기재한 것을 포함하여, 망막 질환, 망막증 및 기타 질환과 같은 병리적 혈관 신생을 특징으로 하는 질환을 치료하는데 치료제로서 유용할 수 있다.
유로키나제 억제 활성을 갖는 본 발명의 화합물의 또다른 용도는 응고 혈액을 용해시키는 것과 같은 목적을 위해 너무 많은 외인성 유로키나제가 환자에 부여될 경우의 해독제로서의 용도이다.
본 발명의 화합물은 세포 유착 또는 이동의 매개물을 방해함으로써 유로키나제의 억제로부터의 항염증성 효과로 인해 염증을 특징으로 하는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 그러한 항염증성 용도에는 발작 및 장기 이식 합병증의 치료가 포함된다.
본 발명은 본 발명의 치료 유효량의 화합물 또는 제약 조성물을 유로키나제 활성을 억제함으로써 호전되는 증상의 치료를 요하는 포유 동물에게 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 상기 포유 동물에 유로키나제 활성을 억제함시킴으로써 호전되는 증상의 치료 방법을 포함한다.
본 발명의 화합물 또는 제약 조성물은 통상적으로 포유 동물, 바람직하게는인간에 체내 투여된다. 본 발명의 화합물 또는 제약 조성물을 체내 사용하는 경우, 이들은 다양한 투여 형태를 사용하여 경구, 비경구, 정맥내, 피하내, 근육내, 결장내, 직장내, 비강내 또는 복강내를 포함하여 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 일일 기준으로 섭취에 의해 정제, 캡슐 또는 엘릭서에 의해서와 같이 경구 투여된다.
본 발명의 방법을 수행함에 있어서, 본 발명의 화합물 또는 제약 조성물은 단독 또는 서로 배합하여, 또는 다른 치료제 또는 체내 진단제와 함께 투여된다.
의약 업계의 숙련자에 명백한 바와 같이, 본 발명의 화합물 또는 제약 조성물의 "치료 유효량"은 연령, 체중 및 치료될 포유 동물 종, 사용되는 특정 화합물, 특정한 투여 경로 및 목적하는 효과 및 치료 척도에 따라 달라질 수 있다. 이러한 양을 결정하는 이러한 인자 및 그의 관계성은 의약 업계의 숙련자에 널리 공지되어 있기 때문에, 치료 유효 투여량 수준, uPA 활성의 억제의 목적하는 결과를 달성하는데 필요한 양의 결정은 이러한 업계의 능력내에 있을 것이다. 통상, 본 발명의 화합물 또는 제약 조성물의 투여는 낮은 투여량 수준에서 시작하여 uPA 활성 억제의 목적하는 효과를 목적하는 정도로 달성할 때까지 투여량 수준을 증가시키며, 이로써 치료 유효량이 정의될 것이다. 단독 또는 제약 조성물의 일부로서의 본 발명의 화합물에 대해, 그러한 투여량은 체중 1 kg당 약 0.01 내지 100 mg, 바람직하게는 체중 1 kg당 약 0.01 내지 10 mg이다.
이해를 돕기 위해, 본 발명을 하기 실시예에 보다 상세히 예시한다. 본 발명에 관한 이들 실시예는 물론 본 발명을 특정하게 제한하지 않으며, 당업계의 숙련자가 알 수 있는, 현재 공지되어 있거나 후에 개발되는 본 발명의 변형은 본원 명세서에 기재되며 이하 청구되는 본 발명의 범위내에 있다고 간주된다.
A. 출발 물질의 제조(도 1 참조)
실시예 1
N-α-t-부톡시카르보닐-N g -니트로아르기니닐-N-메톡시-N-메틸아미드의 제조
4-메틸모르폴린(41.2 g, 407 mmol, 1.3 당량)을 무수 아세토니트릴(523 ㎖)중의 N-α-t-부톡시카르보닐-Ng-니트로아르기닌(100 g, 313 mmol), N,O-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드(61.2 g, 626 mmol, 2 당량), EDC(77.9 g, 407 mmol, 1.3 당량) 및 1-히드록시벤조트리아졸(55.1 g, 407 mmol, 1.3 당량)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하고, 용매를 진공하에 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트와 물 사이에 분배하였다. 수성상을 에틸 아세테이트로 재추출하였다(2x). 합친 유기층을 1 N HCl(1x), 물(1x), 포화 중탄산나트륨(1x), 물(1x)로 세척한 후, 건조시키고(황산마그네슘), 여과하고, 진공하에 농축시켰다. 표제 화합물을 백색 발포체로서 78% 질량 회수로 수득하고, 추가 정제없이 사용하였다. 생성물의 TLC는 만족스러운 순도를 나타내었다. Rf=0.21(10% 메탄올/디클로로메탄). MS(M + H+)=363.0, 이론치 (MW)=362.2.
1H NMR(400 MHz, CDCl3): d 1.47(s, 9H), 1.55-1.68(m, 2H), 1.71-1.83(br, 2H), 3.23(s, 3H), 3.25-3.35(m, 1H), 3.55-3.68(m, 1H), 3.75-3.80(s, 3H), 4.66(t, 1H), 5.63(d, 1H).
실시예 2
N-α-t-부톡시카르보닐-N g -니트로-아르기니날의 제조
1ℓ 3목 둥근 바닥 플라스크에서 무수 테트라히드로푸란(300 ㎖)중의 실시예 1의 화합물(25 g, 68.9 mmol, 1 당량)의 용액에 1 M 리튬 알루미늄 히드리드/테트라히드로푸란(100 ㎖, 1.45 당량)을 -78℃에서 30분 동안 질소 분위기하에 적가하였다. 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하면서 -78℃에서 유지한 후, 실온에서 20 내지 30분 동안 교반하였다. 진한 슬러리가 관찰되었다. 반응 혼합물을 다시 -78℃로 냉각시키고, 2 M 중황산칼륨(100 ㎖)으로 서서히 퀀칭하였다. 침전물을 여과제거하고, 테트라히드로푸란(200 ㎖)으로 세척하였다. 합친 여액을 진공하에 농축시켰다. 조 잔류물을 에틸 아세테이트와 물로 분배하였다. 유기상을 0.5 N HCl,포화 중탄산나트륨 및 염수로 세척하였다. 잔류물을 황산마그네슘상에 건조시키고, 여과하였다. 여액을 증발하여 15.9 g(76% 수율)의 표제 화합물을 백색 고체로서 수득하였다. Rf=0.13(50% 헥산/에틸 아세테이트). 목적하는 생성물은 TLC에 의해 순수한 것으로 판단되었다. MS: (M + H+)=304.0, 이론치 (MW)=303.1.1H NMR(400 MHz, CDCl3): d 1.47(s, 9H), 1.55-1.68(m, 2H), 1.71-1.83(m, 2H), 3.19-3.35(m, 2H), 4.41-4.48(m, 1H), 5.82(s, 1H).
또한, 표제 화합물은 미국 특허 제5,731,413호의 실시예 2에 기재된 절차에 따라 제조할 수 있다.
실시예 3
N-α-t-부톡시카르보닐-N g -니트로-아르기니날(6-헥산산 에틸 에스테르)시클롤의 제조
아세토니트릴(20 ㎖)중의 실시예 2의 화합물(32.7 g, 107.9 mmol, 1 당량) 및 에틸-6-히드록시헥사노에이트(86.5 g, 539.6 mmol, 5 당량)의 교반 용액에 3 N HCl(260 ㎕)을 첨가하였다. 모든 반응물을 실온에서 15분 후 용액으로 되었다. 혼합물을 24시간 동안 교반한 후, TLC 및 질량 분광법을 위해 소량의 분취액을 취해서 완료된 것을 결정하였다. 그 후, 아세트산 무수물(55.1 g, 539.6 mmol, 5 당량) 및 피리딘(42.7 g, 539.6 mmol, 5 당량)을 반응에 첨가해서 과량의 히드록시에스테르-연결제를 캡핑하였다. 반응을 밤새도록 계속하였다. 잔류물을 증발시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트중에 용해시키고, 1 N HCl(1x), 물(1x), 포화 중탄산나트륨(1x), 물(1x)로 세척한 후, 건조시키고(황산마그네슘), 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 25 내지 33%의 헥산/에틸 아세테이트 구배를 사용하여 실리카 겔의 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하고, 45.0 g의 표제 화합물(93.7% 수율)을 점성 오일로서 수득하였다. Rf=0.24(50% 헥산/에틸 아세테이트). MS: (M + H+)=446.0, 이론치 (MW)=445.2.1H NMR(400 MHz, CDCl3): d 1.25(t, 3H), 1.31-1.38(m, 2H), 1.45(s, 9H), 1.50-1.83(m, 8H; aliph., b, g), 2.25-2.35(m, 2H), 2.05-3.28(m, 1.5H), 3.30-3.45(m, 2H), 3.55-3.65(br, 5H), 3.75-3.83(br, 1H), 4.05-4.15(m, 2H), 4.85(d, 1H), 5.60(s, 1H).
실시예 4
N-α-t-부톡시카르보닐-아르기니날(6-헥산산 에틸 에스테르)시클롤, 아세테이트염의 제조
에탄올/물/아세트산(4:1:1)(200 ㎖)중의 실시예 3의 화합물(45.8 g, 103.0 mmol, 1 당량)의 용액에 탄소상의 10% 팔라듐(9.2 g, 20 중량%)을 첨가하였다. 혼합물을 2.72 atm(40 psi)에서 16시간 동안 수소화시켰다. 용액을 여과하고, 여액을 진공하에 증발하였다. 잔류물을 물중에 용해시키고, 에테르(3x)로 세척하였다. 유기층을 물(1x)로 재추출하였다. 수성상을 합치고, 냉동건조시켜 표제 화합물(44.7 g, 94.4% 수율)을 수득하였다. Rf=0.18(디클로로메탄/메탄올/진한 수산화암모늄; 25:5:1). MS: (M + H+)=401.0, 이론치 (MW)=400.2.1H NMR(400 MHz, CDCl3): d 1.25(t, 3H), 1.31-1.38(m, 2H), 1.45(s, 9H), 1.50-1.83(m, 8H; aliph., b, g), 2.25-2.35(m, 2H), 3.05-3.28(m, 1.5H), 3.32-3.48(m, 2H), 3.55-3.61(br, 5H), 3.63-3.73(m, 1H), 4.08-4.15(m, 2H), 4.89(d, 1H), 5.14(d, 1H).
<실시예 5>
N-α-t-부톡시카르보닐-N-ω-알릴옥시카르보닐-아르기니날(6-헥산산 에틸 에스테르)시클롤의 제조
0℃의 디클로로메탄(292 ㎖)중의 실시예 4의 화합물(44.7 g, 97.3 mmol, 1 당량)의 현탁액에 1 N의 수산화나트륨의 용액(291.9 ㎖, 291.9 mmol, 3 당량)을 부분적으로 첨가하면서 pH를 11 내지 13으로 유지하였다. 알릴클로로포르메이트(15.3 g, 126.5 mmol, 1.3 당량)를 반응물에 3 부분으로 나누어 첨가하였다. TLC 및 MS에 의해 반응물을 1시간 동안 모니터한 후, 혼합물을 디클로로메탄(3x)으로 추출하고, 건조하고(황산마그네슘), 여과하고, 증발시켰다. 조 잔류물을 헥산 및 에틸 아세테이트를 용출액으로서 사용하여 실리카겔의 플래쉬 크로마토그래피에 의해 즉시 정제하였다. 표제 화합물(41.5 g)(88.0% 수율)을 점성 오일로서 수득하였다. Rf=0.30(50% 헥산/에틸 아세테이트). MS: (M + H+)=485.0, 이론치 (MW)=484.2.1H NMR(400 MHz, CDCl3): d 1.24(t, 3H), 1.31-1.38(m, 2H), 1.45(s, 9H), 1.50-1.83(m, 8H; aliph., b, g), 2.25-2.33(m, 2H), 2.90-3.12(m, 1.5H), 3.30-3.45(m, 2H), 3.55-3.65(br, 5H), 3.75-3.83(br, 1H), 4.05-4.15(m, 2H), 4.57(d, 2H), 4.83(s, 1H), 5.25(q, 2H), 5.90-6.05(m, 1H).
실시예 6
N-α-t-부톡시카르보닐-N-ω-알릴옥시카르보닐-아르기니날(6-헥산산)시클롤의 제조
에탄올(83.2 ㎖)중의 실시예 5의 화합물(40.3 g, 83.2 mmol)의 용액에 3 N 수산화리튬(55.5 ㎖, 166.4 mmol, 2 당량)을 첨가하였다. 실온에서 2.5 시간 동안교반한 후, 반응 혼합물을 진공하에 농축시켰다. 잔류물을 물중에 용해시키고, 에테르(3x)로 세척하였다. 수성상을 1 N HCl로 pH 2 내지 3으로 산성화하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 용액을 건조하고(황산마그네슘), 여과하고, 증발하여 31.5 g의 표제 화합물(83.0% 수율)을 백색 유리질 발포체로서 수득하였다. Rf=0.33(에틸 아세테이트). MS: (M + H+)=457.1, 이론치 (MW)=456.2.1H NMR(400 MHz, CDCl3): d 1.45(s, 9H), 1.52-1.87(m, 10H; aliph., b, g), 2.32-2.43(m, 2H), 3.05-3.28(m, 1.5H), 3.37-3.55(m, 2H), 3.83(s, 1H), 4.57-4.65(m, 2H), 4.88(d, 1H), 5.31(q, 2H), 5.53(s, 1H), 5.90-6.05(m, 1H).
실시예 7
N-α-t-부톡시카르보닐-N-ω-알릴옥시카르보닐-아르기니날(6-헥사노일-아미노메틸화 폴리스티렌 수지)시클롤의 제조
아미노메틸화 폴리스티렌 수지(22.6 g, 26.2 mmol, 1 당량)에 실온의 디메틸포름아미드(214 ㎖)중의 실시예 6의 화합물(15.5 g, 34.0 mmol, 1.3 당량) 및 PyBOP(17.7 g, 34.0 mmol, 1.3 당량)를 첨가하고, 이어서, 디이소프로필에틸아민(4.4 g, 34.0 mmol, 1.3 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 둥근바닥 플라스크에서 밤새 서서히 교반하였다. 수지를 풍부한 양의 디클로로메탄 및 메탄올로 세척하였다. 수지를 진공하에 건조하고(건조된 수지의 3 mg 시료를 카이저 시험을 위해 취함), 디메틸포름아미드/아세트산 무수물/트리에틸아민(8:1:1)으로 주위 온도에서 30분 동안 아세틸화하였다. 다시, 수지를 유기 용매(디클로로메탄 및 메탄올)로 계속하여 세척하고, 진공하에 건조시켜 표제 화합물(40.8 g, 92.0 중량% 수율)을 수득하였다. 카이저 시험(O.D: 99% 커플링됨); 수지 치환(약 0.75 mmol/g).
B. 소량의 화합물의 고상 제조를 위한 일반 절차
고상 합성은 본 발명의 특정 화합물 소량을 제조하는데 유용하다. 펩티드의 통상적인 고상 합성의 경우, 펩티딜 아르기니날의 고상 합성용 반응기는 용매 및 용해된 시약에 투과성이나 선택된 메쉬 크기의 합성 수지에는 투과성이 아닌 적어도 1개의 표면을 갖는 반응 용기로 구성되어 있다. 그러한 반응기는 소결된 유리 프릿을 갖는 유리 고상 반응 용기, 프릿을 갖는 폴리프로필렌 튜브 또는 칼럼, 또는 반응기 칸스(Kans)(상표명)(이로리(Irori Inc.)사 제조, 미국 캘리포니아주 산 디에고 소재)를 포함한다. 선택된 반응기의 유형은 필요한 고상 수지의 부피에 따라 달라지고, 상이한 반응기 유형이 상이한 합성 단계에서 사용될 수 있다.
실시예 8은 본 발명의 화합물 소량의 고상 합성을 위한 일반 절차를 개시하고 있다(도 2 참조). 본 발명의 추가 화합물을 얻기 위한 이러한 절차의 변형이 실시예 9 내지 15에 기재되어 있다.
실시예 8
이소부틸옥시카르보닐-D-세릴-L-알라닐-아르기니날(화합물 1)의 고상 합성
단계 1: N-ω-알릴옥시카르보닐-아르기니날(6-헥사노일-아미노메틸화 폴리스티렌 수지)시클롤의 제조
60 ㎖의 고상 반응 용기에 2.0 g의 실시예 7의 화합물(0.6 내지 0.7 meq/g 치환), 및 디클로로메탄(12 ㎖), 트리플루오로아세트산(6 ㎖) 및 티오아니솔(2 ㎖)의 혼합물을 첨가하였다. 질소 기체를 15분 동안 버블링하였다. 반응물을 수지로부터 배출시키고, 수지를 디클로로메탄(2×20 ㎖), 디이소프로필에틸아민(20 ㎖), 디클로로메탄(2×20 ㎖), 디이소프로필에틸아민(20 ㎖), 디클로로메탄(2×20 ㎖) 및 디에틸 에테르(2×20 ㎖)로 연속하여 세척하였다. 표제 화합물을 진공하에 저장하였다. 수지의 닌히드린 시험은 t-t-부톡시카르보닐기의 제거에 의해 생성된 유리 아민의 암청색 특성을 나타내었다.
단계 2: N-α-Fmoc-알라닐-N-ω-알릴옥시카르보닐-아르기니날(6-헥사노일-아미노메틸화 폴리스티렌 수지)시클롤의 제조
단계 1의 화합물(2.1 g)을 디메틸포름아미드(15-20 ㎖)중의 Fmoc-알라닌(1 g, 3.2 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸(0.5 g, 3.2 mmol), TBTU(1.024 g, 3.2 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(600 ㎕, 3.4 mmol)을 첨가한 고상 반응 용기에 넣었다. 질소 기체를 반응기를 통해 실온에서 2시간 동안 버블링하였다. 시약을 수지로부터 배출시키고, 수지를 디메틸포름아미드(2x20 ㎖), 디클로로메탄(2x20 ㎖), 디메틸포름아미드(2x20 ㎖), 디클로로메탄(2x20 ㎖) 및 디에틸 에테르(2x20 ㎖)로 연속하여 세척하였다. 표제 화합물을 진공 건조하고, 소량의 분취액을 닌히드린 비색 분석을 위해 취하고, 이는 표제 화합물에 제조에 있어 99.5% 커플링 효율을 나타내었다.
단계 3: 알라닐-N-ω-알릴옥시카르보닐-아르기니날(6-헥사노일-아미노메틸화 폴리스티렌 수지)시클롤의 제조
단계 2의 화합물을 디메틸포름아미드(20 ㎖)중의 50% 피페리딘으로 30분 동안 질소 기체 교반을 이용하여 실온에서 처리하였다. 수지를 상기와 같이 세척하고, 진공 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다. 소량의 분취액에 대한 닌히드린 분석은 탈보호에 대해 고수율을 나타내는 암청색 수지 및 용액을 제공하였다.
단계 4: N-α-Fmoc-D-세릴(O-t-부틸)-알라닐-N-ω-알릴옥시카르보닐-아르기니날(6-헥사노일-아미노메틸화 폴리스티렌 수지)시클롤의 제조
단계 3의 화합물(100 mg)을 이로리 칸(상표명) 반응 용기에 넣었다. 용기를 디메틸포름아미드(4 ㎖), N-α-Fmoc-D-세린(O-t-부틸)(184 mg, 0.48 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸(73 mg, 0.48 mmol), TBTU(154 mg, 0.48 mmol) 및 디이소프로필에틸아민(84 ㎕, 0.48 mmol)을 함유하는 20 ㎖ 유리병안에 위치시켰다. 용기를 진탕기 테이블상에서 3시간 동안 교반하였다. 용기를 배출시키고, 디메틸포름아미드(2x3 ㎖), 디클로로메탄(2x3 ㎖), 디메틸포름아미드(2x3 ㎖), 디클로로메탄(2x3 ㎖), 이소프로판올(2x3 ㎖), 디클로로메탄(2x3 ㎖), 이소프로판올(2x3 ㎖) 및 디에틸 에테르(2x3 ㎖)로 연속하여 세척하였다. 수지를 진공하에 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다.
단계 5: D-세릴(O-t-부틸)-알라닐-N-ω-알릴옥시카르보닐-아르기니날(6-헥사노일-아미노메틸화 폴리스티렌 수지)시클롤의 제조
단계 4의 화합물을 함유하는 용기를 20 ㎖의 유리병에서 디메틸포름아미드(5 ㎖)중의 50% 피페리딘으로 실온에서 45분 동안 처리하면서 진탕기 테이블상에서 교반시켰다. 수지를 상기와 같이 세척하고, 진공 건조시켜 단계 5의 화합물을 수득하였다. 소량의 분취액에 대한 닌히드린 분석은 탈보호에 대해 고수율을 나타내는 암청색 수지 및 용액을 제공하였다.
단계 6: 하기 화학식과 같은 D-세릴(O-t-부틸)-알라닐-N-ω-알릴옥시카르보닐-아르기니날(6-헥사노일-아미노메틸화 폴리스티렌 수지)시클롤의 카르바메이트 유사체의 제조
단계 5의 화합물을 함유하는 용기를 관련 수지 결합된 유사체(하기 실시예 9내지 14 참조)를 함유하는 다른 용기와 함께 20 ㎖ 유리병에서 디메틸포름아미드(5-10 ㎖)중의 이소부틸클로로포르메이트를 포함하여 0.12 M 다양한 각종 클로로포르메이트와 함께 각각 넣었다. 디이소프로필에틸아민(105-210 ㎕, 0.6-1.2 mmol)을 첨가하고, 유리병을 2.5시간 동안 흔들었다. 모든 용기를 배출시키고, 디메틸포름아미드(2x3 ㎖), 디클로로메탄(2x3 ㎖), 디메틸포름아미드(2x3 ㎖), 디클로로메탄(2x3 ㎖), 이소프로판올(2x3 ㎖), 디클로로메탄(2x3 ㎖), 이소프로판올(2x3 ㎖) 및 디에틸 에테르(2x3 ㎖)로 연속하여 세척하였다. 이소부틸옥시카르보닐-D-세릴(O-t-부틸)-알라닐-N-ω-알릴옥시카르보닐-아르기니날(6-헥사노일-아미노메틸화 폴리스티렌 수지)시클롤을 포함하는 칸스(상표명)을 진공 건조하였다.
단계 7: 하기 화학식과 같은 D-세릴(O-t-부틸)-알라닐-아르기니날(6-헥사노일-아미노메틸화 폴리스티렌 수지)시클롤의 카르바메이트 유사체의 제조
단계 5의 생성물로부터 알릴옥시 보호기를 제거하는 것을 250 ㎖의 폴리프로필렌 병에 38개 용기의 집합체를 두고, 메틸술폭사이드(10 ㎖), 테트라히드로푸란(10 ㎖), 1 N HCl(2.5 ㎖) 및 모르폴린(25 ㎖)의 혼합물을 동시에첨가함으로써 본 발명의 여러 화합물에 대해 수행하였다. 그 후, 테트라키스트리페닐포스핀 팔라듐(0.87 g)을 첨가하고, 병을 실온에서 4시간 동안 흔들었다. 이소부틸옥시카르보닐-D-세릴(O-t-부틸)-알라닐-아르기니날(6-헥사노일-아미노메틸화 폴리스티렌 수지)시클롤을 포함하는 용기를 배출시키고, 디메틸포름아미드(2x3 ㎖), 디클로로메탄(2x3 ㎖), 디메틸포름아미드(2x3 ㎖), 디클로로메탄(2x3 ㎖), 이소프로판올(2x3 ㎖), 디클로로메탄(2x3 ㎖), 이소프로판올(2x3 ㎖) 및 디에틸 에테르(2x3 ㎖)로 연속하여 세척하고, 진공 건조시켜 각각의 표제 화합물을 용기에서 수득하였다.
단계 8: 이소부틸옥시카르보닐-D-세릴-알라닐-아르기니날의 제조
이소부틸옥시카르보닐-D-세릴(O-t-부틸)-알라닐-아르기니날(6-헥사노일-아미노메틸화 폴리스티렌 수지)시클롤을 함유하는 용기를 트리플루오로아세트산/디클로로메탄/물(1.5 ㎖ 6:3:1 혼합물)을 함유하는 와트만(Whatman) 폴리프로필렌 미니-칼럼중으로 비웠다. 칼럼을 실온에서 4시간 동안 흔들었다. 반응 용액을 시험관중으로 배출시키고, 수지를 디클로로메탄 및 물로 세척하였다. 세척 혼합물 및 반응 혼합물을 동일 시험관에서 모으고, 혼합물을 교반한 후, 2개의 상으로 분리하였다. 물 층을 제거하고, 여과하였다. 표제 화합물(화합물 1)을 반-예비 역상 HPLC로 정제하고, 동결건조하고, 칭량하고, HPLC 및 질량 분광법에 의해 분석하였다. 화합물 1의 합성의 또다른 경로가 실시예 36 내지 43에 제공되어 있다.
실시예 9
벤질옥시카르보닐-D-세릴-알라닐-아르기니날(화합물 2)의 고상 합성
실시예 8의 단계 1 내지 4 및 7 내지 8에 따라 벤질옥시카르보닐-D-세릴-알라닐-아르기니날인 화합물 2를 단계 4의 Fmoc-D-세린(O-t-부틸)대신에 Cbz-D-세린(O-t-부틸)을 사용하여 제조하였다.
<실시예 10>
화합물 3 내지 9 및 35 내지 40의 고상 합성
실시예 8의 단계 1 내지 8에 따라 단계 6에서의 이소부틸클로로포르메이트에 대신에 하기 기재된 대체물로 하기 화합물을 제조하였다.
화합물 번호 화합물명 단계 6의 대체물
3 (-)메틸옥시-카르보닐-D-세릴-알라닐-아르기니날 (-)멘틸클로로포르메이트
4 2-나프틸옥시-카르보닐-D-세릴-알라닐-아르기니날 2-나프틸클로로포르메이트
5 페녹시카르보닐-D-세릴-알라닐-아르기니날 페닐클로로포르메이트
6 2-에틸헥실옥시-카르보닐-D-세릴-알라닐-아르기니날 2-에틸헥실클로로포르메이트
7 (+)멘틸옥시-카르보닐-D-세릴-알라닐-아르기니날 (+)멘틸클로로포르메이트
8 메틸옥시카르보닐-D-세릴-알라닐-아르기니날 메틸클로로포르메이트
9 n-부틸옥시카르보닐-D-세릴-알라닐-아르기니날 n-부틸클로로포르메이트
35 3-시클로헥실프로피오닐-D-세릴-알라닐-아르기니날 3-시클로헥실프로피오닐 클로라이드
36 시클로헥실메틸옥시카르보닐-D-세릴-알라닐-아르기니날 시클로헥실메틸 클로로포르메이트
37 시클로헥실메틸아자카르보닐-D-세릴-알라닐-아르기니날 시클로헥실메틸 이소시아네이트
38 벤질아자카르보닐-D-세릴-알라닐-아르기니날 벤질 이소시아네이트
39 이소발레릴-D-세릴-알라닐-아르기니날 이소발레릴 클로라이드
40 이소프로필옥시카르보닐-D-세릴-알라닐-아르기니날 이소프로필 클로로포르메이트
실시예 11
플루오레닐메틸옥시카르보닐-D-세릴-알라닐-아르기니날(화합물 10)의 고상 합성
실시예 8의 단계 1 내지 4 및 단계 7 및 8에 따라 플루오레닐메틸옥시카르보닐-D-세릴-알라닐-아르기니날, 화합물 10을 제조하였다.
실시예 12
화합물 11 내지 18의 고상 합성
실시예 8의 단계 1 내지 4 및 7 및 8에 따라 단계 4의 Fmoc-D-세린(O-t-부틸)대신에 Cbz-D-세린(O-t-부틸)의 대체 및 단계 2의 Fmoc-알라닌에 대신에 하기 대체물로 화합물 11 내지 18을 제조하였다.
화합물 번호 화합물명 단계 2의 대체물
11 벤질옥시카르보닐-D-세릴-프롤릴-아르기니날 Fmoc-프롤린
12 벤질옥시카르보닐-D-세릴-L-아제티딘-2-카르보닐--아르기니날 Fmoc-L-아제티딘-2-카르복실산
13 벤질옥시카르보닐-D-세릴-피페콜릴-아르기니날 Fmoc-피페콜산
14 벤질옥시카르보닐-D-세릴-2-아미노부타노일-아르기니날 Fmoc-2-아미노부타노산
15 벤질옥시카르보닐-D-세릴-S-메틸시스테이닐-아르기니날 Fmoc-S-메틸시스테인
16 벤질옥시카르보닐-D-세릴-2-노르발릴-아르기니날 Fmoc-노르발린
17 벤질옥시카르보닐-D-세릴-2-글리실-아르기니날 Fmoc-글리신
18 벤질옥시카르보닐-D-세릴-사르코실-아르기니날 Fmoc-사르코신
실시예 13
화합물 19 내지 23의 고상 합성
실시예 8의 단계 1 내지 4 및 단계 7 및 8에 따라 단계 4에서의 Fmoc-D-세린(O-t-부틸)에 대신에 하기 기재된 대체물로 하기 화합물을 제조하였다.
화합물 번호 화합물명 단계 2의 대체물
19 벤질옥시카르보닐-D-알로트레오닐-알라닐-아르기니날 Cbz-D-알로트레오닌(O-t-부틸)
20 벤질옥시카르보닐-트레오닐-알라닐-아르기니날 Cbz-D-트레오닌(O-t-부틸)
21 벤질옥시카르보닐-D-알라닐-알라닐-아르기니날 Cbz-D-알라닌
22 벤질옥시카르보닐-D-트레오닐-알라닐-아르기니날 Cbz-D-트레오닌(O-t-부틸)
23 벤질옥시카르보닐-세릴-알라닐-아르기니날 Cbz-세린(O-t-부틸)
실시예 14
화합물 24, 25 및 33의 고상 합성
실시예 8의 단계 1 내지 4 및 7 및 8에 따라 단계 4의 Fmoc-D-세린(O-t-부틸)대신에 Cbz-D-알로트레오닌(O-t-부틸)의 대체 및 단계 2의 Fmoc-알라닌에 대신에 하기 대체물로 화합물 24, 25 및 33을 제조하였다.
화합물 번호 화합물명 단계 2의 대체물
24 벤질옥시카르보닐-D-알로트레오닐-사르코실-아르기니날 Fmoc-사르코신
25 벤질옥시카르보닐-D-알로트레오닐-N-메틸알라닐-아르기니날 Fmoc-메틸알라닌
실시예 15
화합물 26 및 27의 고상 합성
실시예 8의 단계 1 내지 4 및 7 및 8에 따라 단계 2의 Fmoc-알라닌대신에 Fmoc-프롤린의 대체 및 단계 3의 Fmoc-D-세린(O-t-부틸)대신에 하기 대체물로 화합물 26 및 27을 제조하였다.
화합물 번호 화합물명 단계 2의 대체물
26 벤질옥시카르보닐-D-트레오닐-프롤릴-아르기니날 Cbz-D-트레오닌(O-t-부틸)
27 벤질옥시카르보닐-D-호모세릴-프롤릴-아르기니날 Cbz-D-호모세린(O-t-부틸)
실시예 16
화합물 41 내지 43의 고상 합성
실시예 8의 단계 1 내지 4 및 7 및 8에 따라 단계 4의 Fmoc-D-세린(O-t-부틸)대신에 N-α-Cbz-N-β-Fmoc-D-2,3-디아미노프로피온산의 대체 및 단계 6의 각각의 클로로포르메이트에 대신에 하기 대체물로 화합물 41 내지 43을 제조하였다.
화합물 번호 화합물명 단계 6의 대체물
41 N-α-벤질옥시카르보닐-N-β-2-페닐에틸카르보닐-D-2,3-디아미노프로피오닐-알라닐-아르기니날 히드로신나모일 클로라이드
42 N-αN-β-디벤질옥시카르보닐-D-2,3-디아미노프로피오닐-알라닐-아르기니날 벤질 클로로포르메이트
43 N-α-벤질옥시카르보닐-N-β-메틸옥시카르보닐-D-2,3-디아미노프로피오닐-알라닐-아르기니날 메틸 클로로포르메이트
C. 특정 화합물에 대한 또다른 합성 경로
(i) 실시예 17 내지 21은 벤젠술포닐-D-Ser-L-Ala-L-Arg-알, 트리플루오로아세테이트 염(화합물 28)의 합성을 기재하고 있다(도 3 참조).
실시예 17
D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe, 아세테이트 염의 합성
N-α-Cbz-D-세린 (바켐 (Bachem), 4.97 g, 16.8 mmol), 알라닌 메틸 에스테르, 히드로클로라이드 염 (노바바이오켐 (Novabiochem), 4.7 g, 33.7 mmol), EDC (6.5 g, 33.7 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (2.6 g, 16.8 mmol)을 합하고 아세토니트릴 (67 ㎖)을 첨가하였다. 슬러리로서 10분 동안 교반한 후, 디이소프로필에틸아민 (14.4 ㎖, 84 mmol)을 첨가하고 얻어진 투명 혼합물을 18시간 동안 더 교반하였다. 용매를 감압하에서 제거하고 잔류물을 에틸 아세테이트 (500 ㎖) 중에 현탁시켰다. 용액을 0.5 M HCl (2 x 100 ㎖)에 이어 포화 중탄산나트륨 (2 x 100 ㎖) 및 염수 (100 ㎖)로 세척하였다. 이어서 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 용매를 진공하에서 제거하고, 역상 (C18) HPLC (20분에 걸쳐 5 내지 75% 수성 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산에서 tR= 16.9분)에서 단일 피크로서 Cbz-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe을 정량적 수율로 얻었다. 이어서 Cbz-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe를 에탄올/아세트산/물 (4:1:1 혼합물 150 ㎖) 중에 용해하였다. 플라스크를 질소로 충전하고 탄소상 10% 팔라듐 (1.5 g)을 첨가하였다. 이 혼합물을 3.06 atm (45 psi)에서 2시간 동안 수소화시켰다. 팔라듐 촉매를 여과하고 용매를 감압하에서제거하고 20분에 걸쳐 역상 (C18) HPLC (5 내지 75% 수성 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산에서 tR=8.0분)에서 단일 피크로서 95% 수율로 표제 화합물 4.85 g을 얻었다. MS (M+H=247.2).
실시예 18
벤젠술포닐-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe의 합성
아세토니트릴 (13 ㎖) 중 실시예 17의 화합물 (1.0 g, 3.3 mmol)의 교반 슬러리에 벤젠술포닐 클로라이드 (0.87 g, 4.9 mmol)를 첨가하였다. 이 혼합물에 디이소프로필에틸아민 (1.67 ㎖, 9.8 mmol)을 1시간에 걸쳐 5회에 나누어 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 더 교반하였다. 용매를 감압하에서 제거하고 잔류물을 에틸 아세테이트 (100 ㎖) 중에 현탁시켰다. 용액을 0.5 M HCl (2 x 10 ㎖)에 이어 포화 중탄산나트륨 (2 x 10 ㎖) 및 염수 (1 x 10 ㎖)로 세척하였다. 이어서 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 용매를 진공하에서 제거하였다. 잔류물을 50% 헥산/에틸 아세테이트로 용출시키는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 43% 수율로 생성물 0.54 g, 1.4 mmol을 얻었다. 생성물은 역상 (C18) HPLC (20분에 걸쳐 5 내지 75% 수성 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산에서 tR=20.2분)에서 단일피크이었다.
실시예 19
벤젠술포닐-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OH의 합성
메탄올 (9 ㎖) 중의 실시예 18의 화합물 (0.53 g, 1.4 mmol)에 1.0 M 수산화리튬 (3.0 ㎖, 3 mmol)을 첨가하였다. 18시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 도웩스 (50 x 8-400) 이온 교환 수지 10 ㎖ 컬럼에 붓고 메탄올/물 (1:1 혼합물 60 ㎖)로 용출하였다. 메탄올을 감압하에서 펌핑 제거하고 잔류하는 물을 동결건조시켜 역상 (C18) HPLC (20분에 걸쳐 5 내지 75% 수성 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산에서 tR=13.5분)에서 단일 피크로서 표제 화합물 0.49 g, 1.3 mmol (95%)을 얻었다.
실시예 20
벤젠술포닐-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-N g -니트로아르기니날 에틸 시클롤의 합성
실시예 19의 화합물 (0.48 g, 1.3 mmol), L-Ng-니트로아르기니날 에틸 시클롤, 히드로클로라이드 염 (0.41 g, 1.5 mmol), EDC (0.37 g, 1.9 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (0.20 g, 1.3 mmol)을 합하고 아세토니트릴 (5 ㎖)을 첨가하였다. 얻은 슬러리를 10분 동안 교반한 후, 디이소프로필에틸아민 (1.10 ㎖, 84 mmol)을 첨가하고 얻어진 투명 혼합물을 18시간 동안 더 교반하였다. 용매를 감압하에서 제거하고 잔류물을 에틸 아세테이트 (100 ㎖) 중에 현탁시켰다. 용액을 0.5 M HCl (2 x 10 ㎖)에 이어 포화 중탄산나트륨 (2 x 10 ㎖) 및 염수 (1 x 10 ㎖)로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 용매를 진공하에서 제거하여 95% 수율로 표제 화합물 0.72 g을 얻었다. 생성물은 역상 (C18) HPLC (20분에 걸쳐 5 내지 75% 수성 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산에서 tR=15.2분)에서 단일 피크이었다. MS (M+H=371).
<실시예 21>
벤젠술포닐-D-Ser-L-Ala-L-Arg-al, 트리플루오로아세테이트 염 (화합물 28)의 합성
에탄올/아세트산/물 (4:1:1 혼합물 24.5 ㎖) 중 탄소상 10% 팔라듐 (250 mg)상에서 실시예 20의 화합물 (0.72 g, 1.23 mmol)을 3.4 atm (50 psi)에서 18시간 동안 수소화시켰다. 촉매를 여과하고 용매를 여액으로부터 진공에서 제거하여 정량 수율의 벤질술포닐-D-Ser(O-t-Bu)-L-Ala-L-아르기니날 에틸 시클롤을 역상 (C18) HPLC (20분에 걸쳐 5 내지 75% 수성 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산에서 tR=12.8분)에서 단일 피크로서 얻었다. MS (M+H=541).
벤질술포닐-D-Ser(O-t-Bu)-L-Ala-L-아르기니날 에틸 시클롤을 6 M HCl (12.25 ㎖)로 처리하고 1시간 동안 교반한 후, 6.5 M 암모늄 아세테이트로 pH 4로 중화시켰다. 이 물질을 예비 HPLC 컬럼에 직접 적재하고 0 내지 20% 수성 아세토니트릴 구배로 용출하고 동결건조시켜 수율 15%로 표제 화합물 88 mg을 얻었다. 표제 화합물은 역상 (C18) HPLC (20분에 걸쳐 5 내지 50% 수성 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산에서 tR=8.2분, 9.2분 및 9.5분)에서 3 개의 피크를 나타내었다. MS (M+H=457).
(ii) 실시예 22 내지 26은 벤질술포닐-D-Ser-L-Ala-L-Arg-al, 트리플루오로아세테이트 염 (화합물 29)의 합성을 기재하고 있다.
실시예 22
벤질술포닐-D-Ser(O-t-Bu)-OMe의 합성
아세토니트릴 (39 ㎖) 중 D-세린(O-t-Bu) 메틸 에스테르, 히드로클로라이드 염 (2.07 g, 9.8 mmol)의 교반 용액에 α-톨루엔술포닐 클로라이드 (1.86 g, 9.8 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에 디이소프로필에틸아민 (3.7 ㎖, 21.5 mmol)을 1시간에 걸쳐 5회에 나누어 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 더 교반하였다. 용매를 감압하에서 제거하고 잔류물을 에틸 아세테이트 (100 ㎖) 중에 현탁시켰다. 용액을 0.5 M HCl (2 x 10 ㎖)에 이어 포화 중탄산나트륨 (2 x 10 ㎖) 및 염수 (1 x 10 ㎖)로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 용매를 진공하에서 제거하여 88% 수율로 표제 화합물 2.84 g을 얻었다. Rf=0.4 (에틸 아세테이트:헥산 4:1).
실시예 23
벤질술포닐-D-Ser(O-t-Bu)-OH의 합성
메탄올 (54 ㎖) 중의 실시예 22의 화합물 (2.66 g, 8.1 mmol)의 교반 용액에 1.0 M 수산화리튬 (17.8 ㎖, 17.8 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 18시간 동안 교반되도록 한 후, 도웩스 (50 x 8-400) 이온 교환 수지 10 ㎖ 컬럼에 붓고 메탄올/물 (1:1 혼합물 60 ㎖)로 용출하였다. 메탄올을 감압하에서 제거하고 잔류하는 수성 용액을 동결건조시켜 97% 수율로 표제 화합물 2.47 g을 얻었다. (20분에 걸쳐 5 내지 75% 수성 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산에서) tR=14.8분.
실시예 24
벤젠술포닐-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe의 합성
실시예 23의 화합물 (1.0 g, 3.2 mmol), 알라닌 메틸 에스테르, 히드로클로라이드 염 (노바바이오켐, 0.89 g, 6.3 mmol), EDC (1.22 g, 6.3 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (0.49 g, 3.2 mmol)을 합하고 아세토니트릴 (13 ㎖)을 첨가하였다. 얻은 슬러리를 10분 동안 교반한 후, 디이소프로필에틸아민 (2.71 ㎖, 15.8 mmol)을 첨가하고 얻어진 투명 혼합물을 18시간 동안 더 교반하였다. 용매를 감압하에서 제거하고 잔류물을 에틸 아세테이트 (100 ㎖) 중에 현탁시켰다. 용액을 0.5 M HCl (2 x 10 ㎖)에 이어 포화 중탄산나트륨 (2 x 10 ㎖) 및 염수 (1 x 10 ㎖)로 세척하였다. 이어서 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 용매를 진공하에서 제거하고, 97% 수율로 표제 화합물 1.22 g을 얻었다. (20분에 걸쳐 5 내지 75% 수성 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산에서) tR=16.2분.
실시예 25
벤질술포닐-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OH의 합성
메탄올 (22 ㎖) 중 실시예 24의 화합물 (1.22 g, 3.1 mmol)에 1 M 수산화리튬 (7.2 ㎖, 7.2 mmol)을 첨가하였다. 18시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 도웩스 (50 x 8-400) 이온 교환 수지 10 ㎖ 컬럼에 붓고 메탄올/물 (1:1 혼합물 60 ㎖)로 용출하였다. 메탄올을 감압하에서 제거하고 수용액을 동결건조시켜 91% 수율로 표제 화합물 1.16 g을 얻었다. (20분에 걸쳐 5 내지 75% 수성 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산에서) tR=13.2분.
실시예 26
벤질술포닐-D-Ser-Ala-Arg-al, 트리플루오로아세테이트 염 (화합물 29)의 합성
실시예 20에 기재된 절차에서 실시예 19의 화합물을 대신하는 실시예 25의 화합물로부터 실시예 20 및 21의 절차를 따라 표제 화합물을 합성하였다.
(iii) 실시예 27 내지 34는 i-부톡시카르보닐-D-Ser-Ala-Arg-CO-펜에틸아미드, 트리플루오로아세테이트 염 (화합물 30)의 합성을 기재하고 있다. 도 4를 참조하기 바란다.
실시예 27
N-α-t-부톡시카르보닐-N g -니트로Arg-COH-펜에틸아미드의 합성
N-α-t-부톡시카르보닐-Ng-니트로Arg-COH-COOH (1.07 g, 3 mmol)(US 제5,371,072호의 실시예 2 내지 5의 절차에 따라 제조됨), 펜에틸아민 (38 ㎖, 3mmol), BOP (1.35 g, 3 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (0.23 g, 1.5 mmol)을 합하고 디메틸포름아미드 (122 ㎖)를 첨가하였다. 이 혼합물을 10분 동안 교반한 후, 4-메틸모르폴린 (2.01 ㎖, 18 mmol)을 첨가하고 얻어진 투명 혼합물을 18시간 동안 더 교반하였다. 용매를 감압하에서 제거하고 잔류물을 에틸 아세테이트 (100 ㎖) 중에 현탁시켰다. 용액을 0.5 M HCl (2 x 10 ㎖)에 이어 포화 중탄산나트륨 (2 x 10 ㎖) 및 염수 (1 x 10 ㎖)로 세척하였다. 이어서 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 용매를 진공하에서 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트:헥산 (4:1)으로 용출시키는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 89% 수율로 표제 화합물 1.22 g을 얻었다. (20분에 걸쳐 5 내지 75% 수성 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산에서) tR=13.2분 및 14.1분.
실시예 28
t-부톡시카르보닐-Ala-N g -니트로Arg-COH-펜에틸아미드의 합성
에틸 아세테이트 (10 ㎖) 중 실시예 27의 화합물 (1.22 g, 2.7 mmol)의 교반 용액에 에틸 아세테이트 (10 ㎖) 중 5 M HCl을 첨가하였다. 2시간 후, 형성된 고체를 여과하고 건조시켜 정량적 수율로 Ng-니트로Arg-COH-펜에틸아미드, 히드로클로라이드 염을 얻고, 이를 t-부톡시카르보닐-Ala-OH (노바바이오켐, 0.77 g, 4.1mmol), EDC (2.4 g, 5.4 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (0.42 g, 2.7 mmol)과 합한 후, 아세토니트릴 (11 ㎖)을 첨가하였다. 이 혼합물을 슬러리로서 10분 동안 교반하고 디이소프로필에틸아민 (2.3 ㎖, 13.55 mmol)을 첨가하였다. 얻어진 투명 혼합물을 18시간 동안 더 교반하였다. 용매를 감압하에서 제거하고 잔류물을 에틸 아세테이트 (100 ㎖) 중에 현탁시켰다. 용액을 0.5 M HCl (2 x 10 ㎖)에 이어 포화 중탄산나트륨 (2 x 10 ㎖) 및 염수 (1 x 10 ㎖)로 세척하였다. 이어서 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 용매를 진공하에서 제거하여 95% 수율로 표제 화합물 1.34 g을 얻었다. (20분에 걸쳐 5 내지 75% 수성 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산에서) tR=13.0분 및 13.6분.
실시예 29
HCl-Ala-N g -니트로Arg-COH-펜에틸아미드의 합성
실시예 28의 화합물 (1.34 g, 2.6 mmol)을 에틸 아세테이트 10 ㎖ 중에 용해하였다. 이 혼합물에 에틸 아세테이트 중의 5M HCl 10 ㎖을 첨가하고 얻어진 혼합물을 교반하였다. 2시간 후, 형성된 고체를 여과하고 건조시켜 98% 수율로 표제 화합물 1.188 g을 얻었다.
실시예 30
t-부톡시카르보닐-D-Ser(OBn)-Ala-N g -니트로Arg-COH-펜에틸아미드의 합성
실시예 29의 화합물 (1.18 g, 2.4 mmol), t-부톡시카르보닐-D-세린 벤질에스테르 (노바바이오켐, 1.08 g, 3.6 mmol), EDC (2.15 g, 4.9 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (0.37 g, 2.4 mmol)을 합하고 아세토니트릴 (10 ㎖)을 첨가하였다. 이 슬러리에 디이소프로필에틸아민 (2.1 ㎖, 15 mmol)을 10분에 걸쳐 첨가하고, 얻어진 투명 혼합물을 18시간 동안 더 교반하였다. 용매를 감압하에서 제거하고 잔류물을 에틸 아세테이트 (100 ㎖) 중에 현탁시켰다. 용액을 0.5 M HCl (2 x 10 ㎖)에 이어 포화 중탄산나트륨 (2 x 10 ㎖) 및 염수 (1 x 10 ㎖)로 세척하였다. 이어서 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 용매를 진공하에서 제거하여 92% 수율로 표제 화합물 1.56 g을 얻었다. (20분에 걸쳐 5 내지 75% 수성 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산에서) tR=16.0분 및 16.5분.
실시예 31
HCl-D-Ser(OBn)-Ala-N g -니트로Arg-COH-펜에틸아미드의 합성
에틸 아세테이트 (10 ㎖) 중 실시예 30의 화합물 (1.5 g, 2.1 mmol)의 용액에 에틸 아세테이트 (10 ㎖) 중 5 M HCl을 첨가하였다. 2시간 동안 교반 후, 형성된 고체를 여과하고 건조시켜 98% 수율로 표제 화합물 1.31 g을 얻었다. (20분에 걸쳐 5 내지 75% 수성 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산에서) tR=11.8분 및 12.3분.
실시예 32
i-부톡시카르보닐-D-Ser(OBn)-Ala-N g -니트로Arg-COH-펜에틸아미드의 합성
아세토니트릴 (6 ㎖) 중 실시예 31의 화합물 (1.0 g, 1.6 mmol)의 교반 용액에 이소부틸클로로포르메이트 (0.225 ㎖, 1.8 mmol)에 이어 디이소프로필에틸아민 (0.81 ㎖, 4.74 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 용매를 감압하에서 제거하고 잔류물을 에틸 아세테이트 (100 ㎖) 중에 현탁시켰다. 용액을 0.5 M HCl (2 x 10 ㎖)에 이어 포화 중탄산나트륨 (2 x 10 ㎖) 및 염수 (1 x 10 ㎖)로 세척하였다. 이어서 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 용매를 감압하에서 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트:헥산 (4:1)으로 용출시키는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 85% 수율로 표제 화합물 0.94 g을 얻었다. (20분에 걸쳐 25 내지 45% 수성 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산에서) tR=20.2분및 21.2분.
실시예 33
i-부톡시카르보닐-D-Ser(OBn)-Ala-N g -니트로Arg-CO-펜에틸아미드의 합성
실시예 32의 화합물 (0.1 g, 0.143 mmol)을 DMSO (1.4 ㎖) 중에 용해하였다. EDC (0.14 g, 0.714 mmol) 및 디클로로아세트산 (0.12 ㎖, 1.43 mmol)을 첨가하고 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (50 ㎖) 중에 붓고 0.5 M HCl (2 x 10 ㎖)에 이어 중탄산나트륨 (2 x 10 ㎖) 및 염수 (1 x 10 ㎖)로 세척하였다. 이어서 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 용매를 감압하에서 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트:헥산 (4:1)으로 용출시키는 플래쉬 크로마토그래피로 정제하여 68% 수율로 표제 화합물 68 mg을 얻었다. Rf=0.32 (4:1 에틸 아세테이트/헥산).
실시예 34
i-부톡시카르보닐-D-Ser-Ala-Arg-CO-펜에틸아미드, 트리플루오로아세테이트 염의합성
실시예 33의 화합물 (68 mg, 0.1 mmol) 및 아니솔 (1 ㎖)을 HF 용기에 첨가하였다. 이 혼합물을 -20 ℃에서 HF (10 ㎖)로 처리하고 교반하였다. 30분 후, HF를 증발시켰다. 잔류물을 20% 아세트산에 현탁시키고 디에틸 에테르 (3x)로 세척하였다. 수성층을 동결건조시켰다. 조 동결건조물을 역상 예비 HPLC (0 내지 40% 수성 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산, C-18 역상)로 정제하고 동결건조시켜 26% 수율로 표제 화합물 14.4 g을 얻었다. tR=12.5분 (20분에 걸쳐 5 내지 75% 수성 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산) 및 MS(M+H=564.5).
(iv) 실시예 35 내지 40에는 화합물 1의 다른 합성 경로가 기재되어 있다.
실시예 35
i-부톡시카르보닐-D-Ser(O-t-Bu)-OMe의 합성
테트라히드로푸란 (200 ㎖) 중의 HCl-D-Ser(O-t-Bu)-OMe (15 g, 71 mmol, 바켐)의 균일한 교반 용액에 포화 중탄산나트륨 (80 ㎖)에 이어 이소부틸클로로포르메이트 (19.45 g, 142 mmol)를 첨가하였다. 층을 분리하고 수성층을 에틸 아세테이트 (50 ㎖)로 세척하였다. 유기 상들을 합하고 용매를 감압하에서 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (100 ㎖) 중에 현탁시키고, 1 M HCl (100 ㎖)에 이어 포화 중탄산나트륨 (100 ㎖) 및 염수 (100 ㎖)로 세척하였다. 이어서 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 용매를 (상표명 다르코 (Darco)와 같은) 탈색화 숯으로 처리하고 여과하고, 용매를 감압하에서 제거하여 정량 수율로 표제 화합물을 얻었다. Rf=0.3 (20% 에틸 아세테이트/헥산).
실시예 36
i-부톡시카르보닐-D-Ser(O-t-Bu)-OH의 합성
테트라히드로푸란 (78 ㎖) 중 실시예 35의 화합물 (19.51 g, 70 mmol)의 교반 용액에 수산화리튬 (78 mmol, 3.28 g)을 첨가하였다. TLC (20% 에틸 아세테이트/헥산)에 의해 출발 물질이 관찰되지 않을 때까지 반응 혼합물을 격렬하게 3시간 동안 교반하였다. 용액을 진한 HCl로 pH 2로 산성화하고 용매를 감압하에서 제거하였다. 조 생성물을 에틸 아세테이트 중에 현탁시키고 포화 중탄산나트륨 (2 x, 75 ㎖)로 추출하였다. 합한 중탄산나트륨 세척액을 6 M HCl로 산성화하고, 분리된오일을 에틸 아세테이트로 추출하였다 (2 x 100 ㎖). 합한 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고 다르코로 처리하고 여과하고 용매를 감압하에서 제거하여 정량 수율의 표제 화합물을 얻었다. Rf=0.01 (헥산 중 20% 에틸 아세테이트)
<실시예 37>
i-부톡시카르보닐-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe의 합성
0 ℃에서 아세토니트릴 (280 ㎖) 중의 실시예 36의 화합물 (16.5 g, 63 mmol), HCl-Ala-OMe (10.6 g, 76 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 (10.2 g, 76 mmol) 및 EDC (16.33 g, 85 mmol)의 용액에 4-메틸모르폴린 (35 ㎖, 315 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 0 ℃에서 1시간 동안에 이어 주위 온도에서 72시간 동안 교반하였다. 용매를 감압하에서 제거하고 얻어진 잔류물을 에틸 아세테이트 (300 ㎖) 및 1M HCl (350 ㎖) 중에 현탁시켰다. 수성층을 분리하고 에틸 아세테이트 (300 ㎖)로 세척하였다. 합해진 에틸 아세테이트 층을 합하고 1 M HCl (300 ㎖), 포화 중탄산나트륨 (400 ㎖) 및 염수 (200 ㎖)로 세척하였다. 유기 층을 황산마그네슘으로 건조시키고 다르코로 처리하고 여과하고 용매를 감압하에서 제거하여 표제 화합물 21.48 g을 얻었다 (98% 수율).
실시예 38
i-부톡시카르보닐-D-Ser-Ala-OH의 합성
트리플루오로아세트산 (110 ㎖) 중에 실시예 37의 화합물 (21 g, 58 mmol)을 용해하고 얻어진 혼합물을 35분 동안 교반하였다. 용액을 얼음 조에 냉각하고 포화 중탄산나트륨 (630 ㎖)에 이어 고체 중탄산나트륨 (70 g)을 45분에 걸쳐 첨가하여 pH 7을 얻었다. 수성 용액을 에틸 아세테이트 (3 x 250 ㎖)로 추출하였다. 합해진 유기 추출물을 합하고 황산마그네슘으로 건조시키고 다르코로 처리하고 여과하고 용매를 진공에서 제거하여 정량 수율로 i-부톡시카르보닐-D-Ser-Ala-OMe를 얻었다.
테트라히드로푸란 (68 ㎖) 중 조 잔류물의 교반 용액에 물 (17 ㎖) 중 수산화리튬 (2.7 g, 64 mmol, 1.1 당량)을 첨가하였다. TLC (9:1 디클로로메탄/이소프로판올)에 의해 출발 물질이 관찰되지 않을 때까지 반응 혼합물을 격렬하게 0.5시간 동안 교반하였다. 용액을 6 M HCl (13 ㎖)로 pH 2로 산성화하고 용매를 감압하에서 제거하였다. 조 생성물을 에틸 아세테이트 (400 ㎖) 및 물 (50 ㎖) 중에 현탁시켰다. 수성층을 에틸 아세테이트 (200 ㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고 여과하고 용매를 감압하에서 제거하여 표제 화합물 13.94 g을 얻었다 (86% 수율). Rf=0.3 (90:30:5 클로로포름/메탄올/아세트산).
실시예 39
i-부톡시카르보닐-D-Ser-Ala-N g -니트로Arg-O(에틸 시클롤)의 합성
0 ℃에서 기계적으로 교반되는 아세토니트릴 (520 ㎖) 중 2,6-루티딘 (30.5 ㎖, 272 mmol)의 용액에 L-Ng-니트로아르기니날 에틸 시클롤, 히드로클로라이드 염 (16.44 g, 61 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물에, 아세토니트릴 (200 ㎖) 중 실시예 38의 화합물 (13.94 g, 50.5 mmol)에 이어 1-히드록시벤조트리아졸 (8.32 g, 33 mmol)을 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 신속히 교반하였다. EDC (12.9 g, 67 mmol)를 15분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 얼음 조를 제거하고 혼합물을 69시간 동안 더 교반하였다. 용액을 감압하에서 농축하고 잔류물을 에틸 아세테이트 (300 ㎖) 및 6M HCl (200 ㎖) 중에 용해하였다. 얻어진 침전물을 여과하고 건조시켜 분량 I을 얻었다. 여액으로부터 층을 분리하고 유기층을 1 M HCl (200 ㎖)로 세척하였다. 합한 수성층을 NaCl로 포화시키고 에틸 아세테이트 (300 ㎖)로 추출하였다. 합한 유기층을 포화 중탄산나트륨 (300 ㎖) 및 염수 (150 ㎖)로 세척하고 황산마그네슘상에 건조시키고 용매를 감압하에서 제거하여 분량 II를 얻었다. 중탄산나트륨 세척액을 디클로로메탄 중 20% 이소프로판올로 추출하였다 (2 x 150 ㎖). 합한 유기층을 황산마그네슘으로 건조시키고 용매를 감압하에서 건조시켜 분량 III을 얻었다. 분량 I, II 및 III을 각각 최소량의 고온 아세토니트릴 중에 용해하고 밤새냉각하였다. 얻어진 고체를 여과하고 건조시켜 분량 I (4.15 g), 분량 II (6.63 g) 및 분량 III (0.3 g)을 얻었다. 분량 I, 분량 II 및 분량 III은 TLC 및1H NMR에 의해 동일하였다. 표제 화합물의 합한 수율은 11.08 g (45% 수율)이었다.
실시예 40
i-부톡시카르보닐-D-Ser-Ala-Arg-al, 트리플루오로아세테이트 염 (화합물 1)의 합성
에탄올/아세트산 (1:1 혼합물 230 ㎖) 중 실시예 39의 화합물 (11.48 g, 23.5 mmol)의 용액에 탄소상 10% 팔라듐 (5.74 g)을 첨가하고 혼합물을 48 ℃로 가열하였다. 45분의 기간에 걸쳐, 물 (9 ㎖) 중 암모늄 포르메이트 (8.82 g, 140 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 3시간 동안 교반하고 냉각하고 여과하였다. 잔류물을 에탄올로 세척하고 용매를 감압하에서 제거하였다. 잔류물을 물 (250 ㎖) 중에 용해하고 동결건조시켜 정량 수율로 i-부톡시카르보닐-D-Ser-Ala-L-아르기니날 에틸 시클롤을 얻었다. 20분에 걸쳐 15 내지 25% 수성 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산에서 tR=12분.
0 ℃에서 i-부톡시카르보닐-D-Ser-Ala-L-아르기니날 에틸 시클롤에 냉 6 M HCl (115 ㎖)을 첨가하였다. 이 혼합물을 50분 동안 교반하였다. 얼음 조를 제거하고 반응 혼합물을 주위 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 이후, 용액을 얼음 조에서 재냉각하고 물 (200 ㎖) 중 소듐 아세테이트 (100 g)를 첨가하였다. 용액을 여과하고 예비 HPLC (10, 18, 30, 50% 수성 아세토니트릴의 0.1% 트리플루오로아세트산 단계 구배를 사용함, C-18 역상 컬럼)로 정제하여 표제 화합물의 3개 분량을 얻었다: 분량 I (1.41 g, 14%, 99% 순도), 분량 II (1.52 g, 16%, 98% 순도) 및 분량 III (3.13 g, 32%, 95% 순도). tR=9.46분, 12.82분 및 13.87분 (역상 HPLC, C-18, 20분에 걸쳐 10 내지 20% 수성 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산). MS(M+H=417.5).
(v) 실시예 41 내지 45에는 본 발명의 화합물을 합성하는데 사용되는 아르기니날-히드라조닐카르보닐-아미노메틸화 폴리스티렌 수지의 합성이 기재되어 있다. 도 6을 참조하기 바란다.
실시예 41
t-부톡시카르보닐-히드라조닐-카르보닐-아미노메틸화 폴리스티렌 수지의 합성
디메틸포름아미드 (300 ㎖) 중 1,1-카르보닐디이미디아졸 (29.19 g, 180 mmol, 6 당량)의 현탁액에 t-부틸카르바제이트 (23.76 g, 180 mmol, 6 당량)를 주위 온도의 질소 대기하에서 교반하면서 조금씩 첨가하였다. 첨가가 완결된 후, 반응 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 교반되도록 한 후, 펩티드 합성 플라스크 중아미노메틸화 폴리스티렌 수지 (30 g, 1 meq/g, 어드벤스 켐테크 (Advance Chemtech))에 부었다. 현탁액을 질소 가스로 3시간 동안 퍼징하였다. 수지를 여과하고 메틸렌 클로라이드 3 x 350 ㎖ 분량으로 세척하였다. 카이저 테스트 (Kaiser Test) (용액 및 비드; 연청색, 투명). 정량적 반응을 확실히 하기 위해 이중 커플링을 시작하였다 (그러나, 이중 커플링은 선택적임). 따라서, 디메틸포름아미드 150 ㎖ 중 1,1-카르보닐디이미디아졸 (14.60 g, 90 mmol, 3 당량) 및 t-부틸카르바제이트 (11.88 g, 90 mmol, 3 당량)의 용액을 주위 온도에서 30분 동안 교반한 후 미리 제조된 수지에 부었다. 질소 가스로 1시간 동안 퍼징한 후, 수지를 여과하고 메틸렌 클로라이드, 메탄올, 메틸렌 클로라이드, 메탄올, 메틸렌 클로라이드 및 메탄올 각각 350 ㎖로 6 회 세척하였다. 카이저 테스트 (용액 및 비드; 투명 및 투명). 수지를 진공하에서 건조시키고 DMF/아세트산 무수물/Et3N (8:1:1, 약 300 ㎖)로 주위 온도에서 30분 동안 아세틸화시켰다. 수지를 용매 (메틸렌 클로라이드 및 메탄올)로 3 회 연속 세척하고 진공하에서 건조시켜 정량 수율로 생성물을 얻었다.
실시예 42
히드라조닐카르보닐-아미노메틸화 폴리스티렌 수지의 제조
DCM/TFA (1:1) (300 ㎖) 및 티오아니솔 (10 ㎖)의 용액을 실시예 41의 수지 (30 g)에 첨가하여 탈보호화시켰다. 이 혼합물을 주위 온도의 펩티드 합성 플라스크 중에서 30분 동안 질소 가스로 천천히 퍼징하였다. 탈보호화된 수지를 여과하고 DCM (2x), DCM/DIEA (2x), DCM (2x) 및 다르게는 유기 용매 (메틸렌 클로라이드, 메탄올)로 세척하였다. 얻어진 표제 수지를 진공하에서 건조하였다. 카이저 테스트 (용액 및 비드; 연청색, 모래색); 이 합성으로 총 수율 30.46 g의 수지를 얻었다 (약 0.85 meq 세미카르바지드/g).
별법으로, 표제 수지를 하기와 같이 제조하였다.
N,N-디메틸포름아미드 (12 ㎖) 중의 아미노 메틸화 폴리스티렌 수지 (1.0 g, 1.0 mmol, 어드벤시드 켐테크)에 1,1-카르보닐디이미다졸 (3.89 g, 24.0 mmol, 24 당량)을 첨가하였다. 현탁액을 실온에서 5시간 동안 흔든 후, 펩티트 합성 플라스크 중에서 여과하였다. 수지를 충분한 양의 메틸렌 클로라이드로 세척하였다. 카이저 테스트 (용액 및 비드; 연청색, 백색). N,N-디메틸 포름아미드 (12 ㎖) 중 히드라진의 2M 용액을 수지에 첨가하고 주위 온도에서 밤새 흔들었다. 수지를 여과하고 다르게는 유기 용매 (메틸렌 클로라이드 및 메탄올)로 세척하고 진공하에서 건조시켜 표제 화합물 1.06 g을 얻었다 (약 0.94 mmol/g).
<실시예 43>
N-α-플루오레닐메틸옥시카르보닐-ω,ω'-디-N-t-부톡시카르보닐-아르기닌 메틸 에스테르의 제조
아세토니트릴 (82 ㎖) 중 N-α-플루오레닐메틸옥시카르보닐-ω,ω'-디-N-t-부톡시카르보닐-아르기닌 (4.97 g, 8.329 mmol, 어드벤시드 켐테크)의 용액에 탄산칼륨 (1.38 g, 10 mmol) 및 요오드화메틸 (1.037 ㎖, 16.66 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 50 ℃로 가온하였다. 50 ℃에서 4.5시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (500 ㎖) 중에 붓고 물 (1 x 50 ㎖), 포화 중탄산나트륨 (1 x 50 ㎖) 및 염수 (1 x 50 ㎖)로 연속하여 세척하였다. 유기상을 황산나트륨으로 건조시키고 용매를 감압하에서 제거하여 표제 화합물 4.7 g을 얻었다.
실시예 44
N-α-플루오레닐메틸옥시카르보닐-ω,ω'-디-N-t-부톡시카르보닐-아르기니놀의 제조
테트라히드로푸란 (15.5 ㎖) 및 메탄올 (93 ㎖) 중 실시예 43의 화합물(5.675 g, 9.29 mmol)의 용액에 염화칼슘 (2.06 g, 18.58 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 얼음 조에서 냉각하였다. 교반 냉각 용액에 소듐 보로히드리드 (1.4 g, 37.17 mmol)을 조금씩 천천히 첨가하였다. 1.5시간 후, 용매를 감압하에서 제거하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (500 ㎖) 및 물 (300 ㎖) 중에 현탁시켰다. 상을 분리하고 유기층을 0.5 M HCl (200 ㎖) 및 염수 (200 ㎖)로 연속하여 세척하였다. 합한 유기 세척액을 에틸 아세테이트로 역추출하였다. 에틸 아세테이트 층을 합하고 실리카 (30 g)을 첨가하고 용매를 감압하에서 제거하였다. 이 실리카를 150 x 80 mm 실리카 플래쉬 컬럼에 적재하고 생성물을 50% 에틸 아세테이트/헥산으로 용출하여 표제 화합물 3.855 g (수율 71%)을 얻었다. 실시예 43의 화합물 (출발 물질) 0.938 g (17% 수율)을 회수하였다. Rf=0.30 (50% 에틸 아세테이트/헥산).1H NMR (CDCl3): 8.35 ppm (bs, 1H), 7.75 ppm (m, 2H), 7.6 ppm (m, 2H), 7.38 ppm (m, 2H), 7.3 ppm (m, 2H), 5.45 ppm (m, 1H), 4.4 ppm (d, 2H), 4.2 ppm (d, 1H), 3.7 ppm (m, 2H), 3.57 ppm (m, 1H), 3.45 ppm (m, 1H), 3.35 (m, 2H), 2.15 ppm (m, 1H), 1.6 ppm (m, 4H), 1.45 ppm (d, 18H).
실시예 45
N-α-플루오레닐메틸옥시카르보닐-ω,ω'-디-N-t-부톡시카르보닐-아르기니날 히드라조닐카르보닐 아미노메틸화 폴리스티렌 수지의 제조
얼음 조 중에 냉각된 메틸 술폭사이드 (31 ㎖) 및 톨루엔 (31 ㎖) 중 실시예 44의 화합물 (3.62 g, 6.21 mmol)의 용액에 EDC (11.93 g, 62.1 mmol) 및 디클로로아세트산 (2.56 ㎖, 31.06 mmol)을 첨가하였다. 출발 물질이 TLC (50% 에틸 아세테이트/헥산)에 의해 관찰되지 않을 때까지 40분 동안 반응 혼합물을 교반하였다. 물 (150 ㎖) 및 에틸 아세테이트 (500 ㎖)를 첨가하고 상을 분리하였다. 이어서 유기층을 0.5 M HCl (100 ㎖), 포화 중탄산나트륨 (2 x 100 ㎖) 및 염수 (100 ㎖)로 연속하여 세척하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고 용매를 감압하에서 제거하였다. 이 잔류물을 디클로로메탄 (45 ㎖) 중에 용해하고 실시예 42의 화합물 (3.65 g, 3.1 mmol)을 첨가하고 밀봉된 튜브 중에서 밤새 교반하였다. 수지를 여과하고 디클로로메탄 (3 x 50 ㎖), 디메틸포름아미드 (3 x 50 ㎖) 및 메탄올 (3 x 50 ㎖)로 연속하여 세척한 후 고 진공하에서 건조하였다. 표제 화합물의 수율은 4.3 g이었다. 피페리딘 풀벤 결정의 적재는 0.37 mmol/g (60% 커플링)을 보여주었다.
(vi) 실시예 46은 벤젠술포닐-D-세릴-아제티딜-아르기니날, 트리플루오로아세테이트 염 (화합물 31)의 합성을 기재하고 있다. 도 7을 참조하기 바란다.
실시예 46
벤젠술포닐-D-세릴-아제티딜-아르기니날, 트리플루오로아세테이트 염의 제조
단계 1: ω,ω'-디-N-t-부톡시카르보닐-아르기니날 히드라조닐카르보닐 아미노메틸화 폴리스티렌 수지의 제조
4 ㎖ 폴리프로필렌 컬럼 중에서 실시예 45의 수지 생성물 (125 mg)을 30% 피페리딘/디메틸포름아미드 (1.5 ㎖)로 처리하였다. 30분 후, 수지를 배출시키고 디클로로메탄 (2 x 3 ㎖) 및 메탄올 (2 x 3 ㎖)로 연속하여 세척하고 진공하에서 건조시켜 표제 화합물을 얻었다. 소량을 닌히드린 분석하여 암청색 수지를 얻었고 용액은 탈보호화에 대해 높은 수율을 보여주었다.
단계 2: N-α-Fmoc-아제티딘-2-카르보닐-ω,ω'-디-N-t-부톡시카르보닐-아르기니날 히드라조닐카르보닐 아미노메틸화 폴리스티렌 수지의 제조
4 ㎖ 폴리프로필렌 컬럼 중 단계 1의 화합물 (0.12 g)에 디메틸포름아미드 (95 ㎕) 중 N-α-Fmoc-아제티딘-2-카르복실산 (110 mg, 0.34 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 (7.7 mg, 0.057 mmol), TBTU (37 mg, 0.11 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (29.8 ㎕, 0.17 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 수지로부터 시약을 배출시키고, 수지를 디클로로메탄 (2 x 3 ㎖) 및 메탄올 (2 x 3 ㎖)로 연속하여 세척하였다. 수지를 진공하에서 건조시키고 소량을 닌히드린 비색 분석하여 표제 화합물의 제조에서 97% 커플링 효율을 보여주었다.
단계 3: 아제티딘-2-카르보닐-ω,ω'-디-N-t-부톡시카르보닐-아르기니날 히드라조닐카르보닐 아미노메틸화 폴리스티렌 수지의 제조
4 ㎖ 폴리프로필렌 컬럼 중에서 단계 2의 화합물을 30% 피페리딘/디메틸포름아미드 (1.5 ㎖)로 처리하였다. 30분 후, 수지를 배출시키고 디클로로메탄 (2 x 3 ㎖) 및 메탄올 (2 x 3 ㎖)로 연속하여 세척하고 진공하에서 건조시켜 표제 화합물을 얻었다. 소량을 닌히드린 분석하여 암청색 수지를 얻었고 용액은 탈보호화에 대해 높은 수율을 보여주었다.
단계 4: N-α-Fmoc-세릴(O-t-Bu)-아제티딘-2-카르보닐-N-ω,ω'-디-N-t-부톡시카르보닐-아르기니날 히드라조닐카르보닐 아미노메틸화 폴리스티렌 수지의 제조
4 ㎖ 폴리프로필렌 컬럼 중 단계 3의 화합물 (0.12 g)에 디메틸포름아미드 (95 ㎕) 중 N-α-Fmoc-D-세린 t-부틸 에테르 (43 mg, 0.11 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 (7.7 mg, 0.057 mmol), TBTU (37 mg, 0.11 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (29.8 ㎕, 0.17 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 4시간 동안 흔들었다. 수지로부터 시약을 배출시키고, 수지를 디클로로메탄 (2 x 3 ㎖) 및 메탄올 (2 x 3 ㎖)로 연속하여 세척하였다. 수지를 진공하에서 건조시킨 후, 디메틸포름아미드 (95 ㎕) 중 N-α-Fmoc-세린 O-t-부틸 에테르 (43 mg, 0.11 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸 (7.7 mg, 0.057 mmol), TBTU (37 mg, 0.11 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (29.8 ㎕, 0.17 mmol)을 사용하여 이중 커플링시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 흔들었다. 수지로부터 시약을 배출시키고, 수지를 디클로로메탄 (2 x 3 ㎖) 및 메탄올 (2 x 3 ㎖)로 연속하여 세척하였다. 수지를 진공하에서 건조시키고 소량을 닌히드린 비색 분석하여 표제 화합물의 제조에서 97.4% 커플링 효율을 보여주었다.
단계 5: 세릴(O-t-Bu)-아제티딘-2-카르보닐-ω,ω'-디-N-t-부톡시카르보닐-아르기니날 히드라조닐카르보닐 아미노메틸화 폴리스티렌 수지의 제조
4 ㎖ 폴리프로필렌 컬럼 중에서 단계 4의 화합물을 30% 피페리딘/디메틸포름아미드 (1.5 ㎖)로 처리하였다. 30분 후, 수지를 배출시키고 디클로로메탄 (2 x 3 ㎖) 및 메탄올 (2 x 3 ㎖)로 연속하여 세척하고 진공하에서 건조시켜 표제 화합물을 얻었다. 소량을 닌히드린 분석하여 암청색 수지를 얻었고 용액은 탈보호화에 대해 높은 수율을 보여주었다.
단계 6: N-α-벤젠술포닐-D-세릴(O-t-Bu)-아제티딘-2-카르보닐-N-ω,ω'-디-N-t-부톡시카르보닐-아르기니날 히드라조닐카르보닐 아미노메틸화 폴리스티렌 수지의 제조
4 ㎖ 폴리프로필렌 컬럼 중 단계 5의 화합물 (0.12 g)에 디메틸포름아미드 (888 ㎕) 중 벤젠술포닐 클로라이드 (17 ㎕, 0.133 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (46.3 ㎕, 0.27 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 흔들었다. 수지로부터 시약을 배출시키고, 수지를 디클로로메탄 (2 x 3 ㎖) 및 메탄올 (2 x 3 ㎖)로 연속하여 세척하였다. 수지를 진공하에서 건조시킨 후, 디메틸포름아미드 (888 ㎕) 중 벤젤술포닐 클로라이드 (17 ㎕, 0.133 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (46.3 ㎕, 0.27 mmol)을 사용하여 이중 커플링시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 흔들었다. 수지로부터 시약을 배출시키고, 수지를 디클로로메탄 (2 x 3 ㎖) 및 메탄올 (2 x 3 ㎖)로 연속하여 세척하였다. 수지를 진공하에서 건조시키고 소량을 닌히드린 비색 분석하여 표제 화합물의 제조에서 96% 커플링 효율을 보여주었다.
단계 7: 벤젠술포닐-D-세릴-아제티딘-2-카르보닐-아르기니날, 트리플루오로아세테이트 염의 제조
4 ㎖ 폴리프로필렌 프리티드 컬럼 중에서 단계 6의 화합물 (45 mg)을 트리플루오로아세트산/물 (9:1 혼합물 0.5 ㎖)로 처리하였다. 컬럼을 실온에서 1.5시간 동안 흔들었다. 반응 용액을 시험 튜브로 배출시키고, 수지를 물로 세척하여 여액의 총 부피가 5.2 ㎖가 되도록 하였다. 표제 화합물을 반-예비 역상 HPLC (0 내지 40% 수성 아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산, C-18 역상)로 정제하고 동결건조시켜 26%의 수율로 표제 화합물 14.4 g을 얻었다. HPLC에 의해 분석한 순수한 분획물을 합하고 동결건조시켜 표제 화합물 (2.1 mg)을 얻었다. MS (M+H=469).
(vii) 실시예 47 내지 50은 N-α-(3-페닐프로필)-D-세릴-알라닐-아르기니날, 트리플루오로아세테이트 염 (화합물 32)의 합성을 기재하고 있다.
실시예 47
N-α-(3-페닐프로필)-D-세린-t-부틸 에테르 메틸 에스테르의 제조
세린 O-t-부틸 에테르 메틸 에스테르 (1.50 g, 7.1 mmol), 히드로신남알데히드 (1.40 ㎖, 10.6 mmol) 및 트리에틸아민 (1.18 ㎖, 8.5 mmol)을 테트라히드로푸란 (70 ㎖) 중에 4시간동안 환류하였다. 용액을 실온으로 냉각한 후, 소듐 보로히드리드 (0.46 g, 12 mmol)를 교반 용액에 2번 나누어 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도로 30분간 교반하였다. 용액을 감압하에 농축하였다. 잔류물을 에틸 아세테이드와 1.0 M HCl 사이에서 분배하였다. 유기 층을 1.0 N HCl로 세척하였다. 수성 층을 40% NaOH로 pH 10으로 염기화하고, 이어서 에틸 아세테이트로 추출하였다 (2X). 합친 유기층을 황산나트륨 상에서 건조하였다; 용매를 진공에서 제거하였다. 잔류물을 10-30%의 에틸 아세테이트/헥산으로 용출하는 실리카 겔 상의 플래쉬 크로마토그래피 (2.54 cm x 15.24 cm(1 x 6 인치) 컬럼)로 정제하여 표제 화합물 150 mg (수율 7%)을 얻었다. Rf= 0.60 (50% 에틸 아세테이트/헥산).
실시예 48
N-α-t-부톡시카르보닐-N-α-(3-페닐프로필)-D-세린-t-부틸 에테르 메틸 에스테르의 제조
실시예 47의 화합물 (150 mg, 0.51 mmol), 디-t-부틸디카르보네이트 (167 mg, 0.77 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (0.13 ㎖, 0.77 mmol)을 테트라히드로푸란 (2 ㎖) 중 주위 온도로 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (20 ㎖)로 희석하고, 연속적으로 1.0 N HCl (2X), 포화 중탄산나트륨 (2X) 및 염수로 세척하였다. 용매를 진공으로 제거하여 정량 수율로 표제 화합물 206 mg을 얻었다. Rf= 0.74 (50% 에틸 아세테이트/헥산).
실시예 49
N-α-t-부톡시카르보닐-N-α-(3-페닐프로필)-D-세린-t-부틸 에테르의 제조
메탄올 (3.5 ㎖) 중 실시예 48의 화합물 (206 mg, 0.52 mmol)의 용액에 1.0 N LiOH (0.63 ㎖, 0.63 mmol)를 적가하였다. 용액이 흐려지고, 5분 후 균질화하되었다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 밤새 교반하였다. 1.0 N LiOH (1.47 ㎖)을 더 첨가하였다. 2시간 후, 1.0 N LiOH (1.0 ㎖)를 더 첨가하였다. TLC (50% 에틸 아세테이트/헥산)로 어떠한 출발 물질도 관측되지 않은 후, 반응 혼합물을 DOWEX (50 X 8-400) 이온 교환 수지로 pH 4로 산성화하였다. 용액을 여과하고, 메탄올, 이어서 물로 헹구었다. 용액을 감압하에 농축하고, 이어서 동결건조하여 황색의 오일로서 수율 95%의 표제 화합물 189 mg을 얻었다. Rf= 0.04 (50% 에틸 아세테이트/헥산).
실시예 50
N-α-(3-페닐프로필)-D-세릴-알라닐-아르기니날-트리플루오로아세테이트 염 (화합물 32)의 제조
단계 2에서 N-α-Fmoc-아제티딘 대신 N-α-Fmoc-알라닌을, 단계 4에서 N-α-Fmoc-D-세린-O-t-부틸 에테르 대신 실시예 49의 화합물을 사용하고 실시예 46의 단계 1 내지 4 및 단계 7에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
(viii) 실시예 51 내지 53은 본 발명의 특정 화합물의 고상 합성을 기술한다.
실시예 51
화합물 44, 47 및 48의 고상 합성
단계 4에서 Fmoc-D-세린(O-t-부틸)을 대체하여 실시예 46의 단계 1 내지 4 및 단계 7에 따랐다.
화합물 번호 화합물명 단계 4에서의 대체물
44 벤질옥시카르보닐-D-2-아미노부티릴-L-알라닐-아르기니날 Cbz-D-2-아미노부티르산
47 2-페닐에틸술포닐-D-세릴-알라닐-아르기니날 2-페닐에틸술포닐-D-세린-(O-t-부틸)
48 3-페닐프로필술포닐-D-세릴-알라닐-아르기니날 3-페닐프로필-술포닐-D-세린(O-t-부틸)
2-페닐에틸술포닐-D-세린-O-t-부틸의 합성에서, 실시예 22에서 두 대체물을 사용하여 실시예 22 및 23의 절차에 따랐다. 2-페닐에틸술포닐 클로라이드 또는 3-페닐프로필술포닐 클로라이드 중 하나를 α-톨루엔술포닐 클로라이드의 대체물로 하고, 4-메틸모르폴린을 디이소프로필에틸아민 대신 사용하였다.
실시예 52
화합물 45, 46 및 49 내지 51의 고상 합성
단계 4에서 Fmoc-D-세린(O-t-부틸) 대신 Cbz-D-세린(O-t-부틸)을 사용하고, 단계 2에서는 Fmoc-L-아제티딘-2-카르복실산을 대체하여 실시예 46의 단계 1 내지 4 및 단계 7을 따랐다.
화합물 번호 화합물명 단계 2에서의 대체물
45 벤질옥시카르보닐-D-세릴-L-세릴-아르기니날 Fmoc-L-세린-O-t-부틸
46 벤질옥시카르보닐-D-세릴-L-β-시아노알라닌-아르기니날 Fmoc-L-β-시아노알라닌
49 벤질옥시카르보닐-D-세릴-L-시스-4-히드록시프롤릴-아르기니날 Fmoc-시스-4-히드록시프롤린
50 벤질옥시카르보닐-D-세릴-L-3,4-데히드로프롤릴-아르기니날 Fmoc-L-3,4-데히드로프롤린
51 벤질옥시카르보닐-D-세릴-L-프로파르길글리실-아르기니날 Fmoc-L-프로파르길글리신
52 벤질옥시카르보닐-D-세릴-L-알릴글리실-아르기니날 Fmoc-L-알릴글리신
실시예 53
트랜스-β-스티렌술포닐-D-세릴-L-알라닐-아르기니날 (화합물 53)의 고상 합성
단계 2에서 N-α-Fmoc-아제티딘-2-카르복실산 대신 Fmoc-L-알라닌을 사용하고, 단계 6에서는 벤젠술포닐 클로라이드 대신 트랜스-β-스티렌술포닐 클로라이드를 사용하고 실시예 46의 단계 1 내지 7에 따라 표제 화합물을 제조하였다.
(ix) 실시예 54 내지 59는 화합물 1의 또다른 합성 방법을 기술한다. 도 5 참고.
실시예 54
i-부톡시카르보닐-D-Ser(O-t-부틸)-OH의 제조
물 (51 ㎖) 중 D-세린-O-t-부틸 에테르 (10.5 g, 65.3 mmol)의 용액에 탄산 나트륨 (20.1 g, 196.2 mmol)을 첨가하고, 이어서 이소부틸 클로로포르메이트 (9.8 ㎖, 75.2 mmol)를 첨가하였다. 3시간 후, 이 혼합물이 흐려지면 추가로 3시간동안 교반하였다. 6시간 후, 용액을 6 M HCl (~50 ㎖)로 산성화하였다. 그리고나서 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (3 x 200 ㎖)로 추출하였다. 초기 추출 후, 수성 층을 염화나트륨으로 포화하고 에틸 아세테이트 (2 x 200 ㎖)로 추출하였다. 에틸 아세테이트층을 합치고, 황산나트륨으로 건조하고, 이어서 진공에서 용매를 제거하여 백색의 고체로서 표제 화합물 17.0 g (수율 99.5%)을 얻었다. HPLC: 1 ㎖/min의 유속에서 4.6 x 250 mm, 5 마이크론 입자, 100 Å 공극, C18 컬럼 상의 0.1% 수성 TFA 완충액 중 5% 내지 75%의 아세토니트릴 구배에서 t=18.5 분.
실시예 55
i-부톡시카르보닐-D-Ser(t-Bu)-L-Ala-O-t-Bu의 제조
아세토니트릴 (153 ㎖) 중 실시예 54의 화합물 (10 g, 38.3 mmol), L-알라닌 t-부틸 에스테르, HCl 염 (10.43 g, 57.4 mmol), EDC (11.05 g, 57 mmol) 및 히드록시벤조트리아졸 (5.85 g, 38.3 mmol)의 용액을 실온에서 15분간 교반하였다. 디이소프로필에틸아민 (32.7 ㎖, 191 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 18시간동안 교반하였다. 용매를 감압하에 제거하였다; 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트 (1000㎖) 및 1 M HCl (100 ㎖)에 재현탁하였다. 에틸 아세테이트층을 0.5 M HCl (100 ㎖), 포화 중탄산나트륨 (2 x 100 ㎖) 및 염수 (100 ㎖)로 세척하였다. 에틸 아세테이트층을 황산나트륨으로 건조하고 용매를 진공에서 제거하여 정량 수율의 표제 화합물을 얻었다. HPLC: 1 ㎖/min의 유속에서 4.6 x 250 mm, 5 마이크론 입자, 100 Å 공극, C18 컬럼 상의 0.1%의 수성 TFA 완충액 중 5% 내지 90%의 아세토니트릴 구배에서 tr= 18.7 분.
실시예 56
i-부톡시카르보닐-D-Ser-L-Ala-OH의 제조
디클로로메탄 (35 ㎖) 중 실시예 55의 화합물 (7.15 g, 18,4 mmol)의 용액에 트리플루오로아세트산 (35 ㎖)을 첨가하였다. 이 혼합물을 2시간동안 교반하고, 이어서 용매를 감압하에 제거하였다. 톨루엔을 첨가하고, 용매를 진공에서 제거하여 트리플루오로아세트산을 제거하였다. 그리고나서 점성의 황색 오일로서 정량 수율의 표제 화합물을 다음 단계에 계속 사용하였다. 1 ㎖/min의 유속에서 4.6 x 250 mm, 5 마이크론 입자, 100 Å 공극, C18 컬럼 상의 0.1%의 수성 TFA 완충액 중 5% 내지 90%의 아세토니트릴 구배에서 tr= 10.5 분.
실시예 57
i-부톡시카르보닐-D-Ser-L-Ala-N g -니트로아르기니날-에틸 시클롤의 제조
아세토니트릴 (74 ㎖) 중 실시예 56의 화합물 (5.09 g, 18.4 mmol), Ng-니트로아르기니날-에틸 시클롤, HCl 염 (6.4 g, 23.9 mmol), EDC (5.31 g, 27.6 mmol) 및 히드록시벤조트리아졸 (2.82 g, 18.4 mmol)의 용액을 주위 온도에서 15분간 교반하였다. 디이소프로필에틸아민 (15.7 ㎖, 92 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을18시간동안 교반하였다. 용매를 감압하에 제거하고, 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트 (1000 ㎖) 및 0.5 M HCl (100 ㎖)에 재현탁하였다. 에틸 아세테이트층을 0.5 M HCl (100 ㎖), 포화 중탄산나트륨 (2 x 100 ㎖) 및 염수 (100 ㎖)로 세척하고, 이어서 황산나트륨으로 건조하였다. 용매를 감압하에 부피 ~25 ㎖로 제거하여 백색의 침전물을 얻었다. 그리고나서 반응 혼합물을 4 ℃로 밤새 방치하였다. 그리고나서 침전물을 여과하고, 건조하여 HPLC에 의해 단일 피크로서의 표제 화합물 4.6 g (수율 50%)을 얻었다. HPLC: 1 ㎖/min의 유속에서 4.6 x 250 mm, 5 마이크론 입자, 100 Å 공극, C18 컬럼 상의 0.1%의 수성 TFA 완충액 중 5% 내지 90%의 아세토니트릴 구배에서 t= 11.5 분.
실시예 58
i-부톡시카르보닐-D-Ser-L-Ala-아르기니날-에틸시클롤의 제조
에탄올:물:아세트산 (4:1:1 혼합물 55 ㎖) 중 실시예 57의 화합물 (4.55 g, 9.3 mmol)의 용액에 탄소 상의 팔라듐(1.15 g, 10% 팔라듐, 50% 물)을 첨가하기 전에 질소를 분사하였다. 이 혼합물을 3.4 atm (50 psi)에서 18시간동안 수소화하였다. 이어서 반응 혼합물을 여과하여 팔라듐을 제거하고, 용매를 진공에서 제거하여 정량 수율의 표제 화합물을 얻었다. HPLC: 1 ㎖/min의 유속에서 4.6 x 250 mm, 5 마이크론 입자, 100 Å 공극, C18 컬럼 상의 0.1%의 수성 TFA 완충액 중 5% 내지50%의 아세토니트릴 구배에서 tr=14.2 분.
실시예 59
i-부톡시카르보닐-D-Ser-L-Ala-아르기니날 (화합물 1)의 제조
3 M HCl 중 실시예 58의 화합물 (9.3 mmol)의 용액을 3시간동안 교반하였다. 그리고나서 이 물질을 직접 세부분으로 나누어 80 ㎖/min의 유속에서 50 x 300 mm, 15 마이크론 입자, 100 Å 공극, C18 컬럼상으로 직접 적재하였다. 생성물을 함유하는 분획을 모아서 동결건조하여 분석 HPLC로 순도 97%의 표제 화합물 2.38 g (수율 61%)을 얻었다. HPLC: 1 ㎖/min의 유속에서 4.6 x 250 mm, 5 마이크론 입자, 100 Å 공극, C18 컬럼 상의 0.1%의 수성 TFA 완충액 중 5% 내지 25%의 아세토니트릴 구배에서 t= 16.4 분, 18.9 분 및 19.6 분. 질량 스펙트럼 (M+H) = 417.
(x) 실시예 60 내지 72는 본 발명의 화합물의 합성에 사용될 수 있는 특정 중간체의 합성을 기술한다. 도 8 (실시예 60 내지 64) 및 도 9 (실시예 65 내지 72)을 참고하기 바란다.
실시예 60
N-(t-부톡시카르보닐)-3-(3-피리딜)-L-알라닌 메틸 에스테르의 제조
메탄올 (100 ㎖) 중 N-(t-부톡시카르보닐)-3-(3-피리딜)알라닌 (5.0 g, 18.8 mmol)의 용액에 티오닐 클로라이드 (디클로로메탄 중 2 M 용액, 66 ㎖, 132 mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 주위 온도로 밤새 교반하였다. 메탄올을 감압하에 최소 부피로 제거하고, 에틸 아세테이트 (100 ㎖)를 첨가하였다. 생성된 백색의 침전물을 프릿 깔대기로 수집하였다. 테트라히드로푸란/물 (각각 40 ㎖)의 혼합물 중 수집한 침전물의 용액에 디-tert-부틸 디카르보네이트 (4.8 g, 21.99 mmol) 및 중탄산나트륨 (1.95 g, 18.4 mmol)을 첨가하였다. 주위 온도로 12시간동안 교반한 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (40 ㎖)로 희석하고, 포화 중탄산나트륨의 용액 (25 ㎖)으로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 진공하에 농축하여 조생성물을 얻었다. 이 생성물을 8 x 52 cm 컬럼을 사용하고 에틸 아세테이트/헥산의 10:90 혼합물, 이어서 에틸 아세테이트/헥산의 60:40의 혼합물로 용출하는 실리카 겔 (230-400 메쉬) 상의 플래쉬 크로마토그래피로 정제하였다. 표제 화합물 4 g (74%)을 오일로서 수득하였다. 박층 크로마토그래피 (실리카 겔; 에틸 아세테이트), Rf= 0.68.
실시예 61
N-(t-부톡시카르보닐)-3-([R,S]-3-피페리딜)-L-알라닌 메틸 에스테르, 아세테이트염의 제조
에탄올 (24 ㎖), 아세트산 (6 ㎖) 및 물 (6 ㎖) 중 실시예 60의 화합물 (5 g, 17.8 mmol)의 용액을 팔라듐 산화물 (500 mg) 상에서 3.06 atm (45 psi)에서 3시간동안 수소화하였다. 촉매를 여과하여 제거하고, 여액을 진공하에 더이상의 정제없이 실시예 62에서 기술된 방법에서 사용하는 유성 잔류물 (6.89 g)로 농축하였다. 박층 크로마토그래피로 Rf값이 각각 0.16 및 0.26인 두 부분입체 이성질체에 상응하는 두 점적을 얻었다 (실리카 겔; 4:1:1 n-부탄올/아세트산/물).
실시예 62
N-(t-부톡시카르보닐)-3-[(R,S)-3-피페리딜-(N-구아니디노(비스-벤질옥시카르보닐))]-L-알라닌 메틸 에스테르의 제조
테트라히드로푸란 (80 ㎖) 중 실시예 61의 화합물 (6.89 g, 19.9 mmol)의 용액에 S-메틸이소티오우레아 비스-벤질옥시카르보닐 (7.13 g, 19.9 mmol)을 첨가하고, 이어서 N-메틸모르폴린 (4.37 ㎖)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 18시간동안 교반하였다. 그리고나서 반응 혼합물을 진공하에 농축하고, 생성된잔류물을 에틸 아세테이트 (100 ㎖)에 용해하고, 1 N 중황산나트륨 및 포화 염화나트륨 (각각 50 ㎖)으로 세척하였다. 무수 황산나트륨 상에서 건조한 후, 용매를 진공하에 제거하였다; 표제 조화합물을 8 x 52 cm 컬럼을 사용하고 1:9의 에틸 아세테이트/헥산 (컬럼 부피 두배), 이어서 1:1의 에틸 아세테이트/헥산으로 용출하는 실리카 겔 (230-400 메쉬) 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 표제 화합물 2.75 g이 두 부분입체 이성질체의 혼합물로서 수득되었다. 박층 크로마토그래피로 Rf값이 각각 0.57 및 0.62인 두 점적을 얻었다 (실리카 겔; 1:1 에틸 아세테이트/헥산).
실시예 63
N-(t-부톡시카르보닐)-3-[(R,S)-3-피페리딜-(N-구아니디노(비스-벤질옥시카르보닐))]-L-알라니놀의 제조
순수 에탄올 (8 ㎖) 및 무수 테트라히드로푸란 (4 ㎖) 중 실시예 62의 화합물 (2.23 g, 3.7 mmol)의 교반 용액에 염화칼슘 (844 mg, 7.6 mmol) 및 소듐 보로히드리드 (575 mg, 15.2 mmol)를 첨가하였다. 주위 온도로 12시간 교반한 후, 반응 혼합물을 진공하에 농축하고, 생성된 잔류물을 에틸 아세테이트 및 1 N 중황산나트륨 (각각 10 ㎖) 사이에서 분배하였다. 두 층을 분리하였다; 유기층을 1 N 중황산나트륨으로 2회 더 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 진공하에 농축하여 잔류물을 얻었다. 잔류물을 5.5 x 45 cm 컬럼을 사용하고 에틸 아세테이트로 용출하는 실리카 겔 (230-400 메쉬) 상의 플래쉬 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 백색의 발포체로서 표제 화합물 1.3 g을 얻었다. 박층 크로마토그래피로 Rf값이 각각 0.18 및 0.27인 두 부분입체 이성질체에 상응하는 두 점적을 얻었다 (실리카 겔; 1:1 에틸 아세테이트/헥산)
실시예 64
3-[(R,S)-3-피페리딜-(N-구아니디노(비스-벤질옥시카르보닐))]-L-알라니놀, 히드로클로라이드 염의 제조
실시예 63 (290 mg, 0.57 mmol)의 화합물을 주위 온도로 1시간동안 에틸 아세테이트 (2.0 ㎖) 중 2.5 N 무수 염산으로 처리하였다. 용매를 진공하에 제거하여 끈끈한 백색의 고체 (260 mg)를 얻었다. 이 고체를 더이상의 단리없이 P1에서 3-피페리디닐-(N-구아니디노)-알라니날을 갖는 본 발명의 화합물을 제조하는데 사용하였다. CD3OD에서 행한1H NMR 스펙트럼은 1.4 ppm에서 t-부톡시카르보닐 양성자를 나타내지 않았다.
실시예 65
세미카르바지드-4-일 디페닐메탄 트리플루오로아세테이트 염의 제조
1 단계:
디메틸포름아미드 225 ㎖ 중 카르보닐디이미다졸 (16.2 g, 0.10 몰)의 용액을 실온에서 제조하여 질소하에 교반하였다. 그리고나서 디메틸포름아미드 225 ㎖ 중 t-부틸 카르바제이트 (13.2 g, 0.100 mole)의 용액을 30분에 걸쳐 적가하였다. 이어서, 디페닐메틸아민 (18.3 g, 0.10 mole)을 30분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 질소하에 1시간동안 실온에서 교반하였다. 물 (10 ㎖)을 첨가하고, 이 혼합물을 진공하에서 약 150 ㎖로 농축하였다. 이 용액을 물 500 ㎖에 붓고, 이어서 에틸 아세테이트 400 ㎖로 추출하였다. 에틸 아세테이트상을 각각 75 ㎖인 1 N HCl, 물, 포화 중탄산나트륨 및 염수로 2회 추출하고, 이어서 무수 황산마그네슘으로 건조하였다. 혼합물을 여과하고, 용액을 농축하여 백색의 발포체로서 1-t-부톡시카르보닐-세미카르바지드-4-일 디페닐메탄 29.5 g (수율 85%)을 얻었다. 이 물질은 에틸 아세테이트/헥산으로부터 재결정으로 정제할 수 있으나, 단계 2에서 직접 사용할 정도로 충분히 순수하다: 융점 142-143 ℃.1H NMR (CDCl3) δ 1.45 (s, 9H), 6.10 (dd, 2H), 6.42 (s, 1H), 6.67 (bs, 1H), 7.21-7.31 (m, 10H).
C19H23N2O3이론치: C, 66.84; H, 6.79; N, 12.31, 실측치: C, 66.46; H,6.75; N, 12.90.
2단계:
디클로로메탄 12.5 ㎖ 중 1-t-부톡시카르보닐-세미카르바지드-4-일 디페닐메탄 3.43 g (10 mmol)의 용액을 0 ℃에서 트리플루오로아세트산 12.5 ㎖로 처리하였다. 반응 혼합물을 이 온도에서 30분간 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 디에틸 에테르 75 ㎖에 적가하여 침전물을 얻었다. 생성된 침전물을 여과하여 제거하고, 디에틸 에테르로 세척하여 표제 화합물 2.7 g (수율 80%)을 얻었다; 융점 182-184 ℃.
실시예 66
3-티오아미도벤질-N-아세틸아미노말론산 디에틸 에스테르의 제조
디옥산 (500 ㎖) 중 α-브로모-메타-톨루니트릴 (45.0 g, 0.24 mole), 디에틸 아세트아미도말로네이트 (48.0 g, 0.22 mole) 및 요오드화칼륨 (3.0 g, 0.018 mole)의 교반 용액에 에탄올 (100 ㎖) 중 2.5 M 소듐 에톡사이드를 아르곤 분위기 하에 적가하였다. 첨가를 완료한 후, 용액을 6시간동안 환류하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 방치하고, 이어서 염수 (250 ㎖) 및 물 (250 ㎖)로 희석하고, 에틸 아세테이트로 4회 (총 1.0 ℓ) 추출하였다. 합친 추출물을 물 (100 ㎖), 10% 시트르산 (100 ㎖), 물 (100 ㎖) 및 염수 (2 x 50 ㎖)로 세척하고, 이어서 무수 황산마그네슘 상에서 건조하고, 여과하였다. 용매를 진공하에 제거하였다. 조잔류물을 에틸 아세테이트 및 디에틸 에테르로부터 두 부분으로 재결정화하여 황색의 결정으로서 3-시아노벤질-N-아세틸아미노말론산 디에틸 에스테르 43.51 g (60%)을 얻었다.
H2S(g)를 피리딘 (300 ㎖) 및 트리에틸아민 (100 ㎖) 중 3-시아노벤질-N-아세틸아미노말론산 디에틸 에스테르 (44.3 g, 0.13 mmol)의 빠르게 교반하는 용액에 40분간 버블링하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간동안 교반하고, 이어서 물 3.0 ℓ에 부었다. 즉시 황색의 침전물이 생겼다. 용액을 4 ℃에서 4시간동안 방치하고, 이어서 여과하였다. 표제 조화합물을 에틸 아세테이트 및 헥산으로부터 재결정화하여 황색의 결정으로서 융점 183-186 ℃인 표제 화합물 48.1 g (수율 98%)을 얻었다. 융점 183-186℃.
C17H22N2O5S 이론치: C, 55.72; H, 6.05; N, 7.64, 실측치: C, 55.55; H, 5.96; N, 7.76.
실시예 67
3-아미디노-D,L-페닐알라닌, 디히드로클로라이드 염의 제조
실시예 66의 화합물 (48.1 g, 0.13 mmol)을 아세톤 (800 ㎖)에 용해하였다. 요오도메탄 (18.3 ㎖, 0.19 mole, 1.5 당량)을 첨가하고, 용액을 30분간 환류하였다. 용액을 실온으로 냉각하였다; 중간체 티오이미데이트를 여과하고, 건조하고, 메탄올 (500 ㎖)에 용해하였다. 암모늄 아세테이트 (14.8 g, 0.19 mole, 1.5 당량)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1시간동안 환류하고, 이어서 실온으로 냉각하고, 에테르 (1.2 ℓ)에 부었다. 용액을 4 ℃에서 72시간동안 방치하였다. 조 3-아미디노벤질-N-아세틸아미노말론산 디에틸 에스테르를 여과하고, 에테르로 세척하고, 공기 중에 건조하고, 이어서 진한 HCl (250 ㎖) 중에 3시간동안 환류하였다. 반응 혼합물을 진공하에 농축하고, 물 (0.5 ℓ)로 희석하고, 다시 진공하에 농축하였다. 이 단계들을 되풀이하였다. 표제 조화합물을 용출액으로서 0-1.0 N HCl의 구배를 사용하는 양이온 교환 (세파덱스 (Sephadex) SP-C25)으로 정제하여 회백색의 고형물로서 표제 화합물 10.8 g (수율 30%)를 얻었다.
C10H13N3O2·2HCl·1.9H2O 이론치: C, 38.20; H, 6.03; N, 13.36, 실측치: C, 38.51; H, 5.64; N, 12.89.
실시예 68
N-α-Boc-N-ω-4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐-3-아미디노-D,L-페닐알라닌의제조
3-아미디노-D,L-페닐알라닌 (실시예 67의 화합물) (4.00 g, 13 mmol)을 50%의 수성 디옥산 (20 ㎖)에 용해하였다. 중탄산나트륨 (3.38 g, 40 mmol)을 첨가하고, 이어서 디옥산 (4 ㎖) 중 디-t-부틸 디카르보네이트 (2.93 g, 13 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 18시간동안 교반하였다. 용액을 얼음 조에서 냉각하고, 이어서 용액이 pH 12가 될 때까지 4.0 N 수산화나트륨을 첨가하였다. 디옥산 (10 ㎖) 중 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐 클로라이드 (8.01 g, 32 mmol)를 적가하였다. 4.0 N 수산화나트륨을 pH 12를 유지하기 위해 필요한만큼 첨가하였다. 얼음 조를 제거하였다. 1시간 후, 1.0 N HCl을 첨가하여 용액의 pH 7-8이 되도록 하였다. 용액에 물 50 ㎖를 더 첨가하여 희석하고, 이어서 에틸 아세테이트로 2회 (각각 20 ㎖) 세척하였다. 수성층을 1.0 N HCl로 pH 1.0으로 산성화하고, 에틸 아세테이트로 3회 (총 100 ㎖) 추출하였다. 합친 유기층을 물 (20 ㎖) 및 염수 2회 (각각 10 ㎖) 세척하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘 상에서 건조하고, 용매를 진공하에 제거하였다. 잔류물을 디클로로메탄의 최소량에 용해하고, 이어서 에테르 (25 ㎖)에 적가하였다. 고체 불순물을 여과하여 제거하고, 용매를 진공하에 여액으로부터 제거하여 회백색의 발포체로서 표제 화합물 4.90 g (조수율 68%)을 얻었다. 표제 화합물의 시료 30 mg을 1% 아세트산/5% 이소프로판올/디클로로메탄으로 전개하는 예비 박층 크로마토그래피로 더 정제하여 더 순수한 발포체로서 표제 화합물 9 mg을 얻었다. Rf= 0.16 (1% 아세트산/5% 이소프로판올/디클로로메탄).
실시예 69
N-α-Boc-N-ω-4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐-3-아미디노-D,L-페닐알라닌-N-메틸-O-메틸-카르복사미드의 제조
얼음 조에서 냉각된 테트라히드로푸란 (4 ㎖) 중 실시예 68의 화합물 (1.00 g, 1.92 mmol), O,N-디메틸 히드록실아민 히드로클로라이드 (375 mg, 3.85 mmol), 히드록시벤조트리아졸 히드레이트 (294 mg, 1.92 mmol) 및 4-메틸모르폴린 (1.06 ㎖, 9.62 mmol)의 교반 용액에 EDC (406 mg, 2.12 mmol)를 첨가하였다. 얼음 조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (75 ㎖)로 희석하고, 물, 10% 시트르산, 물, 포화 중탄산나트륨 및 염수로 세척하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘 상에서 건조하고, 용매를 진공하에제거하였다. 표제 화합물 750 mg (수율 69%)을 단리하였다.
C27H38N4O7S·0.5H2O 이론치: C, 56.73; H, 6.88; N, 9.80, 실측치: C, 56.97; H, 6.66; N, 9.43.
실시예 70
N-α-Boc-N-ω-4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐-D,L-3-아미디노페닐알라니날의 제조
드라이아이스/아세톤 조로 냉각된 테트라히드로푸란 (8 ㎖) 중 LiAlH4(테트라히드로푸란 중 1.0 M 용액 2.00 ㎖, 1.24 mmol)의 교반 용액에 실시예 69의 화합물 (테트라히드로푸란 (5 ㎖) 중 0.75 g, 1.9 mmol)을 적가하였다. 냉각 조를 제거하고 반응 혼합물을 5 ℃로 가온하였다. 반응 혼합물을 드라이아이스/아세톤 조에서 재냉각하고, 1:2.7 중량/중량의 물 중 중황산칼륨의 용액 3.0 ㎖로 퀀칭하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 3시간동안 교반하고, 여과하고, 진공하에 농축하였다. 잔류물을 에틸 아세테이트 (20 ㎖)에 용해하고, 10% 시트르산 (2 ㎖), 물 (2 ㎖), 포화 중탄산나트륨 (2 ㎖) 및 염수 (2 ㎖)로 세척하였다. 유기층을 무수 황산마그네슘 상에서 건조하고, 용매를 진공하에 제거하여 표제 화합물 580 mg (86%)을 얻었다.
C25H33N3O6S·0.5H2O 이론치: C, 58.58; H, 6.69; N, 8.20, 실측치: C, 58.57; H, 6.72; N, 7.98.
실시예 71
N-α-Boc-N-ω-4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐-D,L-3-아미디노페닐알라니날-세미카르바조닐-4-N-디페닐메탄의 제조
실시예 70의 화합물 (0.58 g, 1.9 mmol), 실시예 65의 화합물 (410 mg, 1.15 mmol) 및 소듐 아세테이트 트리히드레이트 (188 mg, 1.38 mmol)를 75% 수성 에탄올 (10 ㎖)하에 1시간동안 환류하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각한 후, 에틸 아세테이트 (50 ㎖)로 희석하고, 1.0 N HCl (5 ㎖), 물 (5 ㎖), 포화 중탄산나트륨 (5 ㎖) 및 염수 (2 x 5 ㎖)로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조하였다. 용매를 진공하에 제거하여 회백색의 발포체로서 표제 화합물 750 mg (수율 89%)을얻었다. C39H46N6O6Sㆍ1.0H2O의 이론치: %C, 62.88; %H, 6.49; %N, 11.28. 실측치: %C, 63.14; %H, 6.35; %N, 11.10. 분자량 이론치는 726.90이었다.
실시예 72
N-ω-4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐-D,L-3-아미디노페닐알라니날-세미카르바조닐-4-N-디페닐메탄, 트리플루오로아세테이트 염의 제조
실시예 71의 화합물 (750 mg, 1.9 mmol)을 50% 트리플루오로아세트산/디클로로메탄 (3 ㎖)으로 실온에서 30분간 처리하였다. 반응 혼합물을 에테르 (50 ㎖)에 적가하였다. 용액을 4 ℃에서 18시간동안 방치하였다. 생성물을 여과하고, 진공하에 건조하여 회백색의 고체로서 표제 화합물 600 mg (수율 79%)을 얻었다. C34H38N6O4Sㆍ1.3CF3CO2H의 이론치: %C, 56.72; %H, 5.11; %N, 10.84. 실측치: %C, 56.34; %H, 5.47; %N, 11.49. 염의 분자량 이론치는 740.8이었다.
실시예 73
화합물 10-6의 제조
도 10의 화합물 10-6을 실시예 60에서의 t-부톡시카르보닐-4-(4-피리딜)알라닌의 대체와 함께 실시예 60 내지 64의 방법에 따라 제조하였다.
실시예 74
화합물 11-7의 제조
도 11의 화합물 11-7을 도 11에서 보이는 반응식에 따라 제조하였다.
실시예 75
화합물 12-5의 제조
도 12의 화합물 12-5를 도 12의 반응식에 따라 제조하였다.
실시예 76
i-부톡시카르보닐-D-(이소프로필옥시카르보닐)Ser-L-Ala-N g -니트로아르기니날-에틸 시클롤의 제조
얼음 조에서 냉각된 피리딘 (100 ㎖) 중 실시예 58의 화합물 (21.0 g, 42.9 mmol)의 용액에 이소프로필 클로로포르메이트 (톨루엔 중 1 M 용액 21 ㎖, 20 mmol, 5 당량)를 첨가하였다. 1시간 후, 반응의 완결 여부를 분석용 HPLC로 측정하였다. 반응 혼합물을 톨루엔 (300 ㎖)으로 희석하였다; 용매를 감압하에 제거하였다. 잔류물을 아세토니트릴 (400 ㎖)에 용해하고, 용매를 감압하에 제거하였다. 잔류물을 아세토니트릴 (30 ㎖) 및 에틸 아세테이트 (30 ㎖)에 용해하였다. 에테르를 첨가하고, 침전물을 단리하였다. 고체를 에테르로 세척하고, 이어서 진공으로 건조하였다. 고체를 에테르 및 에틸 아세테이트 (1:1 혼합물 2 x 200 ㎖)로 세척하고, 이어서 진공에서 건조하여 약간 황색을 띠는 회백색의 고체로서 수율 91%의 표제 화합물 22.4 g을 얻었다. HPLC: 1 ㎖/min의 유속에서 4.6 x 250 mm, 5 마이크론 입자, 100 Å 공극, C18 컬럼 상의 0.1%의 수성 TFA 완충액 중 5% 내지 75%의 아세토니트릴 구배에서 tr= 18.1 분.
실시예 77
i-부톡시카르보닐-D-(이소프로필옥시카르보닐)Ser-L-Ala-아르기니날-에틸 시클롤의 제조
탄소 상의 10% 팔라듐 (2.0 g)을 첨가하기 전에 에탄올:물:아세트산 (4:1:1 혼합물 450 ㎖) 중 실시예 76의 화합물 (11.0 g, 19 mmol)의 용액에 질소를 분사하였다. 이 혼합물을 2.4 atm (35 psi)에서 6시간동안 수소화하였다. 셀라이트를 첨가하고, 반응 혼합물을 여과하여 팔라듐을 제거하고, 용매를 진공하에 제거하여 황색의 검상 고체로서 실시예 78에 기술한 방법에 직접적으로 사용할 수 있는 표제 화합물을 얻었다. HPLC: 1 ㎖/min의 유속에서 4.6 x 250 mm, 5 마이크론 입자, 100 Å 공극, C18 컬럼 상의 0.1%의 수성 TFA 완충액 중 5% 내지 75%의 아세토니트릴 구배에서 tr= 13.1 분.
실시예 78
i-부톡시카르보닐-D-(이소프로필옥시카르보닐)Ser-L-Ala-아르기니날의 제조
아세토니트릴(20 ㎖) 중의 실시예 77의 화합물의 용액(19 mmol)을 6M HCl (60 ㎖)로 40분 동안 처리하였다. 이 반응 혼합물을 0℃로 냉각시킨 후 소듐 아세테이트(2.5 M 용액 240 ㎖)로 퀀칭하였다. 생성된 용액을 여과시킨 후 예비의 HPLC로 두 번으로 나누어 정제하였다. 0.1% TFA를 함유하는 5-40% 수성 아세토니트릴로 용출시킨 생성물을 함유하는 분획을 모아 동결건조시켜 백색 가루로서 표제 화합물 4.1 g을 얻었다. 세 개의 피크가 분석 HPLC에 의해 관찰되었다. HPLC: 1 ㎖/min의 유속에서 4.6 x 250 mm, 5 마이크론 입자, 100 Å 공극, C18 컬럼 상의 0.1%의 수성 TFA 완충액 중 5% 내지 50%의 아세토니트릴 구배에서 tr= 17.2, 18.2, 18.6분.
실시예 79
실시예 76 내지 78의 프로토콜을 따라, 이소프로필 클로로포메이트의 명기된 대체물로 하기의 화합물을 제조하였다.
화합물 이름 실시예 76의 대체물
i-부톡시카르보닐-D-((+)-메틸옥시카르보닐)Ser-L-Ala-아르기니날 (실시예 79A) (+)-메틸 클로로포메이트
i-부톡시카르보닐-D-(페녹시카르보닐)Ser-L-Ala-아르기니날 (실시예 79B) 페닐 클로로포메이트
i-부톡시카르보닐-D-((+)-메틸옥시카르보닐)Ser-L-Ala-아르기니날 (실시예 79A)
i-부톡시카르보닐-D-(페녹시카르보닐)Ser-L-Ala-아르기니날 (실시예 79B)
실시예 80
N-α-벤질옥시카르보닐-D-Ser(O-t-부틸)-L-Ala-t-부틸 에스테르의 제조
EDC(4.90 g, 25.5 mmol, 1.5 당량) 및 1-히드록시벤조트리아졸(2.60 g, 17 mmol)을 아세토니트릴(100 ㎖) 중의 N-α-Cbz-D-세린 t-부틸 에테르(5.02 g, 17 mmol)의 용액에 첨가하였다. 45분간 교반한 후, 알라닌 t-부틸 에스테르, HCl 염(3.55 g, 19.6 mmol, 1.15 당량) 및 4-메틸모르폴린(7.5 ㎖, 68 mmol, 4 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1.5시간 동안 교반하였다. TLC는 반응이 완료된 것을 나타내었다. 반응 혼합물을 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(100 ㎖)에 용해시킨 후, (각각 25 ㎖인) 1N 염산, 포화 중탄산나트륨, 물 그리고 염수로 연속적으로 세척하였다. 용매를 진공에서 제거하여 방치시 결정이 되는 오일을 얻었다. 표제 화합물(6.95 g)을 수율 97%로 엷은 황색의 고체로서 얻었다. Rf= 0.63(디클로로메탄 중 5% 이소프로판올).
실시예 81
D-Ser(O-t-부틸)-L-Ala t-부틸 에스테르의 제조
메탄올 중 실시예 80의 화합물(1.14 g, 2.69 mmol)의 용액을 풍선 압력에서 1.5시간 동안 수산화팔라듐(110 mg) 상에서 수소화하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 용매를 진공에서 제거하여 황색 오일로서 정량적 수율로 표제화합물을 얻었다. Rf= 0.44(디클로로메탄 중 5% 메탄올).
실시예 82
펜에틸술포닐-D-Ser(O-t-부틸)-L-Ala t-부틸 에스테르의 제조
얼음 조에서 냉각된 아세토니트릴(100 ㎖) 중의 실시예 81의 화합물(4.2 g, 14.6 mmol) 및 펜에틸술포닐 클로라이드(3.58 g, 17.5 mmol, 1.2 당량)의 교반 용액에 2,4,6-콜리딘(4.8 ㎖, 36.5 mmol, 2.5 당량)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온한 후, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 에틸 아세테이트(80 ㎖)에 용해시키고 생성된 용액은 1.0 N HCl, 포화 중탄산나트륨, 물 및 염수로 연속적으로 세척한 후, 황산나트륨 상에서 건조시켰다. 용매를 진공에서 제거하였다. 잔류물은 실리카 겔을 통해 0-60% 에틸 아세테이트/헥산으로 용출시켜 크로마토그래피하였다. 표제 화합물은 황색 오일로서 89% 수율로 단리되었다. Rf= 0.84(디클로로메탄 중 5% 메탄올).
실시예 83
펜에틸술포닐-D-Ser-L-Ala-N g -니트로아르기니날-에틸 시클롤의 제조
실시예 82의 화합물(4.16 g, 9.11 mmol)을 50% TFA/디클로로메탄(40 ㎖)으로 처리하였다. 3 시간 후, 반응 혼합물을 톨루엔(45 mmol)으로 희석하고, 용매를 감압하에 제거하였다. 잔류물을 아세토니트릴(40 ㎖) 중에 용해시켰다. 용매를 진공에서 제거하여 펜에틸술포닐-D-세린-L-알라닌(4.36 g)을 얻었다. Rf= 0.52(디클로로메탄 중 10% 이소프로판올).
조 펜에틸술포닐-D-세린-L-알라닌(이론상 9.11 mmol)을 아세토니트릴(90 ㎖) 중에 용해시켰다. 교반 용액을 얼음 조에서 질소 분위기하에 냉각시켰다. EDC(3.63 g, 18.9 mmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸(1.93 g, 12.6 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 5분간 교반하였다. N9-니트로아르기니날 에틸 시클롤, HCl 염(4.04 g, 15.1 mmol)을 첨가하였다. 10분 동안 교반 후, 냉각 조를 제거하고, 4-메틸모르폴린(5.54 ㎖, 50 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축시킨 후 에틸 아세테이트로 희석하였다. 용액을 1.0 N HCl, 포화 중탄산나트륨, 물 및 염수로 연속적으로 세척한 후, 황산나트륨 상에서 건조시키고 감압하에 농축시켰다. 합친 수성층을 에틸 아세테이트(25 ㎖)로 역추출하였다. 유기 층을 1.0 N HCl, 포화 중탄산나트륨, 물 그리고 염수로 연속적으로 세척한 후, 황산나트륨 상에서 건조하고, 감압하에 농축하였다. 추출 및 역추출로부터 합친 조생성물은 실리카 겔을 통해 디클로로메탄 중의 1-6% 에탄올을 사용하여 크로마토그래피하였다. 표제 화합물은 오렌지색 고체로서 단리되었다(3.25 g, 64% 수율). Rf= 0.83(디클로로메탄 중 10% 이소프로판올).
실시예 84
펜에틸술포닐-D-Ser-L-Ala-아르기니날의 제조
실시예 58 및 59에 기재된 수소화 및 가수분해의 두 단계 프로토콜을 따라, 표제 화합물을 흰 색 가루로 제조하였다. HPLC: 1 ㎖/min의 유속에서 4.6 x 250 mm, 5 마이크론 입자, 100 Å 공극, C18 컬럼 상의 0.1%의 수성 TFA 완충액 중 10% 내지 30%의 아세토니트릴 구배에서 tr= 15.6 및 17.8분. 질량 스펙트럼 (M + H) = 485.
실시예 85
펜에틸술포닐-D-(이소프로필옥시카르보닐)Ser-L-Ala-아르기니날의 제조
카보네이트의 형성, 실시예 76 내지 78에서 기술된 수소첨가 및 가수분해의 3 단계 포로토콜을 따라, 표제 화합물을 백색의 가루로 제조하였다. HPLC: 1 ㎖/min의 유속에서 4.6 x 250 mm, 5 마이크론 입자, 100 Å 공극, C18 컬럼 상의 0.1%의 수성 TFA 완충액 중 5% 내지 90%의 아세토니트릴 구배에서 tr= 12.6, 13.1 및 13.2분. 질량 스펙트럼 (M + H) = 571.
본 발명의 상세한 설명의 교시 및 실시예를 따르고 적합한 출발 물질 및 시약을 사용하여, 하기의 화합물을 만들었다.
N-α-(2-페닐에틸)술포닐-D-세릴-아제티딘-2-카르보닐-아르기니날,
벤질옥시카르보닐-D-세릴-4-히드록시프롤릴-아르기니날,및
벤질옥시카르보닐-D-세릴-3-트랜스-히드록시프롤릴-아르기니날.
본 발명의 상세한 기술의 설명 및 실시예를 따르고 적합한 출발 물질 및 시약을 사용하여, 하기의 화합물을 만들었다.
N-α-(2-페닐에틸)술포닐-D-세릴-3,4-디히드로프롤릴-아르기니날,
펜에틸옥시카르보닐-D-Ser-L-Ala-아르기니날,
펜에틸술포닐-D-Ser-L-프로파르길Gly-아르기니날,
3-펜프로필옥시카르보닐-D-Ser-L-Ala-아르기니날,
벤질아미노카르보닐-D-Ser-L-데히드로프롤릴-아르기니날,
펜에틸아미노카르보닐-D-Ser-L-Ala-아르기니날,
벤질아미노카르보닐-D-Ser-L-아제티딘-2-카르복시-아르기니날,
3-펜프로필아미노카르보닐-D-Ser-L-Ala-아르기니날,
시클로헥실메틸아미노카르보닐-D-Ser-L-데히드로프롤릴-아르기니날,
3-펜에틸아미노카르보닐-D-Ser-L-데히드로프롤릴-아르기니날,
시클로헥실메틸아미노카르보닐-D-Ser-L-아제티딘-2-카르복시-아르기니날,
3-펜프로필아미노카르보닐-D-Ser-L-아제티딘-2-카르복시-아르기니날,
펜에틸술포닐-D-Ser-L-데히드로프롤릴-아르기니날,
펜에틸술포닐-D-Ser-L-아제티딘-2-카르복시-아르기니날,
이소부톡시카르보닐-D-(에톡시카르보닐)-Ser-L-Ala-아르기니날,
이소부톡시카르보닐-D-(n-프로필옥시카르보닐)-Ser-L-Ala-아르기니날,
이소부톡시카르보닐-D-(n-부틸옥시카르보닐)-Ser-L-Ala-아르기니날,
이소부톡시카르보닐-D-(2-메톡시에톡시카르보닐)-Ser-L-Ala-아르기니날,
펜에틸술포닐-D-(에톡시카르보닐)-Ser-L-Ala-아르기니날,
펜에틸술포닐-D-(n-프로필옥시카르보닐)-Ser-L-Ala-아르기니날,
펜에틸술포닐-D-(n-부틸옥시카르보닐)-Ser-L-Ala-아르기니날, 및
펜에틸술포닐-D-(2-메톡시에톡시카르보닐)-Ser-L-Ala-아르기니날,
실시예 A
특이성 측정을 위한 체외 효소 분석 실험
본 발명의 화합물의 유로키나제 촉매 활성의 선택적인 억제제로서의 활동 능력은 이 효소의 활성화를 50%까지 억제하는 실험 화합물의 농도를 측정함으로써, (IC50), 그리고 이 수치를 하기의 관련된 세린 프로테아제들(재조합형 조직 플라스미노겐 활성화제(rt-PA), 혈장, 활성 단백질 C, 키모트립신, 인자 Xa, 트롬빈 및 트립신)의 일부 또는 모두의 측정된 수치와 비교함으로써 분석하였다.
모든 분석 실험에 사용한 완충제는 HBSA(10 mM 히피스(HEPES), pH 7.5, 150 mM 염화나트륨, 0.1% 소의 혈청 알부민)이었다.
IC50측정을 위한 분석 실험을 HBSA 50 ㎕, 코닝(Corning) 미세적정 플레이트의 적합한 웰에서, HBSA 중에서 희석된 (또는 VO(비제한 속도) 측정을 위해 HBSA 단독으로의) 특정 농도의 실험 화합물 50 ㎕, 및 HBSA 중에 희석된 효소 50 ㎕를 합침으로써 실시하였다. 주위 환경에서 30 분간 배양에 이어서, 하기에 명기된 농도의 기질 50 ㎕를 웰에 첨가하여, 200 ㎕(약 4배 Km)의 최종 전체 부피를 산출하였다. 색원체 기질 가수분해의 초기 속도를 써모 맥스 키네틱 미크로플레이트 리더(Thermo Max(등록상표) Kinetic Microplate Reader)로 5 분 기간에 걸쳐 첨가된 기질 5% 미만이 이용되는 405 nm에서의 흡광도 변화로 측정하였다. 가수분해 초기 속도의 50% 감소를 일으킨 첨가된 억제제의 농도를 IC50수치로 정의하였다.
유로키나제 분석 실험
유로키나제 촉매 활성은 디아파마 그룹사(DiaPharma Group, Inc.)로부터 구입한 색인체 기질 S-2444(L-피로글루타밀-글리실-L-아르기닌-p-니트로아닐린 히드로클로라이드) 150 mmol을 사용하여 측정하였다. 아보트 래보러토리스(Abbott Laboratories)에 의해 제조되는 유로키나제(아보키나제(Abbokinase))는 프리오리티 파마슈티칼스(Priority Pharmaceuticals)로부터 구입하였고 사용 전에 HBSA 분석 실험 완충제 중에 750 pM으로 희석시켰다. 분석 실험 완충제는 0.1% BSA가 있는 HBS(10 mM 히피스, 150 mM 염화나트륨 pH 7.4)였다.
트롬빈 (fIIa) 분석 실험
효소 활성화를 색원체 기질, Pefachrome t-PA(CH3SO2-D-헥사히드로티로신-글리실-L-아르기닌-p-니트로아닐린, 펜타팜사(Pentapharm Ltd.)로부터 구입)를 사용하여 측정하였다. 기질을 사용 전 탈이온수 중에서 재구성하였다. 정제된 인간 α-트롬빈은 엔자임 리써치 래보러토리스사(Enzyme Research Laboratories, Inc.)로부터 구입하였다. 모든 분석 실험에 사용한 완충제는 HBSA(10 mM 히피스, pH7.5, 150 mM 염화나트륨, 0.1% 소의 혈청 알부민)이다.
IC50측정을 HBSA(50 ㎕), α-트롬빈(50 ㎕)(최종 효소 농도 0.5 nM) 및 억제제(50 ㎕)(넓은 농도 범위에 걸침)를 적합한 웰에서 합치고 기질 Pefachrome t-PA(50 ㎕)(최종 기질 농도는 250 μM, 약 5배 Km)를 첨가하기 전에 30 분 간 실온에서 배양하여 실시하였다. Pefachrome t-PA 가수분해의 초기 속도를 써모 맥스(등록상표) 키네틱 미크로플레이트 리더로 5 분 기간에 걸쳐 첨가된 기질 5% 미만이 이용되는 405 nm에서의 흡광도 변화로 측정하였다. 가수분해 초기 속도의 50% 감소를 일으킨 첨가된 억제제의 농도를 IC50수치로 정의하였다.
인자 Xa
인자 Xa 촉매 활성을 디아파마 그룹(미국 오하이오주 프랭클린 소재)으로부터 구입한 색인체 기질 S-2765(N-벤질옥시카르보닐-D-아르기닌-L-글리신-L-아르기닌-p-니트로아닐린)을 사용하여 측정하였다. 모든 기질을 사용 전 탈이온수 중에서 재구성하였다. S-2765의 최종 농도는 250 μM(약 5배 Km)이었다. 정제된 인간 인자 X는 엔자임 리써치 래보러토리스사(미국 인디애나주 싸우스 밴드 소재)로부터 구입하였고, 문헌(Bock, P. E., Craig, P. A., Olson, S. T., 및 Singh, P., Arch. Biochem. Biophys.273: 375-388 (1989))에 기술된 바와 같이 인자 Xa(FXa)를 이 정제된 인간 인자 X로부터 활성화하고 제조하였다. 효소는 분석 실험 전 HBSA 중에서 희석시켜 최종 농도가 0.25 nM이었다.
재조합 조직 플라스미노겐 활성화제(rt-PA) 분석 실험
rt-PA 촉매 활성을 Pefachrome t-PA(CH3SO2-D-헥사히드로티로신-글리실-L-아르기닌-p-니트로아닐린, 펜타팜사로부터 구입)을 사용하여 측정하였다. 분석 실험 전에 기질을 탈이온수 중에서 만들고 이어서 HBSA 중에서 희석하여 최종 농도가 500 μM(약 3 배 Km)였다. 인간 rt-PA(액티베이스(Activase 등록상표))는 게넨테크사(Genentech Inc.)로부터 구입하였다. 효소를 탈이온수 중에서 재구성하고, 분석 실험 전 HBSA 중에서 희석시켜 최종 농도가 1.0 nM이었다.
플라스민 분석 실험
플라스민 촉매 활성을 디아파마 그룹으로부터 구입한 색인체 기질 S-2366(L-피로글루타밀-L-프롤릴-L-아르기닌-p-니트로아닐린 히드로클로라이드)을 사용하여 측정하였다. 분석 실험 전에 기질을 탈이온수 중에서 만들고 이어서 HBSA 중에서 희석하여 최종 농도가 300 μM(약 2.5 배 Km)였다. 정제된 인간 플라스민은 엔자임 리써치 래보러토리스사로부터 구입하였다. 효소는 분석 실험 전 HBSA 중에서 희석시켜 최종 농도가 1.0 nM이었다.
활성화된 단백질 C(aPC) 분석 실험
aPC 촉매 활성을 색인체 기질, Pefachrome PC(δ-카르보벤질옥시-D-리신-L-프롤릴-L-아르기닌-p-니트로아닐린 디히드로클로라이드, 펜타팜사로부터 구입)을 사용하여 측정하였다. 분석 실험 전에 기질을 탈이온수 중에서 만들고 이어서 HBSA 중에서 희석하여 최종 농도가 400 μM(약 3 배 Km)였다. 정제된 인간 aPC는 헤마톨로직 테크놀로지스사(Hematologic Technologies, Inc.)로부터 구입하였다.효소는 분석 실험 전 HBSA 중에 희석시켜 최종 농도가 1.0 nM이었다.
키모트립신 분석 실험
키모트립신 촉매 활성을 디아파마 그룹으로부터 구입한 색인체 기질 S-2586[메톡시-숙시닐-L-아르기닌-L-프롤릴-L-티로실-p-니트로아닐리드)을 사용하여 측정하였다. 분석 실험 전에 기질을 탈이온수 중에서 만들고 이어서 HBSA 중에서 희석하여 최종 농도가 100 μM(약 9 배 Km)였다. 정제된 (3X-결정화됨, CDI) 소의 췌장의 α-키모트립신은 워싱톤 바이오케미칼사(Worthington Biochemical Corp.)로부터 구입하였다. 효소를 분석 실험 전 탈이온수 중에서 재구성하고 HBSA 중에서 희석시켜 최종 농도가 0.5 nM이었다.
트립신 분석 실험
트립신 촉매 활성을 디아파마 그룹으로부터 구입한 색인체 기질 S-2222(벤조일-L-이소류신-L-글루탐산-[γ-메틸 에스테르]-L-아르기닌-p-니트로아닐리드)를 사용하여 측정하였다. 분석 실험 전에 기질을 탈이온수 중에서 만들고 이어서 HBSA 중에서 희석하여 최종 농도가 250 μM(약 4 배 Km)였다. 정제된 (3X-결정화됨, TRL3) 소의 췌장의 트립신은 워싱톤 바이오케미칼사로부터 구입하였다. 효소를 분석 실험 전 탈이온수 중에서 재구성하고 HBSA 중에서 희석시켜 최종 농도가 0.5 nM이었다.
표 Ⅰ
표 Ⅰ은 다른 세린 프로테아제에 비해 유로키나제 억제에 대한 높은 특이성도를 보이는, 본 발명의 화합물에 대해 상기 열거된 효소 중 몇 개의 효소에 대한측정된 IC50수치를 열거하였다.
화합물 실시예 uPA* tPA* 플라스민*
1 835-4054-61 A D C
2 9 A C C
3 10 A D NT
4 10 A D NT
5 10 A D NT
6 10 A D NT
7 10 A D NT
8 10 A D NT
9 10 A D NT
10 11 A D NT
11 12 A D C
12 12 A D C
13 12 B D NT
14 12 A D NT
15 12 B D NT
16 12 B D NT
17 12 B D NT
A = 100 nm 미만B = 100 내지 250 nmC = 250 내지 2500 nmD = 2500 nm 초과NT = 시험하지 않음
화합물 실시예 uPA* tPA* 플라스민*
18 12 C D NT
19 13 A D C
20 13 B D NT
21 13 B NT NT
22 13 C D NT
23 13 C D NT
24 14 B NT NT
25 14 B NT NT
26 15 B D NT
27 15 B D A
28 16-20 A D C
29 21-26 A D C
30 27-34 B D C
31 46 A NT C
32 47-50 A D C
35 10 C D D
36 10 A D C
A = 100 nm 미만B = 100 내지 250 nmC = 250 내지 2500 nmD = 2500 nm 초과NT = 시험하지 않음
화합물 실시예 uPA* tPA* 플라스민*
37 10 B D D
38 10 B D D
39 10 C D D
40 10 A D D
41 16 C D C
42 16 B D B
43 16 C D C
44 51 C D C
45 52 B D C
46 52 A D C
47 51 A D C
48 51 A D C
49 52 A D C
50 52 A D B
51 52 A D C
52 52 B D C
53 53 A D C
A = 100 nm 미만B = 100 내지 250 nmC = 250 내지 2500 nmD = 2500 nm 초과NT = 시험하지 않음
실시예 B
체내 혈관 형성 억제제로서의 화합물 1의 평가
닭의 CAM(병아리 태아 융모요막) 모델, 표준 혈관 형성 분석 실험을 화합물 1의 혈관 형성 억제력을 평가하는데 사용하였다. 이 모델은 새로운 혈관의 형성에 미치는 실험 화합물의 활성화의 평가를 위한 설정된 모델이다.
혈관 형성을 유도하기 위해 염기성 섬유아세포 성장 인자의 용액 0.5 ㎍/㎖로 포화된 여과 디스크를 10 일 된 병아리 배의 CAM 위에 놓았다. 24 시간 후, 무균 PBS의 전체 부피 100 ㎕ 중의 화합물 0 내지 1 ㎍을 정맥내 주사를 통해 배에 주사하였다. 약 48 시간 후, 배를 희생시키고 여과 디스크 및 주변의 CAM 조직을 분석을 위해 절제하였다. 여과기의 제한된 범위 내의 혈관 분기점의 수를 셈으로써 혈관 형성을 정량하였다[Brooks P. C., 등, Methods in Molecular Biology120: 257-269 (1999)]. 혈관 형성 지수는 실험군과 비처리된 대조용 태아 사이의 혈관 분기점 수의 차이로 정의된다. 각각의 실험군은 8 내지 10 닭의 배를 함유하였다. 본 실험에서 화합물 1의 1 ㎍의 단일 투여는 혈관 형성을 92%까지 억제하였다.
화합물 1에 의한 시토킨-유도 혈관 형성의 억제
처리 혈관 분기점의 수 혈관 형성 지수
없음 13 +/- 2 0
bFGF 39 +/- 8 26
bFGF, 0.001 ㎍ 화합물 1 35 +/- 5 22
bFGF, 0.01 ㎍ 화합물 1 21 +/- 5 8
bFGF, 1.0 ㎍ 화합물 1 15 +/- 1 2
실시예 C
닭의 태아 모형에서 인간 종양 세포의 성장 억제에 대한 화합물 1의 평가
체내에서 인간 종양 세포의 성장을 억제하는 화합물 1의 활성화를 평가하기 위해 닭의 태아 모형을 사용하였다. 40 ㎕의 전체 부피 중 4 ×105세포를 함유하는, 인간 섬유육종 세포의 단일 세포 현탁액(HT 1080)을 브룩스(Brooks) 등("Brooks, P. C., 등, "Integrin αvβ3Antagonists Promote Tumor Regression by Inducing Apoptosis of Angiogenic Blood Vessels", Cell79: 1157-1164 (1994))에 의해 기술된 바와 같이 10 일 된 닭의 배에 적용하였다. 24 시간 후 화합물 1의 0 내지 10 ㎍을 정맥내 주사를 통해 배에 주사하였다. 화합물의 상기 단일 투여에 이어서, 대조용 및 처리된 배를 총 7일 동안 배양한 후 희생시켰다. 종양을 절단하고 주변의 CAM 조직을 제하고 잘라냈으며 중량을 측정하였다. 표 III에는 상기 실험에서 절단된 종양의 젖은 상태의 중량이 열거되어 있다. 각각의 실험군은 10 내지 12 닭의 배를 함유하였다. 화합물 1의 10 ㎍의 단일 투여는 종양 중량을 65%까지 감소시켰다.
화합물 1에 의한 닭의 태아 내에서 HT1080 세포 성장의 억제
처리 젖은 상태의 중량(mg)
대조군 273 +/- 49
화합물 1(1 ㎍) 174 +/- 25
화합물 1(10 ㎍) 97 +/- 15

Claims (70)

  1. 하기 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용가능한 염.
    <화학식 I>
    상기 화학식에서,
    (a) X는 -S(O)2-, -N(R')-S(O)2-, -(C=O)-, -OC(=O)-, -NH-C(=O)-, -P(O)(R')- 및 직접 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 R'는 독립적으로 수소, 탄소 원자수 1 내지 약 4의 알킬, 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴, 또는 탄소 원자수 약 7 내지 약 16의 아랄킬이되, 단 X가 -P(O)(R')-일 경우 R'는 수소가 아니며,
    (b) R1은
    (1) 임의로는 Y1이 치환되는 탄소 원자수 1 내지 약 12의 알킬,
    (2) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 5 내지 약 8의 시클로알킬로 치환된 탄소 원자수 1 내지 약 3의 알킬,
    (3) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는탄소 원자수 3 내지 약 15의 시클로알킬,
    (4) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 S(O)i(여기서, i는 0, 1 또는 2임)로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 4 내지 약 10의 헤테로시클로알킬,
    (5) 임의로는 고리 탄소에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되고, 고리 탄소 원자수 3 내지 6의 5 내지 7원 헤테로사이클인(여기서, V는 -CH2-, -O-, -S(=O)-, -S(O)2- 또는 -S-임)를 포함하는, 산소, 질소 및 S(O)i(여기서, i는 0, 1 또는 2임)로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 4 내지 약 10의 헤테로시클로,
    (6) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 5 내지 약 8의 시클로알킬로 임의로 치환되는 탄소 원자수 2 내지 약 6의 알케닐,
    (7) 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환된 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴,
    (8) 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아릴,
    (9) 임의로는 아릴 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 7 내지 약 15의 아랄킬,
    (10) 임의로는 알킬 사슬에 히드록시 또는 할로겐이 치환되고, 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아랄킬,
    (11) 임의로는 아릴 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 8 내지 약 16의 아랄케닐,
    (12) 임의로는 고리 탄소에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아랄케닐,
    (13),
    (14),
    (15),
    (16),
    (17) 탄소 원자수 약 9 내지 약 15의 융합 카르보시클릭 알킬,
    (18) 디플루오로메틸 또는 탄소 원자수 1 내지 약 12의 퍼플루오로알킬,
    (19) 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 퍼플루오로아릴,
    (20) 탄소 원자수 약 7 내지 약 15의 퍼플루오로아랄킬, 및
    (21) 수소(X가 직접 결합일 경우)로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    여기서, Y1, Y2및 Y3각각은 독립적으로 선택되고,
    (i) 할로겐, 시아노, 니트로, 테트라졸릴, 구아니디노, 아미디노, 메틸구아니디노, -CF3, CF2CF3, -CH(CF3)2, -C(OH)(CF3)2, -OCF3, -OCF2H, -OCF2CF3, -OC(O)NH2, -OC(O)NHZ1, -OC(O)NZ1Z2, -NHC(O)Z1, -NHC(O)NH2, -NHC(O)NZ1, -NHC(O)NZ1Z2, -C(O)OH, -C(O)OZ1, -C(O)NH2, -C(O)NHZ1, -C(O)NZ1Z2, P(O)3H2, -P(O)3(Z1)2, -S(O)3H, -S(O)mZ1, -Z1, -OZ1, -OH, -NH2, -NHZ1, -NZ1Z2, -N-모르폴리노, -S(CF2)qCF3및 -S(O)m(CF2)qCF3로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 m은 0, 1 또는 2이고, q는0 내지 5의 정수이고, Z1및 Z2는 독립적으로 탄소 원자수 1 내지 약 12의 알킬, 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴, 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아릴, 탄소 원자수 약 7 내지 약 15의 아랄킬, 및 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아랄킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는
    (ii) Y1및 Y2는 -O[C(Z3)(Z4)]rO-가 되도록 함께 선택되며, 여기서 r은 1 내지 4의 정수이고, Z3및 Z4는 독립적으로 수소, 탄소 원자수 1 내지 약 12의 알킬, 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴, 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아릴, 탄소 원자수 약 7 내지 약 15의 아랄킬, 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아랄킬로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    (c) R2는 H, -CH3, -C2H5, -(CH2)2OH, -(CH2)2OA2, -CH(R6)OH, -CH(R6)OA2및 -CH2NH-X'-R6으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 A2는 -C(=O)OR9또는 -C(=O)R9이고, X'는 -S(O)2-, -S(O)2-N(R")-, -(C=O)-, -C(=O)-O-, -C(=O)-NH-, P(O)(R")-(여기서, R"는 수소, 탄소 원자수 1 내지 약 4의 알킬, 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴 또는 탄소 원자수 약 7 내지 약 16의 아랄킬이되, 단 X'가 -P(O)(R")-일 경우 R"는 수소가 아님) 및 직접 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R6은
    (1) 임의로는 Y1이 치환되는 탄소 원자수 1 내지 약 12의 알킬,
    (2) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 5 내지 약 8의 시클로알킬로 치환된 탄소 원자수 1 내지 약 3의 알킬,
    (3) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 3 내지 약 15의 시클로알킬,
    (4) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 S(O)i(여기서, i는 0, 1 또는 2임)로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 4 내지 약 10의 헤테로시클로알킬,
    (5) 임의로는 고리 탄소에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되고, 고리 탄소 원자수 3 내지 6의 5 내지 7원 헤테로사이클인(여기서, V는 -CH2-, -O-, -S(=O)-, -S(O)2- 또는 -S-임)를 포함하는, 산소, 질소 및 S(O)i(여기서, i는 0, 1 또는 2임)로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 4 내지 약 10의 헤테로시클로,
    (6) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 5 내지 약 8의 시클로알킬로 임의로 치환되는 탄소 원자수 2 내지 약 6의 알케닐,
    (7) 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴,
    (8) 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아릴,
    (9) 임의로는 아릴 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 7 내지 약 15의 아랄킬,
    (10) 임의로는 알킬 사슬에 히드록시 또는 할로겐이 치환되고, 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아랄킬,
    (11) 임의로는 아릴 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 8 내지 약 16의 아랄케닐,
    (12) 임의로는 고리 탄소에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아랄케닐, 및
    (13) 수소로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R9는
    (1) 임의로는 Y1이 치환되는 탄소 원자수 1 내지 약 12의 알킬,
    (2) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 5 내지 약 8의 시클로알킬로 치환된 탄소 원자수 1 내지 약 3의 알킬,
    (3) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 3 내지 약 15의 시클로알킬,
    (4) 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 S(O)i(여기서, i는 0, 1 또는 2임)로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 4 내지 약 10의 헤테로시클로알킬,
    (5) 임의로는 고리 탄소에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되고, 고리 탄소 원자수 3 내지 6의 5 내지 7원 헤테로사이클인(여기서, V는 -CH2-, -O-, -S(=O)-, -S(O)2- 또는 -S-임)를 포함하는, 산소, 질소 및 S(O)i(여기서, i는 0, 1 또는 2임)로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 4 내지 약 10의 헤테로시클로,
    (6) 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴,
    (7) 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아릴,
    (8) 임의로는 아릴 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 탄소 원자수 약 7 내지 약 15의 아랄킬,
    (9) 임의로는 알킬 사슬에 히드록시 또는 할로겐이 치환되고, 임의로는 고리에 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 산소, 질소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자 및 탄소로부터 선택된 고리 원자수 약 5 내지 약 14의 헤테로아랄킬, 및
    (10) 수소로 이루어진 군으로부터 선택되되, 단 A2가 -C(=O)OR9일 경우 R9는 수소가 아니고,
    (d) R3은 H 또는 메틸로부터 선택되거나, 또는 R3및 R4는 (f)에 설명된 것과 같이 함께 선택되고,
    (e) R4는 S 배위로 존재하고, H, -CH2-S-CH3, -CH2OH, -CH2CN, 탄소 원자수 1 내지 약 3의 저급 알킬, -CH2C≡CH, -CH2CH=CH2및 -CH=CH2로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3및 R4는 (f)에 설명된 것과 같이 함께 선택되고,
    (f) 또는, R3및 R4는 S 배위로 존재하여 프롤릴, 피페콜릴, 아제티딘-2-카르보닐, 4-히드록시프롤릴, 3-히드록시프롤릴 및 3,4-데히드로프롤릴로 이루어진 군으로부터 선택된 P2에서 기를 가지도록 함께 선택되며,
    (g) R5는및로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 R7은,,,및(여기서, d는 1 내지 3의 정수이고, W는 -N- 또는 -CH-임)로부터 선택되고,
    (h) A1은 -NHR8이고, 여기서 R8은 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는, 탄소 원자수 1 내지 약 12의 알킬, 탄소 원자수 약 6 내지 약 14의 아릴 또는 탄소 원자수 약 6 내지 약 15의 아랄킬이거나, 또는 수소이다.
  2. 제1항에 있어서, R5가인 화합물.
  3. 제2항에 있어서, R7이인 화합물.
  4. 제3항에 있어서, d가 2인 화합물.
  5. 제4항에 있어서, R2가 H, -CH3, -CH2CH3, -CH2NH(X')(R6) 또는 -CH(R6)OH인 화합물.
  6. 제5항에 있어서, R6이 수소, 임의로는 Y1이 치환되는 알킬, 또는 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 아랄킬인 화합물.
  7. 제6항에 있어서, R2가 H, -CH2OH 또는 -CH(CH3)OH인 화합물.
  8. 제7항에 있어서, R2가 -CH(CH3)OH이고 R 배위를 가지는 화합물.
  9. 제7항에 있어서, R3이 수소인 화합물
  10. 제9항에 있어서, R4가 메틸 또는 프로파르길인 화합물.
  11. 제7항에 있어서, R3및 R4가 프롤릴, 피페콜릴, 아제티딘-2-카르보닐, 4-히드록시프롤릴, 3-히드록시프롤릴 및 3,4-데히드로프롤릴로 이루어진 군으로부터 선택된 P2에서 기를 가지도록 함께 선택되는 화합물.
  12. 제11항에 있어서, R3및 R4가 프롤릴, 4-시스-히드록시프롤릴, 3,4-데히드로프롤릴 및 아제티딘-2-카르보닐로 이루어진 군으로부터 선택된 P2에서 기를 가지도록 함께 선택되는 화합물.
  13. 제5항에 있어서, R6이 H인 화합물.
  14. 제1항에 있어서, X가 -S(O)2-, -OC(=O)-, -NH-C(=O)- 및 직접 결합으로부터 선택되는 화합물.
  15. 제14항에 있어서, X가 -S(O)2- 또는 -OC(=O)-인 화합물.
  16. 제15항에 있어서, R1이 페닐, 벤질, 2-페닐에틸, 이소부틸 및 3-페닐프로필로부터 선택되는 화합물.
  17. 제16항에 있어서, R1-X-가 페닐-S(O)2-, 벤질-S(O)2-, 2-페닐에틸-S(O)2-, 3-페닐프로필-S-(O)2-, 벤질-OC(=O)- 및 이소부틸-OC(=O)-로부터 선택되는 화합물.
  18. 제1항에 있어서, R2가 수소, 메틸, 에틸, -CH2NH(X')(R6) 및 -CH(R6)OH로부터 선택되는 화합물.
  19. 제18항에 있어서, R6이 수소, 임의로는 Y1이 치환되는 알킬, 및 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 아랄킬로부터 선택되는 화합물.
  20. 제19항에 있어서, R2가 글리실, D-세릴, (R,R)D-알로트레오닐, D-2-아미노부티릴, N-β-메틸옥시카르보닐-D-2,3-디아미노프로피오닐, N-β-(2-페닐에틸카르보닐)-D-2,3-디아미노프로피오닐, 및 N-β-벤질옥시카르보닐-D-2,3-디아미노프로피오닐로부터 선택된 P3에서 기를 가지도록 선택되는 화합물.
  21. 제20항에 있어서, P3이 D-세릴 또는 (R,R)D-알로트레오닐인 화합물.
  22. 제1항에 있어서, R3이 수소인 화합물.
  23. 제1항에 있어서, R4가 메틸 또는 프로파르길인 화합물.
  24. 제1항에 있어서, R3및 R4가 프롤릴, 피페콜릴, 아제티딘-2-카르보닐, 4-히드록시프롤릴, 3-히드록시프롤릴 및 3,4-데히드로프롤릴로부터 선택된 P2에서 기를 가지도록 함께 선택되는 화합물.
  25. 제24항에 있어서, R3및 R4가 프롤릴, 4-시스-히드록시프롤릴, 3,4-데히드로프롤릴 및 아제티딘-2-카르보닐로부터 선택된 P2에서 기를 가지도록 함께 선택되는 화합물.
  26. 제1항에 있어서, R2가 D-세릴 및 (R,R)D-알로트레오닐로부터 선택된 P3에서 기를 가지도록 선택되고, R5는 P1에서 아르기닌 알데히드를 가지도록 선택되는 화합물.
  27. 제26항에 있어서, R3이 수소이고, R4가 메틸인 화합물.
  28. 제26항에 있어서, R3및 R4가 프롤릴, 아제티딘-2-카르보닐 및 3,4-데히드로프롤릴로부터 선택된 P2에서 기를 가지도록 함께 선택되는 화합물.
  29. 제1항에 있어서, R5가인 화합물.
  30. 제1항에 있어서,
    로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물.
  31. 제7항에 있어서, R2가 -CH2OH이고 R 배위를 가지는 화합물.
  32. 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용가능한 염.
  33. 제1항에 있어서, R2가 -(CH2)2OA2또는 -CH(R6)OA2인 화합물.
  34. 제33항에 있어서, R2가 -CH(R6)OA2인 화합물.
  35. 제34항에 있어서, R6이 수소, 임의로는 Y1이 치환되는 알킬, 및 임의로는 Y1, Y2및(또는) Y3이 일치환, 이치환 또는 삼치환되는 아랄킬로부터 선택되는 화합물.
  36. 제35항에 있어서, R2가 아실 및 D-세릴의 카르보네이트 에스테르로부터 선택된 P3에서 기를 가지도록 선택되는 화합물.
  37. 제36항에 있어서, R3이 수소인 화합물.
  38. 제37항에 있어서, R4가 메틸 또는 프로파르길인 화합물.
  39. 제36항에 있어서, R3및 R4가 프롤릴, 피페콜릴, 아제티딘-2-카르보닐, 4-히드록시프롤릴, 3-히드록시프롤릴 및 3,4-데히드로프롤릴로부터 선택된 P2에서 기를 가지도록 함께 선택되는 화합물.
  40. 제1항에 있어서, R2가 아실 및 D-세릴의 카르보네이트 에스테르로부터 선택된 P3에서 기를 가지도록 선택되고, R5는 P1에서 아르기닌 알데히드를 가지도록 선택되는 화합물.
  41. 제40항에 있어서, R3이 수소이고, R4는 메틸인 화합물.
  42. 제40항에 있어서, R3및 R4가 프롤릴, 아제티딘-2-카르보닐 및 3,4-데히드로프롤릴로부터 선택된 P2에서 기를 가지도록 함께 선택되는 화합물.
  43. 제4항에 있어서, R2가 -(CH2)2OA2또는 -CH(R6)OA2인 화합물.
  44. 제4항에 있어서, R2가 아실 및 D-세릴의 카르보네이트 에스테르로부터 선택된 P3에서 기를 가지도록 선택되는 화합물.
  45. 제29항에 있어서, R2가 H, -CH3, -CH2CH3, -CH2NH(X')(R6) 또는 -CH(R6)OH인 화합물.
  46. 제29항에 있어서, R2가 -(CH2)2OA2또는 -CH(R6)OA2인 화합물.
  47. 제약상 허용가능한 담체 및 치료 유효량의 제1항에 기재된 화합물을 포함함을 특징으로 하는 제약 조성물.
  48. 제약상 허용가능한 담체 및 치료 허용량의 제4항에 기재된 화합물을 포함함을 특징으로 하는 제약 조성물.
  49. 제약상 허용가능한 담체 및 치료 허용량의 제12항에 기재된 화합물을 포함함을 특징으로 하는 제약 조성물.
  50. 제약상 허용가능한 담체 및 치료 허용량의 제17항에 기재된 화합물을 포함함을 특징으로 하는 제약 조성물.
  51. 제약상 허용가능한 담체 및 치료 허용량의 제21항에 기재된 화합물을 포함함을 특징으로 하는 제약 조성물.
  52. 제약상 허용가능한 담체 및 치료 허용량의 제24항에 기재된 화합물을 포함함을 특징으로 하는 제약 조성물.
  53. 제약상 허용가능한 담체 및 치료 허용량의 제26항에 기재된 화합물을 포함함을 특징으로 하는 제약 조성물.
  54. 제약상 허용가능한 담체 및 치료 허용량의 제30항에 기재된 화합물을 포함함을 특징으로 하는 제약 조성물.
  55. 제약상 허용가능한 담체 및 치료 유효량의 제32항에 기재된 화합물을 포함함을 특징으로 하는 제약 조성물.
  56. 제약상 허용가능한 담체 및 치료 유효량의 제33항에 기재된 화합물을 포함함을 특징으로 하는 제약 조성물.
  57. 제약상 허용가능한 담체 및 치료 유효량의 제40항에 기재된 화합물을 포함함을 특징으로 하는 제약 조성물.
  58. 치료 유효량의 제1항에 기재된 화합물을 유로키나제 활성을 억제 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료를 요하는 포유 동물에게 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 상기 포유 동물에 유로키나제 활성을 억제하거나 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료 방법.
  59. 치료 유효량의 제4항에 기재된 화합물을 유로키나제 활성을 억제 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료를 요하는 포유 동물에게 투여하는 것을 포함함을특징으로 하는 상기 포유 동물에 유로키나제 활성을 억제하거나 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료 방법.
  60. 치료 유효량의 제12항에 기재된 화합물을 유로키나제 활성을 억제 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료를 요하는 포유 동물에게 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 상기 포유 동물에 유로키나제 활성을 억제하거나 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료 방법.
  61. 치료 유효량의 제17항에 기재된 화합물을 유로키나제 활성을 억제 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료를 요하는 포유 동물에게 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 상기 포유 동물에 유로키나제 활성을 억제하거나 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료 방법.
  62. 치료 유효량의 제21항에 기재된 화합물을 유로키나제 활성을 억제 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료를 요하는 포유 동물에게 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 상기 포유 동물에 유로키나제 활성을 억제하거나 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료 방법.
  63. 치료 유효량의 제24항에 기재된 화합물을 유로키나제 활성을 억제 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료를 요하는 포유 동물에게 투여하는 것을 포함함을특징으로 하는 상기 포유 동물에 유로키나제 활성을 억제하거나 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료 방법.
  64. 치료 유효량의 제26항에 기재된 화합물을 유로키나제 활성을 억제 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료를 요하는 포유 동물에게 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 상기 포유 동물에 유로키나제 활성을 억제하거나 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료 방법.
  65. 치료 유효량의 제30항에 기재된 화합물을 유로키나제 활성을 억제 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료를 요하는 포유 동물에게 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 상기 포유 동물에 유로키나제 활성을 억제하거나 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료 방법.
  66. 치료 유효량의 제32항에 기재된 화합물을 유로키나제 활성을 억제 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료를 요하는 포유 동물에게 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 상기 포유 동물에 유로키나제 활성을 억제하거나 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료 방법.
  67. 치료 유효량의 제32항에 기재된 화합물을 혈관 형성의 감소 또는 억제를 요하는 포유 동물에 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 상기 포유 동물에 혈관형성을 감소시키거나 또는 억제하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 혈관 형성이 병리학상 증상과 관련있는 방법.
  69. 치료 유효량의 제33항에 기재된 화합물을 유로키나제 활성을 억제 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료를 요하는 포유 동물에게 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 상기 포유 동물에 유로키나제 활성을 억제하거나 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료 방법.
  70. 치료 유효량의 제40항에 기재된 화합물을 유로키나제 활성을 억제 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료를 요하는 포유 동물에게 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 상기 포유 동물에 유로키나제 활성을 억제하거나 또는 감소시킴으로써 호전되는 증상의 치료 방법.
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