CZ2001276A3

CZ2001276A3 - Inhibitory urokinázy a farmaceutický prostředek, který je obsahuje

Info

Publication number: CZ2001276A3
Application number: CZ2001276A
Authority: CZ
Inventors: Terence K Brunck; Susan Y Tamura
Original assignee: Corvas International
Priority date: 1999-07-22
Filing date: 1999-07-22
Publication date: 2001-06-13

Abstract

Popisují se nové sloučeniny, které mají inhibiční aktivitu vůči urokináze a jsou aktivní při snížení nebo inhibici tvorby cév. Tyto sloučeniny obsahují argininovou nebo argininaldehydovou skupinu nebo argininketoamidovou skupinu v pozici Pl. Tyto sloučeniny jsou vhodné in vitro pro monitorování hladin aktivátoru plasminogenu a in vivo pro léčení onemocnění, která se mohou zlepšit inhibici nebo snížením aktivity urokinázy a pro léčení patologických stavů, při kterých vznik cév souvisí s patologickým stavem.

Description

Oblast techniky

Urokináza je enzym, který se účastní metastázování nádorových buněk, neovaskularizace a dalších pochodů. Jedním z cílů podle předkládaného vynálezu je získání nových sloučenin, které jsou aktivními inhibitory urokinázy, které lze použít pro inhibici aktivity urokinázy a tak tlumit její negativní účinky. Dalším cílem podle předkládaného vynálezu je získání nových sloučenin, které inhibují neovaskularizaci, zejména neovaskularizaci spojenou s patologickými stavy.

Dosavadní stav techniky

Aktivátor plasminogenu urinárního typu (uPA; urokináza) je serinová proteáza ze skupiny trypsin/chymotrypsin. Ve fyziologickém stavu se uPA nalézá ve třech formách: proforma pro-uPA s jednoduchým řetězcem, uPA se dvěma řetězci a nízkomelukární uPA (postrádá N-koncové domény). Zymogen pro-uPA je převeden na u-PA rozštěpením peptidické vazby v pozici K158-I159. Vzniklý uPa se dvěma řetězci spojenými disulfidickými můstky má relativní molární hmotnost kolem 50 kD a C-koncovou serin-proteinázovou doménu.

Aktivita uPA je po navázání na svůj receptor uPAR zaměřena na povrch buňky. uPAR je membránový receptor s jedním řetězcem zakotvený na glykosylfosfatidylinositol (GPI). 92 N-koncových aminokyselin uPAR hraje důležitou roli při vazbě na uPA a pro-uPA. Receptor pro uPA byl lokalizován na T-buňkách, NK buňkách, monocytech a neutrofilech i na buňkách svalového endotelu, fibroblastech, buňkách hladké svaloviny, keratinocytech,

trofoblastech placenty, hepatocytech a na velké škále nádorových buněk.

Po přeměně pro-uPA na uPA, ke které primárně dochází na uPAR na povrchu buňky, aktivuje uPA plasminogen na plasmin. K aktivaci, dochází po štěpení na zbytcích PGR-W u lidskéh plasminogenu nebo na zbytcích SGR-IV telecího plasminogenu. Protože je i plasminogen přítomen na povrchu buňky, je tato aktivační kaskáda u-PA a plasminu zaměřena na plasmovou membránu. Plasmin má řadu rolí včetně aktivace další uPA a dalších enzymů, trávení fibrinu a trávení složek extracelulární matrice (ECM). Trávení ECM obklopující nádor odstraní ECM jako fyzikální bariéru metastázujících buněk, které pak mohou volně opustit primární nádor a napadnout sekundární místa. Přehled o roli systému uPA/uPAR u metastázy nádoru poskytuje práce The Urokinase-type Plasminogen Activator System in Cancer Metastasis: A Review, Areasen a další, Int. J. Canc. 72; 1-22 (1997).

Korelace mezi vysokou hladinou uPA a rychlou metastázou a špatnou prognózou byla publikována u některých druhů rakoviny, zejména prsu [Quax a další, J. Cell Biol. 115:191-199 (1991); Duffy a další, Cancer Res. 50: 6827-6829 (1990)]. Například u rakoviny plic (Oka a další, Cancer Res. 51:3522-3525 (1991)), močového měchýře [Hasui a další, Int. J. Cancer 50: 871-873 (1992)], žaludku [Nekarda a další, Lancet 343:117 (1994)], hrtanu [Kobayashi a další, Cancer Res. 54:6539-6548 (1994)), vaječníků (Kuhn a další, Cynecol. Oncol. 55:401-409 (1994)), ledvin [Kofmann a další, Cancer 78:487-492 (1996)], mozku [Bmdahl a další, J. Neuro-Oncol. 22:101-110 (1994)] a sarkomu měkkých tkání [Choong a další, Int. J. Cancer (Před. Oncol.) 69: 268-272 (1996)] byla nalezena vysoká hladina uPA a/nebo aktivita uPA a vysoká rychlost metastázy. U nadprodukce uPA byla publikována jako in vivo výsledek zvýšená kosterní metastáza rakovinnými buňkami prostaty [Achbarou a další, Cancer Res.

:2372-2377 (1994) ] .

U inhibice nebo snížení aktivity uPA, nebo porušení/inhibice interakce mezi uPA a jejím receptorem (uPAR) byl popsán pozitivní účinek na zachování extracelulární matrice a inhibiční efekt na metastázu [Ossowski a Reich, Cell 35: 611-619 (1983); Ossowski, Cell 52: 321-328 (1988); Ossowski, J. Cel Biol. 107: 2437-2445 (1988); Wilhelm a další, Clin. Exp. Metastasis 11: 296-302 (1995); Achbarou a další, Cancer Res. 54: 2372-2377 (1994); Crowley a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 50215025 (1993); Kock a další, EMBO J. 13: 3983-3991 (1994)]. Výsledky těchto experimentálních studií naznačuji, že aktivace plasminogenu katalyzovaná uPA omezuje rychlost progrese nádoru, lokální invaze nádoru a/nebo tvorby vzdálené metastázy [Areasen a další, Int. J. Canc. 72:1-22 (1997)] .

Účinky uPA systému na pohyb buněk a. invazi se považují za následek proteolytického účinku plasminem ovlivněné degradace extracelulární matrice a přímé interakce uPA receptoru se složkami extracelulární matrice. Degradace extracelulární matrice umožňuje metastazujicim buňkám přestoupit matrici, přičemž interakce mezi receptorem uPA a samotnou matricí pomáhá buňkám v migraci. Lokalizace systému uPA/plasmin na povrchu buňky nebo čelo metastazujících buněk souhlasí s předpokládanou rolí uPA v metastáze [Plesner a další, Stem Cells 15: 398-408 (1997)] .

Interakce uPAR s vitronektinem (složka extracelulární matrice) ovlivňuje adhezi buněk a může stoupnout, pokud je uPAR navázán k uPA. Adhezní molekuly buněčného povrchu (integriny) se zřejmě také účastní této adhezní funkce, zejména se jedná o β-l a β-2

integriny [Paysant a další, Br. J. Haematol. 100:45-51 (1998); Simon a další, Blood 88:3185-3194 (1996)]. CDllb/CD18 integrin se může asociovat s komplexem uPA-uPAR a podpořit adhezi buněk nesoucích tyto receptory, např. neutrofilů a leukocytů.

Systém uPA/uPAR se účastní rovněž vzniku nových cév nebo neovascularizace.

Ustavení nové vaskulatury je potřebné udržení primárního růstu i pro růst metastázovaného nádoru. Patologická neovaskularizace je také charakteristická pro retinální choroby, rubeosis iritis, proliferativní vitreoretinopatické zánětlivé choroby, diabetickou retinopatii, chronickou uveitidu, Fuchsovu heterochromní iridocyklitidu, neovaskulární glaukom, neovaskularizaci rohovky nebo optického nervu, cévní choroby, pterygium, porucha hojení po operaci glaukomu, hyperkeratosu, tvorbu cheloidů a polypů (viz. EP 451 130) . Při následujících chorobách rovněž může dojít k nežádoucí angiogenezí (nebo může být výsledkem následujících aktivit): degenerace pih, retinopatie prematurity, odmítnutí transplantované rohovky, retrolentální fibroplasie, epidemická keratokonjunktivitida, nedostatek vitaminu A, následky používání kontaktních čoček, atopická keratitida, vyšší limbická keratitida, pterygium keratitis sicca, Sogrensova choroba, akné rosacea, fylektenulosa, syfilida, mykobakteriální infekce kromě leprosy, lipidová degenerace, chemické popáleniny, bakteriální nebo mykotické vředy, Herpes simplex nebo infekce zoster, infekce protozoa, Kaposiho sarkom, Moorenův vřed, Terrienova marginální degenerace, marginální kerato lýza, trauma, revmatoidní artritida, systémový lupus, polyarteritida, Wegenerova sarkoidosa, sleritida, Steven-Johnsonova choroba, radiální keratotomie, anemie srpovitých buněk, sarkoid, pseudoxantoma elasticum, Pagetova choroba, žilní nebo tepenná okluze, zanesení krkavice, chronická uveitida, chronická vitritida, Lymeova choroba, Ealesova choroba, Bechetova choroba, myopie, optické prohlubně, Stargartova choroba, pars planitis, chronické odchlípnutí sítnice, hyperviskozitní syndromy, toxoplasmosy, postlaserové komplikace, abnormální proliferace fibrovaskulární tkáně, hemangioma, Osler-Wever-Rendu, pevné nádory, nádory vzniklé v krvi, AIDS, oční neovaskulární choroba, osteoartritida, chronické záněty, Crohnova choroba, vředová kolitida, nádory rhabdomyosarkomu, nádory retinoblastomu, nádory Ewingova sarkomu, nádory neuroblastomu, nádory osteosarkomu, leukemie, psoriasa, atherosklerosa, pemfigoid, které jsou uvedeny v U.S. patentu 5,712,291.

Antagonisté vazby uPA/uPAR (doména EGF-typu uPA kondenzovaná k Fc komplexu IgG) se uvádí jako inhibiry neovaskularizace a růstu myšího B16 melanomu (Min a další, Cancer Res. 56: 24282433 (1996). Konsistentní s tímto tvrzením je korelace mezi hustotou vlásečnic, vaskulární invazí a hladinou uPA u rakoviny prsu [Hildenbra a další, Brit. J. Cancer 72: 818-823 (1995)]. Známý inhibitor uPA amilorid byl rovněž označen jako inhibitor různých neovaskularizačních patologických stavů (Glaser a další, EP 451,130; Avery a další, Arch. Ophthalmol. 108: 1474-1476 (1990) ] .

Existují dva primární fyziologické inhibitory uPA. Jsou to PAI-1 a PAI-2, což jsou zástupci skupiny serpinů z proteinasových inhibitorů. Vazba serpinů na jejich příslušné proteázy zahrnuje dlouhou řadu interakcí mezi aminokyselinami každého proteinu včetně těch, které jsou v aktivním místě serpinů PAI-1 (Ser-Ala-Arg-Met-Ala; identifikační číslo sekvence 1) a PAI-2 (Thr-Gly-Arg-Thr-Gly; identifikační číslo sekvence 2). Při zavedení exogenní PAI-2 pokusným zvířatům se uvádí inhibice rych6

• · · · · · · losti plicní metastáze [Evans a Lin, Amer. Surg. 61: 692-697 (1995); Mueler a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92: 205-209 (1995)]. Schopnost PAI-1 inhibovat metastázi dosud nebyla prokazatelně dokázána. Gen pro PAI-1 (prostředek jeho recombinační exprese) je uveden v patentu Loskutoff a další, U.S. patent 4,952,512. Rekombinační a přirozený lidský PAI-2 je uveden v patentu Stefens a další, U.S. patent 5,422,090.

Nejvíce studované inhibitory uPA jsou ze skupiny 4-substituovaných benzo[b]thiofen-2-karboxamidinových inhibitorů, mezi něž patří B428 (4-jodbenzo[b]thiofen-2-karboxamidin) a B623 [Towle a další, Cancer Res. 53: 2553-2559 (1993); Bridges a další, Bioorg. Med. Chem. 1: 403-410 (1993); Bridges a další, U.S. patent 5,340,833]. U infuze B428 pokusným krysám inokulovaným nádorovými buňkami byla uvedena inhibice exprese genu uPAR, snížení objemu primárního nádoru a omezení metastáze [Xing a další, Cancer Res. 57:3585-3593 (1997)]. U denního intraperitoneálního léčení myší s nádorem pomocí B428 nebo B623 bylo uvedeno blokování metastáze do svalů a tuku, ale nedošlo k inhibici nádorem vyvolané angiogeneze nebo omezení rychlosti spontánní plicní metastáze. Dokonce B623 zvýšil plicní metastázi [Alonso a další, Breast Cancer Res. Treat. 40: 209-223 (1996)]. Infuze B428 v a syngenovém modelu rakoviny prostaty u krys také vedla ke snížení objemu a hmotnosti primárního nádoru a redukci metastáze [Rabbani a další, Int. J. Cancer 63: 840-845 (1995)].

Mezi další známé inhibitory uPA patří p-aminobenzamidin, což je kompetitivní inhibitor uPA, a amilorid. U obou sloučenin, byla dokázána redukce velikosti nádoru u pokusných zvířat (Jankan a další, Cancer Res. 57: 559-563 (1997); Bilstrom a další, Int. J. Cancer 61: 542-547 (1995). V současnosti byla u epigalokatecin-3-galátu (EGCG) a polyfenolu ze zeleného čaje popsána vazba

na uPA a inhibice její aktivity [Jankun a další, Nátuře 387: 561 (1997)]. Autoři uvádí, že EGCG je slabší inhibitor uPA než amilorid, ale zároveň předpokládají, že EGCG může být používán ve značně větších dávkách, než amilorid bez toxického efektu. Pye a další v U.S. patentu 4,165,258 uvádí jako kompetitivní inhibitor uPA α-N-benzylsulfonyl-p-aminofenylalanin.

Jiný přístup k inhibici systému uPA/uPAR zahrnuje vývoj bifunkční hybridní molekuly obsahující uPAR-vazebnou doménu uPA a PAI-2, která má inhibovat uPA a in vitro vázat uPAR [Balance a další, Eur. J. Biochem. 207: 177-183 (1992)]. Také byly studováni antagonisté uPAR [Doyle a Rosenberg, U.S. patent 5,656,726; Min a další, Cancer Res. 56: 2428-2433 (1996)], jako protismyslné oligonukleotidy komplementární k uPA (Wilhelm a další, Clin. Exp. Metast. 13: 296-302 (1995); Iversen a

Scholar, U.S. patent 5,552,390). V patentu Dano a další, U.S. patent 5,519,120 jsou uvedeny protilátky proti uPAR a jejich inhibice vazby uPA na uPAR. Mezi malé molekuly s inhibicí urokinázy kromě řady dalších serinových proteáz patří látky uvedené v patentu Abe a další: U.S. patent 5,508,385 a U.S. patent 5,153,176 a Takano a další: J. Pharmacol. Exp. Therapeut. 271: 1027-1033 (1994).

Také byly vyvinuty sloučeniny pro přímou inhibici vazby uPA na uPAR [Crowley a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 5021-5025 (1993); Goodson a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:

7129-7133 (1994); Kobayashi a 537-544 (1993); Int. J. Cancer Chem. 270: 8361-8366 (1995); Lu (1994) a FEBS Lett. 380: 21-24 ( další: Brit. J. Cancer 67:

57: 727-733 (1994); J. Biol.

a další, FEBS Lett. 356: 56-59 1996)].

Dále je substrátem uPA faktor pro-hepatocytového růstu (HGF), což je protein stimulující migraci buněk [Naldinie a další,

EMBO J. 11: 4825-4833 (1992)] . Také bylo posáno přímé štěpení 66kDa extracelulárního matricového proteinu a fibronektinu pomocí uPA, což napovídá o přímější roli uPA při pomoci buněčné migraci [Quigley a další, Proč. Nati. Acad. Sci. 84: 2776-2780 (1987)] . Proto může inhibice uPA ovlivnit i tyto aktivity.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu jsou nové peptidové aldehydy a ketoamidy. Peptidové aldehydické sloučeniny mají v pozici PÍ arginin nebo argininový motiv. Ketoamidové sloučeniny mají v pozici PÍ argininketoamidovou skupinu. Tyto sloučeniny mají aktivitu jako silné inhibitory urokinázy, a proto jsou vhodné pro snížení jejích negativních účinků. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou aktivní při inhibici neovaskularizace zejména spojené s patologickými procesy.

Proto v jednom z aspektů poskytuje předkládaný vynález sloučeniny obecného vzorce I:

R,

R;

N

O

Rj

R_e kde (a) X je vybráno ze skupiny, kterou tvoří skupina -S(O)₂-, skupina -N(R') -S(O)₂-, skupina -(C=O)-, skupina -00(=0)-, skupina -NH-C(=O)-, skupina -P(O)(R') - a přímá vázba, kde R' je nezávisle vybrán ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku nebo arylalkylová skupina obsahující 7 až 16 atomů uhlíku,s výhradou, že pokud X je skupina -P(O) CR')-, pak R' není atom vodíku;

• · · · · · · • · · · · (b) R_l je ze skupiny, kterou tvoří (1) alkylová skupina obsahující 1 až 12 atomů uhlíku, která je popřípadě substituovaná skupinou Y_x, (2) alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku substituovaná cykloalkylovou skupinou obsahující 5 až 8 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y_x, Y₂ a/nebo Y₃, (3) cykloalkylová skupina obsahující 3 až 15 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y_1; Y₂ a/nebo Y₃, (4) heterocykloalkylová skupina obsahující 4 až 10 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku nebo heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a skupina S(O)_t, kde i je 0, 1 nebo 2, která je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y_x, Y₂ a/nebo Y₃, (5) heterocyklus 4 až 10 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku nebo heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a skupina S(0)_x, kde i je 0, 1 nebo 2, včetně — Ν V —Ν V , kde je 5 až 7-členný heterocyklus obsahující 3 až 6 kruhových atomů uhlíku, kde V je skupina -CH₂-, skupina -0-, skupina -S(=O)-, skupina -S(O)₂- nebo skupina -S-, který je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaný na kruhu skupinami Y₃, Y₂ a/nebo Y₃, (6) alkenylová skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku , která je popřípadě substituovaná cykloalkylovou skupinou obsahující 5 až 8 atomu uhlíku, která je popřípadě mono-, dinebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y_x, Y₂ a/nebo Y₃, (7) arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y₃, Y₂ a/nebo Y₃, (8) heteroarylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, a která je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y_lz Y₂ a/nebo Y₃, (9) arylalkylová skupina obsahující 7 až 15 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y_x, Y₂ a/nebo Y₃, (10) heteroarylalkylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, a která je popřípadě substituovaná na alkylovém řetězci hyxdroxyskupinou nebo atomem halogenu a popřípadě mono-, dinebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y_lř Y₂ a/nebo Y₃, (11) arylalkenylová skupina obsahující 8 až 16 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y_x, Y₂ a/nebo Y₃, (12) heteroarylalkenylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, a která je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y₁₍ Y₂ a/nebo Y₃,

• · (17) připojená karbocyklická alkylová skupina obsahující 9 až 15 atomů uhlíku;

(18) difluormethylová nebo perfluoralkylová skupina obsahující 1 až 12 atomů uhlíku;

(19) perfluorarylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku;

(20) perfluorarylalkylová skupina obsahující -7 až 15 atomů uhlíku; a (21) atom vodíku, pokud X je přímá vazby;

kde každé Y_x, Y₂ a Y₃ je nezávisle vybrané (i) ze skupiny, kterou tvoří atom halogenu, kyanoskupina, nitroskupina, tetrazolylová skupina, guanidinoskupina, amidinoskupina, methylguanidinoskupina, skupina -CF₃, skupina -CF₂CF₃, skupina -CH(CF₃)₂, skupina -C(OH) (CF₃)₂, skupina -OCF₃, skupina -OCF₂H, skupina -OCF₂CF₃, skupina -OC(O)NH₂, skupina -OC(O)NHZ_X, skupina -OC(O)NZ_XZ₂, skupina -NHC(O)Z_X, skupina -NHC(O)NH₂, skupina -NHC(O)NZ_X, skupina -NHC (O) NZ_XZ₂, skupina -C(O)OH, skupina -C(O)OZ_lz skupina -C(O)NH₂, skupina -C(O)NHZ_X, skupina -C(O)NZ_XZ₂, skupina -P(O)₃H₂, skupina -P(O)₃(Z_X)₂, skupina -S(O)₃H, skupina -S(O)_raZ_lz skupina -Z_lz skupina -0Z_x, skupina -OH, sku12

pina -NH₂, skupina -NHZ_X, skupina -NZ_XZ₂, -N-morfolinoskupina, skupina -S(CF₂)_qCF₃ a skupina -S (0) _ra (CF₂) _qCF₃, kde m je 0, 1 nebo

2, q je celé číslo od 0 do 5 a Z_x a Z₂ jsou nezávisle vybrané ze skupiny, kterou tvoří alkylová skupina obsahující 1 až 12 atomů uhlíku, arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku, heteroarylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, arylalkylová skupina obsahující 7 až 15 atomů uhlíku a heteroarylalkylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, nebo (ii) Y_x a Y₂ dohromady tvoří skupinu -O[C(Z₃) (Z₄)]_r0-, kde r je celé číslo od 1 do 4 a Z₃ a Z₄ jsou nezávisle vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 12 atomů uhlíku, arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku, heteroarylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, arylalkylová skupina obsahující 7 až 15 atomů uhlíku a heteroarylalkylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů;

(c) R₂ je vybrán ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku, skupina -CH₃, skupina -C₂H₅, skupina -(CH₂)₂OH, skupina -(CH₂)₂OA₂, skupina -CH(R_S)OH, skupina -CH(R_S)OA₂ a skupina -CH₂NH-X'-R₆, kde A₂ je skupina -C(=O)OR₉ nebo skupina -C(=O)R_g; X' je vybrán ze skupiny, kterou tvoří skupina -S(0)₂-, skupina -S (0) ₂-N(R'')-, skupina -(C=0)-, skupina -C(=0)-0-, skupina -C(=0)-NH-, skupina -P(0) (R')- a přímá vazba, kde R je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku nebo arylalkylová skupina obsahující 7 až 16 atomů uhlíku s výhradou, že pokud X' je skupina -P(0) (R) -, pak R' není atom vodíku; R_s je vybrán ze skupiny, kterou tvoří:

• · · · · ··· ··· ·· · · · a · a a a a a aa ·· aaa· ·· · (1) alkylová skupina obsahující 1 až 12 atomu uhlíku, popřípadě substituovaná skupinou Y_1Z (2) alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku substituovaná cykloalkylovou skupinou obsahující 5 až 8 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, (3) cykloalkylová skupina obsahující 3 až 15 _atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y_lz Y₂, a/nebo Y₃, (4) heterocykloalkylová skupina obsahující 4 až 10 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atomy kyslíku, dusíku a skupina S(0)_iz kde i je 0, 1 nebo 2, která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, (5) heterocyklus obsahující 4 až 10 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a skupina S(O)_lZ kde i je 0, 1 nebo 2, — Ν V —/ včetně skupiny , kde je 5 až 7-členný heterocyklus obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, kde V je skupina -CH₂-, skupina -0-, skupina -S(=O)-, skupina -S(O)₂- nebo skupina -S-, který je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y,, Y₂, a/nebo Y₃, (6) alkenylová skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, která je popřípadě substituovaná cykloalkylovou skupinou obsa• · · · · · *· • ···· · · · • · · · · · · · hující 5 až 8 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, (7) arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku, která je popřípadě mono·-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, (8) heteroarylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, a která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, (9) arylalkylová skupina obsahující 7 až 15 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na arylovém kruhu skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, (10) heteroarylalkylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, která je popřípadě na alkylovém řetězci substituovaná hydroxyskupinou nebo atomem halogenu a popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y₃, Y₂, a/nebo Y₃, (11) arylalkenylová skupina obsahující 8 až 15 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, (12) heteroarylalkenylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, a která'je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, a (13) atom vodíku; a

R₉ je vybrán ze skupiny, kterou tvoří:

(1) alkylová skupina obsahující 1 až 12 atomů uhlíku popřípadě substituovaná skupinou Y_i; (2) alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku substituovaná cykloalkylovou skupinou obsahující 5 až 8 atomů uhlíku, která je popřípadě na kruhu mono-, di-, nebo trisubstituovaná skupinou Y₂, Y₂, a/nebo Y,, (3) cykloalkylová skupina obsahující 3 až 15 atomů uhlíku, která je popřípadě na kruhu mono-, di-, nebo trisubstituovaná skupinou Y_1Z Y₂, a/nebo Y₃, (4) heterocykloalkylová skupina obsahující 4 až 10 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a skupina S(0)_lZ kde i je 0, 1 nebo 2, která je popřípadě na kruhu mono-, di-, nebo trisubstituovaná skupinou Y₂, Y₂, a/nebo Y₃, (5) heterocyklus obsahující 4 až 10 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku nebo heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a skupina S(O)_iz kde i je 0, 1, nebo 2, — N V —N V včetně skupiny , kde je 5 až 7-členný heterocyklus obsahující 3 až 6 kruhových atomů, kde V je skupina -CH₂-, skupina -0-, skupina -S(=0)-, skupina -S(0)₂- nebo skupina -S-, která je popřípadě na kruhu mono-, di-, nebo trisubstituovaná skupinou Y_lz Y₂, a/nebo Y₃, ·« ·· ·· «99« 9 * · • · ♦ · · • ·· (6) arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku, která je popřípadě na kruhu mono-, di-, nebo trisubstituovaná skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, (7) heteroarylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, a která je popřípadě na kruhu mono-, di-, nebo trisubstituovaná skupinou Y_lř Y₂, a/nebo Y₃, (8) arylalkylová skupina obsahující 7 až 15 atomů uhlíku, která je popřípadě na arylovém kruhu mono-, di-, nebo trisubstituovaná skupinou Y_1Z Y₂, a/nebo Y₃, (9) heteroarylalkvlová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku nebo heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, a která je popřípadě substituovaná na alkylovém řetězci hydroxyskupinou nebo atomem halogenu a popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na kruhu skupinou Y₃, Y₂, a/nebo Y₃, a (10) atom vodíku, s výhradou, že R_g není atom vodíku, pokud A₂ j e skupina -C(=O)OR₉;

(d) R₃ je vybrán ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku nebo methylová skupina, nebo R. a R₄ jsou vybrány, jak uvádí bod (f);

(e) R₄ je v S konfiguraci a je vybrán ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku, skupina -CH₂-S-CH₃, skupina -CH₂OH, skupina -CH₂CN, ·· « · ·· β· • ···· ··· • · · ·· · · · • · · ·· ···· »· · · · nižší alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku, skupina -CH₂C=CH, skupina -CH₂CH=CH₂ a skupina -CH=CH₂ nebo R₃ a R₄ jsou vybrány, jak je uvedeno v bodu (f);

(f) alternativně jsou R₃ a R₄ spolu vybrány tak, že jsou v S konfiguraci a tvoří v pozici P2 skupinu z množiny, kterou tvoříprolylová skupina, pipecholylová skupina, azetidin-2-karbonylová skupina, 4-hydroxyprolylová skupina, 3-hydroxyprolylová skupina a 3,4-dehydroprolylová skupina;

(g) R_s je vybrán ze skupiny, kterou tvoří

H

a kde R₇ je vybrán ze skupiny, kterou tvoří

kde d je' celé číslo od 1 do 3 a W je skupina -N- nebo skupina -CH-; a (h) A_x je skupina -NHR_a, kde R_a je alkylová skupina obsahující 1 až 12 atomů uhlíku, arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku nebo arylalkylová skupina obsahující 6 až 15 atomů uhlíku, všechny popřípadě mono-, di- nebo tri-substituované skupinou Y_1Z Y₂ a/nebo Y₃, nebo je atom vodíku; a jejich farmaceuticky upotřebitelné soli.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu lze fragmentovat na la a lb:

:ia)

(lb) kde X, R_x, R₂, R₃, R₄, R₇ a A_x jsou definované u vzorce I. Tak je fragmentem sloučeniny vzorce I označeným jako P_x nebo Pl skupina

Fragmentem sloučeniny vzorce I označeným jako P₂ nebo P2 skupina

R4

Fragmentem skupina sloučeniny vzorce I označeným jako P₃ nebo P3 je

U peptidylargininových aldehydů, je popsáno, že se ve vodném roztoku vyskytují v rovnovážných strukturách. Bajusz S. a dal-, ší, J. Med. Chem. 33: 1729 (1990). Tyto struktury jak je popsáno níže zahrnují argininaldehyd A, aldehydhydrát B a dvě aminocyklol formy C a D. Skupina R reprezentuje zbytek dané sloučeniny popsaný provedením předkládaného vynálezu. Peptidové aldehydy podle předkládaného vynálezu zahrnují všechny rovnovážné formy.

C(NH₂)₂ .NH

H ;C(NH₂)₂•N H ^R OH

Kromě jiných faktorů je předkládaný objevu, že nové sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou aktivní jako inhibitory urokinázy. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu vykazují aktivitu při inhibici angiogeneze.

V dalším aspektu se předkládaný vynález týká farmaceutických prostředků obsahuj ících therapeuticky účinné množství sloučenin podle předkládaného vynálezu a farmaceuticky upotřebitelný nosič.

vynález založen na našem

V dalším aspektu se předkládaný vynález týká způsobů použití sloučenin a farmaceutických prostředků podle předkládaného vynálezu pro inhibici urokinázy.

Definice

Pokud není uvedeno jinak, mají termíny použité podle předkládaného vynálezu následující význam:

Termín „alkenylová skupina je nenasycená alifatická skupina obsahující alespoň jednu dvojnou vazbu.

Termín „alkylová skupina je nasycená alifatická skupina včetně lineárních, rozvětvených a cyklických (včetně polycyklických) skupin.

Termín „alkoxyskupina a „alkoxylová skupina je skupina vzorce R-Ο-, přičemž R je alkylová skupina.

Termín „alkoxykarbonylová skupina je skupina vzorce -C(O)OR, přičemž R je alkylová skupina.

Termín „arylalkenylová skupina je alkenylová skupina substituovaná arylovou skupinou. Výhodná alkenylová skupina obsahuje 2 až 6 atomů uhlíku.

Termín „arylalkylová skupina je alkylová skupina substituovaná arylovou skupinou. Vhodné arylalkylová skupiny jsou benzylová skupina, fenethylová skupina apod., z nichž všechny mohou být popřípadě substituované. Výhodná alkylová skupina obsahuje 1 až 6 atomů uhlíku.

Termín „arylová skupina je aromatická skupina, která má alespoň jeden kruhový π elektronový systém a zahrnuje karbocyklickou arylovou skupinu, heterocyklickou arylovou skupinu a biary21 lovou skupinu, z nichž všechny mohou být popřípadě substituované .

Termín „arvloxyskupina je skupina vzorce R-0-, kde R je arylová skupina.

Termín „arylalkoxyskupina je skupina vzorce R-0-, kde R je arylalkylová skupina.

Termín „aminokyselina znamená přírodní i syntetickou aminokyselinu v jejích D a L stereoisomerních formách, pokud její struktura umožňuje takové stereoisomerní formy a její analoga. Mezi přírodní aminokyseliny patří alanin (Ala), arginin (Arg), asparagin (Asn), aspartová kyselina (Asp), cystein (Cys), glutamin (Gin) , glutamová kyselina (Glu) , glycin (Gly) , histidin (His) , isoleucin (Ile) , leucin (Leu) , lysin (Lys) , methionin (Met), fenylalanin (Phe), prolin (Pro), serin (Ser), threonin (Thr) , tryptofan (Trp) , tyrosin (Tyr) a valin (Val) . Mezi syntetické aminokyseliny patří (ale nejen) azetidinkarboxylová kyselina, 2-aminoadipová kyselina, 3-aminoadipová kyselina, β-alanin, aminopropionová kyselina, 2-aminomáselná kyselina, 4-aminomáselná kyselina, 6-aminokapronová kyselina, 2-aminoheptanová kyselina, 2-aminoisobutanová kyselina, 3-aminoisobutanová kyselina, 2-aminopimelová kyselina, 2,4 diaminoisobutanová kyselina, demosin, 2,2'-diaminopimelová kyselina, 2,3-diaminopropionová kyselina, N-ethylglycin, N-ethylasparagin, hydroxylysin, allohydroxylysin, 3-hydroxyprolin, 4-hydroxyprolin, isodesmosin, alioisoleucin, N-methylglycin, N-methylisoleucin, N-methylvalin, norvalin, norleucin, ornithin a pipecolová kyselina. Aminokyselinová analoga zahrnují přírodní a syntetické aminokyseliny, které jsou chemicky blokované (reversibilně nebo irreversibilnš) nebo modifikované na jejich N-koncové aminoskupině nebo jejich skupinách v postranním řetězci jako * · « ♦ « * · · · · · • « » · · * · ·· · ϊίϊ⁴ίί.·*ϊϊϊ • ·· ·» ·· ···· ·· ··· například methioninsulfoxid, methioninsulfon, S-(karboxymethyl)cystein, S-(karboxymethyl)cysteinsulfoxid a S-(karboxymethyl)cysteinsulfon.

Termín „analog aminokyseliny je aminokyselina, kde je C-koncová karboxylová skupina, N-koncová aminoskupina nebo funkční skupina postranního řetězce chemicky modifikovaná na jinou funkční skupinu. Například beta-methylester aspartové kyseliny je aminokyselinový analog aspartové kyseliny; N-ethylglycin je aminokyselinový analog glycinu; nebo alaninkarboxamid je aminokyselinový analog alaninu.

Termín „aminokyselinový zbytek znamená zbytek struktury:

(1) -C(O)-R-NH-, kde R je typicky -CH(R')-, kde R' je atom vodíku nebo uhlíkatý substituent; nebo f~j^CH2)p

Ϊ (2) , kde p je 1, 2 nebo 3, representující zbytek azetidinkarboxylové kyseliny, prolinu nebo pipekolové kyseliny.

Termín „biarylová skupina je fenylová skupina substituovaná karbocyklickým nebo heterocyklickým arylovým zbytkem v poloze ortho, meta nebo para k místu připojení fenylového kruhu.

„Solanka je vodný nasycený roztok chloridu sodného.

Termín „karbocyklická arylová skupina je aromatická skupina, kde jsou kruhovými atomy aromatického kruhu atomy uhlíku. Karbocvklické arylové skupiny zahrnují monocyklické karbocyklické arylové skupiny a naftylové skupiny, z nichž všechny mohou být popřípadě substituované. Vhodné karbocyklické arylové skupiny zahrnují fenylovou a naftylovou skupinu. Vhodné substituované karbocyklické arylové skupiny jsou indenová a fenylová skupina

substituovaná jedním nebo dvěma substituenty jako je výhodně nižší alkylová skupina, hydroxyskupina, nižší alkoxyskupina, nižší alkoxykarbonylová skupina, atom halogenu, trifluormethylová skupina, difluormethylová skupina, nitroskupina a kyanoskupina. Substituovaný naftyl je naftylová skupina, výhodněji 1- nebo 2-naftylová skupina substituovaná zbytky Y_x, Y₂ a/nebo Y₃ definovanými u vzorce I výše.

Termín „cykloalkenylová skupina je cyklická alkenylová skupina. Vhodné cykloalkenylové skupiny jsou například cyklopentenylová a cyklohexenylová skupina.

„Cykloalkylová skupina je cyklická alkylová skupina obsahující alespoň jeden kruh a také polycyklická ' skupina obsahující kondenzované kruhové cyklické alkylové skupiny. Vhodné cykloalkylové skupiny jsou například cyklohexylová skupina, cyklopropylová skupina, cyklopentylová .skupina a cykloheptylová skupina.

„Cyklohexylmethylová skupina je cyklohexylová skupina připojená ke skupině CH₂-, „Kondenzovaná karbocyklická skupina je multicyklický kondenzovaný karbocyklický kruh obsahují aromatické a/nebo nearomatické kruhy. Vhodné kondenzované karbocyklické kruhy jsou fluorenylová skupina, tetralin apod.

„Kondenzovaná karbocyklická alkylová skupina je alkylová skupina substituovaná kondenzovanou karbocyklickou kruhovou skupinou, vhodně multicyklickou kondenzovanou karbocyklickou kruhovou skupinou obsahující aromatické a/nebo nearomatické kruhy. Vhodné kondenzované karbocyklické alkylové skupiny jsou fluorenylmethylová skupina apod.

« · · · * „Atom halogenu je atom fluoru, chloru, bromu a jodu.

„Heteroarylalkenylová skupina je alkenylová skupina substituovaná heteroarylovou skupinou a zahrnuje heterocyklické systémy popsané v „Handbook of Chemistry a Physics, 49. vydání, 1968, R.C. Weast, vydavatel:. The Chemical Rubber *Co. , Clevela, OH.Viz. zejména sekce C. pravidla názvosloví organických sloučenin, B. základní heterocyklické systémy. Výhodná alkenylová skupina obsahuje 2 až 6 atomů uhlíku.

„Heteroarylalkylová skupina je alkylová skupina substituovaná heteroarylovou skupinou jako je pikolylová skupina a zahrnuje heterocyklické systémy popsané v „Handbook of Chemistry a Physics, 49. vydání, 1968, R.C. Weast, vydavatel: The Chemical Rubber Co., Clevela, OH. Viz. zejména sekci C. pravidla názvosloví organických sloučenin, B. základní heterocyklické systémy. Výhodná alkylová skupina obsahuje 1 až 6 atomů uhlíku.

„Heteroarylová skupina je aromatická skupina obsahující 1 až 14 atomů uhlíku a zbytek kruhových atomů jsou heteroatomy a zahrnuje heterocyklické systémy popsané v „Handbook of Chemistry a Physics, 49. vydání, 1968, R.C. Weast, vydavatel: The Chemical Rubber Co., Clevela, OH. Viz. zejména sekci C. pravidla názvosloví organických sloučenin, B. základní heterocyklické systémy. Vhodné heteroatomy jsou atom kyslíku, dusíku a skupina S(0)_iř kde i je 0, 1 nebo 2, a vhodné heterocyklické arylové skupiny jsou furanylová skupina, thienylová skupina, pyridylová skupina, pyrrolylová skupina, pyrimidylová skupina, pyrazinylová skupina, imidazolylová skupina apod.

„Heterocykloskupina je redukovaný heterocyklický kruhový systém tvořený atomy uhlíku, dusíku, kyslíku a/nebo síry a zahrnuje heterocyklické systémy popsané v „Handbook of Chemistry a

Physics, 49. vydání, 1968, R.C. Weast, vydavatel: The Chemical

Rubber Co., Clevela, OH. Viz. zejména sekci C. pravidla názvosloví organických sloučenin, B. základní heterocykličké systémy .

„Heterocykloalkylová skupina je alkylová skupina substituovanáa heterocyklickou skupinou a zahrnuje heterocykličké systémy popsané v „Handbook of Chemistry a Physics, 49. vydání, 1968, R.C. Weast, vydavatel: The Chemical Rubber Co., Clevela, OH. Viz. zejména sekci C. pravidla názvosloví organických sloučenin, B. základní heterocykličké systémy. Výhodná alkylová skupina obsahuje od 1 do 6 atomů uhlíku.

„Nižší znamená, v souvislosti s organickými zbytky nebo skupinami, obsahující 1 až 5 atomů uhlíku, výhodně až 4 atomy uhlíku, vhodně 1 nebo 2 atomy uhlíku. Uvedené zbytky nebo skupiny mohou být lineární nebo rozvětvené.

„Perfluoralkylová skupina je alkylová skupina, která má všechny atomy vodíku nahrazeny atomy fluoru.

„Perfluorarylová skupina je arylová skupina, která má všechny atomy vodíku nahrazeny atomy fluoru.

„Perfluorarylalkylová skupina je arylalkylová skupina, která má všechny atomy vodíku v arylové části nahrazeny atomy fluoru.

„Farmaceuticky upotřebitelná sůl zahrnuje soli sloučenin podle předkládaného vynálezu odvozené od kombinace těchto sloučenin a organické nebo anorganické kyseliny. V praxi je použití soli formou použití báze. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou vhodné ve formě soli i jako volné báze, kdy obě formy patří do rámce předkládaného vynálezu.

H ,N.

,CHO

Termín „Arg-al znamená zbytek L-argini nalu vzorce:

H,N

HN

Λ

NH

OH

Termín „Arg-ol znamená zbytek L-argininolu vzorce:

„Hydrochlorid (S) -iP-nitroarginolu označuje sloučeninu vzorce:

„N-t-butoxykarbonyl-L^-nítro-L-arginin označuje sloučeninu vzorce:

HN

- N0₂

H,N N „L-N^-nitroarginalethylcyklol označuje sloučeninu vzorce:

.NO, EtO N ¹ λ

γ N NH₂

Viz. také U.S. patent 5,514,777.

··· · · ·· ···· ·· ·

Zkratky

Bn	benzylová skupina
Boc	t-butoxykarbonylová skupina
BzlSO₂	benzylsulfonylová skupina
Cbz nebo „CBz	benzyloxykarbonylová skupina
DCA	dichloroctová kyselina
DCC	Ν,N'-dicyklohexylkarbodiimid
DCM	dichlormethan
DMF	N,N-dimethylformamid
DMSO	.dimethylsulfoxid
DMAP	4-Ν,Ν-dimethylaminopyridin
EDC	hydrochloridová l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiímidu
Et₃N	triethylamin
EtOH	ethanol
HBTU	2- (lH-benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfát
HCI	chlorovodíková kyselina
HOAC	octová kyselina
HPLC	vysokotlaká kapalinová chromatografie
HOBt	monohydrát 1-hydroxybenzotriazolu
i-BuOCOCl	isobutylchloroformát
LiAlH	1ithiuma1uminumhydrid
LiAlH., (OEt) ₂	diethoxid lithiumaluminumhydridu
Me	methylová skupina
NMM	N-methylmorfolin
PhB(OH)₂	fenylboronová kyselina
PyBOP	benzotriazolyloxytrispyrrolidinofosfoniumhexafluorfosfát
TFA	trifluoroctové kyselina
THF	tetrahydrofuran
TLC	tenkovrstvá chromatografie

Stručný popis obrázků na výkresech

Obrázek 1 popisuje reakční schéma přípravy meziproduktu pro syntézu sloučeniny podle předkládaného vynálezu, mající v pozici' PÍ argininal, na pevné fázi. V tomto obrázku mají symboly „i až „vii následující význam: i) 4-methylmorfolin, EDC a 1-hydroxybenzotriazol v bezvodém acetonitrilu; míchání 16 hodin při teplotě místnosti, výtěžek 78 % po zpracování; ii) lithium28

aluminumhydrid/tetrahydrofuran při teplotě -78 °C v atmosféře dusíku, 1 hodina; vytemperování na teplotu místnosti, ochlazení na teplotu -78 °C a rozklad hydrogensíraném sodným, výtěžek 76 % po zpracování; iii) ethyl-6-hydroxyhexanoát v acetonitrilu, vodná kyselina chlorovodíková; převrstveno přebytkem ethyl6-hydroxyhexanoátu s acetanhydridem a pyridinem, výtěžek 93,7 % po zpracování; iv) ethanol/voda/octová kyselina (4:1:1), 10% palladium na uhlí, 16 hodin v atmosféře vodíku při tlaku 276 kPa (40 psi), výtěžek 94,4 % po zpracování; v) dichlormethan, IN roztok hydroxidu sodného, pH 11-13, allylchloroformát, výtěžek 80 % po zpracování; ví) ethanol, 3N hydroxid lithný, IN kyselina chlorovodíková do pH 2-3, výtěžek 83 % po zpracování; a vii) aminomethylovaná polystyrénová pryskyřice („AM pryskyřice) , PyBOP v dimethylformamidu, diisopropylethylamin, kondenzace stanovena Kaiserovým testem; převrstvení směsí dimethylformamid/octová kyselina/triethylamin (8:1:1), výtěžek 92 % po zpracování výtěžek. Viz. také příklady 1 až 7.

Obrázek 2 je reakční schéma syntézy na pevné fázi (sloučeniny podle předkládaného vynálezu) za použití pryskyřice 1-9 (viz. obrázek 1). V tomto obrázku mají symboly „i až „viii následující význam: i) dichlormethan, trifluoroctová kyselina a thioanisol; ii) Fmoc-alanin, 1-hydroxyhenzotriazol, TBTU a diisopropylethylamin v dimethylformamidu, účinnost kondenzace '99,5 %; iii) 50% piperidin v dimethylformamidu; iv) dimethylformamid, Ν-α-Fmoc-D-serin (O-t-butyl), 1-hydroxyhenzotriazol, TBTU, diisopropylethylamin; v) 50% piperidin v dimethylformamidu; vi) isobutylchloroformát v dimethylformamidu, diisopropylethylamin; vii) methylsulfoxid, tetrahydrofuran, IN kyselina chlorovodíková, morfolin, tetrakistrifenylfosfinpalladium; a viii) trifluoroctová kyselina/dichlormethan/voda (6:3:1), čiš29

těni semipreparativní HPLC na reverzní fázi. Viz. také příklad .

Obrázek 3 uvádí reakční schéma syntézy sloučenin podle předkládaného vynálezu v roztoku, které mají v pozici PÍ argininal za použití L-N⁹-nitroargininalethylcyklolového meziproduktu. Sloučenina 3-1 je Ν-α-Cbz-D-serin (O-t-butyl), sloučenina 3-2 hydrochlorid methylesteru alaninu. V tomto obrázku mají symboly „i až „vii následující význam: i) EDC, 1-hydroxybenzotriazol a acetonitril, diisopropylethylamin za získání Cbz-D-Ser (O-tbutyl )-Ala-OMe; (ii) ethanol/octová kyselina/voda (4:1:1), 10% palladium na uhlí, 2 hodin v atmosféře vodíku při tlaku 311 kPa (45 psi), výtěžek 95 % po zpracování; iii) acetonitril, benzensulfonylchlorid, diisopropylethylamin, výtěžek 43 % po zpracování; iv) methanol, 1,OM hydroxid lithný, okyselí se iontově výměnné pryskyřici DOWEX, eluce směsi methanol/voda, výtěžek 95 % po zpracování; v) 1-hydroxybenzotriazol, acetonitril, diisopropylethylamin, výtěžek 95 % po zpracování; vi) hydrogenace na 10% palladaiu na uhlí ve směsi ethanol/ kyselina octová/voda (4:1:1) při tlaku 345 kPa (50 psi), izolace benzylsufonylD-Ser(O-t-Bu)-L-Ala-L-argininalethylcyklolu; a vii) 6M kyselina chlorovodíková za míchání, 6,5M octan amonný do pH 4, čištění preoarativní HPLC na reverzní fázi, 15% výtěžek ve třech krocích (v-vii). Viz. také příklady 17 až 20.

Obrázek 4 popisuje reakční schéma syntézy sloučeniny podle předkládaného vynálezu, která má v pozici PÍ argininketoamiaovou skupinu. V tomto obrázku mají symboly „i až „ix následující význam: i) fenethylamin, BOP a 1-hydroxybenzotriazol, dimethylf ormamidu, 4-methylmorfolin, výtěžek 89 % po zpracováni; ii) chlorovodík v ethylacetátu, za získání hydrochloridu N⁹nitro-Arg-COH-fenethylamidu; iii) t-butoxykarbonyl-Ala-OH, EDC,

1-hydroxybenzotriazol a acetonitril, diisopropylethylamin, výtěžek 95 % po zpracování; iv) chlorovodík v ethylacetátu, výtěžek 98 % po zpracování; v) benzylether EDC a t-butoxykarbonylšeřinu a 1-hydroxybenzotriazol, acetonitril, diisopropylethylamin, výtěžek 92 % po zpracování; vi) chlorovodík v ethylacetátu, výtěžek 98 % po zpracování; vii) acetonitril, isobutylchloroformát, diisopropylethylamin, výtěžek 85 % po zpracování; viii) EDC, methyl sulfoxid a dichloroctová kyselina, výtěžek 68 % po zpracování; ix) anisol, fluorovodík při teplotě -20 °C, výtěžek 26 % po zpracování a čištění preparativní HPLC na reverzní fázi. Viz. také příklady 27 až 34.

Obrázek 5 uvádí reakční schéma alternativní syntézy v roztoku meziproduktu sloučeniny 1 (sloučenina z obrázku 2), kterým je L-N⁹-nitroargininalethylcyklol. V tomto obrázku mají symboly „i až „vii následující význam: i) isobutyl chloroformát, uhličitan sodný, voda, výtěžek 99,5 % po zpracování; ii) hydrochlorid t-butylesteru alaninu, EDC a hydroxybenzotriazol v acetonitrilu; diisopropylethylamin, kvantitativní výtěžek po zpracování; iii) TFA, dichlormethan, kvantitativní výtěžek po zpracování; iv) hydrochlorid ethylcyklolu N^-nitroargininalu, EDC a hydroxybenzotriazol v acetonitrilu; diisopropylethylamin, výtěžek 50 % po zpracování; v) ethanol/octová kyselina/voda (4:1:1), 10% palladium na uhlí, 4 hodiny v atmosféře vodíku při tlaku 345 kPa (50 psi); vi) 3, 0M kyselina chlorovodíková; preparativní HPLC na reverzní fázi; výtěžek 62 % sloučeniny 1 ve dvou krocích (v) a (vi). Viz. také příklady 54 až 59.

Obrázek 6 uvádí reakční schéma syntézy chráněné argininalhydrazonylkarbonylaminomethylované polystyrénové pryskyřice použité při snytéze sloučeniny podle předkládaného vynálezu, která má v pozici Pl argininal, na pevné fázi. Sloučenina 6-1 ··· ·· ·· ··*· «· · j e N-cc- f luorenylmethyloxykarbonyl -ω,ω-άί-N-t-butoxykarbonylarginin. V tomto obrázku mají symboly „i až „iv následující význam: i) acetonitril, uhličitan draselný, methyljodid, 50 °C, ethylacetát; ii) tetrahydrofuran a methanol, chlorid vápenatý, ledová lázeň, natriumborohydrid, míchání, výtěžek 71 % po zpracování; iii) methylsulfoxid a toluen, ledová lázeň, EDC a dichloroctová kyselina; a iv) dichlormethan, HCAM pryskyřice, teplota místnosti, 16 až 24 hodin. Viz. také příklady 41 až 45.

Obrázek 7 popisuje reakční schéma syntézy sloučeniny podle předkládaného vynálezu, která má v pozici Pl argininal, na pevné fázi za použití meziproduktu z obrázku β. V tomto obrázku mají symboly „i až „ix následující význam: i) 30 % piperidinu v dimethylformamidu; ii) N-a-Fmoc-azetidin-2-karboxylová kyselina, 1-hydroxybenzotriazol, TBTU a diisopropylethylamin v dimethylformamidu; iii) 30 % piperidinu v dimethylformamidu; iv) Ν-α-Fmoc-D-serin-t-butylether, 1-hydroxybenzotriazol, TBTU a diisopropylethylamin v dimethylformamidu; v) dvojitá kondenzace: Ν-α-Fmoc-serin-O-t-butylether, 1-hydroxybenzotriazol, TSTU a diisopropylethylamin v dimethylformamidu, účinnost kondenzace 97 % po zpracování; vi) 30 % piperidinu v dimethylformamidu; vii) benzensulfonylchlorid a diisopropylethylamin v dimethylformamidu; viii) dvojitá kondenzace: benzensulfonylchlorid a diisopropylethylamin v dimethylformamidu, účinnost kondenzace 96 % po zpracování; a ix) trifluoroctová kyselina/voda (9:1), výtěžek 26 % po čištění semipreparativní HPLC na reverzní fázi. Viz. také příklady 46 až 53.

Obrázek 8 popisuje reakční schéma přípravy meziproduktu pro syntézu sloučeniny podle předkládaného 'vynálezu, která má v pozici Pl 3-piperidinyl-(N-guanidino)alaninal. V tomto obrázku mají symboly „i až „vi následující význam: i) thionylchlorid, methanol; ii) di-t-butyldikarbonát, pH 7 až 8; iii) plynný vodík, oxid platičitý v ethanolu, voda a octová kyselina; iv) bis-benzyloxykarbonyl-S-methylisothiomočovina, báze, tetrahydrofuran; v) chlorid vápenatý, natriumborohydrid v tetrahydrofuranu a ethanolu; vi) chlorovodík, ethylacetát. Hvězdička označuje pozici asymetrického atomu uhlíku. Viz. také příklady 60 a 64.

Obrázek 9 uvádí a reakční schéma přípravy meziproduktu pro syntézu sloučeniny podle předkládaného vynálezu, která má v pozici PÍ 3-amidinofenylalaninal. V tomto obrázku mají symboly „i až „xi následující význam: i) jodid draselný, dioxan; 2,5M ethoxid sodný v ethanolu, atmosféra argonu, 6 hodin zahřívání k varu; výtěžek po zpracování 60 %; ii) pyridin, triethylamin;

plynný sirovodík, 16 hodin míchání při teplotě místnosti, výtěžek po zpracování 98 %; iii) aceton, jodmethan, 30 minut zahřívání k varu, filtrace, methanol; iv) octan amonný, 1 hodina zahřívání k varu, filtrace a sušení; v) koncentrovaná kyselina chlorovodíková, 3 hodin zahřívání k varu, výtěžek po zpracování 30 %; vi) dioxan, hydrogenuhličitan sodný, di-t-butyldikarbonát, míchání 18 hodin při teplotě místnosti; vii) teplota 4 °C, 4 , ON roztok hydroxidu sodného do pH 12; 4-methoxy-2,3,6 -trimethylbenzensulfonylchlorid v dioxanu; l,0N kyselina chlorovodíková do pH 7 až 8, voda, výtěžek po zpracování 68 %, viii) hydrochlorid O,N-dimethylhydroxylaminu, hydroxybenzotriazolhydrát, 4-methylmorfolin, tetrahydrofuran, míchání 2 hodiny, výtěžek po zpracování 69 %; ix) LiAlH₄, tetrahydrofuranu, -78 °C;

vodný hydrogensíran draselný, výtěžek po zpracování 86 %; x) trifluoracetátová sůl 4-benzhydrylsemikarbazidu (sloučenina z příkladu 65), trlhydrát octanu sodného· v ethanolu, reflux, výtěžek po zpracování 89 %; a xi) 50% trifluoroctová kyselina/di33

chlormethan, přidáni k etheru, výtěžek po zpracování 79 %. Viz. také příklady 65 až 72.

Obrázek 10 uvádí reakční schéma přípravy meziproduktu pro syntézu sloučeniny podle předkládaného vynálezu, která má v poloze PÍ 4-piperidinyl-(N-guanidino)alaninal. V tomto obrázku mají' symboly „i až „vi následující význam: i) thionylchlorid, methanol; ii) di-t-butylkarbonát, pH 7 až 8; iii) plynný vodík, oxid platičitý v ethanolu, voda a octová kyselina; iv) bis-benzyloxykarbonyl-S-methylisothiomočovina,. báze, tetrahydrofuran; v) chlorid vápenatý, natriumborohydrid v tetrahydrofuranu a ethanolu; a vi) chlorovodík v ethylacetátu. Hvězdička označuje polohu asymetrického atomu uhlíku. Viz. příklad 73.

Obrázek 11 uvádí reakční schéma syntézy sloučeniny podle předkládaného vynálezu, která má v pozici PÍ 3-guanidinopiperidinalovou skupinu, za použití meziproduktu jako je látka 8-6 z obrázku 8. V tomto obrázku mají symboly „i až „ix následující význam: i) isobutylchloroformát, hydrogenuhličitan sodný, vodný dioxan; ii) t-butylester alaninu, EDC, HOBt, NMM; iii) plynný vodík, palladium na uhlí; iv) pyridin, fenylchloroformát; v) trifluoroctová kyselina/dichlormethan; vi) EDC, HOBt, NMM; vii) plynný vodík, palladium na uhlí; viii) EDC, DCA, DMSO, toluen; a ix) voda, pH 7; preparativní HPLC na reverzní fázi. Viz. příklad 74.

Obrázek 12 uvádí reakční schéma syntézy sloučeniny podle předkládaného vynálezu, která má v pozici PÍ amidinofenvlalaninal, za použití meziproduktu jako je látka 9-10 z obrázku 9. V tomto obrázku mají symboly „i až „iii následující význam: i) EDC, HOBt, NMM; ii) fluorovodík, anisol; a iii) 90% vodná trifluoroctová kyselina; preparativní HPLC na reverzní fázi. Viz. příklad 75., • »· ·· · · ·· • · · · · · · · · · • · · · · « · 9 9 • 9 · · · · ··

999 99 99 9999 49 9

Obrázek 13 uvádí reakční schéma syntézy sloučeniny podle předkládaného vynálezu, kde R₂ je skupina -CH₂OA₂ a A₂ je skupina -C(=O)R₉, za použití meziproduktu 13-1 (látka 5-5 z obrázku 5; příklad 57). V tomto obrázku mají symboly „i až „iii následující význam: i) pyridin, R₉COC1; ii) plynný vodík, 10% palladium na uhlí, ethanol, voda; iii) vodný HPF₆, acetonitril.

Podrobný popis vynálezu

1. Výhodné sloučeniny

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu odpovídají vzorci:

Ri

(I) kde (a) X je vybráno ze skupiny, kterou tvoří skupina -S(O)₂-, skupina -N (R )-S (O) ₂-, skupina -(C=O)'-, skupina -OC (=0)-, skupina -NH-C(=0)-, skupina -P(0) (R') - a přímá vázba, kde R' je nezávisle vybrán ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku nebo arylalkylová skupina obsahující 7 až 16 atomů uhlíku, s výhradou, že pokud X je skupina -P(O)(R')-, pak R' není atom vodíku;

(b) R_x je ze skupiny, kterou tvoří (1) alkylová skupina obsahující 1 až 12 atomů uhlíku, která je popřípadě substituovaná skupinou Y_x, • 99 99 9 9 *9 • 99 9 9 · 9 * V · · · · « · · ·

999 9 9 99 9

9 9 9 9 · 9 9

999 99 99 9·99 99 (2) alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku substituovaná cykloalkylovou skupinou obsahující 5 až 8 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y_1Z Y₂ a/nebo Y₃, (3) cykloalkylová skupina obsahující 3 až 15 atomůuhlíku, která je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y_x, Y₂ a/nebo Y₃, (4) heterocykloalkylová skupina obsahující 4 až 10 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku nebo heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a skupina S(O)_i; kde i je 0, 1 nebo 2, která je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y_x, Y₂ a/nebo Y₃, (5) heterocyklus 4 až 10 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku nebo heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a skupina S(0)_x, — Ν V —Ν V kde i je 0, 1 nebo 2, včetně , kde je 5 až 7-členný heterocyklus obsahující 3 až 6 kruhových atomů uhlíku, kde V je skupina -CH₂-, skupina -0-, skupina -S(=0)-, skupina -S(0)₂- nebo skupina -S-, který je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaný na kruhu skupinami Y_lř Y₂ a/nebo Y₃, (6) alkenylová skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, která je popřípadě substituovaná cykloalkylovou skupinou obsahující 5 až 8 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, dinebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y_x, Y₂ a/nebo Y₃, (7) arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná skupinami Y,, Y₂ a/nebo Y₃, (8) heteroarylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomyjsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, a která je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná skupinami Y_lz Y₂ a/nebo Y₃, (9) arylalkylová skupina obsahující 7 až 15 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na arylovém kruhu skupinami Y_lř Y₂ a/nebo Y₃, (10) heteroarylalkylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, a která je popřípadě substituovaná na alkylovém řetězci hydroxyskupinou nebo atomem halogenu a popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y_1Z Y₂ a/nebo Y₃, (11) arylalkenylová skupina obsahující 8 až 16 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na arylovém kruhu skupinami Y_1Z Y₂ a/nebo Y₃, (12) heteroarylalkenylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, a která je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y_x, Y₂ a/nebo Y₃, ·· ·· ·· · ι» • ···· fc · c • e · ·· · ··

(17) připojená karbocyklická alkylová skupina obsahující 9 až 15 atomů uhlíku;

(19) perfluorarylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku;

(20) perfluorarylalkylová skupina obsahující 7 až 15 atomů uhlíku; a (21) pokud X je přímá vazba, atom vodíku;

kde každé Y_x, Y₂ a Y₃ je nezávisle vybrané (i) ze skupiny, kterou tvoří atom halogenu, kyanoskupina, nitroskupina, tetrazolylová skupina, guanidinoskupina, amidinoskupina, methylguanidinoskupina, skupina -CF₃, skupina -CF₂CF₃, skupina -CH(CF₃)₂, skupina -C (OH) (CF₃)₂, skupina -OCF₃, skupina -OCF₂H, skupina -OCF₂CF₃, skupina -OC(O)NH₂, skupina -OC(O)NHZ_lzskupina -OC(O)NZ_XZ₂, skupina -NHC(O)Z_lz skupina -NHC(O)NH₂, skupina -NHC(O)NZ_lz skupina -NHC (O) NZ_XZ₂, skupina -C(O)OH, skupina -C(O)OZ_lz skupina -C(O)NH₂, skupina -C(O)NHZ_lz skupina -C(O)NZ_XZ₂, skupina -P(O)₃H₂, skupina -P (O) ₃ (Z_ť) ₂, skupina -S(O)₃H, skupina -S(O)_mZ_lz skupina -Z_x, skupina -OZ_lř skupina -OH, skupina € » ρ ·♦ *· »· c · · ···· · · · ···» · · · ·· ·· · · · · · · · ο ··· ·· ·· <· · · · ·· ·«·

-ΝΗ₂, skupina -ΝΗΖ_Χ, skupina -ΝΖ_ΧΖ₂, -N-morfolinoskupina, skupina -S(CF₂)_qCF₃ a skupina -S (0) _ra (CF₂) _qCF₃, kde m je 0, 1 nebo 2, q je celé číslo od 0 do 5 a Z_x a Z₂ jsou nezávisle vybrané ze skupiny, kterou tvoří alkylová skupina obsahující 1 až 12 atomů uhlíku, arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku, heteroarylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, arylalkylová skupina obsahující 7 až 15 atomů uhlíku a heteroarylalkylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, nebo (ii) Y_x a Y₂ dohromady tvoří skupinu -O[C(Z₃) (Z₄)]_r0~, kde r je celé číslo od 1 do 4 a Z₃ a Z₄ j sůu nezávisle vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 12 atomů uhlíku, arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku, heteroarylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, arylalkylová skupina obsahující 7 až 15 atomů uhlíku a heteroarylalkylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů;

(c) R₂ je vybrán ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku, skupina -CH₃, skupina -C₂H_S, skupina -(CH₂)₂OH, skupina -(CH₂)₂OA₂, skupina -CH(R_S)OH, skupina -CH(R₆)OA₂ a skupina -CH-NH-X-R_s, kde A₂je skupina -C(=O)OR₉ nebo skupina -C(=O)R₉; X' je .vybrán ze skupiny, kterou tvoří skupina -S(0)₂-, skupina -S (0) ₂-N(R'')-, skupina -(C=0)-, skupina -C(=0)-0-, skupina -C(=0)-NH-, skupina -P(0) (R'')- a přímá vazba, kde R je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku nebo arylalkylová skupina obsahující 7 až 16 atomů uhlíku, s výhradou, že pokud X' je skupina -P(0) (R'') -, pak R není atom vodíku; R_s je vybrán ze skupiny, kterou tvoří:

• · • · · ♦«« · · · · • · · · • · · · · • » · · te · · · «3 · · · · (1) alkylová skupina obsahující 1 až 12 atomů uhlíku, popřípadě substituovaná skupinou Y_1Z (2) alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku substituovaná cykloalkylovou skupinou obsahující 5 až 8 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na' kruhu skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, (3) cykloalkylová skupina obsahující 3 až 15 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y_1Z Y₂, a/nebo Y₃, (4) heterocykloalkylová skupina obsahující 4 až 10 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybraně ze skupiny, kterou tvoří atomy kyslíku, dusíku a skupina S(O)_iz kde i je 0, 1 nebo 2, která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, (5) heterocyklus obsahující 4 až 10 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a skupina 5(0/, kde i je 0, 1 nebo 2, — Ν V —;N V včetně skupiny , kde je 5 až 7-členný heterocyklus obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, kde V je skupina -CH₂-, skupina -0-, skupina -S(=O)-, skupina -S(O)₂- nebo skupina -S-, který je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhových atomech uhlíku skupinou Y_1Z Y₂, a/nebo Y₃, (6) alkenylová skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, která je popřípadě substituovaná cykloalkylovou skupinou obsa40

• · · <' · ···· · · ··· hující 5 až 8 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y_1Z Y₂, a/nebo Y₃, (7) arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y_:, Y₂, a/nebo Y₃, (8) heteroarylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, a která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná skupinou Y,, Y₂, a/nebo Y₃, (9) arylalkylová skupina obsahující 7 až 15 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na arylovém kruhu skupinou Y_lř Y₂, a/nebo Y₃, (10) heteroarylalkylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, která je popřípadě na alkylovém řetězci substituovaná hydroxyskupinou nebo atomem halogenu a popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, (11) arylalkenylová skupina obsahující 8 až 16 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na arylovém kruhu skupinou Y_1Z Y₂, a/nebo Y₃, (12) heteroarylalkenylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, a která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhových atomech uhlíku skupinou Y_1Z Y₂, a/nebo Y₃, ·· · · ·· · · • · · · · · · ··· · · · ·· • < * * « · a · a · (13) atom vodíku; a

R₉ je vybrán ze skupiny, kterou tvoří:

(1) alkylová skupina obsahující 1 až 12 atomů uhlíku popřípadě substituovaná skupinou Y_x, (2) alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku substituovaná cykloalkylovou skupinou obsahující 5 až 8 atomů uhlíku, která je popřípadě na kruhu mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y_1Z Y₂, a/nebo Y₃, (3) cykloalkylová skupina obsahující 3 až 15 atomů uhlíku, která je popřípadě na kruhu mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y_1Z Y₂, a/nebo Y₃, (4) heterocykloalkylová skupina obsahující 4 až 10 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a skupina S(0)_iz kde i je 0, 1 nebo 2, která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y_1Z Y₂, a/nebo Y₃, (5) heterocyklus obsahující 4 až 10 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku nebo heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a skupina S(O)_iz kde i je 0, 1, nebo 2, — Ν V —Ν V včetně skupiny , kde je 5 až 7-členný heterocyklus obsahující 3 až 6 kruhových atomů uhlíku, kde V je skupina -CH₂-, skupina -0-, skupina -S(=0)-, skupina -S(0)₂nebo skupina -S-, která je popřípadě na kruhu mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhových atomech uhlíku skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, (6) arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku, která je popřípadě na kruhu mono-, di-, nebo trisubstituovaná skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, (7) heteroarylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, a která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, (8) arylalkylová skupina obsahující 7 az 15 atomů uhlíku, která je popřípadě na arylovém kruhu mono-, di-, nebo trisubstituovaná skupinou Y_lř Y₂, a/nebo Y₃, (9) heteroarylalkylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku nebo heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, a která je popřípadě substituovaná na alkylovém řetězci hydroxyskupinou nebo atomem halogenu a popřípadě mono-, di- nebo tri - substituovaná na kruhu skupinou Y_1Z Y₂, a/nebo Y₃, a (10) atom vodíku, s výhradou, že R₉ není atom vodíku, pokud A₂ je skupina -C(=O)OR₉;

(d) R₃ je vybrán ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku nebo methylová skupina, nebo R₃ a R₄ jsou vybrány, jak uvádí bod (f) ;

(e) R₄ je v S konfiguraci a je vybrán ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku, skupina -CH₂-S-CH₃, skupina -CH₂OH, skupina -CH₂CN, nižší alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku, skupina • · · ···<«« ·· «

-CH₂OCH, skupina -CH₂CH=CH₂ a skupina -CH=CH₂ nebo R₃ a R₄ jsou vybrány, jak je uvedeno v bodu (f) ;

(f) alternativně jsou R₃ a R₄ spolu vybrány tak, že jsou v S konfiguraci a tvoří v pozici P2 skupinu z množiny, kterou tvoří prolylová skupina, pipecholylová skupina, azetidin-2-karbo-’ nylová skupina, 4-hydroxyprolylová skupina, 3-hydroxyprolylová skupina a 3,4-dehydroprolylová skupina;

(g) R_s je vybrán ze skupiny, kterou tvoří kde vybí

m ze sku _ny kterou tvoří

kde d je celé číslo od 1 do 3 a W j e skupina -N- nebo skupina

-CH-; a (h) A_x je skupina -NHR₈, kde R_a je alkylová skupina obsahující 1 až 12 atomů uhlíku, arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku nebo arylalkylová skupina obsahující 6 až 15 atomů uhlíku, všechny popřípadě mono-, di- nebo tri - substituované skupinou Y₁₍ Y₂ a/nebo Y₃, nebo je atom vodíku; a jejich farmaceuticky upotřebitelné soli.

Výhodné skupiny X jsou skupina -S(0)₂-, skupina -0C(=0)-, skupina -NH-C(=O)- a přímá vazba. Zejména výhodné jsou skupina -S(0)₂- a skupina -0C(=0)-.

Výhodné skupiny R_L jsou alkylové skupiny, zejména isobutylová skupina, 2-ethylhexylová skupina, methylová skupina, butylová skupina, isopropylová skupina, cyklohexylmethylová skupina a cyklohexylpropylová skupina; cykloalkylové skupiny, zejména (-)menthylová skupina, (+)menthylová skupina a cyklohexylová skupina; aryiové skupiny, zejména naftylová a fenylová skupina; arylalkylové skupiny, zejména benzylová skupina, 3-fenylpropylová skupina a 2 -fenylethylové skupina; a připojené karbocyklické alkylové skupiny, zejména fluorenylmethylová skupina. Zejména výhodné skupiny R_x jsou fenylová skupina, benzylová skupina, 2-fenylethylové skupina, isobutylová skupina a 3-fenylpropylová skupina.

Výhodné kombinace R_x-X- jsou následující skupiny: skupina fenyl-S(0) ₂-, skupina benzyl-S (O) ₂-, skupina 2-fenylethylS(0)₂-, skupina 3-fenylpropyl-S(0)₂-, skupina benzyl-QC(=0)- a skupina isobutyl-OC(=0)-.

Výhodné R₂ skupiny jsou atom vodíku, skupina -CH₃, skupina -C₂H_s, skupina -CH₂NH-X'-R_S a skupina -CH(R₆)0H, kde R-_s je atom vodíku, alkylová skupina, zejména methylová skupina, nebo arylalkylová skupina. Výhodná chiralita na a atomu uhlíku je R. V případě chirality β atomu uhlíku, je výhodná chiralita R. Výhodné skupiny R₂ jsou takové, které definují v pozici P3 glycin, d-seryl (-CH(R_S)OH kde R_s je Η) , (R, R) d-allothreonyl (-CH(R_S)OH kde R_s je methyl), d-2-aminobutyrylová skupina, N^-methyloxykarbonyl-d-2,3-diaminopropionylová skupina (-CH₂NH-X'-R_S kde R₆ je.CHj a X' je (-C=0)0-)_; Ν-β-(2-fenylethylkarbonyl)-d-2,3-diaminopropionylová skupina (-CH₂NH-X-R_S kde R_s je • « ·

2-fenylethyl a X' je -(C=0)-), a N-p~benzyloxykarbonyl-d-2,3diaminopropionylová skupina (-CH₂NH-X-R_s kde R_s je benzyl a X' je -(C=O)O-). Zejména výhodná skupina R₂ je taková, která definuje v poloze P3 d-serylovou skupinu (R_s je atom vodíku H) nebo (R,R)d-allothreonylovou skupinu (R_s je methylová skupina).

Alternativní výhodné skupiny R₂ jsou skupina -(CH₂)₂OA₂ a skupina -CH(R₆)OA₂, výhodněji skupina -CH(R₆)OA₂; výhodná skupina R_sje atom vodíku. Výhodněji je skupina R₂ vybrána tak, že fragment P3 je acylová skupina nebo karbonátový ester d-serylové skupiny. Sloučeniny, kde je R₂ skupina -(CH₂)₂OA₂ nebo -CH(R_S)0A₂, mohou působit jako proléčiva.

Výhodná skupina R₃ je atom vodíku, pokud nejsou R₃ a R₄ vybrány společně. Výhodná skupina R₄ je methylová nebo propargylová skupina, pokud nejsou R₃ a R₄ vybrány společně. Pokud jsou R₃ a R₄ vybrány společně, vyberou se tak, že výhodné skupiny v pozici P2 jsou pak prolylová skupina, 4-cis-hydroxyprolylová skupina, 3,4-dehydroprolylová skupina a azetidin-2-karbonylové s kup i ny.

Výhodná skupina R_s je skupina -CH ( (CH₂) ₃NHC (=NH) NH₂) CHO tzn. v pozici Pl je argininaldehyd.

Mezi nárokovanými sloučeninami jsou výhodné ty, kde R₂ je takový, že v uvedené pozici je d-serin nebo d-allothreonin a argininaldehyd v pozici R_s. Zejména výhodné jsou sloučeniny, které mají bud'

i) atom vodíku v pozici R₃ a methylovou skupinu v pozici R₄ (P2 j e alanin) , nebo ·

• 9 · ii) R₃ a R₄ vybrány spolu tak, že P2 je prolylová skupina, azetidin-2-karbonylová skupina nebo 2,4-dehydroprolylová skupina.

Výhodné sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou:

··· · · · ··

7

2. Příprava výhodných sloučenin

Obrázky 1 až 12 popisují syntetická schémata přípravy některých výhodných sloučenin podle předkládaného vynálezu.

Obrázek 1 uvádí syntézu N-a-t-butoxykarbonyl-N-o-allyloxykarbonylargininalu (6-hexanoylaminomethylované polystyrénové pryskyřice) cyklolu, která vhodná pro syntézu sloučenin podle před·· ·· ·· · · • · · < · · · ·«· · · · · · kládaného vynálezu na pevné fázi, které mají jako PÍ argininaldehyd. Tato syntéza je podrobně popsána příklady 1 až 7.

Obrázek 2 uvádí syntézu sloučenin podle předkládaného vynálezu na pevné fázi za použití pryskyřice popsané na obrázku 7. Tato syntéza je dále popsána v příkladu 8.

Obrázek 3 uvádí syntézu sloučenin podle předkládaného vynálezu v roztoku za použití L-IS^-nitroargininalethylcyklolového meziproduktu. Viz. také příklady 17 až 21 a 22 až 26.

Obrázek 4 uvádí syntetické schéma pro sloučeniny podle předkládaného vynálezu, které mají jako PÍ argininketoamid. Syntéza těchto sloučenin je dále popsána příklady 27 až 34.

Příklady 35 až 40 popisují syntézu výhodných sloučenin podle předkládaného vynálezu v roztoku za použití L-N^-nitroargininalethylcyklolového meziproduktu.

Obrázek 5 uvádí alternativní způsob přípravy sloučenin uvedených v obrázku 2 zat použití syntézy v roztoku a L-N⁹-nitroargininalethylcyklolového meziproduktu. Viz. také příklady 54 až 59 .

Obrázek 6 uvádí syntetické schéma a příklady 41 až 45 dále popisují syntézu argininalhydrazonylkarbonylaminomethylovaných pryskyřic, které lze použít pro přípravu sloučenin podle předkládaného vynálezu.

Obrázek 7 uvádí syntetické schéma přípravy sloučenin podle předkládaného vynálezu na pevné fázi za použití pryskyřice z příkladu 45. Příklady 46 až 53 dále popisují uvedenou syntézu na pevné fázi.

• · · · · · ·

Obrázek 8 uvádí syntetické schéma přípravy meziproduktu použitého pro syntézu sloučenin podle předkládaného vynálezu, které mají jako PÍ 3-piperidinyl-(N-guanidino)-alaninalovou skupinu.

Tuto syntézu podrobně popisují příklady 60 až 64.

Obrázek 9 uvádí reakční schéma přípravy meziproduktu meziproduktu, který se použije pro syntézu sloučeniny podle předkládaného vynálezu, která má jako PÍ 3-amidinofenylalaninal. Meziprodukty použité pro přípravu sloučeniny vzorce (I), která má jako PÍ 4-amidinofenylalaninal, lze připravit podle reakční schématu obrázku 9 a popsaného v příkladech 65 až 72, za použití příslušného α-brom-p-tolunitrilu jako výchozí látky.

Obrázek 10 uvádí reakční schéma přípravy meziproduktu, který se se použije pro syntézu sloučeniny podle předkládaného vynálezu, která má jako PÍ 4-piperidinyl-(N-guanidino)alaninal. Tento meziprodukt se připraví stejným postupem jako je popsáno v příkladu 60 až 64 a za použití příslušných výchozích látek.

Obrázek 11 uvádí reakční schéma přípravy sloučenin podle předkládaného vynálezu, které mají jako PÍ 3-piperidinyl-(N-guanidino) alaninal , za použití meziproduktu jako u 8-6 z obrázku 8.

Obrázek 12 uvádí reakční schéma přípravy sloučenin podle předkládaného vynálezu, které mají jako PÍ 3-amidinofenylalaninal, za použití meziproduktu jako u 9-10 z obrázku 9.

Obrázek 13 uvádí reakční schéma přípravy sloučenin podle předkládaného vynálezu, které mají jako P3 esterifikovanou hydroxylovou skupinu.

Vhodný prostředek chemické kondenzace (jako například amidické vazby) zahrnuje vytvoření peptidické vazby za použití běžných kondenzačních činidel, která jsou známá. Viz. Bodanszky, N.

Peptide Chemistry, strana 55-73, Springer-Verlag, New York (1988) a tam uvedené odkazy. Chemickou kondenzaci lze provést v jednom nebo ve dvou krocích. U jednokrokové kondenzace se přímo kondenzují oba partnerské materiály. Vhodná činidla podle předkládaného vynálezu pro kondenzaci v jednom kroku zahrnují DCC s HOBt, EDC s HOBt, EDC s HOAt, HBTU nebo TBTU. Při kondenzaci ve dvou krocích se nejprve připraví aktivovaný ester nebo anhydrid C-koncové karboxylové skupiny jednoho z partnerů kondenzace a pak následuje jeho kondenzace s druhým partnerem.

U přípravy některých sloučenin, které mají substituenty citlivé k hydrogenací, je vhodné vyhnout se použití plynného vodíku a a palladia na uhlí. Jinou vhodnou metodou přípravy sloučenin podle předkládaného vynálezu, které obsahují skupiny citlivé na hydrogenací, jako je alkenylová nebo arylová skupina substituovaná atomem halogenu, kyanoskupinou, nitroskupinou nebo skupinou -3-Z₁, je vhodné použít pro štěpení N⁹-nitroskupiny argininu tris(trifluoracetat) boritý tj. B(OCOCF₃)₃. Činidlo se připraví reakcí BBr₃ a CF₃COOH v dichlormethanu při teplotě 0 °C. Činidlo je rovněž dostupné komerčně. Obecně reaguje N⁹-nitrosloučenina s tris(trifluoracetátem) boritým v trifluoroctové kyselině při teplotě 0 °C. Viz. například Fieser M. a Fieser L. F. , Reagents for Organic Synthesis, strana 46, John Wiley & Sons, New York (1974); Pless J. a Bauer W. , Angew. Chem., Internát. Ed. 12, 147 (1973) .

Dalším vhodným činidlem pro selektivní štěpení nitroskupiny je chlorid titanitý. Toto činidlo je komerčně dostupné. I^-nitrosloučenina reaguje s chloridem titanitým ve vodném methanolu obsahujícím pufr (octan amonný). Následně se reakční směs podrobí působení vzduchu nebo dimethylsulfoxidu. Viz. například

Freidinger R. M., Hirschmann R. a Veber D.F., J. Org. Chem. 43,

4800 (1978).

Dalším vhodným způsobem syntézy těchto sloučenin, které mají L-argininalovou skupinu, je použití di-N-t-butoxykarbonylové chránící skupiny (pro L-argininal) pro skupiny, které nejsou kompatibilní s hydrogenací na palladiu na uhlí. Například se a-N-benzyloxykarbonyl-ω,ω-di-N-t-butoxykarbonylárginin rozpustí v acetonitrilu a přidá se hydroxyhenzotriazol a hydrochlorid 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu za vzniku a-Nbenzyloxykarbonyl-ω,ω -di-N-1-butoxykarbonyl-L-argininlaktamu. Laktam se redukuje reakcí s LiAlH₄ v tetrahydrofuranu při teplotě -70 °C za získání a-N-benzyloxykarbonyl-m,c-di-N-t-butoxykarbonyl-L-argininalu. Tento aldehyd se chrání jako diethylacetal reakcí s ethanolem a chlorovodíkem. N-Benzyloxykarbonylová chránící skupina se odstraní reakcí s plynným vodíkem a palladiem na uhlí za získání hydrochloridu ω,ω-di-N-t-butoxykarbonyl-L-argininaldiethylacetalu. Tuto chráněnou L-argininalovou část lze pak kondenzovat s požadovanou karboxylovou kyselinou reakcí s N-hydroxybenzotriazolem a hydrochloridem l-ethyl-3(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu. Diethylacetal a di-Boc chránící skupiny se odstraní reakcí s hexafluorfosforečnou kyselinou v acetonitrilu při teplotě 0 °C. Reakční směs se rozloží přidáním 2, 5M vodného roztoku octanu sodného do dosažení pH 4. Směs se filtruje přes 2 pm filtr. Preparativní HPLC za použití 0,1 % CF₃COOH v 10-40% vodném acetonitrilu poskytne trifluoracetát požadovaného substituovaného L-argininalu.

Obrázek 13 uvádí reakční schéma syntézy sloučeniny podle předkládaného vynálezu, kde R₂ je skupina -CH₂OA₂ a A₂ je skupina -C(=O)R₉. Meziprodukt 13-1 (příklad 57) reaguje s chloridem kyseliny R₉COC1 v přítomnosti báze jako. je pyridin. Meziprodukt

13-2 se hydrogenuje (vodík, 10% palladium na uhlí, směs ethanol :voda:octová kyselina) a pak reaguje s vodnou HPF_S a acetonitrilem za odstranění chránících skupin bez hydrolýzy esteru na R₂. Sloučeniny, kde R₂ je skupina -(CH₂)₂OA₂ nebo skupina -CH(R₆)OA₂ kde A₂ je skupina -C(=O)R_g, lze snadno připravit reakci příslušného meziproduktu odpovídajícího látce 13-1 s vhodným derivátem chloridu kyseliny R_gCOCl vhodně v přítomnosti báze jako je pyridin. Při přípravě sloučenin, kde R_s je argininalová skupina, se pak produkt hydrogenuje a reaguje s vodnou HPF_S a acetonitrilem za získáni argininalu bez hydrolýzy esteru na R₂.

Sloučeniny, kde R₂ je skupina -(CH₂)₂OA₂ nebo skupina -CH(R_S)OA₂kde A, je skupina -C(=O)OR, lze snadno připravit reakcí odpovídající sloučeniny, kde R₂ je skupina -(CH₂)₂OH nebo skupina -CH(R₆)OH s vhodným derivátem chloroformátu. Při přípravě sloučenin, kde PÍ je argininal, je vhodné chránit karbonátem před deprotekcí postranního řetězce argininu. Proto je vhodné, aby odpovídající FP-nitroargininalethylcyklolový meziprodukt reagoval s derivátem chloroformátu. Viz. přiklad 76. Produkt se pak hydrogenuje a reaguje za hydrolytických podmínek, čímž se získá požadovaný argininal. Viz. příklady 77 až 78.

3. Výběr vhodných sloučenin

Podle jednoho z aspektů předkládaného vynálezu, jsou vhodné sloučeniny vybrány kvůli své schopnosti a selektivitě inhibice serinových proteáz, zejména urokinázy. Uvedené hodnocení se rutinně provádí in vitro například postupy uvedenými v příkladu A. Jak je tam popsáno a obecně známo, kondenzuje se cílová serinová proteáza a její substrát za testovacích podmínek, což umožní reakci proteázy s jejím substrátem. Test se provede bez přítomnosti,testované sloučeniny a pak v přítomnosti rostoucí

koncentrace testované sloučeniny. Koncentrace testované sloučeniny, při které dojde k 50% inhibici aktivity serinové proteázy testovanou sloučeninou je hodnota IC₅₀ (inhibiční koncentrace) nebo EC_SO (efektivní koncentrace) dané sloučeniny. V řadě nebo skupině testovaných sloučenin jsou ty, které mají nižší hodnotu IC_S0 nebo EC₅₀, silnějšími inhibitory serinové proteázy než ty, které mají vyšší hodnotu IC₅₀ nebo EC_S0. Měření hodnoty IC₅₀ se často používá pro jednoduché testy, zatímco EC_S0 se často používá u složitějších testů, jako jsou testy používající buňky.

Výhodné sloučeniny podle tohoto aspektu předkládaného vynálezu mají hodnotu IC₅₀ 100 nebo nižší (při stanovení inhibice aktivity urokinázy in vitro testem). Zejména výhodné sloučeniny mají hodnotu IC_S0 menší než 30 nM.

U testovaných sloučenin se také hodnotí selektivita vůči serinové proteáze. Jak popisují příklady a jak je obecně známo, testovaná sloučenina se hodnotí na potenci vůči řadě serinových proteáz a dalších enzymů. V každém testovacím systému se pro každou testovanou sloučeninu stanoví hodnota IC₅₀ nebo EC_S0. Sloučenina, která vykáže nízké hodnoty IC₅₀ nebo EC₅₀ pro cílový enzym např. urokinázu a vyšší hodnoty IC_S0 nebo EC_S0 pro ostatní enzymy v testované skupině (například tkáňový aktivátor plasminogenu, thrombin, Faktor Xa), je považována za selektivní vůči cílovému enzymu. Obecně se sloučenina považuje za selektivní, pokud je její hodnota IC₅₀ nebo EC₅₀ v testu s cílovým enzymem aspoň o jeden řád menší než další nejmenší hodnota IC₅₀ nebo EC₅₀ (při měření selektivity u řady enzymů) .

Výhodné sloučeniny podle předkládaného vynálezu mají hodnotu IC₅₀ 100 nM nebo menší při měření inhibice aktivity urokinázy in vitro testem. Zejména výhodné sloučeniny mají hodnotu IC₅₀ u in vitro testu inhibice urokinázy, která je alespoň o jeden řád

menší než IC₅₀ měřená v in vitro testu inhibice tPA. Zejména výhodné sloučeniny mají poměr selektivity IC₅₀ v tPA testu :IC_S0testu urokinázy větší než 100.

U sloučenin podle předkládaného vynálezu se hodnotí také in vivo aktivita. Typ testu zvoleného pro hodnocení testované sloučeniny závisí na patologických podmínkách, které se mají léčit nebo preventivně působit použitím uvedené sloučeniny a způsobu podávání.

Například pro stanovení aktivity sloučenin podle předkládaného vynálezu při redukci růstu nádoru inhibici urokinázy lze použít postup popsaný v Jankun a další [Canc. Res. 57-. 559-563, 1997] pro hodnocení PAI-1. Stručně řečeno, myším se podá injekce SCID, která obsahuje ATCC buněčný kmen IDU145, který exprimuje velké množství uPA, a LnCaP, který neexprimuje uPA. Po vzniku nádoru se myším podává testovaná sloučenina za dávkovacího režimu stanoveného podle in vitro charakteristiky sloučeniny. Jankun a další podávali sloučeniny ve vodě. Po dobu 5 týdnů se dvakrát týdně měří velikost nádoru. Sloučenina se považuje za aktivní, pokud u zvířat, kterým se sloučenina podává, dochází k redukci velikosti nádoru v porovnání se zvířaty, kterým se podává příslušná kontrolní sloučenina. Dále porovnání účinku sloučeniny u zvířat, kterým byly podány buňky DU145 versus buňky LnCaP, může indikovat, zda účinek sloučeniny byl vyvolán inhibici urokinázy nebo jinak.

Jiný in vivo experimentální model navržený pro hodnocení účinku p-aminobenzamidinu (významný inhibitor urokinázy) na redukci velikosti nádoru je popsán v práci Bilistróm a další, Int. J. Cancer 61: 542-547, 1995.

Pro hodnocení schopnosti sloučenin podle předkládaného vynálezu redukovat nebo inhibovat metastázi lze použít postup popsaný v práci Kobayashi a další (Int. J. Canc. 57: 727-733d, 1994). Myším C57B1/6 se při tomto postupu podá injekce xenogenního vzorku s vysokým potenciálem plicní kolonizace (experimentální metastáze) nebo do břišní stěny (spontánní metastáze). V Matrigelu lze před injekci smíchat různé koncentrace testované sloučeniny s nádorovými buňkami. Pak se denně podávají i.p. injekce testované sloučeniny ve dnech 1-6 nebo 7-13 po naočkování nádoru. Zvířata se pak tři až čtyři týdny po naočkování nádoru usmrtí a měří se plicní nádorové kolonie. Hodnocení výsledných dat umožňuje stanovení účinnost testované sloučeniny, optimální dávku a způsob podávání.

Schopnost sloučenin podle předkládaného vynálezu redukovat velikost nádoru a metastázi lze hodnotit i modelem popsaným v práci Rabbani a další [Int. J. Cancer 63: 840-845, 1995]. Při tomto postupu se do slabin Copenhagenových krys podá injekce Mat LyLu nádorových buněk s velkou exprimací uPA. Zvířatům se implantují osmotické minidávkovače za účelem plynulého podávání různých dávek testované sloučeniny po dobu až tří týdnů. Během experimentu se hodnotí hmotnost a objem nádoru experimentálních a kontrolních zvířat (metastatický růst). Vyhodnocení výsledných dat umožní stanovení účinnosti testované sloučeniny, optimálního dávkování a způsobu podávání. Někteří autoři popsali podobný protokol v Xing a další [Canc. Res. 57: 3585-3593, 1997] .

Pro hodnocení inhibiční aktivity sloučenin podle předkládaného vynálezu proti neovaskularizaci lze použít model neovaskularizace králičí rohovky. Avery a další [Arch. Ophthalmol. 108: 1474-1475, 1990] popisuje anestézii novozélandských králíků al0 0 0 0 0 · 00 « · · · 0 0 0

0·· 00 0 00 bínú a následný výřez centrální rohovky a tvorbu radiální rohovkové kapsy. K indukci neovaskularizace se do kapsy umístí peleta s pomalým uvolňováním prostaglainu. Testovaná sloučenina se i. p. podává pět dní a pak se zvířata usmrtí. Účinek testované sloučeniny se hodnotí porovnáním periodických fotografií limbu, které lze použít pro výpočet plochy neovaskulární reakce resp. neovaskularizace limbu. Redukce plochy neovaskularizace v porovnání s příslušným kontrolním vzorkem znamená, že je testovaná sloučenina účinná při redukci nebo inhibici neovaskularizace .

Model angiogeneze použitý pro hodnocení účinku testované sloučeniny při prevenci angiogeneze popisuje Min a další (Canc. Res. 56: 2428-2433, 1996] . Myším C57BL6 se podá podkožní injekce Matrigelové směsi obsahující bFGF (jako činidlo indukující angiogenezí) s a bez testované sloučeniny. Po pěti dnech se zvířata usmrtí a vyfotografuje se Matrigelová zátka, na které lze pozorovat neovaskularizaci. Pokusná zvířata, která obdržela Matrigel a účinnou dávku testované sloučeniny vykazují nižší vaskularizaci, než kontrolní zvířata nebo pokusná zvířata, která obdržela méně účinnou nebo neúčinnou dávku sloučeniny.

In vivo systém navržený pro testování schopnosti sloučenin redukovat rozšíření primárních nádorů, je popsán v práci Crowley a další [Proč. Nati. Acad. Sci. 90: 5021-5025, 1993], Nahým myším se podá injekce s nádorovými buňkami (PC3) upravenými k exprimaci CAT (chloramfenikolacetyltransferasa). Buňky vylučují velké množství uPA a vykazují sytící množství uPA aktivity vázané na uPAR na buněčném povrchu. Zvířatům se podají sloučeniny testované na svou schopnost redukovat velikost nádoru a/nebo metastázi a následně se měří velikost nádoru a/nebo metastatický růst. Kromě toho indikuje schopnost testované sloučeniny « · · ·· «« «· • t · ·««· » · · • · · · · · · · · inhibovat metastázi hladina CAT stanovená v různých orgánech. Detekce nižší hladiny CAT v tkáních léčených zvířat oproti kontrolním zvířatům indikuje, že buňky s CAT-exprimací migrovaly do těchto tkání méně.

In vivo experimentální modely navržené pro hodnocení inhibičního potenciálu testovaných sloučenin proti urokináze za použití nádorových buněk kmene F3II (známých vysokou invazí) jsou popsány v práci Alonso a další [Breast Canc. Res. Treat. 40: 209223, 1996]. Tato skupina popisuje in vivo studie pro stanovení toxicity, nádorového růstu, invazivnosti, spontánní metastáze, experimentální plicní metastáze a angiogeneze.

Další způsob hodnocení inhibiční aktivity testovaných sloučenin proti urokináze poskytuje CAM model (chick embryo chorioalantoinní model membrány zárodku kuřat), poprvé popsaný v práci L. Ossowski [J. Cell Biol. 107: 2437-2445, 1988]. U CAM modelu je invaze nádorových buněk přes chorioalantoinní membránu závislá na přítomnosti katalyticky aktivní uPA. Kontakt CAM s nádorovými buňkami v přítomnosti inhibitoru urokinázy vede k redukci nebo zastavení invaze nádorových buněk přes membránu. Proto se CAM test provádí s CAM a nádorovými buňkami v přítomnosti a za absence různých koncentrací testovaných sloučenin. Za těchto podmínek se měří invazivnost nádorových buněk, což poskytne stanovení inhibiční aktivity sloučenin proti urokináze. Inhibiční aktivita sloučeniny proti urokináze koreluje s menší invazí nádoru.

Model CAM se také používá při standardním testu angiogeneze (tj . účinek na tvorbu nových cév; Brooks P. C.; Montgomery A. Μ. P.; Cheresh D. A., Methods in Molecular Biology 129: 257-269 (1999)). V tomto modelu se na CAM umístí filtrační disk obsahující induktor angiogeneze, jako je bázický faktor fibroblasto9 99 »9 · · ·· · 9999 99

9999 99 9 «9 · 9 9 · 9 99

999 99 99 9999 99 vého růstu (bFGF). Difúze cytokinu na CAM indukuje lokální angiogenezí, kterou lze měřit různými způsoby, např. počítáním míst rozvětvení cév v CAM přímo pod filtračním diskem. Pomocí tohoto modelu lze testovat schopnost sloučenin podle předkládaného vynálezu inhibovat cytokinem indukovanou angiogenezí. Testovanou sloučeninu lze bud' přidat do filtračního disku, který obsahuje induktor angiogeneze, nebo umístit přímo na membránu nebo podávat systemicky. Pomocí tohoto modelu lze porovnat stupeň tvorby nových cév v přítomnosti a/nebo za absence testované sloučeniny. Tvorba malého množství nových cév v přítomnosti testované sloučeniny indikuje anti-angiogenezní aktivitu. Protože jsou některé sloučeniny podle předkládaného vynálezu aktivní jako inhibitory urokinázy, může anti-angiogenezní aktivita těchto sloučenin napovídat, že urokináza hraje důležitou roli při angiogenezí.

4. Farmaceutické prostředky

V dalším aspektu zahrnuje předkládaný vynález farmaceutické prostředky připravené pro skladování nebo podávání, které obsahují terapeuticky účinné množství sloučeniny podle předkládaného vynálezu s farmaceuticky upotřebitelným nosičem.

Terapeuticky účinné množství sloučenin podle předkládaného vynálezu závisí na způsobu podávání, druhu léčených savců a fyzikálních charakteristikách daných specifických jedinců. Uvedené faktory a jejich vztahy pro stanovení tohoto množství jsou odborníkům dobře známé. Toto množství a způsob podávání lze upravit k dosažení optimálního účinku a obecně závisí na faktorech jako je hmotnost, dieta, komedikace a další faktory, které odborníci znají.

• · 9 · · 9 9 9 9

Terapeuticky účinné množství sloučenin podle předkládaného vynálezu se může značně lišit podle, požadovaného účinku a terapeutické indikace. Dávkování je typicky od 0,01 mg/kg do 100 mg/kg tělesné hmotnosti, vhodně od 0,01 do 10 mg/kg tělesné hmotnosti.

Farmaceuticky upotřebitelné nosiče pro terapeutické použití jsou dobře známé a popsané například v práci Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro 1985). Například lze použít sterilní šalin a fosfátem pufrovaný šalin při fyziologickém pH. Farmaceutický prostředek může obsahovat i konzervační látky, stabilizátory, barviva a příchuti. Jako konzervační látky lze přidat benzoan sodný, sorbovou kyselinu a estery p-hydroxybenzoové kyseliny (viz. tamtéž strana 1449). Dále lze použít antioxidanty a suspendující činidla (viz. tamtéž) .

Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být ve formě tablet, kapsulí nebo roztoků pro perorální podávání; čípků pro rektální podávání; sterilních roztoků a suspenzí pro injekce; apod. Způsob dávkování a podávání lze upravit pro každý případ (k dosažení optimální účinnosti), ale obecně závisí na faktorech, jako je hmotnost, dieta, komedikace a dalších faktorech, které odborníci znají.

Při parenterálním podávání (jako je intravenózní denní podávání) lze připravit v běžné formě farmaceutický prostředek pro injekce buď jako roztok nebo suspenzi, pevnou látku vhodnou pro rozpouštění (nebo suspenzi) v kapalině před podáním injekce, nebo jako emulzi. Vhodné přísady jsou například voda, šalin, dextrosa, mannitol, laktosa, lecitin, albumin, glutaman sodný apod. Dále může v případě potřeby farmaceutický prostředek pro injekce obsahovat menší menší množství netoxických přísad jako • · · · ·· ·· • · · · ♦ ··· ··· · · · · · je zvlhčovadlo, pH pufr apod. V případě potřeby lze použít prostředky usnadňující vstřebávání (např. liposomy).

5. Použití

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu, které jsou inhibitory aktivity urokinázy a/nebo jsou aktivní při redukci nebo inhibici tvorby cév, včetně angiogeneze a neovaskularizace, lze použít při řadě in vitro a in vivo aplikací, z nichž některé jsou popsány níže.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou aktivní jako inhibitory urokinázy a specificky váží urokinázu. Proto lze tyto sloučeniny, které obsahují vhodná místa pro zakotvení na pevnou fázi nebo gel, použít in vitro pro afinitní chromatografii k izolaci urokinázy ze vzorku nebo k odstranění urokinázy ze vzorku za použití postupů běžné afinitní chromatografie. Tyto sloučeniny se připojí ke stacionární fázi při afinitní chromatografií běžnými metodami bud' přímo nebo přes vhodnou spojku. Viz. např. Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons (J.E. Coligana další, 1997) a Protein Purification Protocols, Humana Press (S. Doonan, 1966) a zde uvedené odkazy.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu s inhibiční aktivitou proti urokináze jsou vhodné při in vitro testech k měření tPA aktivity ve vzorku. Při testech, kdy se měří celková aktivační aktivita plasminogenu ve vzorku krve, sloučenina podle předkládaného vynálezu s inhibiční aktivitou proti urokináze odstraní část aktivace plasminogenu příslušející uPA, což umožní výpočet podílu celkové aktivace plasminogenu vlivem aktivity tPA a uPA. Tyto testy monitorující tPA aktivitu umožní lepší dávkování u pacientů, kterým se podává tPA. Tyto testy lze také použít pro « · · ·· ·· ·· « 9 · 9 9 9 9 ··« • · · · ·· 9 · · sledování aktivity uPA ve vzorcích tkáně např. z biopsie nebo pro sledování uPA/tPA aktivity při jakýchkoliv klinických stavech, kdy je nutné měřit aktivační aktivitu plasminogenu. Tyto testy lze také použít pro sledování aktivační aktivity plasminogenu, když byl pacient léčen neendogenní sloučeninou s aktivační aktivitou plasminogenu, jako je streptokináza a stafylokináza.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou vhodné při in vivo léčení patologických stavů, kdy pomáhá snížení aktivity urokináza. Tyto sloučeniny například inhibují aktivaci metaloproteáz pomocí uPA-plasminové kaskády v synoviální tekutině, a tak je lze použít při léčení artritidy.

Má se za to, že tyto sloučeniny budou vhodné pro redukci nebo inhibici metastáze, neovaskularizace a rozkladu extracelulární matrice nádorů a dalších novotvarů. Tyto sloučeniny budou vhodné jako léčiva při léčení stavů vyznačujících se patologickou neovaskularizací jako jsou choroby sítnice, retinopatie a další stavy včetně popsaných zde v oddílech oblast techniky a dosavadní stav techniky.

Další aplikací sloučenin podle předkládaného vynálezu, které jsou inhibitory urokinázy, je funkce jako protijed, když bylo pacientovi podáno příliš mnoho exogenní urokinázy za účelem např. rozpuštění krevní sraženiny.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu lze použít pro léčení zánětů, protože mají protizánětlivé účinky dané inhibici urokinázy, čímž působí na mediátory buněčné adheze nebo migrace. Tyto protizánětlivé aplikace tahrnují léčení vředů a komplikací při transplantaci orgánů.

« α · · · ♦ · · • · · ·· · · · • ·· ······ ·· ·

Předkládaný vynález zahrnuje i způsoby prevence nebo léčení a stavů, kdy je podezřeni na stavy, které lze léčit inhibici aktivity urokinázy, což zahrnuje podání terapeuticky účinného množství sloučenin nebo farmaceutických prostředků podle předkládaného vynálezu uvedeným savcům.

Sloučeniny nebo farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu se podávají in vivo běžně savců, výhodně lidem. Při použití in vivo lze sloučeniny nebo farmaceutické prostředky podávat savcům různými způsoby např.

intravenózně, podkožně, do svalu, nasálně nebo intraperitoneálnš, za použití různých dávkovačích forem. Podávání je vhodné perorálně např. tabletami, kapsulemi nebo roztoky podávanými na denní bázi.

perorálně, parenterálně, do tračníku, rektálně,

Při aplikaci způsobů podle předkládaného vynálezu se sloučeniny nebo farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu podávají samostatně nebo v kombinaci jedna s druhou nebo v kombinaci s dalšími therapeutickými nebo in vivo diagnostickými činidly.

Jak je odborníkům zřejmé, „terapeuticky účinné množství sloučeniny nebo farmaceutického prostředku podle předkládaného vynálezu se liší podle věku, hmotnosti' a druhu léčeného savce, konkrétní použité sloučeniny, konkrétního způsobu podávání a požadovaného účinku a terapeutické indikace. Protože jsou tyto faktory a jejich vztahy ke stanovení uvedeného množství dobře známé, je toto stanovení terapeuticky účinného množství a dávky a množství nezbytného pro dosažení požadovaných výsledků při inhibici aktivity uPA v rámci znalostí odborníků v této oblasti. Typicky podávání sloučenin nebo farmaceutických prostředků podle předkládaného vynálezu začíná nižší dávkou, která se zvyšuje dokud se nedosáhne požadovaného účinku při inhibici

9 9 · · · · · · ·

9 99 9 9 · 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 9999 99 999 aktivity uPA, což definuje terapeuticky účinné množství. Pro sloučeniny podle předkládaného vynálezu podávané samostatně nebo jako součást farmaceutického prostředku, je tato dávka od 0,01 mg/kg do 100 mg/kg tělesné hmotnosti,. vhodně od 0,01 do 10 mg/kg tělesné hmotnosti.

Pro lepší pochopení je předkládaný vynález dále ilustrován následujícími příklady., Tyto příklady v žádném případě vynález neomezují a do vynálezu patří i variace, které jsou nyní známé nebo budou později vyvinuty v rámci znalostí odborníků, jak je zde popsáno a dále nárokováno.

Příklady provedení vynálezu

A. Příprava výchozí látky (viz. obr. 1)

Příklad 1

Příprava N-a -1 - butoxykarbonyl - N⁹-ni troargininyl- N-methoxy-N-methylamidu

41,2 g (407 mmol, 1,3 ekvivalentu) 4-methylmorfolinu se přidá k roztoku 100 g (313 mmol) N-α-1-butoxykarbonyl-N^-nitroargininu, 61,2 g (626 mmol, 2 ekvivalenty) hydrochloridů N,O-dimethylhydroxylaminu, 77,9 g (407 mmol, 1,3 ekvivalentu) a EDC 55,1 g (407 mmol, 1,3 ekvivalentu) 1-hydroxybenzotriazolu v 523 ml bezvodého acetonitrilu. Reakční směs se míchá 16 hodin při teplotě místnosti a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Zbytek se extrahuje mezi ethylacetát a vodu. Vodná fáze se extrahuje ··· ·· ·· ···· ·· ··· dvakrát ethylacetátem. Spojené organické vrstvy se jednou promyjí IN roztokem kyseliny chlorovodíkové, jednou vodou, jednou nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, jednou vodou a potom se suší nad síranem hořečnatým, filtrují se a odpaří se ve vakuu. Sloučenina uvedená v názvu se získá ve výtěžku 78 % ve formě bílé pěny a použije se bez čištění. Podle TLC (chromatografie na tenké vrstvě) je produkt uspokojivě čistý. R_f = 0,21 (10 % methanol/dichlormethan) . HS (M+H*) = 363,0, vypočteno (MW) =362,2.

Ή NMR (400 MHz, deuterochloroform) δ 1,47 (s, 9H) , 1,55-1,68 (m, 2H) , 1,71-1,83 (š, 2H) , 3,23 (s, 3H) , 3,25-3,35 (m, IH) , 3,55-3,68 (m, IH) , 3,75-3,80 (s, 3H),'4,66 (t, IH) , 5,63 (d, IH) .

Příklad 2

Příprava N-α-t-butoxykarbonyl-N^-nitro-argininalu

OH

NO₂

K roztoku 25 g (68,9 mmol, 1 ekvivalent) sloučeniny z příkladu 1 v 300 ml bezvodého tetrahydrofuranu v llitrové tříhrlé baňce s kulatým dnem se při teplotě -78 °C během 30 minut v dusíkové atmosféře přikape 100 ml (1,45 ekvivalentu) 1M roztoku lithiumaluminumhydridu v tetrahydrofuranu. Reakční směs se míchá 1 hodinu při teplotě. -78 °C a potom se nechá míchat 20 až 30 minut při teplotě místnosti. Objeví se hustá sraženina. Reakční směs se znovu ochladí na -78 °C a pomalu se rozloží 100 ml 2M roztoku hydrogensíránu draselného. Sraženina se odfiltruje a promyje se 200 ml tetrahydrofuranu. Spojené filtráty se odpaří ve vakuu. Surový zbytek se extrahuje mezi ethylacetát a vodu.

Organická fáze se promyje 0, 5N roztokem kyseliny chlorvodíkové, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sdoného a solankou. Zbytek se suší nad síranem hořečnatým a filtruje se. Po odpaření filtrátu se získá 15,9 g (výtěžek 76 %) sloučeniny uvedené v názvu ve formě bílé pevné látky. Rf = 0,13 (50 % hexan/ ethylacetát). Požadovaný produkt se identifikuje pomocí TLC. HS : (M+H*) = 304,0, vypočteno (MW) 303,1.

Ή NMR (400 MHz, deuterochloroform) : δ 1,47 (s, 9H) , 1,55-1,68 (m, 2H) , 1,71-1,83 (m, 2H) , 3,19-3,35 (m, 2H) , 4,41-4,48 (m,

1K), 5,82 (s, IH).

Alternativně se může sloučenina uvedená v názvu připravit podle postupu popsaného v příkladu 2 US patentu číslo 5,731,413.

Příklad 3

Příprava ethylesteru 6-[(N-a-t-butoxykarbonyl-N⁹-nitro-argininal)cyklol]hexanové kyseliny

Boc

O N„ (CH₂)_s

CO₂£t

NH₂ no₂

K míchajícímu se roztoku 32,7 g (107,9 mmol, 1 ekvivalent) sloučeniny z příkladu 2 a 86,5 g (539,6 mmol, 5 ekvivalentů) ethyl-6-hydroxyhexanoátu v 20 ml acetonitrilu se přidá 260 μΐ 3N kyseliny chlorovodíkové. Všechny reaktanty přejdou do roztoku po 15 minutách při teplotě místnosti. Po 24 hodinách míchání směsi se odebere malý alikvotní díl a podle TLC a hmotové spektroskopie se určí postup reakce. Potom se k reakční směsi přidá 55,1 g (539,6 mmol, 5 ekvivalentů) anhydridu kyseliny octové a 42,7 g (539,6 mmol, 5 ekvivalentů) pyridinu čímž se zablokuje přebytek hydroxyesterového můstku. Reakce se nechá pokračovat přes noc. Zbytek se odpaří. Zbytek se převede do ethylacetátu a jednou se promyje IN kyselinou chlorovodíkovou, jednou vodou, jednou nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, jednou vodou a suší se nad síranem hořečnatým, filtruje se a odpaří se. Zbytek se čistí pomocí velmi rychlé chromatografie na silikagelu za použití gradientu směsi 25 až 33 % hexanu v ethylacetátu a získá se 45,0 g sloučeniny uvedené v názvu ve výtěžku 93,7 % ve formě viskózního oleje. R_£ = 0,24 (50 % hexan/ethylacetát). HS: (M+H^r) = 446,0, vypočteno (MW) = 445,2.

^:H NMR	(400	MHz, deuterochloroform) : δ.1,25 (t, 3H) ,	1,31	-1,38
(m, 2H	) ,	1,45 (s, 9H), 1,50-1,83 (ra, 8H; alif.	, b,	g)'
2,25-2,	35	(m, 2H) , 2,05-3-28 (m, 1,5H), 3,30-3,45	(m,	2H) ,
3,55-3,	65 l	!š, 5H) , 3,75-3,83 (š, IH) , 4,05-4,15 (m,	2H) ,	4,85
(a, ln)	, 5,	6 0 (s, IH.) .

Příklad 4

Příprava soli kyseliny octové a ethylesteru 6-[ (N-cc-1-butoxykarbonyl -argininal)cyklol]hexanové kyseliny

(CH₂)₅

CO₂Et

K roztoku 45,8 g (103,0 mmol, 1 ekvivalent) sloučeniny z příkladu 3 ve 200 ml směsi ethanol/voda/octová kyselina se přidá 9,2 g (20 % hmotnostních) 10% palladia na uhlí. Směs se hydrogenuje při tlaku 276 kPa 16 hodin. Roztok se filtruje a filtrát se odpaří ve vakuu. Zbytek se převede do vody a třikrát se promyje etherem. Organická vrstva se extrahuje jednou vodou. Vodné • · · » · •·· ·· ·· · · · · ·· ··· fáze se spojí a lyofilizují se a získá se 44,7 g (výtěžek 94,4 %) sloučeniny uvedené v názvu. R_f=0,18 (dichlormethan/methanol/konc. hydroxid amonný; 25:5:1).' HS: (M+H*) = 401,0, vypočteno (MW) 400,2. ^:H NMR (400 MHz, deuterochloroform): δ 1,25 (t, 3H) , 1,31-1,38 (m, 2H) , 1,45 (s, 9H) , 1,50-1,83 (m, 8H; alif., b, g), 2,25- 2,35 (m, 2H), 3,05-3,28 (m, 1,5H), 3,32-3,48 (m, 2H), 3,55-3,61 (š, 5H), 3,63-3,73 (m, 1H),

4,08-4,15 (m, 2H), 4,89 (d, 1H), 5,14 (d, 1H).

Příklad 5

Příprava ethylesteru 6-[(Ν-α-t-butoxykarbonyl-N-omega-allyloxykarbonylargininal)cyklol]hexanové kyseliny

CO₂Et

K suspenzi 44,7 g (97,3 mmol, 1 ekvivalent) sloučeniny z příkladu 4 v 292 ml dichlormethanu se po částech při 0 °C přidá roztok 291,9 ml (291,9 mmol, 3 ekvivalenty) IN hydroxidu sodného, aby se pH udrželo mezi 11 až 13. K reakční směsi ve třech dávkách přidá 15,3 g (126,5 mmol, 1,3 ekvivalentu) allylchloroformátu. Po 1 hodině monitorování reakce pomocí TLC a HS se směs extrahuje třikrát dichlormethanem, suší se nad síranem hořečnatým, filtruje se a odpaří. Surový zbytek se čistí okamžitě pomocí velmi rychlé chromatografie na silikagelu zá použití směsi hexanu a ethylacetátu jako eluentu. Získá se 41,5 g sloučeniny uvedené názvu ve výtěžku 88,0 % ve formě viskozního oleje. R_£ = 0,30 (50 % hexan/ethylacetát) HS: (M+H*) = 485,0, vypočteno (MW) = 484,2. ^XH NMR (400 MHz, deuterochloroform) : δ 1,24 (t, 3H) , 1,31-1,38 (m, 2H) , 1,45 (s, 9H) , 1,50-1,83 (m, • a · ·· ·· ·· • · « · · · · ··· ···'·· a · ···· ·· · · ·

8H; alif.	, b,	g)	, 2,25-2,33	(m, 2H)', 2,90-3,12	(m, 1,5H),
3,30-3,45	(m,	2Hi	), 3,55-3,65	(š, 5H), 3,75-3,83	(Š, 1H),
4,05-4,15	(m,	2H)	4,57 (d, 2H)	, 4,83 (s, ÍH), 5,25	(kv, 2H) ,
5,90-6,05	(m,	ÍH) .

Příklad 6

Příprava 6- [ (N-cc-t-butoxykarbonyl-N-omega-allyloxykarbonylargininal)cyklol]hexanové kyseliny

co₂h

K roztoku 40,3 g (83,2 mmol) sloučeniny z příkladu 5 v 83,2 ml ethanolu se přidá 55,5 ml (166,4 mmol, 2 ekvivalenty) 3N hydroxidu lithného.Po 2,5 hodinách míchání -při teplotě místnosti se reakční směs odpaří ve vakuu. Zbytek se rozpustí ve vodě a třikrát se promyje etherem. Vodná fáze se okyselí pomocí IN kyseliny chlorovodíkové na pH 2 až 3 a extrahuje se dichlormethanem. Roztok se suší nad síranem hořečnatým, filtruje se a odpaří se a získá se 31,5 g sloučeniny uvedené v názvu ve výtěžku 83,0 % ve formě bílé sklovité pěny. R_£ = 0,33 (ethylacetát). HS: (Μ+ΗΊ = 457,1, vypočteno (MW) = 456,2. ^XH NMR (400 MHz, deuterochloroform) : δ 1,45 (s, 9H) , 1,52-1,87 (m, 10H;

alif., b, g), 2,32-2,43 (m, 2H), 3,05-3,28 (m, 1,5H), 3,37-3,55 (m, 2H) , 3,83 (s, ÍH) , 4,57-4,65 (m, 2H) , 4,88 (d, ÍH) , 5,31 (kv, 2H), 5,53 (s, ÍH), 5,90-6,05 (m, ÍH).

Příklad 7

Příprava 6-[(Ν-α-t-butoxykarbonyl-N-omega-allyloxykarbonylargininal)cyklol]hexanoyl-aminomethylované polystyrénové pryskyřice

(CH₂)₅

O AM pryskyřice

K 22,6 g (26,2 mmol, 1 ekvivalent) aminomethylované polystyrénové pryskyřice se při teplotě místnosti přidá 15,5 g (34,0 mmol, 1,3 ekvivalentu) sloučeniny z příkladu 6 a 17,7 g (34,0 mmol, 1,3 ekvivalentu) PyBOP v 214 ml dimethylformamidu a potom 4,4 g (34,0 mmol, 1,3 ekvivalentu) diisopropylethylaminu. Směs se nechá pomalu -míchat v baňce s kulatým dnem přes noc. Pryskyřice se promyje větším množstvím diehlormethanu a methanolu. Pryskyřice se suší za vysokého vakua (3mg vzorek sušené pryskyřice se odebere na Kaiserúv test) a acetyluje se směsí dimethylformamid/anhydrid kyseliny octové/triethylamin (8:1:1) 30 minut při teplotě místnosti. Pryskyřice se znovu postupně promyje dichlormethanem a methanolem a suší se za vakua a získá se 408 g (hmotnostní výtěžek 92,0 %) Kaiserúv test (O.D: 99 % kondenzováno); substituce pryskyřice (asi 0,75 mmol/g).

B. Obecný postup přípravy sloučenin v menších množstvích na pevné fázi

Syntéza na pevné fázi je vhodná pro přípravu malých množství určitých sloučenin podle předkládaného vynálezu. Jako při běžné přípravě peptidů na pevné fázi se reaktory pro syntézu peptidylargininalú na pevné fázi skládají z reakční nádoby s nejméně

• · • · · 9 .	9 9 9 9 • 9 9	9 9 9 '' .9	' 9 9
• 99 9 9 9 9	• 9 9 9 9 9 · · 9	• · 99	9 9

jedním povrchem prostupným pro rozpouštědlo a rozpuštěná činidla, ale neprostupným pro syntetizovanou pryskyřici o vybrané velikosti oka. Tyto reaktory obsahují skleněnou reakční nádobu pro reakci na pevné fázi s fritou ze sintrovaného skla, polypropylenové trubičky nebo kolony s fritami nebo reaktor ?Cans‘^ od společnosti Irori lne., San Diego CA. Vybraný typ reaktoru závisí na objemu potřebné pryskyřice, která tvoří pevnou fázi a v různých stupních syntézy se mohou použít různé 'typy reaktorů.

Příklad 8 popisuje obecný postup syntézy na pevné fázi malých množství sloučenin podle předkládaného vynálezu. Viz. obr. 2. Modifikace tohoto postupu za vzniku dalších sloučenin podél předkládaného vynálezu jsou popsané v příkladech 9 až 15.

Příklad 8

Syntéza isobutyloxykarbonyl-D-seryl-L-alanyl-argininalu (sloučenina 1) na pevné fázi

Krok 1: Příprava 6-[(N-omega-allyloxykarbonyl-argininal)cyklol]hexanoylaminomethylované polystyrénové pryskyřice

H,N

ΝγΝΗ₂

O N_xi Alloc (CH₂)₅

O AM pryskyřice • · · · ·· · · • · · · · ··· • · · · · · · · • · · · · · · ·' · ··· · · ·· ···· ·· ···

Do 60ml reakční nádoby pro syntézu na pevné fázi se přidá 2,0 g sloučeniny z příkladu 7 (0,6 až 0,7 meq/g substituce) a směs 12 ml dichlormethanu 6 ml kyseliny trifluoroctové a 2 ml thioanisolu. 15 minut se probublává plynný dusík. Reaktanty se oddělí od pryskyřice a potom se pryskyřice postupně promyje dvakrát 20 ml dichlormethanu, 20 ml diisopropylethylaminu, dvakrát 20 ml dichlormethanu, 20 ml diisopropylethylaminu, dvakrát 20 ml dichlormethanu a dvakrát 20 ml diethyletheru. Sloučenina uvedená v názvu se skladuje ve vakuu. Při ninhydrinovém testu pryskyřice se objeví tmavě modrá barva typická pro volný amin připravený odstraněním t-butoxykarbonylové skupiny.

Krok 2: Příprava 6-[(N-a-Fmoc-alanyl-N-omega-allyloxykarbonylargininal)cyklol]hexanoylaminomethylované polystyrénové pryskyřice

2,1 g sloučeniny z kroku 1 se umístí do reakční nádoby pro syntézu na pevné fázi do které se přidal 1 g (3,2 mmol) Fmocalanínu, 0,5 g (3,2 mmol) 1-hydroxybenzotriazolu, 1,024 g (3,2 mmol) TBTU a 600 μΐ (3,4 mmol) diisopropylethylaminu v 15 až 20 ml dimethylformamidu. Reaktorem se při teplotě místnosti 2 hodiny probublává plynný dusík. Činidla se oddělí od pryskyřice a pryskyřice se postupně promyje dvakrát 2 0 ml dimethylformamidu, dvakrát 20 ml dichlormethanu, dvakrát 20 ml dimethylformamidu, dvakrát 20 ml dichlormethanu a dvakrát 20 ml diethyletheru. Pryskyřice se suší ve vakuu a malý alikvotní díl se odebere na ninhydrinový kolorimetrický test, který ukáže kondenzační účinnost 99,5 % při přípravě sloučeniny uvedené v názvu .

Ί2.

Krok 3: Příprava 6-[(alanyl-N-omega-allyloxykarbonyl-argininal ) cyklol ] hexanoyl - aminomethylované polystyrénové pryskyřice

Sloučenina z kroku 2 se reaguje s 20 ml 50% piperidinu v dimethyl f ormamidu 30 minut při teplotě místnosti za promíchání dusíkem. Pryskyřice se promyje stejně, jako je uvedeno výše a suší se ve vakuu za získání sloučeniny uvedené v názvu. Ninhydrinový test malého alikvotního podílu poskytne tmavě modrou pryskyřici a roztok vykazující vysoký výtěžek odstranění chránící skupiny.

Krok 4: Příprava 6-[(Ν-α-Fmoc-D-seryl(O-t-butyl)-alanyl-N-omega-allyloxykarbonyl-argininal)cyklol]hexanoyl-aminomethylované polystyrénové pryskyřice

FmoCx

O

N

H

O

100 mg sloučeniny z kroku 3 se umístí do reakční nádoby Kan™. Nádoba se umístí do 20ml viálky obsahující 4 ml dimethylformamidu, 184 mg (0,48 mmol) Ν-α-Fmoc-D-serin(O-t- butyl), 73 mg (0,48 mmol) 1-hydroxybenzotriazolu, 154 mg (0,48 mmol) TBTU a ·· · · · * · · • ···· · · · ··· ·· · · * • · · ··· ··'· ··· ·· ·· ···· ·· ··· μΐ (0,48 mmol) diísopropylethylaminu. Nádoba se třepe 3 hodiny na třepací desce. Nádoba se zbaví rozpouštědel, postupně se promyje dvakrát 3 ml dimethylformamidu, dvakrát 3 ml dichlormethanu, dvakrát 3 ml dimethylformamidu, dvakrát 3 ml dichlormethanu, dvakrát 3 ml isopropanolu, dvakrát 3 ml dichlormethanu, dvakrát 3 ml isopropanolu, a dvakrát 3 ml diethyletheru. Pryskyřice se suší ve vakuu a získá se sloučenina uvedená v názvu.

Krok 5: Příprava 6-[ (D-seryl(O-t-butyl)-alanyl-N-omega-allyloxykarbonyl-argininal) cyklol] -hexanoyl-aminomethylováné polystyrénové pryskyřice

Nádoba obsahující sloučeninu z kroku 4 se reaguje s 5 ml 50% piperidinu v dimethylformamidu v 20 ml viálce 45 minut při teplotě místnosti, přičemž se třepe na třepací desce. Pryskyřice se promyje stejně, jako je uvedeno výše a suší se ve vakuu a získá se sloučenina z kroku 5. Ninhydrinový test malého alikvotního dílu poskytne tmavě modrou pryskyřici a roztok vykazuje vysoký stupeň odstranění chránících skupin.

Krok 6: Příprava karbamátových analogů 6-[(D-seryl(O-t-butyl)a1anyl-N-omega-allyloxykarbonyl-argininal)cyklol]hexanoyl-aminomethylované polystyrénové pryskyřice, jako je:

Nádoba obsahující sloučeninu z kroku 5, společně s dalšími nádobami obsahujícími příbuzná analoga vázaná k pryskyřici (viz. příklady 9 až 14 níže), se každá umístí do 20ml viálky s 0,12M různými chloroformiáty, včetně isobutylchloroformiátu, v 5 až 10 ml dimethylformamidu. Přidá se 105 až 210 μΐ (0,6 až 1,2 mmol) diisopropylethylaminu a viálky sse třepou 2,5 hodiny. Ze všech nádob s,e oddělí rozpouštědlo a postupně se promyjí dvakrát 3 ml dimethylformamidu, dvakrát 3 ml dichlormethanu, dvakrát 3 ml dimethylformamidu, dvakrát 3 ml dichlormethanu, dvakrát 3 ml isopropanolu, dvakrát 3 ml dichlormethanu, dvakrát 3 ml isopropanolu, a dvakrát 3 ml diethyletheru. Kans™ se suší ve vakuu, včetně té, která obsahuje 6-[(isobutyloxykarbonylD-seryl(0-t-butyl)-alanyl-Ν-ω-allyloxykarbonyl-argininal)cyklol]-hexanoyl-aminomethylovanou polystyrénovou pryskyřici.

Krok 7: Příprava karbamátových analogů 6-[(D-seryl(O-t-butyl)a1anyl-argininal)cyklol]hexanoyl-aminomethy1ováné polystyrénové pryskyřice, jako je:

• ·· ·· ·· ·· ·« · ···· 9 9 1

91 ·· · 99

1 9 9 9 9 ··’·

199 19 19 9999 91 999

Odstranění allyloxychráníci skupiny z produktu kroku 5 se provede u několika sloučenin podle vynálezu současně umístěním souboru 38 nádob do 250ml polypropylenové nádoby a přidáním směsi 10 ml methylsulfoxidu, 10 ml tetrahydrofuranu, 2,5 ml IN kyseliny chlorovodíkové a 25 ml morfolínu. Potom se přidá 0,87 g tetrakistrifenylfosfinpaladia a nádoby se třepou 4 hodiny při teplotě místnosti. Nádoby, včetně té, která obsahuje 6-[ (isobutyloxykarbonyl-D-seryl(O-t-butyl)-alanyl-argininal)cyklol]hexanoylaminomethylovanou polystyrovou pryskyřici, se oddělí od rozpouštědel a postupně se promyjí dvakrát 3 ml dimethylformamidu, dvakrát 3 ml dichlormethanu, dvakrát 3 ml dimethylformamidu, dvakrát 3 ml dichlormethanu, dvakrát 3 ml isopropanolu, dvakrát 3 ml dichlormethanu, dvakrát 3 ml isopropanolu a dvakrát 3 ml diethyletheru a suší se ve vakuu za získáni jednotlivých sloučenin v nádobách.

Krok '8: Příprava isobutyloxykarbonyl-D-seryl-alanyl-argininalu

Nádoba obsahující 6-[(isobutyloxykarbonyl-D-seryl(O-t-butyl)· alanyl-argininal)cyklol]hexanoyl-aminomethylovanou polystyrénovou pryskyřici se vyprázdní na polypropylenovou minikolonu Whatman obsahující směs trifluoroctová kyselina/dichlormethan/ voda (1,5 ml směsi 6:3:1) . Kolona se 4 hodiny třepe při teplotě místnosti. Z reakčního roztoku se do zkumavky odstraní rozpouštědla a pryskyřice se promyje dichlormethanem a vodou. Promývací směsi a reakční směs se spojí do stejné zkumavky a směs se ··· · · · · · • ··· · · ·· · • > · 5 · · · ' ·· ······ ·· · třepe a potom se nechá rozdělit na dvě fáze. Vodná vrstva se oddělí a filtruje. Sloučenina uvedená v názvu (sloučenina 1) se čistí pomocí semipreparativní HPLC na reverzní fázi, lyofilizuje a zváží a analyzuje se pomocí HPLC a hmotové spektroskopie. Alternativní způsob syntézy sloučeniny 1 je uvedeno v příkladech 36 až 43.

Příklad 9

Syntéza benzyloxykarbonyl-D-seryl-alanyl-argininalu (sloučenina 2) na pevné fázi

Zopakováním kroku 1 až 4 a 7 až 8 z příkladu 8 a náhradou CbzD-serin(O-t-butyl) v kroku 4 za Fmoc-D-serin(O-t-butyl) se připraví benzyloxykarbonyl-D-serylalanylargininal, sloučenina 2.

Příklad 10

Syntéza sloučenin 3 až 9 a 35 až 40 na pevné fázi

Následující sloučeniny se připraví zopakováním kroků 1 až 8 z příkladu 8 přičemž se v kroku 6 nahradí isobutylchloroformiát za uvedené sloučeniny:

Slouč. číslo	Název sloučeniny	Náhrada v kroku 6
3	(-)menthyloxy-karbonyl-D-seryl-alanyl-argininal	(-)menthy1chloroformiát
4	2-naftyloxy-karbonyl-D-seryl-alanylargininal	2-naftylchloroformiát
5	fenoxykarbonyl-D-serylalanyl-argininal	fenylehloroformiát
6	2 - ethylhexyloxykarbonyl-D-seryl-alanylargininal	2-ethylhexylchloroformiát

A 9 · · ·· · · • · · · · ··· ·«· ·* · ··

Slouč. číslo	Název sloučeniny	Náhrada v kroku 6
Ί	(+)menthyloxy-karbonyl-D-seryl-ala- nyl-argininal	(+)menthylchloroformiát
8	methyloxykarbonyl-D-seryl-alany1-argininal	methylchloroformiát
9	n-butyloxykarbonyl-D-seryl-alanylargininal	n-butylchloroformiát
35	3-cyklohexylpropionyl-D-seryl-alanyl - argininal	3-cyklohexylpropionylchlorid
36	cyklohexylmethyloxykarbonyl-D-serylalanylargininal	cyklohexylmethylchloroformiát
37	cyklohexylmethylazakarbonyl-D-serylalanylargininal	cyklohexylmethylisokyanát
38	benzylazakarbonyl-D-seryl-alanylargininal	benzylisokyanát
39	isovaleryl-D-serylalanyl-argininal	isovalerylchlorid
40	i sopropyloxykarbonyl-D-seryl-alanylargininal	isopropy1chloroformiát

Příklad 11

Syntéza fluorenylmethyloxykarbonyl-D-séry1-alanyl-argininalu (sloučeniny 10) na pevné fázi

Zopakováním kroků 1 až 4 a kroků 7 a 8 z příkladu 8 se připraví fluorenylmethyloxykarbonyl-D- séry1-alanyl-argininal, sloučenina 10 .

Příklad 12

Syntéza sloučenin 11 až 18 na pevné fázi

Sloučeniny 11 až 18 se připraví pomocí zopakování postupu popsaného v krocích 1 až 4 a 7 až 8 v příkladu 8, přičemž se v kroku 4 nahradí Cbz-D-serin(O-t-butyl) za Fmoc-D-serin(O-tbutyl) , a v kroku 2 se provede naznačená substituce za Fmocalanin .

Slouč. č.	Název sloučeniny	Substituce v kroku 2
11	benzyloxykarbonyl-D-seryl-prolylargininal	Fmoc-prolin
12	benzyloxykarbonyl-D-seryl-L-azetidin2-karbonyl-argininal	Fmoc-L-azetidin-2-karboxylová kyselina
13	benzyloxykarbonyl - D- seryl - pipekoly'1 argininal	Fmoc-pipekolová kyselina
14	benzyloxykarbonyl-D-seryl-2aminobutanoyl-argininal	Fmoc-2-aminobutanová kyselina
15	benzyloxykarbonyl-D-seryl-Smethy1cystěiny1-argininal	Fmoc-S-methylcystein
16	benzyloxykarbonyl-D-seryl-2-norvalylargininal	Fmoc-norvalin
17	benzyloxykarbonyl-D-seryl-2-glycylargininal	Fmoc-glycin
18	benzyloxykarbonyl-D-seryl-sarkosylargininal	Fmoc-sarkosin

Příklad 13

Syntéza sloučenin 19 až 23 na pevné fázi

Sloučeniny 19 až 23 se připraví tak, že se zopakují kroky 1 až 4 a kroky 7 až 8 z příkladu 8 a v kroku 4 se provede označená substituce za Fmoč-D-serin(0-t-butyl).

Číslo slouč.	Název sloučeniny	Substituce v kroku 4
19	benzyloxykarbonyl-D-allothreonylalanyl-argininal	Cbz-D-allothreonin(O-t-butyl)
20	benzyloxykarbonyl-threonyl-alanyl- argininai	Cbz-threonin(O-t-butyl)
21	benzyloxykarbonyl-D-alanyl-alanylargininal	Cbz-D-alanin
22	benzyloxykarbonyl-D-threonylalanyl-argininal	Cbz-D-threonin(O-t-butyl)
23	benzyloxykarbonyl-serylalanylargininal	Cbz-serin(O-t-butyl)

Příklad 14

Syntéza sloučenin 24, 25 a 33 na pevné fázi

Sloučeniny 24, 25 a 33 se připraví pomocí zopakování kroků 1 až 4 a 7 až 8 z příkladu 8, přičemž se v kroku 4 nahradí Cbz-Dallothreonin(O-t-butyl) za Fmoc-D-serin(O-t-butyl), provede se označená substituce v kroku 2 za Fmoc-alanin.

€ β · • · · ·· ·· · β • · ♦ · · · · ·· • · · · · 9 · · » • · · 6 · « Μ ·· # ··· ··· 4 · «ο· · ο « · ··«· ··

Slouč. číslo	Název sloučeniny	Substituce v kroku 2
24	benzyloxykarbonyl-Dallothreonyl-sarkosyl-argininal	Fmoc-sarkosin
25	benzyloxykarbonyl-Dallothreonyl-N-methylalanylargininal	Fmoc-N-methylalanin

Příklad 15

Syntéza sloučenin 26 až 27 na pevné fázi

Sloučeniny 26 až 27 se připraví pomocí zopakování kroků 1 až 4 a 7 až 8 z příkladu 8, přičemž se v kroku 2 nahradí Fmoc-prolin za Fmoc-alanin a v kroku 3 se provede označená substituce za

Fmoc-D-serin(O-t-butyl).

Slouč. číslo	Název sloučeniny	Substituce v kroku 2
26	benzyloxykarbonyl-D-threonylprolyl-argininal	Cbz-D-threonin(O-t-butyl)
27	benzyloxykarbonyl-D-homoserylprolyl-argininal	Cbz-D-homoserin(O-t-butyl)

Příklad 16

Syntéza sloučenin 41 až 43 na pevné fázi

Sloučeniny 41 až 43 se připraví pomocí zopakování kroků 1 až 4 a 7 až 8 z příkladu 8, přičemž se v kroku 4 nahradí N-a-CbzN-3-Fmoc-D-2,3-diaminopropionová kyselina za Fmoc-D-serin(0-tbutyl), a v kroku 6 se provede označená substituce za jednotlivé chloroformiáty:

Slouč. číslo	Název sloučeniny	Substituce v kroku 6
41	Ν-a-benzyloxykarbonyl-Ν-β-2-fenylethylkarbonyl-D-2,3-diaminopropionyl-alanyl-argininal	hydrocinnamoylchlorid
42	Ν-α-Ν-β-dibenzyloxykarbonyl-D-2,3-diaminopropionyl -alanyl-argininal	benzylchloroformiát
43	N-α-benzyloxykarbonyl-N-β-methyloxykarbonylD-2,3-diaminopropionyl-alanyl-argininal	methylchloroformiát

C. Alternativní způsoby syntézy některých sloučenin «4 · · · » * * • · · · · · « (i) Příklady 17 až 21 popisují syntézu trifiuoracetátu benzensulfonyl-D-Ser-L-Ala-L-Arg-al (sloučenina 28). Viz. obr. 3.

Příklad 17

Syntéza acetátu D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe

,0 ch₃co₂h · h₂ och₃

4,97 g (16,8 mmol) Ν-α-Cbz-D-serinu (Bachem), 4,7 g (33,7 mmol) hydrochloridu methylesteru alaninu (Novabiochem), 6,5 g (33,7 mmol) EDC a 2,6 g (16,8 mmol) 1-hydroxybenzotriazolu se smísí a přidá se 67 ml acetonitrilu. Po 10 minutách míchání suspenze se přidá 14,4 ml (84 mmol) diisopropylethylaminu a získaná čirá směs se míchá dalších 18 hodin. Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku a zbytek se suspenduje v 500 ml ethylacetátu. Roztok se promyje dvakrát 100 ml 0,5M kyseliny chlorovodíkove, potom dvakrát 100 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 100 ml solanky. Organická vrstva se potom suší nad síranem sodným a roztpouštšdlo se odpaří ve vakuu a získá se Cbz-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe v kvantitativním výtěžku jako jeden pík při HPLC na reverzní fázi (C18) v retenčním čase t_R = 16,9 za eluce směsí 0,1 % kyseliny trifluoroctové v 5 až 75% vodném acetonitrilu po dobu 20 minut. Cbz-DSer(0-t-Bu)-Ala-OMe se potom rozpustí ve 150 směsi ethanol/octová kyselina/voda (4:1:1). Baňka se naplní dusíkem a přidá se 1,5 g palladia na uhlí. Tato směs se hydrogenuje 2 hodiny při tlaku 310 kPa. Palladiový katalyzátor se filtruje a rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku a získá se 4,58 g sloučeniny uvedené v názvu ve výtěžku· 95 % ve formě jednoho píku při HPLC na reverzní fázi (C18) (t_R = 8,0 minut za eluce směsí 0,1 % kyseliny trifluoroctové v 5 až 75% vodném acetonitrilu během 20 minut) a HS (M+H=247,2).

Příklad 18

Syntéza benzensufonyl-D-Ser(O-t-2u)-Ala-OMe

K míchající se suspenzi 1,0 g (3,3 mmol) sloučeniny z příkladu 17 v 13 ml acetonitrilu se přidá 0,87 g (4,9 mmol) benzensulfonylchloridu. K této směsi se v pěti dílech během 1 hodiny přidá 1,67 ml (9,8 mmol) diísopropylethylaminu. Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku a zbytek se suspenduje v 100 ml ethylacetátu. Roztok se promyje dvakrát 10 ml 0,5M kyseliny chlorovodíkové, potom dvakrát 10 ml hydrogenuhličitanu sodného a 10 ml solanky. Organická vrstva se potom suší nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku. Zbytek se čistí pomocí velmi rychlé chromatografie za eluce směsí 50 % hexanu v ethylacetátu a získá se 0,54 g (1,4 mmol) produktu ve výtěžku 43 %. Produkt poskytne při HPLC na reverzní fázi (C18) jeden pík (t_p=20,2 minuty za eluce směsí 0,1 % kyseliny trifluoroctové v 5 až 75 % vodného acetonitrilu během 20 minut) . ^XH NMR (deuteromethanol): 7,5-7,9 ppm (m,5H), 4,3 ppm (kv,IH), 3,9 ppm

		•	« « « · · » · * • · · · · · ·
		82 «	• · · ·· · · · • ·* · · ··· · »·
(t,ÍH),	3,7 (s,3H) , 3,4 ppm	(m, ÍH) , 3,5 ppm	(m, ÍH) , 1,3 ppm
(d,3H),	1,05 ppm (s,9H).
Příklad	19
Syntéza	benzensufonyl-D-Ser(0-	t-Bu)-Ala-OH

Κ 0,53 g (1,4 mmol) sloučeniny z příkladu 18 v 9 ml methanolu se přidá 3,0 ml (3 mmol) l,0M hydroxidu lithného. Po 18 hodinách míchání se reakční směs nanese na lOml kolonu iontoměničové pryskyřice DOWEX (50 x 8-400) a eluuje se 60 ml směsi methanolu a vody 1:1. Methanol se odpaří za sníženého tlaku a zbývající voda se lyofilizuje a získá se 0,49 g (1,3 mmol, 95 %) sloučeniny uvedené v názvu, která vykazuje jeden pík při HPLC na reverzní fázi (C18) (t_R=13,5 minuty za eluce směsí 0,1. % kyseliny trifluoroctové v 5 až 75 % vodného acetonitrilu během 20

minut).		NMR	(deuteromethanol)	: 7,9 ppm (d,2H), 7,6 ppm
(t,ÍH),	7,5	ppm	(t,2H), 4,25 ppm	(kv,lH), 3,9 (t,lH), 3,5 ppm
(m,1H),	3,4	ppm	(m,ÍH), 1,3 ppm (d	,3H), 1,075 ppm (s,9H).
Příklad	20
Syntéza	benzensuf onyl -D-ser (0-t-Bu) -Ala-N^-nitroargininalethyl -
cyklolu

0,0 \\ //

Q^s'^s nh₂ no₂ * ♦ · » 9 9 9 9 • ····'·«

9 1 · · · · · »9 ·· 9 9

Smísí se 0,48 g (1,3 mmol) sloučeniny z příkladu 19, 0,41 g (1,5 mmol) hydrochloridu L-F^-nitroargininalethylcyklolu, 0,37 g (1,9 mmol) EDC a 0,20 g (1,3 mmol) 1-hydroxybenzotriazolu a přidá se 5 ml acetonitrilu.. Po 10 minutách míchání vznikající suspenze se přidá 1,10 ml (84 mmol) diisopropylethylaminu a získaná čirá směs se míchá dalších 18 hodin. Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku a zbytek se suspenduje v 100 ml ethylacetátu. Roztok se promyje dvakrát 10 ml 0,5M kyseliny chlorovodíkové, potom dvakrát 10 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 10 ml solanky. Organická vrstva se suší nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a získá se 0,72 g sloučeniny uvedené v názvu ve výtěžku 95 %. Produkt vykazuje při HPLC na reverzní fázi (C18) jeden pík (t_R=15,2 minuty za eluce směsí 0,1 % kyseliny trifluoroctové v 5 až 75% vodném acetonitrilu během 20 minut), HS (M+H=371).

Příklad 21

Syntéza trifluoracetátu benzensulfonyl-D-Ser-L-Ala-L-Arg-al, (sloučenina 28)

0,92 g (1,23 mmol) sloučeniny z příkladu 20 se hydrogenuje nad 250 g 10% palladia na uhlí v 24,5 ml směsi ethanol/octová kyselina/voda (4:1:1) při tlaku 345 kPa 18 hodin. Katalyzátor se odfiltruje a rozpouštědlo z filtrátu se odpaří ve vakuu a získá se benzylsufonyl-D-Ser(O-t-Bu)-L-Ala-L-argininalethylcyklol v kvantitativním výtěžku, který vykazuje při HPLC na reverzní fázi (C18) jeden pík (t_R=12,8 minuty za eluce směsí 0,1 % trifluoroctové kyseliny v 5-75 % vodného acetonitrilu podobu minut), a HS(M+H=541).

Benzylsufonyl-D-Ser(O-t-Bu)-L-Ala-L-argininalethylcyklol se reaguje s 12,25 ml 6M kyseliny chlorovodíkové, míchá se 1 hodinu a potom se neutralizuje pomocí 6,5M octanu amonného na pH 4.' Tato látka se nanese přímo na preparativní HPLC kolonu a eluuje se gradientem směsi 0 až 20 % vodného acetonitrilu a získá se 88 mg sloučeniny uvedené v názvu ve výtěžku 15 % po lyofilizaci. Sloučenina uvedená v názvu vykazuje při HPLC na reverzní fázi (C18) 3 píky (t_R=8,2 minuty, 9,2 minuty, a 9,5 minuty za eluce směsí 0,1% trifluoroctové kyseliny v 5-50% vodném acetonitrilu během 20 minut), při KS (M+H=457).

(ii) Příklady 22 až 26 popisují syntézu trifluoracetátu benzylsulfonyl-D-Ser-L-Ala-L-Arg-al (sloučenin 29).

Příklad 22

Syntéza benzylsulfonyl-D-Ser(O-t-Bu)-OMe

O

K míchajícímu se roztoku 2,07 g (9,8 mmol) hydrochloridů methylesteru D-serin(O-t-Bu) v 39 ml acetonitrilu se přidá 1,86 g • · β

• · · • · · · · · · · · · ·· 9 9» (9,8 mmol) α-toluensulfonylchloridu. K této směsi se během 1 hodiny v pěti částech přidá 3,7 ml (21,5 mmol) diisopropylethylaminu. Směs se nechá míchat další hodinu. Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku a zbytek se suspenduje v 100 ml ethylacetátu. Roztok se promyje dvakrát 10 ml 0,5M kyseliny chlorovodíkové, potom dvakrát 10 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 10 ml solanky. Organická vrstva se suší nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a získá se 2,84 g sloučeniny uvedené v názvu ve výtěžku 88 %. R_f=0,4 (4:1 ethylacetát:hexan).

Příklad 23

Syntéza benzylsulfonyl-D-Ser(O-t-Bu)-OH

K míchajícímu se roztoku 2,66 g (8,1 mmol) sloučeniny z příkladu 22 v 54 ml methanolu se přidá 17,8 ml (17,8 mmol) 1, 0M roztoku hydroxidu lithného. Reakční směs se nechá míchat 18 hodin, potom se nalije na kolonu 10 ml iontoměničové pryskyřice DOWEX (50 x 8-400) a eluuje se 60 ml směsi methanolu a vody .1:1. Methanol se odpaří za sníženého 'tlaku a zbývající vodný roztok se lyofilizuje za získání 2,47 g sloučeniny uvedené v názvu ve výtěžku 97 %. t_R=14,8 minuty (0,1 % trifluoroctové kyseliny v 5-75% vodném acetonitrilu během 20 minut).

Příklad 24

Syntéza benzylsulfonyl-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe

och₃ o

Smísí se 1,0 g (3,2 mmol) sloučeniny z.příkladu 23, 0,89 g (6,3 mmol) hydrochloridu methylesteru alaninu (Novabiochem), 1,22 g (6,3 mmol) EDC a 0,49 g (3,2 mmol) 1-hydroxybenzotriazol (0,49 g, 3,2 mmol) a přidá se 13 ml acetonitrilu. Po 10 minutách míchání získané suspenze se přidá 2,71 ml (15,8 mmol) diisopropylethylaminu a získaná čirá směs se míchá dalších 18 hodin. Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku a zbytek se suspenduje v 100 ml ethylacetátu. Roztok se promyje dvakrát 10 ml 0, 5M roztoku kyseliny chlorovodíkové., potom dvakrát 10 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 10 ml solanky. Organická vrstva se suší nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a získá se 1,22 g sloučeniny uvedené v názvu ve výtěžku 97 %. t_R=16,2 minuty (0,1 % trifluoroctové kyseliny v

5-75% vodném acetonitrilu během 20 minut).

Příklad 25

Syntéza benzylsulfonyl-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OH

OH

K 1,22 g (3,1 mmol) sloučeniny z příkladu 24 v 22 mlmethanolu se přidá 7,2 ml (7,2 mmol) INI roztoku hydroxidu lithného. Po 18 hodinách míchání se reakční směs nalije na lOml kolonu s iontoměničovou pryskyřicí DOWEX (50x8-400) a eluuje se 60 ml směsi methanolu a vody 1:1. Methanol se odpaří za sníženého

tlaku a vodný roztok se lyofilizuje a získá se 1,16 g sloučeniny uvedené v názvu ve výtěžku 91 %. t„=13,2 minuty (0,1 % trifluoroctové kyseliny v 5-75% vodném acetonitrilu během 20 minut) .

Příklad 26

Syntéza trifluoracetátu benzylsulfonyl-D-ser-Ala-Arg-al (sloučenina 29)

Sloučenina uvedená v názvu se syntetizuje ze sloučeniny z příkladu 25 podle postupu popsaného v příkladu 20 a 21, přičemž se v postupu popsaném v příkladu 20 použije sloučenina z příkladu 25 místo sloučeniny z příkladu 19.

(iii) Příklady 27 až 34 popisují syntézu trifluoracetátu ibutoxykarbonyl-D-Ser-Ala-Arg-CO-fenethylamidu (sloučenina 30) . Viz. obr. 4 .

Příklad 27

Syntéza N-α-t-butoxykarbonyl-NP-nitroArg-COH-fenethylamidu

Η

Ν

Boc_x

Ν

Η

ΟΗ

Smísí se 1,07 g (3 mmol) Ν-α-t-butoxykarbonyl-N^-nitroArg-COHCOOH (připraví se podle postupu popsaného, v US 5,371,072, příklady 2 až 5), 38 ml (3 mmol) fenethylaminu, 1,35 g (3 mmol) BOP a 0,23 g (1,5 mmol) 1-hydroxybenzotriazolu a přidá se 122 ml dimethyl formamidu. Tato směs se míchá 10 minut, potom se přidá 2,01 ml (18 mmol) 4-methylmorfolinu a získaná čirá směs se míchá dalších 18 hodin. Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku a zbytek se suspenduje v 100 ml ethylacetátu. Roztok se promyje dvakrát 10 ml 0,5M roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom dvakrát 10 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 10 ml solanky. Organická vrstva se suší nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku.. Zbytek se čistí pomocí velmi rychlé chromatografie za eluce směsí ethylacetátu a hexanu 4:1) a získá se 1,22 g sloučeniny uvedené v názvu ve výtěžku 8 9 %. t_R=13,2 minuty a 14,1 minuty (0,1 % trifluoroctové kyseliny v 5-75% vodném acetonitrilu během 20 minut) .

Příklad 28

Syntéza t -butoxykarbonyl -Ala-N^-nitroArg-COH- fenethylamidu

Boc'

OH ·· ·· ·t · · « ···» · · · • · · ·· · · · ··· *· ·· ···· ·· ···

K míchajícímu se roztoku 1,22 g (2,7 mmol) sloučeniny z příkladu 27 v 10 ml ethylacetátu se přidá 10 ml 5M roztoku kyseliny chlorovodíkové v ethylacetátu. Po 2 hodinách se vznikající pevná látka odfiltruje, suší a získá se hydrochlorid tf-nitroArgCOH-fenethylamidu v kvantitativním výtěžku. Ten se smísí s 0,77 g (4,1 mmol, Novabiochem) t-butoxykarbonyl-Ala-OH, 2,4 g (5,4 mmol) EDC a 0,42 g (2,7 mmol) 1-hydroxybenzotriazolu; potom se přidá 11 ml acetonitrilu. Tato suspenze se míchá 10 minut a potom se přidá 2,3 ml (13,55 mmol) diisopropylethylaminu. Získaná čirá směs se míchá dalších 18 hodin. Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku a zbytek se suspenduje v 100 ml ethylacetátu. Roztok se promyje dvakrát 10 ml 0,5M roztoku kyseliny chlorovodíkové, potom dvakrát 10 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 10 ml solanky. Organická vrstva se potom suší nad síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu a získá se 1,34 g sloučeniny uvedené v názvu ve výtěžku 95 %. t_R=13,0 minuty a 13,6 minuty (0,1 % trifluoroctové kyseliny v 5-75% vodném acetonitrilu během 20 minut).

Příklad 29

Syntéza hydrochloridu Al a - N⁹-nitroArg-COH-fenethylamidu

1,34 g sloučeniny z příkladu 28 (2,6 mmol) se rozpustí v 10 ml ethylacetátu. K této směsi se přidá 10 ml 5M chlorovodíku v ethylacetátu výsledná směs se míchá. Po 2 hodinách se odfiltruje vzniklá pevná látka a vysuší se za získání 1,188 g sloučeniny uvedené v názvu s výtěžkem 98 %.• · · · ·· ·· • < · · · · · · • · *· « · · · *

Příklad 30

Syntéza t-butoxykarbonyl-D-Ser (OBn) -Ala-lsF-nitro-Arg-COH-£enethylamidu

1,18 g sloučeniny z příkladu 29 (2,4 mmol), 1,08 g benzylesteru t-butoxykarbonyl-O-šeřinu (Novabiochem, 3,6 mmol), 2,15 g EDC (4,9 mmol) a 0,37 g 1-hydroxybenzotriazolu (2,4 mmol) se smíchá a přidá se 10 ml acetonitrilu. K této suspenzi se během 10 min přidá 2,1 ml diísopropylethylaminu (15 mmol) a výsledná čirá směs se míchá dalších 18 hodin. Rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku a zbytek se suspenduje ve 100 ml ethylacetátu. Roztok se promyje dvakrát 10 ml 0,5M chlorovodíkové kyseliny, dvakrát 10 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a jednou 10 ml nasyceného roztok chloridu sodného. Organická vrstva se pak vysuší síranem sodným a rozpouštědlo se odstraní ve vakuu za získání 1,56 g sloučeniny uvedené v názvu s výtěžkem 92 %. t_R=16,0 minut a 16,5 minut (0,1% trifluoroctové kyselina v 5-75% vodném acetonitrilu během 20 minut).

Příklad 31

Syntéza hydrochloridu D-Ser (OBn)-Ala-N⁹-nitroArg-COH-f enethyl amidu

K roztoku 1,5 g sloučeniny z příkladu 30 (2,1 mmol) v 10 ml ethylacetátu se přidá 10 ml 5M chlorovodíku v ethylacetátu. Směs se míchá 2 hodiny, vzniklá pevná látka se odfiltruje a vysuší za získání 1,31 g sloučeniny uvedené v názvu s výtěžkem 98 %. t_R=ll,8 minut a 12,3 minut; mobilní fáze 0,1 % trifluoroctové kyseliny v 5-75% vodném acetonitrilu během 20 minut.

Příklad 32

Syntéza i-butoxykarbonyl-D-Ser (OBn) -Ala-ISÚ-nitroArg-COH-f enethylamidu

K míchanému roztoku 1,0 g sloučeniny z příkladu 31 (1,6 mmol) v 6 ml acetonitrilu se přidá 0,225 ml isobutylchlorformátu (1,8 mmol) a pak 0,81 ml diisopropylethylaminu (4,74 mmol). Směs se míchá 2 hodiny. Rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku, a zbytek se suspenduje ve 100 ml ethylacetátu. Roztok se promyje dvakrát 10 ml 0,5M 'kyselinou chlorovodíkovou, dvakrát 10 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a jednou 10 ml nasyceného roztoku chloridu sodného. Organická vrstva se pak vysuší síranem sodným a rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Zbytek se chromatograficky čistí na silikagelu; mobilní fáze ethylacetát/hexan (4:1) za získání 0,94 g sloučeniny uve92 děné v názvu sloučeniny uvedené v názvu s výtěžkem 85 %. t_R=

20,2 minut a 21,2 minut (mobilní fáze 0,1 % trifluoroctové kyseliny v 25-45% vodném acetonitrilu během 20 minut).

Příklad 33

Syntéza i-butoxykarbonyl-D-Ser (OBn) -Ala-řÚ-nitroArg-COH-fenethylamidu

0,1 g sloučeniny z příkladu 32 (0,143 mmol) se rozpustí v 1,4 ml dimethylsulfoxidu. Pak se přidá 0,14 g EDC (0,714 mmol) a 0,12 ml dichloroctové kyseliny (1,43 mmol) a směs se míchá 1 hodinu. Reakční směs se pak nalije do 50 ml ethylacetátu a dvakrát promyje 10 ml 0,5M kyseliny chlorovodíkové, dvakrát 10 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a jednou 10 ml nasyceného roztoku chloridu sodného. Organická vrstva se pak vysuší síranem sodným a rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Zbytek se chromatograficky čistí na silikagelu; mobilní fáze ethylacetát/hexan (4:1) za získání 68 mg sloučeniny uvedené v názvu s výtěžkem 68 %. R_f=0,32 (4:1 ethylacetát/ hexan)

Příklad 34

Syntéza soli trifluoroctové kyseliny a i-butoxykarbonyl-D-SerAla-Arg-CO-fenethylamidu

mg sloučeniny z příkladu 33 (0,1 mmol) a 1 ml anisolu se přidá do HF nádoby. Směs se nechá reagovat s 10 ml fluorovodíku při teplotě -20 °C a přitom se míchá. Po 30 minutách se fluorovodík odpaří. Zbytek se suspenduje ve 20% octové kyselině a třikrát promyje diethyletherem. Vodná vrstva se lyofilizuje. Surový lyofilát se čistí HPLC na reverzní fázi (0,1 % trifluoroctové kyseliny v 0-40% vodném acetonitrilu, C-18 reverzní fáze) a lyofilizuje za získání 14,4 g sloučeniny uvedené v názvu s výtěžkem 26 %. t_R=12,5 minuty (0,1 % trifluoroctové kyseliny v 5-75% vodném acetonitrilu během 20 minut) a HS (M+H =

564,5) .

(iv) Příklady 35 až 40 popisují alternativní syntetickou cestu přípravy sloučenin vzorce 1.

Příklad 35

Syntéza i-butoxykarbonyl-D-Ser(O-t-Bu)-OMe

K míchanému homogennímu roztoku 0,15 g hydrochloridu D-Ser(0-tBu)-OMe (71 mmol, Bachem) ve 200 ml tetrahydrofuranu se přidá 80 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a pak 19,45 g isobutylchlorformátu (142 mmol). Vrstvy se oddělí a vodná vrstva se promyje 50 ml ethylacetátu. Organické fáze se spojí a rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Zbytek se suspenduje ve 100 ml ethylacetátu a promyje se 100 ml ÍM kyseliny chlorovodíkové, 100 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 100 ml nasyceného roztoku chloridu sodného. Organická vrstva se vysuší bezvodým síranem hořečnatým síranem, odbarví karborafinem (jako je komerční Darco), filtruje a rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Získá se kvantitativní výtěžek sloučeniny uvedené v názvu. R_f = 0,3 (20 % ethylacetátu v hexanu).

Příklad 36

Syntéza i-butoxykarbonyl-D-Ser(O-t-Bu)-OH

K míchanému roztoku 19,51 g sloučeniny z příkladu 35 (70 mmol) v 78 ml tetrahydrofuranu se přidá 3,28 g hydroxidu lithného (3,28 g). Reakční směs se 3 hodiny intenzívně míchá, dokud výchozí látka nevymizí (podle tenkovrstvé chromatografie; 20 % ethylacetátu v hexanu). Roztok se okyselí koncentrovanou chlorovodíkovou kyselinou na pH 2 a rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Surový produkt se suspenduje v ethylacetátu a extrahuje dvakrát 75 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Spojené vodné vrstvy se okyselí 6M chlorovodíkovou ky-

selinou a vzniklý olej se dvakrát extrahuje 100 ml ethylacetátu. Spojené organické vrstvy se vysuší bezvodým síranem hořečnatým, odbarvi karborafinem (Darco), filtrují a rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Získá se kvantitativní výtěžek sloučeniny uvedené v názvu. R_f= 0,01 (20 % ethylacetátu v hexanu).

Příklad 37

Syntéza i-butoxykarbonyl-D-Ser(O-t-Bu)-Ala-OMe

K roztoku 16,5 g sloučeniny z příkladu 36 (63 mmol), 10,6 g hydrochloridu Ala-OMe (76 mmol), 10,2 g 1-hydroxybenzotriazolu (76 mmol) a 16,33 g EDC (85 mmol) ve 280 ml acetonitrilu se při teplotě 0 °C přidá 35 ml 4-methylmorfolinu (315 mmol) . Tato směs se míchá 1 hodinu pří teplotě 0 °C a pak 72 hodin při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se pak odstraní za sníženého tlaku a výsledný zbytek se suspenduje ve 300 ml ethylacetátu a 350 ml chlorovodíkové kyseliny. Vodná vrstva se oddělí a promyje 300 ml ethylacetátu. Spojené ethylacetátové vrstvy se promyjí 300 ml 1M chlorovodíkové kyseliny, 400 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 200 ml nasyceného roztoku chloridu sodného. Organická vrstva se vysuší bezvodým síranem hořečnatým, odbarví karborafinem (Darco), filtruje a rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Získá se 21,48 g sloučeniny uvedené v názvu s výtěžkem 98 %.

Příklad 38

Syntéza i-butoxykarbonyl-D-Ser-Ala-OH

g sloučeniny z příkladu 37 (58 mmol) se rozpustí ve 110 ml trifluoroctové kyseliny a výsledná směs se míchá 35 minut. Roztok se ochladí v ledové lázni a přidá se 630 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a pak během 45 minut 70 g pevného hydrogenuhličitanu sodného do výsledného pH 7. Vodný roztok se třikrát extrahuje 250 ml ethylacetátu. Spojené organické extrakty se vysuší bezvodým síranem hořečnatým, odbarví karborafinem (Darco), filtruje a rozpouštědlo se odstraní ve vakuu. Získá se kvantitativní výtěžek i-butoxykarbonyl-D-SerA.1 a - OMe .

K míchanému roztoku surového produktu v 68 ml tetrahydrofuranu se přidá 2,7 g hydroxidu lithného (64 mmol, 1,1 ekv.) v 17 ml vody. Reakční směs se 0,5 hodiny intenzívně míchá do vymizení výchozí látky podle tenkovrstvé chromatografie (9:1 dichlormethan/isopropanol). Roztok se okyselí 13 ml 6M chlorovodíkové kyseliny na pH 2 a rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Surový produkt se suspenduje ve 400 ml ethylacetátu a 50 ml vody. Vodná vrstva se extrahuje 200 ml ethylacetátu. Spojené organické vrstvy se vysuší bezvodým síranem hořečnatým, filtrují a rozpouštědlo se odstraní ve vakuu. Získá se 13,94 g sloučeniny uvedené v názvu s výtěžkem 66 % výtěžek. R_f=0,3 (90:30:5 chlorform/methanol/octová kyselina).

Příklad 39

Syntéza i -butoxykarbonyl -D-Ser-Ala-lP-nitroArg-O (ethylcyklolu)

K mechanicky míchanému roztoku30,5 ml 2,6-lutidinu (272 mmol) v 520 ml acetonitrilu se při teplotě 0 °C přidá 16,44 g hydrochloridu L-N⁹-nitroargininalethylcyklolu (61 mmol). K této směsi se přidá 13,94 g sloučeniny z příkladu 38 (50,5 mmol) ve 200 ml acetonitrilu a pak 8,32 g 1-hydroxybenzotriazolu (33 mmol). Výsledná směs se intenzívně míchá. Pak se pomalých částech během 15 minut přidá 12,9 g EDC (67 mmol). Ledová lázeň se odstraní a směs se míchá dalších 69 hodin. Roztok se zahustí za sníženého tlaku a zbytek se rozpustí ve 300 ml ethylacetátu a 200 ml 6M chlorovodíkové kyseliny. Výsledná sraženina se filtruje a vysuší za získání podílu I.

Potom se oddělí jednotlivé vrstvy filtrátu a organická vrstva se promyje 200 ml 1M chlorovodíkové kyseliny. Spojené vodné vrstvy se nasytí chloridem sodným a extrahují se 300 ml ethylacetátu. Spojené organické vrstvy se promyjí 300 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 150 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysuší se bezvodým síranem horečnatým' a rozpouštědlo odstraní za sníženého tlaku za získání podílu II .

Vymývací vrstvy nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného se dvakrát extrahují 150 ml 20% isopropanolu v dichlormethanu. Spojené organické vrstvy se vysuší bezvodým síranem hořečnatým a rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku za získání podílu

III. Podíly I, II a III se každý rozpustí v minimálním množství horkého acetonitrilu a přes noc ochladí. Výsledné pevné látky se filtrují a vysuší, získá se 4,15 g podílu I, 6,63 g podílu II a 0,3 g podílu III. Podíly I, II a III jsou podle tenkovrstvé chromatografie a ^ΤΗ NMR identické. Jejich spojením se získá 11,08 g sloučeniny uvedené v názvu s výtěžkem 45 %..

Příklad 40

Syntéza soli trifluoroctové kyseliny a i-butoxykarbonylD-Ser-Ala-Arg-alu (sloučenina 1)

O

OH

K roztoku 11,48 g sloučeniny z příkladu 39 (23,5 mmol) ve 230 ml směsi ethanolu a octové kyseliny 1:1 se přidá 5,74 g 10% palladia na uhlí a směs se zahřeje na 48 °C. Během 45 minut se přidá 8,82 g mravenčanu amonného (140 mmol) v 9 ml vody. Směs se míchá 3 hodiny, ochladí a filtruje. Zbytek se promyje ethanolem a rozpouštědlo odstraní za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustí ve 250 ml vody a lyofilizuje za získání kvantitativního výtěžku i-butoxykarbonyl-D-Ser-Ala-L-argininalethylcyklolu. t_s=12 minut; mobilní fáze 0,1 % trifluoroctové kyseliny v 15-25% vodném acetonitrilu během 20 minut.

K i-butoxykarbonyl-D-Ser-Ala-L-argininalethylcyklolu se při teplotě 0 °C přidá 115 ml chladné 6M kyseliny chlorovodíkové. Tato směs se míchá 50 minut. Ledová lázeň se odstraní a reakční směs se míchá 2 hodiny při teplotě místnosti. Potom se roztok opět ochladí v ledové lázni a přidá se 200 ml vodného roztoku

100 g octanu sodného. Roztok se filtruje a čistí preparativní HPLC (krokový gradient 0,1 % trifluoroctové kyseliny v 10, 18, 30, 50% vodném acetonitrilu, reverzní fáze C-18) za získání tří podílů sloučeniny uvedené v názvu: 1,41 g podílu I (výtěžek 14 %, čistota 99 %) , 1,52 g podílu II (výtěžek 16 %, čistota 98 %) a 3,13 g podílu III (výtěžek 32 %, čistota 95 %) . t_R= 9,46 minut, 12,82 minut a 13,87 minut (HPLC na reverzní fázi C-18, 0,1 % trifluoroctové kyseliny v 10-20% vodném acetonitrilu během 20 minut). MS(M+H=417,5).

(v) Příklady 41 až 45 popisují syntézu argininalhydrazonylkarbonylaminomethylované polystyrénové pryskyřice použité při syntéze sloučenin podle předkládaného vynálezu. Viz. obrázek 6.

Příklad 41

Příprava t-butoxykarbonylhydrazonylkarbonylaminomethylované polystyrénové pryskyřice

K suspenzi 29,19 g 1,1-karbonyldiimidiazolu (180 mmol, 6 ekvivalentů) v 300 ml dimethylformamidu se za míchání při teplotě místnosti v atmosféře dusíku po částech přidá 23,76 g t-butylkarbazátu (180 mmol, 6 ekvivalentů). Po ukončení přidávání se směs 2,5 hodiny míchá při teplotě místnosti a pak se nalije na 30 g aminomethylované polystyrénové pryskyřice (1 meq/g, Advance Chemtech) v baňce pro syntézu peptidu. Suspenze se 3 hodiny profoukává dusíkem. Pryskyřice se pak filtruje a promyje třikrát 350 ml methylenchloridu. Kaiserův test (roztok a korálky; světlá modř, čirý). Za účelem zajištění kvyntitivní reakce se provádí dvojité spojení, které je ale bolitelné. Proto se 30

100

minut při teplotě místnosti míchá roztok 14,60 g 1,1-karbonyldiimidiazolu (90 mmol, 3 ekvivalenty) a 11,88 g t-butylkarbazátu (90 mmol, 3 ekvivalenty) ve 150 ml dimethylformamidu. Pak se nalije na dříve připravenou pryskyřici. Směs se pak 1 hodinu probublává dusíkem, pryskyřice se 'filtruje a promyje postupně vždy 350 ml methylenchloridu, methanolu, methyencholoridu, methanolu, methylenchloridu a methanol. Kaiserúv test (rozpouštění a bublinky; čirý a čirý). Pryskyřice se vysuší ve vakuu a acetyl.uje ve směsi dimethylformamid/acetanhydrid/Et₃N (8:1:1; 300 ml) po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Pryskyřice se důkladně promyje třikrát každým rozpouštědlem (methylenchlorid a methanol) a vysuší ve vakuu za získání produktu v kvantitativním výtěžku.

Příklad 42

Příprava hydrazonylkarbonylaminomethyiované polystyrénové pryskyřice

H „N

H₂N

Ke 30 g pryskyřice z příkladu 41 se za účelem deprotekce přidá 300 ml roztoku dichlormethan/trifluoroctová kyselina (1:1) a 10 ml thioanisolu. Směs se 30 minut profukuje dusíkem při teplotě místnosti v baňce peptidového syntetizátoru. Odchráněná pryskyřice se filtruje a promyje dvakrát dichlormethanem, dvakrát směsí dichlormethanu a DIEA , dvakrát dichlormethanem a alternativně organickými rozpouštědly (methylenchlorid, methanol) . Výsledná pryskyřice uvedená v názvu se vysuší ve vakuu. Kaiserúv test (rozpouštění a bublinky; světle modrá, pískové zbarvení). Tato syntéza poskytne celkový výtěžek 30,64 g pryskyřice (0,85 meq semikarbazidu/g).

• Μ · · » ·· · · ··· · · · · ··· ···· ·· · · ·

101

Alternativně se pryskyřice uvedená v názvu připraví následovně: k 1,0 g aminomethylovanépolystyrenové pryskyřice (1,0 mmol, Advanced Chemtech) ve 12 ml N,N-dimethylformamidu se přidá 3,89 g 1,1-karbonyldiimidazolu (24,0 mmol, 24 ekviv.). Suspenze se třepe 5 hodin při teplotě místnosti a pak filtruje v baňce pro syntézu peptidů. Pryskyřice se promyje dostatečným množstvím methylenchloridu. Kaiserův test (rozpouštění a bublinky; světle modrá, bílá). K pryskyřici se přidá 12 ml 2M roztoku hydrazinu v N,N-dimethylformamidu a směs se třepe přes noc při teplotě místnosti. Pryskyřice se filtruje a střídavě promyje organickými rozpouštědly (methylenchlorid a methanol) a vysuší ve vakuu za získání 1,06 g produktu uvedeného v názvu (0,94 mmol/g).

Příklad 43

Příprava methylesteru Ν-α-fluorenylmethyloxykarbonyl-ω,ω-di-Nt-butoxykarbonylargininu

K roztoku 4,97 g N-α-f luorenylmethyloxykarbonyl-ω,ω '-di-N-t-butoxykarbonylargininu (8,329 mmol, Advanced Chemtech) v 82 ml acetonitrilu se přidá 1,38 g uhličitanu draselného (10 mmol) a 1,037 ml methyljodidu (16,66 mmol). Směs se zahřeje na teplotu 50 °C, při které se míchá 4,5 hodiny. Pak se nalije do 500 ml ethylacetátu a důkladně promyje 50 ml vody, 50 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 50 ml nasyceného roztoku

102 • · · · · chloridu sodného. Organická fáze se vysuší bezvodým síranem hořečnatým a rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Získá se 4,7 g sloučeniny uvedené v názvu.

Příklad 44

Příprava N-α- f luorenylmethyloxykarbonyl -ω,ω ' -di-N-1 - butoxykarbonyl argininolu

K roztoku 5,675 g sloučeniny z příkladu 43 (9,29 mmol) v 15,5 ml tetrahydrofuranu a 93 ml methanolu se přidá 2,06 g chloridu vápenatého (18,58 mmol). Směs se ochladí v ledové lázni a za míchání se po částech pomalu přidává 1,4 g natriumborohydridu (37,17 mmol). Po 1,5 hodině se rozpouštědlo odstraní za sníženého tlaku a zbytek se suspenduje v 500 ml ethylacetátu a 300 ml vody. Fáze se oddělí a organická vrstva se důkladně promyje 200 ml 0,5M chlorovodíkové kyseliny a 2 00 ml nasyceného roztoku chloridu sodného. Spojené vodné fáze se zpět extrahují ethylacetátem. Ethylacetátové vrstvy se spojí, přidá se 30 g silikagelu a rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Silikagel se zbytkem se nanese na kolonu silikagelu 150 x 80 mm a produkt se vymývá 50% ethylacetátem v hexanu za získání 3,855 g (výtěžek 71 %) sloučeniny uvedené v názvu. Dále se získá 0,938 g (výtěžek 17 %) sloučenin z příkladu 43 (výchozí látka). R_f=0,30 (50% ethylacetát v hexanu) . ^:Η NMR (CDC1₃) : 8,35 ppm (šs, IH) , 7,75 ppm (m, 2H) , 7,6 ppm (m, 2H) , 7,38 ppm (m, 2H) , 7,3 ppm (m, 2H), 5~45 ppm (m, IH), 4,4 ppm (d, 2H), 4,2 ppm (m,

103

1H), 3,7 ppm (m, 2H), 3,57 ppm (m, IH), 3,45 ppm (m, IH), 3,35 ppm (m, 2H) , 2,15 ppm (m, IH) , 1,6 ppm (m, 4H) , 1,45 ppm (d,

18H) .

Příklad 45

Příprava N-α-fluorenylmethyloxykarbonyl-ω, ω'-di-N-1-butoxykarbonyl argininal hydrazonylkarbonylaminomethylové polystyrénové pryskyřice

H

N_x

Boc

am-pryskyřice

K roztoku 3,62 g sloučeniny z příkladu 44 (6,21 mmol) v 31 ml methylsulfoxidu a 31 ml toluenu ochlazenému v ledové lázni se přidá 11,93 g EDC (62,1 mmol) a 2,56 ml dichloroctové kyseliny (31,06 mmol). Reakční směs se míchá 40 minut, dokud podle tenkovrstvé chromatografie (50 % ethylacetátu v hexanu) nevymizí výchozí látka. Pak se přidá 150 ml vody a 500 ml ethylacetátu a fáze se oddělí. Organická vrstva se pak důkladně promyje 100 ml 0,5M chlorovodíkové kyseliny, dvakrát 100 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 100 ml nasyceného roztoku chloridu sodného. Organická vrstva se vysuší síranem sodným a rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustí v 45 ml dichlormethanu a přidá k 3,65 g sloučeniny z příkladu 42 (3,1 mmol). Směs se míchá přes noc v uzavřené zkumavce. Pryskyřice se filtruje a důkladně třikrát promyje 50 ml dichlormethanu, třikrát 50 ml dimethylformamidu a třikrát 50 ml methanolu a pak se vysuší ve vysokém vakuu. Výtěžek sloučeniny uvedené v

104

• » ···· ·· · · t názvu je 4,3 g. Piperidin-fulvenové stanovení zatížení ukázalo 0,37 mmol/g (60% spojení).

(vi) Příklad 46 popisuje syntézu soli trifluoroctové kyseliny a benzensulfonyl-D-serylazetidylargininalu (sloučenin 31). Viz. obrázek 7.

Příklad 46

Příprava soli trifluoroctové kyseliny a benzensulfonyl-D-seryl azetididylargininalu

Krok 1: příprava ω,ω'-di-N-t-butoxykarbonylargininalhydrazonylkarbonylaminomethylované polystyrénové pryskyřice

am-pryskyřice

125 mg pryskyřice z příkladu 45 se nechá reagovat s 1,5 ml 30% piperidinu v dimethylformamidu na 4 ml polypropylenové koloně. Po 30 minutách se pryskyřice vysuší, důkladně dvakrát promyje 3 ml dichlormethanu a dvakrát 3 ml methanolu a vysuší ve vakuu za získání sloučeniny uvedené v názvu. Ninhydrinový test malého vzorku poskytne tmavě modrou pryskyřici a roztok vykazující vysoký stupeň deprotekce.

105

Krok 2: příprava Ν-α-Fmoc-azetidin-2-karbonyl-ω, ω'-di-N-t-butoxykarbonyl argininal hydra zóny lkarbonylaminome thy lované polystyrénové pryskyřice

··· ·· « · · · · · t> · ···

am-pryskyřice

K 0,12 g sloučeniny z kroku 1 se na 4ml polypropylenové koloně přidá 110 mg N-a-Fmoc-azetidin-2-karboxylové kyseliny (0,34 mmol), 7,7 mg 1-hydroxybenzotriazolu (0,057 mmol), 37 mg TBTU (0,11 mmol) a 29,8 μΐ diisopropylethylaminu (0,17 mmol) v 95 μΐ dimethylformamidu. Reakční směs se přes noc třepe při teplotě místnosti, činidla se pak z pryskyřice vypustí a pryskyřice se důkladně dvakrát promyje 3 ml dichlormethanu a dvakrát 3 ml methanolu. Pryskyřic se vysuší ve vakuu a malý vzorek se podrobí ninhydrinové kalorimetrické analýze, která ukázala účinnost spojení 97 % (produkce sloučeniny uvedené v názvu).

Krok 3: Příprava azetidin-2-karbonyl-ω, ω'-di-N-t-butoxykarbonyl argininal hydra zóny lkarbonyl aminome thylované polystyrénové pryskyřice

Η H

Νγ am -pryskyřice

O , Boc O

I ^N \ , Boc

Ν N Η H

Sloučenina z kroku 2 se nechá reagovat s 1,5 ml směsi 3 0 % piperidinu a dimethylformamidu na 4 ml polypropylenové koloně.

106

Po 30 minutách se z pryskyřice nechá odtéci roztok a pryskyřice se důkladně promyje dvakrát 3 ml dichlormechanu a dvakrát 3 ml methanolu. Pak se vysuší ve vakuu za získání sloučeniny uvedené v názvu. Ninhydrinový test malého vzorku poskytne tmavě modoru pryskyřici a roztok vykazující vysoký stupeň deprotekce.

Krok 4: příprava N-ct-Fmoc-seryl (O-t-Bu)-azetidin-2-karbonylΝ-ω, ω'-di-N-1-butoxykarbonylargininalhydrazonylkarbonylaminomethylované polystyrénové pryskyřice

FmoCx

am-pryskyřice

K 0,12 g-sloučeniny z kroku 3 se na 4ml polypropylenové koloně přidá 43 mg t-butyletheru N-a-Fmoc-D-serinu (0,11 mmol), 7,7 mg 1-hydroxybenzotriazolu (0,057 mmol), 37 mg TBTU (0,11 mmol) a 29,8 μΐ diisopropylethylaminu (0,17 mmol) v 95 μΐ dimethylformamidu. Reakční směs se 4 hodiny třepe při teplotě místnosti. Činidla se vypustí z pryskyřice; pryskyřice se důkladně promyje dvakrát 3 ml dichlormethanu a dvakrát 3 ml methanolu. Pryskyřice se vysuší ve vakuu a pak se dvakrát spojí za použití 43 mg O-t-butyletheru N-ct-Fmoc-šeřinu (0,11 mmol), 7,7 mg 1-hydroxybenzotriazolu (0,057 mmol), 37 mg TBTU (0,11 mmol) a 29,8 μΐ diisopropylethylaminu (0,17 mmol) v 95 μΐ dimethylformamidu. Reakční směs se třepe 2 hodiny při teplotě místnosti. Činidla se vypustí z pryskyřice, pryskyřice se důkladně dvakrát 3 ml dichlormethanu a dvakrát 3 ml methanolu. Pryskyřice se vysuší ve vakuu a malý vzorek se podrobí ninhydrinové kalori107

metrické analýze, která ukázala účinost spojení při vzniku sloučeniny uvedené v názvu 97,4 %.

Krok 5: Příprava seryl(0-t-Bu)-azetidin-2-karbonyl-<a,<O'-di-Nt-butoxykarbonylargininalhydrazonylkarbonylaminomethylované polystyrénové pryskyřice

ir o

N

am -pryskyřice , Boc O

I ^N

U JU 'Boc

Ν N

Η H

Sloučenina z kroku 4 se nechá reagovat s 1,5 ml směsi 30 % piperidinu v dimethylformamidu na 4ml polypropylenové koloně. Po 30 minutách se roztok z pryskyřice vypustí, důkladně promyje dvakrát 3 ml dichlormethanu a dvakrát 3 ml methanolu a vysuší ve vakuu za získání sloučeniny uvedené v názvu. Ninhydrinový test malého vzorku vykázal tmavě modrou pryskyřici a roztok vykazující vysoký výtěžek deprotekce.

Krok 6: příprava N-cc-benzensulfonyl-D-seryl (O-t-Bu)-azetidin2-karbonyl-ω, ω ' -di-N-1-butoxykarbonylargininalhydrazonylkarbonylaminomethylované polystyrénové .pryskyřice

O O w // ,S.

ΓΤ'ίΠίΗ H 'N am-pryskyřice = ^N Y / , Boc O

I ^N

U JU 'Boc

Ν N Η H

108

K 0,12 g sloučeniny z kroku 5 se na 4ml polypropylenové koloně přidá 17 μΐ benzensulfonylchloridu (0,133 mmol) a 46,3 μΐ diisopropylethylaminu (0,27 mmol) v 888 μΐ dimethylformamidu. Reakční směs se třepe přes noc při teplotě místnosti. Činidla se vypustí z pryskyřice; pryskyřice se promyje důkladně dvakrát 3 ml dichlormethanu a dvakrát 3 ml methanolu. Pryskyřice se vysuší ve vakuu a pak dvakrát spojí se 17 μΐ benzensulfonylchloridu (0,133 mmol) a 46,3 μΐ diisopropylethylaminu (0,27 mmol) v 888 μΐ dimethyl formamidu. Reakční směs se třepe 3 hodiny při teplotě místnosti. Činidla se vypustí z pryskyřice a pryskyřice se důkladně promyje dvakrát 3 ml dichlormethanu a dvakrát 3 ml methanol. Pryskyřice se vysuší ve vakuu a malý vzorek se podrobí ninhydrinové kalorimetrické analýze, která vykázela 96% účinnost spojení za vzniku sloučeniny uvedené v názvu.

Krok 7: Příprava soli trifluoroctové kyseliny a benzensulfonylD-serylazetidin-2-karbonyl-argininalu

N NH,

H mg sloučeniny z kroku 6 se na 4ml polypropylenové koloně s fritou nechá reagovat s 0,5 ml směsi trifluoroctové kyselina/ voda (9:1). Kolona se třepe 1,5 hodiny při teplotě místnosti. Reakční roztok se vypustí do testovací zkumavky a pryskyřice se promyje vodou tak, aby celkový objem filtrátu byl 5,2 ml. Sloučenina uvedená v názvu se čistí semipreparativní HPLC na reverzní fázi (0,1 % trifluoroctové kyseliny v 0-40% vodném acetonitrilu, reverzní fáze C-18) a lyofilizuje za získání 14,4 » · ·· ·· · ·

109 • ·· · · ·· ···· ·· · g sloučeniny uvedené v názvu s výtěžkem 26 %. Čisté frakce (podle HPLC) se spojí a lyofilizují za získání 2,1 mg sloučeniny uvedené v názvu. MS (M+H=469).

(vii) Příklady 47 až 50 popisují syntézu soli trifluoroctové kyseliny a N-ct- (3 -f enylpropyl) -D-serylalanylargininalu (sloučenina 32)

Příklad 47

Příprava methylesteru N-α-(3-fenylpropyl)-D-serin-t-butyletheru

V 70 ml tetrahydrofuranu se 4 hodiny zahřívá k varu směs 1,50 g methylesteru serin-O-t-butyletheru (7,1 mmol), 1,40 ml hydrocinnamaldehydu (10,6 mmol) a 1,18 ml triethylaminu (8,5 mmol). Po ochlazení roztoku na teplotu místnosti se k míchanému roztoku přidá ve dvou částech 0,46 g natriumborohydridu (12 mmol). Reakční směs se míchá 30 minut při teplotě místnosti a roztok se pak zahustí za sníženého tlaku. Zbytek se roztřepe mezi ethylacetát a l,0M kyselinu chlorovodíkovou. Organická vrstva se promyje l,0M kyselinou chlorovodíkovou. pH vodné vrstvy se upraví 40% roztokem hydroxidu sodného, na hodnotu 10 a pak se

110 extrahuje dvakrát ethylacetátem. Spojené organické vrstvy se vysuší síranem sodným a rozpouštědlo se odstraní ve vakuu. Zbytek se chromatograficky čistí na silikagelu (kolona 1x6 palců) s mobilní fází 10-30 % ethylacetátu v hexanu za získání 150 mg sloučeniny uvedené v názvu tj·. výtěžek 7 %. R_f = 0,60 (50 % ethylacetátu v hexanu).

Příklad 48

Příprava methylesteru N-α-1-butoxykarbonyl-N-α-(3-fenylpropyl)-D-serin-t-butyletheru

Boc O

150 mg sloučeniny z příkladu 47 (0,51 mmol), 167 mg di-t-butyldikarbonátu (0,77 mmol) a 0,13 ml diisopropylechylaminu (0,77 mmol) se míchá přes noc při teplotě místnosti ve 2 ml tetrahydrofuranu. Reakční směs se zahustí za sníženého tlaku a zbytek se zředí 20 ml ethylacetátu, důkladně dvakrát promyje 1,0M kyselinou chlorovodíkovou, dvakrát nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a jednou nasyceným roztokem chloridu sodného. Rozpouštědlo se odstraní ve vakuu za získání 206 mg sloučeniny uvedené v názvu v kvantitativním výtěžku. R_£ = 0,74 (50 % ethylacetátu v hexanu).

Příklad 49

Příprava t-butyletheru Ν-α-t-butoxykarbonyl-N-a-(3-fenylpropyl)-D-serinu • ·· tt · · · · • · ♦ ···· ··· ···· ·· · ··

K roztoku 206 mg sloučeniny z příkladu 48 (0,52 mmol) v 3,5 ml methanolu se přidá po kapkách 0,63 ml l,0M roztoku hydroxidu lithného (0,63 mmol). Roztok se zakalí a po 5 minutách se vyčeří. Reakční směs se míchá přes noc při teplotě místnosti. Pak se přidá další 1,47 ml l,0M roztoku hydroxidu lithného. Po 2 hodinách se přidá další 1,0 ml l,0M roztoku hydroxidu lithného. Po vymizení výchozí látky (podle tenkovrstvé chromatograf ie, 50 % ethylacetátu v hexanu) se reakční směs okyselí na pH 4 na iontově výměnné pryskyřici DOWEX (50x8-400). Roztok se filtruje, pryskyřice se promyje methanolem a pak vodou. Roztok se zahustí za sníženého tlaku a pak lyofilizuje za získání 189 mg sloučeniny uvedené v názvu (s výtěžkem 95 %) ve formě žlutého oleje. R_f = 0,04 (50 % ethylacetátu v hexanu).

Příklad 50

Příprava soli trifluoroctové kyseliny a N-α-(3-fenylpropyl)D-serylalanylargininalu (sloučenina 32)

Provedou se kroky 1 až 4 a krok 7 podle příkladu 46, ale s náhradou N-a-Fmoc-azetidinu Ν-α-Fmoc-alaninem v kroku 2 a náhra112 • · ···· ·· ··· dou 0-t-butyletheru N-cc-Fmoc-D-šeřinu sloučeninou z příkladu v kroku 4. Získá se sloučenina uvedená v názvu.

(viii) Příklady 51 až- 53 popisují syntézu některých sloučenin podle předkládaného vynálezu na pevné fázi.

Příklad 51

Syntéza sloučenin 44, 47 a 48 na pevné fázi

Provedou se kroky 1 až 4 a krok 7 podle příkladu 46, ale v kroku 4 se (0-t-butyl)Fmoc-D-serin nahradí následujícími sloučeninami :

č.	Název sloučeniny	Náhrada v kroku 4
44	benzyloxykarbonyl-D-2-amino- butyryl-L-alanylargininal	Cbz-D-2-aminomáselná kyselina
47	2-fenylethylsulfonyl-D-seryl alanylargininal	(O-t-butyl)-2-fenylethylsul- fonyl-D-serin
48	3-fenylpropylsulfonyl- D-serylalanylargininal	(O-t-butyl)-3-fenylpropyl- sulfonyl-D-serin

Za účelem syntézy O-t-butyl-2-fenylethylsulfonyl-D-serinu se zopakuje postup z příkladů 22 a 23, ale v¹příkladu 22 se provedou 2 záměny, a-toluensulfonylchlorid se nahradí buď 2-fenylethylsulfonylchloridem nebo 3-fenylpropylsulfonylchloridem, a místo diisopropylethylaminu se použije 4-merhylmorfolin.

Příklad 52

Syntéza sloučenin 45, 46 a 49 až 51 na .pevné fázi

Zopakují se kroky 1 až 4 a krok 7 z příkladu 46 s následující náhradou: v kroku 4 se nahradí (O-t-butyl)-Fmoc-D-serin (O-tbutyl) Cbz-D-serinem a v kroku 2 se Fmoc-L-azetidin-2-karboxylová kyselina nahradí následujícími sloučeninami:

·· ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · · ··

113

č.	Název sloučeniny	Náhrada v kroku 2
45	benzyloxykarbonyl-D-seryl-L-seryl argininal	0-t-butyl-Fmoc-L-serin
46	benzyloxykarbonyl-D-seryl-L-β- kyanoalaninargininal	Fmoc-L-P-kyanoalanin
49	benzyloxykarbonyl-D-seryl-L-cis - 4-hydroxyprolylargininal	Fmoc-c i s-4 -hydroxyp ro1i n
50	benzyloxykarbonyl-D-seryl-L-3,4 - dehydroprolylargininal	Fmoc-L-3,4-dehydroprolin
51	benzyloxykarbonyl-D-seryl-L-pro- pargylglycylargininal	Fmoc-L-propargylglycin
52	benzyloxykarbonyl-D-seryl- L-allylglycylargininal	Fmoc-L-allylglycin

Příklad 53

Syntéza trans-β-styrensulfonyl-D-seryl-L-alanylargininalu (sloučenina 53)

Provedou se kroky 1 až 7 z přikladu 46 s následující náhradou: N“-Fmoc-azetidin-2-karboxylová kyselina v kroku 2 se nahradí Fmoc-L-alaninem a v kroku 6 se nahradí benzensulfonylchlorid trans-p-styrenesulfonylchloridem. Získá se sloučenina uvedená v názvu.

• 9« ·« 9 9 ·· • 99 ···· · · · ···« ·· · · ·

114

9 · · 9 9 9 · ··· · · 9 9 · « 9 · 9 9 (ix) Příklady 54 až 59 popisují alternativní syntetický postup přípravy sloučeniny 1. Viz. obrázek 5.

Příklad 54

Příprava i-butoxykarbonyl-D-Ser(O-t-butyl)-OH

K roztoku 10,5 g O-t-butyletheru D-serinu (65,3 mmol) v 51 ml vody se přidá 20,1 g uhličitanu sodného (196,2 mmol) a pak 9,8 ml isobutylchlorformátu (75,2 mmol). Po 3 hodinách se směs zakalí a míchá se další 3 hodiny. Po 6 hodinách se roztok okyselí 6M kysleinou chlorovodíkovou (50 ml) . Reakční směs se pak extrahuje třikrát 200 ml ethylacetátu. Vodná vrstva se pak nasytí chloridem sodným a extrahuje se dvakrát 200 ml ethylacetátu. Ethylacetátové vrstvy se spojí a vysuší síranem sodným, rozpouštědlo se odstraní ve vakuu a získá se 17,0 g (výtěžek 99,5 %) sloučeniny uvedené v názvu ve formě bílé pevné látky. HPLC: t = 18,5 minuty,- gradient 5 % až 75 % acetonitrilu v 0,1% vodné trifluoroctové kyselině (pufr); kolona 4,6 x 250 mm, částice 5 pm, póry 100 angstromů, kolona C18; průtok 1 ml/min. NMR (CDC1₃) : 5,5 ppm (m, 1H) , 4,45 ppm (šs,lH), 3,82-3,95 ppm (m,3H), 3,52-3,6 ppm (m, 1H) , 1,85-1,97 ppm (m, 1H) , 1,2 ppm (s,9H), 0,9 ppm (d,6H).

Příklad 55

Příprava i-butoxykarbonyl-D-Ser(t-Bu)-L-Ala-0-t-Bu

115 • ·· ·· φφ φφ · » « φ r · « Φ • «φφ Φ · φφφ φφφ φφφ φφ φφφ φφ φφ φφφφ φφ

Ve 153 ml acetonitrilu se rozpustí 10 g sloučeniny z příkladu 54 (38,3 mmol), 10,43 hydrochloridu 't-butylesteru L-alaninu (57,4 mmol), 11,05 g EDC (57 mmol) a 5,85 g hydroxybenzotriazolu (38,3 mmol). Směs se míchá 15 minut při teplotě místnosti. Pak se přidá 32,7 ml diisopropylethylaminu (191 mmol) a reakční směs se míchá 18 hodin. Rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku, výsledný zbytek se opět suspenduje v 1000 ml ethylacetátu a 100 ml 1M kyseliny chlorovodíkové. Ethylacetátová vrstva se promyje 100 ml 0,5M chlorovodíkové kyseliny, dvakrát 100 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 100 ml nasyceného roztoku chloridu sodného. Ethylacetátová vrstva se vysuší síranem sodným a rozpouštědlo se odstraní ve vakuu. Získá se kvantitativní výtěžek sloučeniny uvedené v názvu. HPLC: t_r=18,7 minut; gradient 5 % až 90 % acetonitrilu v 0,1% vodné trifluoroctové kyselině (pufr); kolona 4,6 x 250 mm, částice 5 pm, póry 100 angstromů, kolona G18; průtok 1 ml/minutu. NMR(CDC1₃) : 7,15 ppm (šs, IH) , 5,6 ppm (šs, IH) , 4,4-4,5 ppm (m, IH) , 4,2 ppm (šs, IH), 3,87-3,95 ppm (m, 3H), 3,3-3,4 ppm (m, IH), 1,85-1,95 ppm (m, IH) , 1,45 ppm (s, 9H) , 1,39 ppm (d, 3H) , 1,2 ppm (s,

9H), 0,9 ppm (d, 6H).

Příklad 56

Příprava i-butoxykarbonyl-D-Ser-L-Ala-OH

116 ··· ···· ···· • · · · ·♦ · ·· · • β···· ··»· · ··· · * · · · · ··· ·· ·· · ·»· ·· · ·

K roztoku 7,15 g sloučeniny z přikladu 55 (18,4 mmol) v 35 ml dichlormethanu, se přidá 35 ml trifluoroctové kyseliny. Tato směs se míchá 2 hodiny, rozpouštědlo se pak odstraní za sníženého tlaku. Pak se přidá toluen a rozpouštědla se opět odstraní ve vakuu za odstranění trifluoroctové kyseliny. V dalším kroku se pokračuje s kvantitativním výtěžkem sloučeniny uvedené v názvu ve formě viskózního žlutého oleje. t_r=10,5 minuty, gradient 5 % až 90 % acetonitrilu v 0,1% vodné trifluoroctové kyselině (pufr), kolona 4,6 x 250 mm, 5 pm částice, póry 100 angstromú, kolona C18, průtok 1 ml/minutu.

Příklad 57

Příprava i -butoxykarbonyl -D-Ser-L-Ala-PP-ni troargininalethyl cvklolu

Roztok 5,09 g sloučeniny z příkladu 56 (18,4 mmol), 6,4 g hydrochloridů N^-nitroargininalethylcyklolu (23,9 mmol) a 5,31 g EDC (27,6 mmol) a 2,82 g hydroxybenzotriazolu v 74 ml acetonitrilu se míchá 15 minut při teplotě místnosti. Pak se přidá 15,7 ml diisopropylethylamínu (92 mmol) a reakční směs se míchá 18 hodin. Rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku a výsledný zbytek se zpětně suspenduje v 1000 ml ethylacetátu a 100 ml 0,5M kyseliny chlorovodíkové. Ethylacetátová vrstva se promyje 100 ml 0,5M kyseliny chlorovodíkové, dvakrát 100 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 100 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, pak se vysuší síranem sodným. Roztok se zahustí za sníženého tlaku na objem 25 ml, což vede ke srážení bílé látky. Reakční směs se pak ponechá

117 přes noc při teplotě 4 °C. Sraženina se pak filtruje a vysuší. Získá se 4,6 g (50% výtěžek) sloučeniny uvedené v názvu ve formě látky, která má podle HPLC jeden pík. t = ll,.5 minuty, gradient 5 % až 90 % acetonitrilu 0,1% vodné trifluoroctové kyselině (pufr), kolona 4,6 x 250 mm, částice 5 μπι, póry 100 angstromú, kolona C18, průtok 1 ml/minutu.

Příklad 58

Příprava i-butoxykarbonyl-D-Ser-L-Ala-argininalethylcyklolu

4,55 g sloučeniny z příkladu 57 (9,3 mmol) se rozpustí v 55 ml směsi ethanol:voda:octová kyselina (4:1:1 směs), profouká se dusíkem a přidá se 1,15 g 10% palladia na uhlí (10 % palladia, 50 % vody). Tato směs se hydrogenuje 18 hodin při tlaku 345 kPa (50 psi). Reakční směs se pak filtruje za odstraněni palladia a rozpouštědlo se odstraní ve vakuu za získání kvantitativního výtěžku sloučeniny uvedené v názvu. HPLC: t=14,2 minut, gradient 5 % až 50 % acetonitrilu v 0,1% vodné trifluoroctové kyselině (pufr) , kolona 4,6 x 250 mm, částice 5 μπι, póry 100 angstromů, kolona C18, průtok 1 ml/minutu.

Příklad 59

Příprava i-butoxykarbonyl-D-Ser-L-Ala-argininalu (sloučenina 1)

H

O

118

Roztok sloučeniny z příkladu 58 (9,3 mmol) se 3 hodiny míchá v 3M kyselině chlorovodíkové. Tato látka se pak přímo ve třech podílech nanese na kolonu 50 x 300 mm, částice 15 μιη, póry 100 angstromú, kolona C18, průtok 80 ml/minutu. Frakces obsahující produkt se spojí a lyofilizují za získání 2,38 g (61% výtěžek) sloučeniny uvedené v názvu, která vykazuje 97% čistotu podle analytické HPLC. HPLC: t=16,4 minut, 18,9 minut a 19,6 minut, gradient 5 % až 25 % acetonitrilu v 0,1% vodné trifluoroctové kyselině (pufr), kolona 4,6 x 250 mm, částice 5 pm, póry 100 angstromú, kolona C18, průtok 1 ml/minutu. Hmotnostní spektrum (M+H) =417. NMR(D₂O) : 5,4 ppm (s, IH) , 4,25-4,37 ppm (m, IH) , 4,1-4,25 ppm (m, IH) , 3,75-3,95 ppm (m, 5H) , 3,42-3,52 ppm (m, IH), 3,2-3,3 ppm (m, IH), 1,58-1,98 ppm (m, 5H), 1,35 ppm (d, 3H), 0,85 ppm (d, 6H).

(x) Příklady 60 až 72 popisují syntézu některých meziproduktů, které lze použít při syntéze sloučenin podle předkládaného vynálezu. Viz. obrázek 8 (příklady 60 až 64) a obrázek 9 (příklady 65 až 72) .

Příklad 60

Příprava methylesteru N-(t-butoxykarbonyl)-3 -(3-pyridyl)L-alaninu

Boc

K roztoku 5,0 g N-(t-butoxykarbonyl)-3-(3-pyridyl)alaninu (18,8 mmol) ve 100 ml methanolu se přidá 66 ml thionylchloridu (2M roztok v dichlormethanu, 132 mmol). Výsledný roztok se míchá' přes noc při teplotě místnosti. Methanol se odstraní za · · • · · · · · · ··· ···· · · · · · • · · · · » · · · · ₁₁₉ ·..· .

sníženého tlaku a ke zbytku se přidá 100 ml ethylacetátu. Výsledná bílá sraženina se oddělí filtrací na fritě. Získaná sraženina se rozpustí ve směsi tetrahydrofuran/voda (40 ml od každého) a přidá se 4,8 g di-tert-butyldikarbonátu (21,99 mmol) a 1,95 g uhličitanu sodného (18,4 mmol). Směs se míchá 12 hodin při teplotě místnosti, pak se zředí 40 ml ethylacetátu (40 ml) a promyje 25 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Organická vrstva se vysuší bezvodým síranem sodným a zahustí ve vakuu za získání surového produktu, tento produkt se podrobí tlkaové chromatografii na silikagelu (230-400 mesh), kolona 8x52 cm, mobilní fáze směs 10:90 ethylacetát/hexan a pak směs 60:40 ethylacetát/hexan. Získají se 4 g (74 %) sloučeniny uvedené v názvu ve formě oleje. Tenkovrstvá chromatografie (silikagel; ethylacetát, R_f = 0,68.

Příklad 61

Příprava soli octové kyseliny a methylesteru N-(t-butoxykarbonyl) -3 -([R,S]-3-piperidyl)-L-alaninu

5,0 g sloučeniny z příkladu 60 (17,8 mmol) se rozpustí ve směsi 24 ml ethanolu, 6 ml octové kyseliny a 6 ml vody a hydrogenuje se na 500 mg oxidu platičitého při tlaku 310 kPa (45 psi) po dobu 3 hodin. Katalyzátor se odstraní filtrací a filtrát se zahustí ve vakuu za získání 6,89 g olejovitého zbytku, který se použije v postupu popsaném v příkladu 62 bez dalšího čištění. Tenkovrstvá chromatografie ukazuje dvě skvrny odpovídající • »

120 dvěma diastereomerúm s R_f hodnotami 0,16 a 0,26 (silikagel; 4:1:1 n-butanol/octová kyselina/voda).

Příklad 62

Příprava methylesteru N-(t-butoxykarbonyl)-3-[(R,S)-3-piperidyl- (N-guanidíno(bis-benzyloxykarbonyl))]-L-alaninu

Boc

6,89 g sloučeniny z přikladu 61 (19,9 mmol) se rozpustí v 80 ml tetrahydrofuranu a přidá se 7,13 g bis-benzyloxykarbonylS-methylisothiomočoviny (19,9 mmol) a pak 4,37 ml N-methylmorfolinu. Reakční směs se míchá 18 hodin při teplotě místnosti, pak se zahustí ve vakuu a výsledný zbytek se rozpustí ve 100 ml ethylacetátu a promyje IN roztokem hydrogensíranu sodného a nasyceným roztokem chloridu sodného (50 ml od každého). Po vysušení síranem sodným se rozpouštědla odstraní ve vakuu a surová sloučenina uvedená v názvu se podrobí tlakové chromatografií na silikagelu (230-400 mesh), kolona 8x52 cm, mobilní fáze 1:9 ethylacetát/hexan (dvojnásobný objem kolony) a pak 1:1 ethylacetát/hexan. Získá se 2,75 g sloučeniny uvedené v názvu jako směsi dvou diastereomerů. Tenkovrstvá chromatografie ukáže dvě skvrny, R_f 0,57 a 0,62 (silikagel; 1:1 ethylacetát/hexan).

Příklad 63

Příprava N-(t-butoxykarbonyl)-3-[(R,S)-3-piperidyl-(N-guanidino(bis-benzyloxykarbonyl))]-L-alaninolu • ·· ·« ·· »· ··» ♦ · · · ··· • € · · · · * ··

121

K míchanému roztoku 2,23 g sloučeniny z příkladu 62 (3,7 mmol), v 8 ml absolutního ethanolu a 4 ml bezvodého tetrahydrofuranu se přidá 844 chloridu vápenatého (7,6 mmol) a 575 mg natriumborohydridu (15,2 mmol) . Směs se míchá 12 hodin při teplotě místnosti a pak se zahustí ve vakuu a výsledný zbytek se roztřepe mezi ethylacetát a IN hydrogensíran sodný (10 ml od každého). Vrstvy se oddělí, organická vrstva se promyje dvakrát roztokem hydrogensíranu sodného, vysuší bezvodým síranem sodným a zahustí ve vakuu za získání zbytku, který se chromatograficky čistí tlakově na silikagelu (230-400 mesh), kolona 5,5x45 cm, mobilní fáze ethylacetát, za získání 1,3 g sloučeniny uvedené v názvu ve formě bílé pěny. Tenkovrstvá chromatografie indikuje dvě skvrny, které odpovídají dvěma diastereomerů s R_f 0,18 a 0,27 (silikagel; 1:1 ethylacetát/hexan).

Příklad 64

Příprava hydrochloridu 3-[ (R,S)-3-piperidyl-(N-guanidino(bisbenzyloxykarbonyl))]-L-alaninoluHCI · H₂N

290 mg sloučeniny z příkladu 63 (0,57 mmol) se nechá reagovat jednu hodinu s 2,0 ml 2,5M roztoku bezvodého chlorovodíku v ethylacetátu při teplotě místnosti. Rozpouštědlo se odstraní ve vakuu a získá se 260 mg lepkavé látky, která se použije bez dalšího čištění pro přípravu sloučeniny podle předkládaného

122 • · • · · · vynálezu, která má v pozici PÍ 3-piperidinyl-(N-guanidino)-alaninal. ¹H NMR spektrum měřené v CD₃OD neobsahuje žádný signál na 1,4 ppm (tzn. není přítomen žádný t-butoxykarbonylový proton) .

Příklad 65

Příprava soli trifluoroctové kyseliny a semikarbazid-4-yldifenylmethanu

H f₃cco₂h h₂n y o

Krok 1

V 225 ml dimethylformamidu se při teplotě místnosti rozpustí

16,2 g karbonyldiimidazolu (0,10 mol) a míchá se v atmosféře dusíku. Pak se po kapkách během 30 minut přidá roztok 13,2 g t-butylkarbazátu (0,100 mol) v 225 ml dimethylformamidu. Pak se během 3 0 minut přidá 18,3 g difenylmethylaminu (0,10 mol) . Reakční směs se míchá jednu hodinu při teplotě místnosti v atmosféře dusíku. Pak se přidá 10 ml vody a tato směs se zahustí ve vakuu na objem 150 ml. Tento roztok se nalije do 500 ml vody a pak extrahuje 400 ml ethylacetátu. Ethylacetátová vrstva se vždy dvakrát extrahuje 75 ml kyseliny chlorovodíkové, vody, nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a nasyceného roztoku chloridu sodného a pak se vysuší bezvodým síranem hořečnatým. Směs se filtruje a roztok se zahustí za získání 29,5 g (85% výtěžek) 1-t-butoxykarbonylsemikarbazid4-yldifenylmethanu ve formě bílé pěny. Tuto látku lze čistit rekrystalizací ze směsi ethylacetát/hexan, ale její čistota umožňuje přímé použití v kroku 2. Teplota tání 142-143 °C. ^XH

123 • · ···· ·· r

NMR (CDC1₃) δ 1,45 (s, 9H) , 6,10 (dd, 2H) , 6,42 (s, ÍH) , 6,67 (šs, ÍH) , 7,21-7,31 (m, 10H) . Elementární analýza - vypočteno pro C₁₉H₂₃N₃O₃: C 66,84; H 6,79; N 12,31. Nalezeno: C 66,46; H 6,75; N 12,90 .

Krok 2

Roztok 3,43 g (10 mmol) 1-t-butoxykarbonylsemikarbazid-4-yl difenylmethanu ve 12,5 ml dichlormethanu se nechá reagovat s 12,5 ml trifluoroctové kyseliny při teplotě 0 °C. Reakční směs se přit této teplotě míchá 30 minut a pak se po kapkách přidá do 75 ml diethyletheru za získání sraženiny. Výsledná sraženina se filtruje a promyje diethyletherem za získání 2,7 g (80% výtěžek) sloučeniny uvedené v názvu, teplota tání 182-184 °C.

Příklad 66

Příprava diethylesteru 3-thioamidobenzyl-N-acetylaminomalonové kyseliny

V 500 ml dioxanu se rozpustí a s

míchá 45,0 g α-brom-m-tolunitrilu (0,24 mol), 48,0 g diethylacetamidomalonátu (0,22 mol) a 3,0 g jodidu draselného (0,018 mol) . Ke směsi se po kapkách v atmodféře argonu přidá 100 ml 2,5M ethoxidu sodného v ethanolu. Po dokončení přidávání se roztok zahřívá k varu po dobu 6 hodin. Reakční směs se nechá stát při teplotě místnosti přes noc, pak se zředí 250 ml nasyceného roztoku chloridu sodného a 250 ml vody a extrahuje se čtyřikrát ethylacetátem (celkem 1,0 1). Spojené extrakty se promyjí 100 ml vody, 100 ml 10% citrónové kyseliny, 100 ml vody a dvakrát 50 ml nasyceného roztoku

124 chloridu sodného. Pak se vysuší bezvodým síranem hořečnatým a filtrují. Rozpouštědlo se odstraní ve vakuu a surový zbytek se rekrystalizuje ze směsi ethylacetátu a diethyletheru. Ve dvou frakcích se získá 43,51 g (60% výtěžek) diethylesteru 3-kyanobenzyl-N-acetylaminomalonové kyseliny ve formě žlutých krystalů.

Do intenzívně míchaného roztoku 44,3 g diethylesteru 3-kyanobenzyl-N-acetylaminomalonové kyseliny (0,13 mmol) ve 300 ml pyridinu a 100 ml triethylaminu se 40 minut bublá plynný sulfan. Reakční směs se míchá při teplotě místnosti 16 hodin, pak se nalije do 3,0 1 vody. Okamžitě vznikne žlutá sraženina. Roztok se nechá stát 4 hodiny při teplotě 4 °C a pak se filtruje. Surová sloučenina uvedená v názvu se rekrystalizuje ze směsi ethylacetátu a hexanu za získáni 48,1 g (98% výtěžek) sloučeniny uvedené v názvu ve formě žlutých krystalů. Teplota tání 133-186 °C. ^XH NMR (CDC1₃) : δ 1,31 (t, J=7,l Hz, 6H) , 2,06 (s, 3H) , 3,70 (s, 2H) , 4,29 (kv, J=7,l Hz, 4H) , 4,80-4,37 (m, IH) , 6,60 (s, IH) , 7,10-7,20 (m, IH) , 7,27-7,35 (m, 2H) , 7,60-7,70 (m, 2H) . Elementární analýza vypočtena pro C₁₇H₂₂N₂O₅S:

Nalezeno: C 55,55; H 5,96; N 7,76.

3-amidino-D,L-fenylalaninu

C 55,72; H 6,05; N 7,64.

Příklad 67

Příprava dihydrochloridu

HCI

48,1 g sloučeniny z příkladu 66 (0,13 mmol) se rozpustí v

800.ml acetonu a přidá se 18,3 ml jodmethanu (0,19 mol, 1,5 ekvivalentu) a roztok se zahřívá 30 minut k varu. Roztok se

125 • · · · « « · · · » · · · ochladí na teplotě místnosti a získaný meziprodukt (thioimidát) se filtruje, vysuší a rozpustí v 500 ml methanolu. Pak se přidá 14,8 g octanu amonného (0,19 mol; 1,5 ekvivalentu) a reakční směs se zahřívá 1 hodinu k varu. Pak se ochladí na teplotu místnosti a nalije do 1,2 1 etheru. Roztok se nechá stát hodin při teplotě 4 °C. Pak se surový diethylester 3-amidinobenzy-N-acetylaminomalonové kyseliny oddělí filtrací, promyje etherem, vysuší vzduchem a pak se 3 hodiny zahřívá k varu ve 250 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Reakční směs se zahustí ve vakuu, zředí 0,5 1 vody a opět zahustí ve vakuu, tyto kroky se opakují. Surová sloučenina uvedená v názvu se čistí výměnou kationtu (Sefadex SP-C25) za vymývání použití gradientem 0-1,0M roztoku kyseliny chlorovodíkové. Získá se 10,8 g (30% výtěžek) sloučeniny uvedené v názvu ve formě šedobílé pevné látky. ^XH NMR (D₂0) δ 3,14-3,29 (2H, m), 4,17 (dd, J=7,4;

6,2 Hz, ÍH) , 7,42-7,69 (4H, m) . Elementární analýza vypočtena pro C₁₀H₁₃N₃O₂'2HCl'1,9H₂O : C 38,20; H 6,03; N 13,36. Nalezeno: C 38,51; H 5,64; N 12,89.

Příklad 68

Příprava Ν-α-Βοο-Ν-ω-4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzensulfonyl 3 -amidino-D,L-fenylalaninu

4,00 g 3-amidino-D,L-fenylalaninu (sloučenina z příkladu 67; 13 mmol) se rozpustí ve 20 ml 1:1 směsi vody a dioxanu. Pak se přidá 3,3 8 g hydrogenuhličitanu sodného (9, 4 0 mmol) a pak roztok 2,93 g di-t-butyldikarbonátu (13 mmol) ve 4 ml dioxanu.

126 •9 ·» · · · · • · 9 · · 9 · * • 99 ·· · ·· • «9 ·· · 9 9 9 99 999

Reakční směs se míchá 18 hodin při teplotě místnosti, roztok se ochladí v ledové lázni a pak se po kapkách přidává 4,OM roztok hydroxidu sodného do pH 12. Pak se po kapkách přidá roztok 8,01 g 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzensulfonylchloridu (32mmol) v 10 ml dioxanu. Pak se přidává 4, OM roztok hydroxidu sodného do pH 12. Ledová lázeň se odstraní a po 1 hodině se do roztoku přidává l,0M roztok kyseliny chlorovodíkové do pH 7-8. Roztok se zředí dalšími 50 ml vody a pak se promyje dvakrát 20 ml ethylacetátu. Vodná vrstva se okyselí na pH 1,0 pomocí 1,0M roztoku kyseliny chlorovodíkové a třikrát se extrahuje ethylacetátem (celkem 100 ml). Spojené organické vrstvy se promyjí 20 ml vody a dvakrát 10 ml nasyceného roztoku chloridu sodného. Organická vrstva se vysuší bezvodým síranem hořečnatým a rozpouštědlo se odstraní ve vakuu. Zbytek se rozpustí v minimálním množství dichlormethanu a pak se po kapkách přidá do 25 ml etheru. Pevné nečistoty se odstraní filtrací a rozpouštědlo z filtrátu se odstraní vakuu za získání 4,90 g (68% výtěžek) surové sloučeniny uvedené v názvu ve formě šedobílé pěny. Vzorek (30 mg) sloučeniny uvedené v názvu se dále čistí pomocí preparativní tenkovrstvé chromatografie; mobilní fáze 1 % octové kyseliny, 5 % isopropanolu, 94 % dichlormethanu; za získání 9 mg sloučeniny uvedené v názvu v čisté formě. R_£=0,16 (mobilní fáze 1 % octové kyseliny, 5 % isopropanolu, 94 % dichlormethanu) . 'H NMR (CD₃OD): δ 1,32 (s, 9H), 2,14 (s, 3H), 2,63 (s, 3H), 2,71 (s, 3H), 2,93 (dd, J=13,7, 9,3 Hz, IH), 3,22 (dd, J=13,7,

4,3 Hz, IH) , 3,85 (s, 3H) , 4,34-4-,37 (m, IH) , 6,72 (s, IH) , 7,3S-7,47 (2H, m), 7,69-7,75 (m, 2H).

Příklad 69

Příprava N-methyl-O-methylkarboxamidu Ν-α-Βοο-Ν-ω-4-methoxy2,3,6 -trimethylbenzensulfonyl-3-amidino-D,L-fenylalaninu • · · · · ·· ···· · · ·· ·

Boc

Ve 4 ml tetrahydrofuranu se rozpustí a míchá 1,00 g sloučeniny z příkladu 68 (1,92 mmol), 375 mg hydrochloridu O,N-dimethylhydroxylaminu (3,85 mmol), 294 mg hydrátu hydroxybenzotriazolu (1,92 mmol) a 1,06 ml 4-methylmorfolinu (9,62 mmol). Roztok se ochladí v ledové lázni a přidá se 406 mg EDC (2,12 mmol) . Ledová lázeň se odstraní a reakční směs se míchá 2 hodiny při teplotě místnosti. Reakční směs se zředí 75 ml ethylacetátu, promyje vodou, 10% kyselinou citrónovou, vodou, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a nasyceným roztokem chloridu sodného. Organická vrstva se vysuší bezvodým síranem hořečnatým a rozpouštědlo se odstraní ve vakuu. Získá se 750 mg (69% výtěžek) sloučeniny uvedené v názvu. ^XH NMR (CDC1₃) : δ 1,33 (s,

9H) , 2,14 (s, 3H) , 2,66 (s, 3H) , 2,75 (s, 3H) , 2,80-2,88 (m,

IH) , 3,06-3,20 (m, 4H) , 3,70 (s, 3H) , 3,84 (s, 3H) , 4,98-5,06 (m, IH) , 5,21, (d, J=8,7 Hz, IH) , 6,48 (šs, IH) , 6,58 (s, IH) ,

7,30-7,34 (m, 2H) 7,60-7,68 (m, 2H), 8,11 (šs, IH). Elementární analýza vypočtena pro C₂₇H_3aN₄O₇SO, 5H₂O: C 56,73; H 6,88; N 9,80. Nalezeno: C 56,97; H 6,66; N. 9,43.

Příklad 70

Příprava N-a-Boc-N-m-4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzensulfonylD, L-3-amidinofenylalaninalu

128

K 8 ml tetrahydrofuranu se přidají 2,0 0 ml 1, OM roztoku LiAlH₄' v tetrahydrofuranu (1,24 mmol). Roztok se ochladí v lázni suchý led/eceton a po kapkách se přidá roztok 0,75 g sloučeniny z příkladu 69 (1,9 mmol) v 5 ml tetrahydrofuranu. Chladící lázeň se odstaví a reakční směs se vytemperuje na 5 °C. Reakční směs se opět ochladí v lázni suchý led/aceton a rozloží se 3,0 ml roztoku 1:2,7 (hmotnostní poměr) hydrogensíranu ve vodě. Reakční směs se vytemperuje na teplotu místnosti a pak se míchá 3 hodiny. Pak se filtruje a zahustí ve vakuu. Zbytek se rozpustí ve 20 ml ethylacetátu a promyje 2 ml 10% kyseliny citrónové, 2 ml vody, 2 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 2 ml nasyceného roztoku chloridu sodného. Organická vrstva se vysuší bezvodým síranem hořečnatým a rozpouštědlo se odstraní ve vakuu za získání 560 mg (výtěžek 86 %) sloučeniny uvedené v názvu. H NMR (CDC1₃) : δ 1,31 (s, 9H) , 2,07 (s, 3H) , 2,57 (s,

3H) , 2,67 (s, 3H) , 2,90-3,17 (2H, m) , 3,77 (s, 3H) , 4,33-4,40 (IH, m) , 5,02-5,08 (IH, m) , 6,46 (IH, s) , 7,23-7,31 ' (2H, m) ,

7,50-7,62 (2H, m), 7,94, (IH, šs), 8,05 (IH, šs), 9,55 (IH, s).

Elementární analýza vypočtena pro C₂₅H₃₃N₃O_sS'0,5H₂O : C 58,58 ; H 6,69; N 8,20. Nalezeno: C 58,57; H 6,72; N 7,96.

Příklad 71

Příprava Ν-α-Βοο-Ν-ω-4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzensulfonylD,L-3-amidinofenylalaninalsemikarbazonyl-4-N-difenylmethan • · • · ·

129

BQCx

Ν

Η

och₃

V 10 ml 75% vodného ethanolu se 1 hodinu zahřívá k varu 0,58 g sloučeniny z příkladu 70 (1,9 mmol) , 410 mg sloučeniny z příkladu 65 (1,15 mmol) a 188 mg trihydrátu octanu sodného (1,38 mmol) . Reakční směs se pak ochladí na teplotu místnosti, zředí se 50 ml ethylacetátu, promyje 5 ml l,0M roztoku kyseliny chlorovodíkové, 5 ml vody, 5 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a dvakrát 5 ml nasyceného roztoku chloridu sodného. Pak se vysuší bezvodým síranem hořečnatým, rozpouštědlo se odstraní ve vakuu a získá se 750 mg (výtěžek 89 %) sloučeniny uvedené v názvu ve formě šedobílé pěny. Elementární analýza vypočtena pro C₃₉H_4SN₅O_sS’l, 0H₂0 : C 62,88; H 6,49; N 11,28. Nalezeno: C 63,14; H 6,35 N 11,10. Vypočtená molární hmotnost byla 726,90.

Příklad 72

Příprava soli trifluoroctové kyseliny a Ν-ω-4-methoxy-2,3,6 trimethylbenzensulfonyl-D,L-3-amidinofenylalaninalsemikarbazonyl-4-N-difenylmethanu

H

OCHj

130

750 mg sloučeniny z příkladu 71 (1,9 mmol) se nechá reagovat se ml 50% směsi trifluoroctové kyseliny a dichlormethanu po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Reakční směs se po kapkách přidá do 50 ml etheru. Roztok se nechá stát 18 hodin při teplotě 4 °C, produkt se oddělí filtrací a vysuší ve vakuu za získání 600 mg (79% výtěžek) sloučeniny uvedené v názvu ve formě šedobílé pevné látky. Elementární analýza vypočtena pro C₃₄H₃₈N_sO₄S'l, 3CF₃COOH: C 56,72; H 5,11; N 10,84. Nalezeno: C 56,34; H 5,47; N 11,49. Sůl má vypočtenou molární hmotnost 740,8.

Příklad 73

Příprava sloučeniny 10-6

Sloučenina 10-6 z obrázku 10 se připraví postupem popsaným v příkladech 60 až 64, ale v příkladu 60 se substituuje t-butoxykarbonyl-4 -(4-pyridyl)alanin.

Příklad 74

Příprava sloučeniny 11-7

Sloučenina 11-7 z obrázku 11 se připraví podle reakčního schématu z obrázku 11.

Příklad 75

Příprava sloučeniny 12-5

Sloučenina 12-5 z obrázku 12 se připraví podle reakčního schématu z obrázku 12.

131

Příklad 76

Příprava i-butoxykarbonyl-D-(isopropyloxykarbonyl)Ser-L-AlaN⁹ -nitroargininalethylcyklolu

,NH no₂

K roztoku 21,0 g sloučeniny z příkladu 58 (42,9 mmol) ve 100 ml pyridinu chlazenému v ledové lázni se přidá 21 ml 1M roztoku isopropylchlorformátu v toluenu (20 mmol, 5 ekvivalentů). Po 1 hodině reakce proběhla do konce (podle analytické HPLC). Reakční směs se zředí 300 ml toluenu, rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku a zbytek se rozpustí ve 400 ml acetonitrilu a rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustí ve 30 ml acetonitrilu a 30 ml ethylacetátu. Pak se přidá ether a izoluje se sraženina, která se promyje etherem a pak vysuší ve vakuu. Získaná pevná látka se promyje etherem a ethylacetátem (dvakrát 200 ml směsi 1:1) a pak vysuší ve vakuu za získání 22,4 g sloučeniny uvedené v názvu s výtěžkem 91 % ve formě šedobílé nažloutlé pevné látky. HPLC: t_r=18,l minut, gradient 5 % až 75 % acetonitrilu v 0,1% vodné trifluoroctové kyselině (pufr), kolona 4,6 x 250 mm, částice 5 pm, póry 100 angstroemů, kolona C18, průtok 1 ml/minutu.

Příklad 77

Příprava i-butoxykarbonyl-D-(isopropyloxykarbonyl)Ser-L-AlaArgininal-ethylcyklolu

Roztok 11,0 g' sloučeniny z příkladu 76 (19 mmol) ve 450 ml směsi ethanol:voda:octová kyselina (4:1:1) se probublá dusíkem a pak se přidají 2,0 g 10% palladia .na uhlí. Tato smě se 6 hodin hydrogenuje při tlaku 242 kPa (35 psi). Pak se přidá křemelina a reakční směs se filtruje za odstranění palladia. Rozpouštědlo se odstraní ve vakuu za získání sloučeniny uvedené v názvu ve formě nažloutlého medu, který se přímo použije v postupu příkladu 78. HPLC: t_r=13,l minut, gradient 5 % až % acetonitrilu v 0,1% vodné trifluoroctové kyselině (pufr), kolona 4,6 x 250 mm, částice 5 μπι, póry 100 angstroemů, kolona C18, průtok 1 ml/minutu.

Příklad 78

Příprava i-butoxykarbonyl-D-(isopropyloxykarbonyl)ser-L-AlaArgininalu

K roztoku 19 mmol sloučeniny z příkladu 77 ve 20 ml acetonitrilu se na 40 minut přidá 60 ml 6M chlorovodíkové kyseliny. Reakční směs se ochladí na teplotu 0 °C a pak se rozloží přidáním 240 ml 2,5M roztoku octanu sodného. Výsledný roztok se • 9 ·· ·· «·

133 filtruje a pak čistí ve dvou podílech pomocí preparativní HPLC. Frakce obsahující produkt (mobilní fáze 5-40 % vodný acetonitril obsahující 0,1 % trifluoroctové kyseliny) se spojí a lyofilizují za získání 4,1 g (výtěžek 42 %) sloučeniny uvedené v názvu ve formě bílého prášku. Analytická HPLC indikuje tři píky: t_r=17,2; 18,2; 18,6 minut, gradient 5 % až 50 % acetonitrilu v 0,1% vodné trifluoroctové kyselině (pufr), kolona

4,6 x 250 mm, částice 5 μπι, póry 100 angstroemů, kolona C18, průtok 1 ml/minutu.

Příklad 79

Postupuje se podle postupů popsaných v příkladech 76 až 78, ale isopropylchlorformát se nahradí (substituce) uvedenými látkami. Tím se získají následující sloučeniny:

Název sloučeniny	Substituce v příkladu 76
i-butoxykarbonyl-D-((+)-menthyloxykarbonyl) Ser-L-Ala-argininal (příklad 79A)	(+)-menthylchlorformát
i - (butoxykarbonyl-D-fenoxykarbonyl)SerAla-Arginirial (příklad 79B)	fenylchlorformát

i-butoxykarbonyl-D-((+)-menthyloxykarbonyl)Ser-L-Ala-argininal (příklad 79A).

ΝΗο ·· < • · • · · ·

i-butoxykarbonyl-D-(fenoxykarbonyl)Ser-L-Ala-argininal (příklad 79B).

Příklad 80

Příprava t-butylesteru N-ce-benzyloxykarbonyl-D-ser (0-t-butyl) L-Ala

K roztoku 5,02 g t-butyletheru N-a-Cbz-D-serinu (17 mmol) ve 100 ml acetonitrilu se přidá 4,90 g EDC (25,5 mmol; 1,5 ekvivalentu) a 2,60 g 1-hydroxybenzotriazolu (2,60 g, 17 mmol). Směs se míchá 45 minut a pak se přidá 3,55 h hydrochloridu t-butylesteru alaninu (19,6 mmol, 1,15 ekvivalentu) a 7,5 ml 4-methylmorfolinu (68 mmol, 4 ekvivalenty) . Reakční směs se míchá 1,5 hodiny (TLC indikuje konec reakce). Reakční směs se zahustí za sníženého tlaku a zbytek se rozpustí ve 100 ml ethylacetátu, pak se důkladně promyje IN kyselinou chlorovodíkovou, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného (25 ml od každého). Rozpouštědlo se odstraní ve vakuu za získání oleje, který stáním krystalizuje. Získá se 6,95 g sloučeniny uvedené v názvu ve formě světle žluté pevné

135

• ·	*·	•	• 9 «	• » • ·	•	·· • ·
« ·	• #	*	«	•	•	•
• ·	•	•	•	«	•	•
• ·	• ·		• ·	• · · ·		• · ·

látky (výtěžek 97 %) . R_fthanu).

=0,63 (5 % isopropanolu v dichlormePříklad 81

Příprava t-butylesteru D-Ser(O-t-butyl)-L-Ala

Roztok 1,14 g sloučeniny z příkladu 80 (2,69 mmol) v methanolu se hydrogenuje za použití 110 mg hydroxid palladnatého 1,5 hodiny (při tlaku balónku). Reakční směs se filtruje přes křemelinu a rozpouštědlo se odstraní ve vakuu za získání sloučeniny uvedené v názvu v kvantitativním výtěžku ve formě žlutého oleje. Rf = 0,44 (5 % methanolu v dichlormethanu).

Příklad 82

Příprava t-butylesteru fenethylsulfonyl-D-Ser(O-t-butyl)-L-Ala

K míchanému roztoku 4,2 g sloučeniny z příkladu 81 (14,6 mmol) a 3,58 g fenethylsulfonylchloridu (17,5 mmol, 1,2 ekvivalentu) ve 100 ml acetonitrilu chlazenému v ledové lázni se přidá 4,8 ml 2,4,6-kolidinu (36,5 mmol, 2,5 ekvivalentu). Reakční

136

• ·	··	·· Φ	•	·· • ·	·· •	•	• • ·
• ·	• *	•	•	•	*	•	•
• ·	•	•	•	•	•	•	«
··	··	··		• »··	··		··

směs se vytemperuje na teplotu místnosti a pak se míchá přes noc. Reakční směs se zahustí za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustí v 80 ml ethylacetátu a výsledný roztok se důkladně promyje 1,OM kyselinou chlorovodíkovou, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného. Pak se vysuší síranem sodným, rozpouštědlo se odstraní ve vakuu a zbytek se chromatograficky čistí na silikagelu, mobilní fáze 0-60 % ethylacetátu v hexanu. Získá se sloučenina uvedená v názvu (výtěžek 89 %) ve formě žlutého oleje. Rf=0,64 (5 % methanolu v dichlormethanu).

Příklad 83

Příprava fenethyl sulf onyl -D-Ser- L- Ala-Is^-ni troargininalethyl cyklolu

4,16 g sloučeniny z příkladu 82 (9,11 mmol) se nechá reagovat se 40 ml směsi 1:1 trifluoroctové kyseliny a dichlormethanu. Po 3 hodinách se reakční směs zředí 45 ml toluenu a rozpouštědlo se odstraní za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustí ve 40 ml acetonitrilu a rozpouštědlo se odstraní ve vakuu za získání 4,36 g fenethylsulfonyl-D-serin-L-alaninu. Rf=0,52 (10 % isopropanolu v dichlormethanu). 9,11 mmol surového fenethylsulfonyl-D-serin-L-alaninu se rozpustí v 90 ml acetonitrilu a míchaný roztok se ochladí v ledové lázni v dusíkové atmosféře. Pak se přidá 3,63 g EDC (18,9 mmol) a 1,93 g 1-hydroxybenzotriazolu (12,6 mmol) . Reakční směs se míchá 5 minut a pak se přidá 4,04 g hydrochloridů N⁹-nitroargininalethylcyklolu • · ·

137 (15,1 mmol) . Směs se míchá 10 minut, pak se chladící lázeň odstraní a přidá se 5,54 ml 4-methylmorfolinu (50 mmol). Reakční směs se míchá přes noc, pak se zahustí za sníženého tlaku a pak zředí ethylacetátem. Roztok se důkladně promyje 1, OM chlorovodíkovou kyselinou, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného a pak vysuší síranem sodným a zahustí za sníženého tlaku. Spojené vodné vrstvy se zpětně extrahují 25 ml ethylacetátu. Organická vrstva se důkladně promyje l,0M chlorovodíkovou kyselinou, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného a pak vysuší síranem sodným a zahustí za sníženého. Surový produkt se jako zbytek z extrakce směsi a vodné vrstvy chromatograficky čistí na silikagelu, mobilní fáze 1-6 % ethanolu v dichlormethanu. Získá se 3,25 g sloučeniny uvedené v názvu (výtěžek 64 %) ve formě oranžové pevné látky. Rf=0,83 (10 % isopropanolu v dichlormethanu) .

Příklad 84

Příprava fenethylsulfonyl-D-Ser-L-Ala-argininalu

Provede se hydrogenace a hydrolýza postupem popsaným v příkladech 58 a 59. Získá se sloučenina uvedená v názvu ve formě bílého prášku. HPLC: t_r = 15,6 a 17,8 minut, gradient 10 % až 30 % acetonitrilu v 0,1% vodné trifluoroctové kyselině (pufr), kolona 4,6 x 250 mm, částice 5 μπι, póry 100 angstroemů, kolona C18, průtok 1 ml/minutu. Hmotnostní spektrum (M+H)=485.

138

Příklad 85

Příprava fenethylsulfonyl-D-(isopropyloxykarbonyl)Ser-L-Alaargininalu

Provedou se následující tři kroky: příprava karbonátu, hydrogenace a hydrolýza, popsané v příkladech 76 až 78. Získá se sloučenina uvedená v názvu ve formě bílého prášku. HPLC: t_r=12,6; 13,1 a 13,2 minut; gradient 5 % až 90 % acetonitrilu v 0,1% vodné trifluoroctové kyselině (pufr), kolona 4,6 x 250 mm, částice 5 um, póry 100 angstroemů, kolona C18, průtok 1 ml za minutu. Hmotnostní spektrum (M+H) = 571.

Za použití návodu z podrobného popisu vynálezu a z příkladů se za použití příslušných výchozích látek připraví následující sloučeniny:

N-a- (2-fenylethyl)sulfonyl-D-serylazetidin-2-karbonylargininal ;

benzyloxykarbonyl-D-seryl-4-hydroxyprolylargininal a benzyloxykarbonyl-D-seryl-3-trans-hydroxyprolylargininal.

Za použití návodu z podrobného popisu vynálezu a z příkladů se za použití příslušných výchozích látek a činidel připraví následující sloučeniny:

N-a-(2-fenylethyl)sulfonyl-D-seryl-3,4-dihydroprolylargininal;

139

fenethyloxykarbonyl-D-Ser-L-Ala-argininal;

fenethylsulfonyl-D-Ser-L-propargyl-Gly-argininal;

3-fenpropyloxykarbonyl-D-Ser-L-Ala-argininal;

benzylaminokarbonyl-D-Ser-L-dehydroprolylargininal;

fenethylaminokarbonyl-D-Ser-L-Ala-argininal;

benzylaminokarbony-D-Ser-L-azetidin-2-karboxyargininal;

3-fenylpropylaminokarbonyl-D-Ser-L-Ala-argininal;

cyklohexylmethylaminokarbonyl-D-Ser-L-dehydroprolylargininal;

\ s

-fenethylaminokarbonyl-D-Ser-L-dehydroprolylargininal;

141 cyklohexylmethylaminokarbonyl-D-Ser-L-azetidin-2-karboxyargininal;

-fenylpropylaminokarbonyl-D-Ser-L-azetidin-2-karboxyargininal;

fenethylsulfonyl-D-Ser-L-dehydroprolylargininal;

isobutoxykarbonyl-D-ethoxykarbonyl-Ser-L-Ala-argininal;

isobutoxykarbonyl-D-(n-butyloxykarbonyl)-Ser-L-Ala-argininal ;

fenethylsulfonyl-D-ethoxykarbonyl-Ser-L-Ala-argininal;

143

fenethylsulfonyl-D-(n-butyloxykarbonyl)-Ser-L-Ala-argininal; a

fenethylsulfonyl-D-(2-methoxyethoxykarbonyl)-Ser-L-Alaargininal .

Příklad A

In vitro enzymový test na stanovení specifičnosti

Schopnost sloučenin podle předkládaného vynálezu selektivně inhibovat katalytickou aktivitu urokinázy se hodnotí stanovením koncentrace testované sloučeniny, která inhibuje aktivitu tohoto enzymu na 50 % (IC₅₀) , a srovnáním této hodnoty s hodnotou stanovenou pro všechny nebo některé z následujících serinových proteas: aktivátor plasminogenu rekombinované tkáně (rt-PA),

144

plasmin, aktivovaný protein C, chymotrypsin, faktor Xa, thrombin a trypsin.

Ve všech testech se použije pufr HBSA (10 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM chloridu sodného; 0,1 % albuminu telecího séra).

Stanovení IC₅₀ se provede spojením (ve vhodných jamkách Corningovy mikrotitrační desky) 50 μΐ HBSA, 50 μΐ roztoku testované sloučeniny s danou koncentrací (testy se provedou se širokou škálou koncentrací) v HBSA (nebo je HBSA při měření rychlosti V_o bez inhibitoru) a 50 μΐ roztoku enzymu v HBSA. Po 30minutové inkubaci při teplotě místnosti se do jamky přidá 50 μΐ roztoku substrátu s koncentrací uvedenou níže za dosažení konečného celkového objemu 200 μΐ (4násobek Km) . Počáteční rychlost hydrolýzy chromogenního substrátu se měří změnou v absorbanci při 405 nm za použití měřidla Thermo Max® pro kinetické měření desky během 5minutového intervalu, kdy se použije méně než 5 % přidaného substrátu. Koncentrace přidaného inhibitoru, která způsobí 50% pokles počáteční rychlosti hydrolýzy se definuje jako hodnota IC_S0.

Test s urokinázou

Katalytická aktivita urokinázy se stanoví za použití chromogenního substrátu 150 mM S-2444 (hydrochlorid L-pyroglutamylglycyl-L-arginin-p-nitroanilinu) získaného od DiaPharma Group, Inc. Urokináza (Abbokináza) vyrobená firmou Abbott Laboratories se získá od firmy Priority Pharmaceuticals a před použitím se zředí na 750 pM v HBSA testovacím pufru. testovací pufr je HBS (10 mM HEPES, 150 mM chloridu sodného pH 7,4) a 0,1 % BSA.

• · · · · · · ·

145

Test s thrombinem (flla)

Aktivita enzymu se stanoví za použití chromogenního substrátu Pefachrome t-PA (CH₃S0₂-D-hexahydrotyrosin-glycyl-L-Argininp-nitroanilin od firmy Pentapharm Ltd.). Substrát se před použitím rekonstituuje v deionizované vodě. Jako enzym sé použije čištěný lidský ct-thrombin od firmy Enzym Research Laboratories, lne. Pro všechny testy se použije pufr HBSA (10 mM HEPES, pH 7,5; 150 mM chloridu sodnéhu, 0,1 % albuminu z telecího séra).

Stanovení IC_S0 se stanoví spojením HBSA (50 μΐ) , cc-thrombinu (50 μΐ; konečná koncentrace enzymu je 0,5 nM) a inhibitoru (50 μΐ; široká škála koncentrací). Jamky se inkubují 30 minut při teplotě místnosti a pak se přidá substrát Pefachrome-t-PA (50 μΐ; konečná koncentrace substrátu je 250 μΜ, tj. 5krát Km). Počáteční rychlost hydrolýzy Pefachromu t-PA se měří změnou absorbance při 405 nm za použití kinetického měřidla desek Thermo MAX® v průběhu 5minutového intervalu, během kterého se spotřebuje méně než 5 % přidaného substrátu. Koncentrace přidaného inhibitoru, která způsobí- 50% pokles počáteční rychlosti hydrolýzy definuje hodnotu IC₅₀.

Faktor Xa

Katalytická aktivita faktoru Xa se stanoví za použití chromogenního substrátu S-2765 (N-benzyloxykarbonyl-D-arginin-L-glycin-L-arginin-p-nitroanilin) od firmy DiaPharma Group (Franklin, OH) . Všechny substráty se před použitím rekonstitutuuji v deionizované vodě. Konečná koncentrace S-2765 je 250 μΜ (5krát Km) . Čištěný lidský faktor X se získá od firmy Enzym Research Laboratories, lne. (South Bend, TN) a faktor Xa (FXa) se aktivuje a připraví podle práce Bock Ρ. E., - Craig P. A.,

146

Olson S. T. a Singh P., Arch. Biochem. Biophys. 273: 375-388 (1989). Enzym se zředí před testem v HBSA na konečnou koncentraci 0,25 nM.

Test aktivátoru plasminogenu rekombinované tkáně (rt-PA)

Test katalytické aktivity rt-PA se provede za použití substrátu Pefachrom t-PA (CH₃S0₂-D-hexahydrotyrosinglycyl-L-arginin-pnitroanilin od firmy Pentapharm Ltd.). Substrát zpracuje v deionizované vodě a pak se zředí HBSA. Při testu je pak konečná koncentrace se 500 μΜ (3krát Km) . Lidský rt-PA (Activase®) se získá od firmy Genentech Inc. Enzym se rekonstituuje v deionizované vodě a před testem se zředí v HBSA. Konečná koncentrace při testu je 1,0 nM.

Test s plasminem

Katalytická aktivita plasminu se stanoví za použití chromogenního substrátu S-2366 [hydrochlorid L-pyroglutamyl-L-prolylL-arginin-p-nitroanilinu], který se získá od firmy DiaPharma Group. Substrát se zpracuje v deionizované vodě a pak před testem zředí v HBSA. Konečná koncentrace při testu je 3 00 μΜ (2,5krát Km) . Čištěný lidský plasmin se získá od firmy Enzym Research Laboratories, Inc. Enzym se před testem zředí v HBSA, konečná koncentrace při testu je 1,0 nM.

Test s aktivovaným proteinem C- (aPC)

Katalytická aktivita aPC se stanoví za použití chromogenního substrátu Pefachrome PC (dihydrochlorid δ-karbobenzyloxy-D-lysin-L-prolyl-L-arginin-p-nitroanilinu) od firmy Pentapharm Ltd.). Substrát se zpracuje před testem v deionizované vodě a pak zředí v HBSA. Konečná koncentrace při testu je 400 μΜ (3krát Km) . Čištěný lidský aPC se získá od firmy Hematologie

147

Technologies, lne. Enzym se před testem zředí v HBSA, konečná koncentrace při testu je 1,0 nM.

Test s chymotrypsinem

Katalytická aktivita chymotrypsinu se stanoví za použití chro-_ mogenního substrátu S-2586 (methoxysukcinyl-L-arginin-L-prolylL-tyrosyl-p-nitroanilid), který se získá od firmy DiaPharma Group. Substrát se zpracuje v deionizované vodě a pak před testem zředí HBSA. Konečná koncentrace při testu je 100 μΜ (9krát Km) . Čištěný (třikrát krystalizovaný; CDI) telecí pankreatický α-chymotrypsin se získá od firmy Worthington Biochemical Corp. Enzym se rekonstituuje v deionizované vodě a před testem zředí v HBSA. Konečná koncentrace při testu je 0,5 nM.

Test s trypsinem

Katalytická aktivita trypsinu se stanoví za použití chromogenního substrátu S-2222 (benzoyl-L-isoleucin-L-glutamová kyselina- [γ-methylester]-L-arginin-p-nitroanilid), který se získá od firmy DiaPharma Group. Substrát se zpracuje v deionizované vodě a pak před testem zředí v HBSA. Konečná koncentrace při testu je 250 μΜ (4krát Km) . Čištěný (třikrát krystalizovaný; TRL3) telecí pankreatický trypsin se získá od firmy Worthington Biochemical Corp. Enzym se rekonstituuje v deionizované vodě a před testem zředí v HBSA. Konečná koncentrace při testu je 0,5 nM.

Tabulka I

Tabulka I uvádí zjištěné hodnoty IC₅₀ některých enzymů uvedených výše pro sloučeniny podle předkládaného vynálezu, které

148 vykazují vysoký stupeň specifičnosti pro inhibici urokinázy (v porovnání s jinými serinovými proteázami).

Tabulka I

SlouČ. č.	Příklad. S.	uPA*	tPA*	plasmin*
1	3 35-40 54-61	A	D	C
2	9	A	C	C
3	10	A	D	NT
4	10	A	D	NT
5	10	A	D	NT
6	10	A	D	NT
7	10	A	D	NT
3	10	A	D	NT
9	10	A	D	NT
10	11	A	D	NT
11	12	A	D	C
12	12	A	D	C
13	12	B	D	NT
14	12	A	D	NT
15	12	B	D	NT
1 z 1 1	12	B	D	NT
17	12	B	D	NT
18	12	C	D	NT
19	13	A	D	C
20	13	B	D	NT
21	13	3	NT	NT
22	13	C	D	NT
23	13	C	D	NT
24	14	B	NT	NT
25	14	B	NT	NT
26	15	B	D	NT

149

Slouč. č.	Příklad č.	uPA*	tPA*	plasmin*
27	15	B	D	A
28	16-20	A	D	C
29	21-26	A	D	c
30	27-34	3	D	c
31	46	A	NT	c
32	47-50	A	D	c
35	10	C	D	D
36	10	A	D	C
37	10	3	D	D
38	10	B	D	D
39	10	C	D	D
40	10	A	D	D
41	16	C	D	C
42	16	3	D	B
43	15	n	T~\ U	c
44	51 '	c	D	c
45	52	B	D	c
46	52	A	D	c
47	51	A	D	c
48	51	A	D	c
4 9	52	A	D	c
50	52	A	D	B
51	52	A	D	C
52	52	3	D	c
53	53	A	D	c

A = méně, než 100 nm B = 100/250 nm

C = 250-2500 nm

D = více, než 2500 nm

NT = netestováno • · · · · · · · • ···· · · · ··· ·· · · ·

150 • ·· «· ···· ·· ···

Příklad Β

Hodnocení sloučeniny 1 in vivo jako inhibitoru angiogeneze

Pro hodnocení schopnosti sloučeniny 1 inhibovat angiogenezi se použije model kuřecí CAM (kuřecí chorioalantoická membrána) ,_ což je standardní test angiogeneze. Tento model je zavedený pro hodnocení aktivity testované sloučeniny ovlivnit tvorbu nových cév.

Na CAM lOdenních kuřecích zárodků se umístí kroužek filtru nasycený roztokem (0,5 pg/ml) bázickéhó faktoru fibroblastového růstu (bFGF) za účelem vyvolání angiogeneze. Po 24 hodinách se zárodku vstříkne do žíly 0 až 1 pg sloučeniny 1 v celkovém objemu 100 μΐ sterilního PBS. Po 48 hodinách se zárodky usmrtí a kroužky filtru a okolní CAM tkáň se vyjme a analyzuje. Stupeň angiogeneze se stanoví spočtením míst větvení cév v ohraničené ploše filtru [Brooks P. C. a další, Methods in Molecular Biology 120: 257-269 (1999)]. Index angiogeneze je definován jako rozdíl počtu míst větvení cév u pokusné skupiny a kontrolní skupiny zárodků, kterým nebyla podána testovaná sloučenina. Každá pokusná skupina obsahuje 8 až 10 kuřecích zárodků. Při tomto pokusu jedna dávka 1 pg sloučeniny 1 inhibuje angiogenezi o, o .

o 92 ··· ·· · · ···· ·· ·

151

Tabulka II

Inhibice cytokinem indukované angigeneze pomocí sloučeniny 1

Ošetření	Počet rozvětvení cév	Index angiogeneze
žádné	13 ± 2	0
bFGF	39 ± 8	26
bFGF, 0,001 μρ sl. 1	35 + 5	22
bFGF, 0,01 μg sl. 1	21 ± 5	8
bFGF, 1,0 μg sl. 1	15 ± 1	2

Příklad C

Hodnocení schopnosti sloučeniny 1 inhibovat růst lidských nádorových buněk v modelu kuřecího zárodku

Pro hodnocení schopnosti sloučeniny 1 in vivo inhibovat růst lidských nádorových buněk se použije model kuřecího zárodku. Monobuněčná suspenze lidských buněk fibrosarkomu (HT 1080) obsahující 4xl0⁵ buněk v celkovém objemu 40 μΐ se aplikuje 10dennímu zárodku kuřete podle práce Brooks a další („Brooks P.C. a další, „Integrin α_νβ₃ Antagonists Promte Tumor Regression by Inducing Apoptosis of Angiogenic Blood Vessels, Cell 79: 1157-1164 (1994)). Po 24 hodinách se zárodku intravenózně podá až 10 pig sloučeniny 1. Po jednorázové dávce sloučeniny resp. kontrolní látky se zárodky inkubují celkem 7 dnů a pak se usmrtí. Nádory se vyjmou, očistí od okolní CAM tkáně a váží. Tabulka III uvádí čisté hmotnosti nádorů vyjmutých při tomto pokusu. Každá pokusná skupina obsahuje 10 až 12 kuřercích zárodků. Jednorázová dávka 10 μρ sloučeniny 1 snížila hmotnost nádoru o 65 %.

152

Tabulka III

Inhibice růstu buněk HT1080 v zárodku kuřete pomocí slouč. 1

Ošetření	Čistá hmotnost (mg)
kontrolní pokus	273 ± 49
sloučenina 1 (1 pg)	174 ± 25
sloučenina 1 (10 pg)	97 ± 15

4 4 · 4 44

Claims

PATENTOVÉ

NÁROKY

4 44 4 · 44«

1. Sloučenina vzorce I:

R< N H

N

O R,

R₃ O <r₅ (i) kde (a) X je vybráno ze skupiny, kterou tvoří skupina -S(0)₂-, skupina -N(R')-S(O) ₂-, skupina -(C=O)-, skupina -OC(=O)-, skupina -NH-C(=O)-, skupina -P(0)(R) - a přímá vazba, kde R' je nezávisle vybrán ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku nebo arylalkylová skupina obsahující 7 až 16 atomů uhlíku, s výhradou, že pokud X je skupina -P(0)(R)-, pak R' není atom vodíku;

(b) R_x je ze skupiny, kterou tvoří (1) alkylová skupina obsahující 1 až 12 atomů uhlíku, která je popřípadě substituovaná skupinou Y_x, (2) alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku substituovaná cykloalkylovou skupinou obsahující 5 až 8 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di- nebo tri - substituovaná na kruhu skupinami Y_lř Y₂ a/nebo Y₃, (3) cykloalkylová skupina obsahující 3 až 15 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y_x, Y₂ a/nebo Y₃, ·· · · · · ·· • » » · · ·«· « » · · · · ··

154 » ·· ·· ···· ·· ··· (4) heterocykloalkylová skupina obsahující 4 až 10 kruhových atomů, kterýmu jsou atomy uhlíku nebo heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a skupina S(0)_x, kde i je 0, 1 nebo 2, která je popřípadě mono-, di- nebo tri - substituovaná na kruhu skupinami Y_x, Y₂ a/nebo Y₃, (5) heterocyklus 4 až 10 kruhových atomů, kterými jsou atomy uhlíku nebo heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a skupina S(O)_iz — Ν V —Ν V kde i je 0, 1 nebo 2, včetně , kde je 5 až 7-členný heterocyklus obsahující 3 až 6 kruhových atomů uhlíku, kde V je skupina -CH₂-, skupina -0-, skupina -S(=0)-, skupina -S(O)₂- nebo skupina -S-, který je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaný na kruhu skupinami Y_x, Y₂ a/nebo Y₃, (6) alkenylová skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, která je popřípadě substituovaná cykloalkylovou skupinou obsahující 5 až 8 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di- nebo tri - substituovaná na kruhu skupinami Y_1Z Y₂ a/nebo Y₃, (7) arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y_x, Y₂ a/nebo Y₃, (8) heteroarylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, kterými jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, a která je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y_x, Y₂ a/nebo Y₃,

155

• ♦ ·· • ·· • ·· • 9 ·· • · • · • Φ • • • • • • · • • • • • • · >· ·· »··· ·· ·

(9) arylalkylová skupina obsahující 7 až 15 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di- nebo tri - substituovaná na kruhu skupinami Y_lř Y₂ a/nebo Y₃, (10) heteroarylalkylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, a která je popřípadě substituovaná na alkylovém řetězci hyxdroxyskupinou nebo atomem halogenu a popřípadě mono-, dinebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y_lř Y₂ a/nebo Y₃, (11) arylalkenylová skupina obsahující 8 až 16 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y_1; Y₂ a/nebo Y₃, (12) heteroarylalkenylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, a která je popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na kruhu skupinami Y_x, Y₂ a/nebo Y₃, (17) kondenzovaná karbocyklická alkylová skupina obsahující 9 až 15 atomů uhlíku;

(18) difluormethylová nebo perfluoralkylová skupina obsahující 1 až 12 atomů uhlíku;

* ·» ·« ·· ·· • · · ···· · · • · · · · · · ··

156 (19) perfluorarylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku;

(20) perfluorarylalkylová skupina obsahující 7 až 15 atomů uhlíku; a (21) atom vodíku, pokud X je přímá vazby;

kde každé Y_x, Y₂ a Y₃ je nezávisle vybrané (i) ze skupiny, kterou tvoří atom halogenu, kyanoskupina, nitroskupina, tetrazolylová skupina, guanidinoskupina, amidinoskupina, methylguanidinoskupina, skupina -CF₃, skupina -CF₂CF₃, skupina -CH(CF₃)₂, skupina -C(OH) (CF₃)₂, skupina -OCF₃> skupina -OCF₂H, skupina -OCF₂CF₃, skupina -OC(O)NH₂, skupina -OC(O)NHZ_lřskupina -OC(O)NZ_XZ₂, skupina -NHC(O)Z_lz skupina -NHC(O)NH₂, skupina -NHC(O)NZ_X, skupina -NHC (O) NZ_XZ₂, skupina -C(O)OH, skupina -C(O)OZ_X, skupina -C(O)NH₂, skupina -C(O)NHZ_X, skupina -C(O)NZ₁Z₂, skupina -P(O)₃H₂, skupina -P(O)₃(Z_X)₂, skupina -S(O)₃H, skupina -S(O)_mZ₁, skupina -Z_x, skupina -OZ_X, skupina -OH, skupina -NH₂, skupina -NHZ_X, skupina -NZ_XZ₂, -N-morfolinoskupina, skupina -S(CF₂)_qCF₃ a skupina -S (O) _m (CF₂) _qCF₃, kde m je 0, 1 nebo 2, q je celé číslo od 0 do 5 a Z_x a Z₂ jsou nezávisle vybrané ze skupiny, kterou tvoří alkylová skupina obsahující 1 až 12 atomů uhlíku, arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku, heteroarylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, arylalkylová skupina obsahující 7 až 15 atomů uhlíku a heteroarylalkylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, nebo (ii) Y_x a Y₂ dohromady tvoří skupinu -O[C(Z₃) (Z₄)]_rO-, kde r je celé číslo od 1 do 4 a Z₃ a Z₄ jsou nezávisle vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 12 atomů uhlíku, arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů

157 • ·· ·· ·· ·· · • · · ♦ · · · ···· • · · · · · * ♦ · · ·· · · · · · ·· · · • · · · 4 · · · · ··· ·· «· ···· ·· · · · uhlíku, heteroarylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, arylalkylová skupina obsahující 7 až 15 atomů uhlíku a heteroarylalkylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů;

(c) R₂ je vybrán ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku, skupina -CH₃, skupina -C₂H_S, skupina -(CH₂)₂OH, skupina -(CH₂)₂OA₂, skupina -CH(R_S)OH, skupina -CH(R_S)OA₂ a skupina -CH₂NH-X'-R_s, kde A₂je skupina -C(=O)OR₉ nebo skupina -C(=O)R₉; X' je vybrán ze skupiny, kterou tvoří skupina -S(0)₂-,· skupina -S (0) ₂-N (R) -, skupina -(C=0)-, skupina -C(=0)-0-, skupina -C(=0)-NH-, skupina -P(0) (R)- a přímá vazba, kde R je atom vodíku, alkylová skupina obsahující 1 až 4 atomy uhlíku, arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku nebo arylalkylová skupina obsahující 7 až 16 atomů uhlíku, s výhradou, že pokud X' je skupina -P(0) (R) -, pak R není atom vodíku; R_s je vybrán ze skupiny, kterou tvoří:

(1) alkylová skupina obsahující 1 až 12 atomů uhlíku, popřípadě substituovaná skupinou Y_lř (2) alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku substituovaná cykloalkylovou skupinou obsahující 5 až 8 atomu uhlíku, která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y_lř Y₂, a/nebo Y₃, (3) cykloalkylová skupina obsahující 3 až 15 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, (4) heterocykloalkylová skupina obsahující 4 až 10 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atomy

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 * C • · · 9 9 9 99

158 kyslíku, dusíku a skupina S(0)_iz kde i je O, 1 nebo 2, která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou

Y_lř Y₂, a/nebo Y₃, • 9 9 99 9999 99 »·· (5) heterocyklus obsahující 4 až 10 kruhových atomů, kterými jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a skupina S(O)_iz kde i je 0, 1 nebo 2, včetně skupiny — Ν V —Ν 7 , kde je 5 až 7-členný heterocyklus obsahující 3 až 6 atomů uhlíku, kde V je skupina -CH₂-, skupina -0-, skupina -S(=O)-, skupina -S(O)₂- nebo skupina -S-, který je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y_1Z Y₂, a/nebo Y₃, (S) alkenylová skupina obsahující 2 až 6 atomů uhlíku, která je popřípadě substituovaná cykloalkylovou skupinou obsahující 5 až 8 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y_1Z Y₂, a/nebo Y₃, (7) arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y_lz Y₂, a/nebo Y₃, (8) heteroarylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, a která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na kruhu skupinou Y_lz Y₂,. a/nebo Y₃, ·· ·· · · ·r

159 (9) arylalkylová skupina obsahující 7 až 15 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná na arylovém kruhu skupinou Y_lz Y₂, a/nebo Y₃, (10) heteroarylalkylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, kterými jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, která je popřípadě na alkylovém řetězci substituovaná hydroxyskupinou nebo atomem halogenu a popřípadě mono-, di-, nebo trisubstítuovaná na. kruhu skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, (11) arylalkenylová skupina obsahující 8 až 15 atomů uhlíku, která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstítuovaná skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, (12) heteroarylalkenylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, a která je popřípadě mono-, di-, nebo trisubstituovaná skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, a (13) atom vodíku; a

Rq je vybrán ze skupiny, kterou tvoří:

(1) alkylová skupina obsahující 1 až 12 atomů uhlíku popřípadě substituovaná skupinou Y_lř (2) alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku substituovaná cykloalkylovou skupinou obsahující 5 až 8 atomů uhlíku, která je popřípadě na. kruhu mono-, dí-, nebo trisubstituovaná skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃,

160 (3) cykloalkylová skupina obsahující 3 až 15 atomů uhlíku, která je popřípadě na kruhu mono-, di-, nebo trisubstituovaná skupinou Y_1Z Y₂, a/nebo Y_3Z φφφ · φ (4) heterocykloalkylová skupina obsahující 4 až 10 kruhových atomů, kterými jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a skupina S(O)_iz kde i je 0, 1 nebo 2, která je popřípadě na kruhu mono-, di-, nebo trisubstituovaná skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, (5) heterocyklus obsahující 4 až 10 kruhových atomů, což jsou atomy uhlíku nebo heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a skupina S(O)_iz kde i je 0, 1, nebo 2, —· Ν V — Ν V včetně skupiny , kde je 5 až 7-členný heterocyklus obsahující 3 až 6 kruhových atomů, kde V je skupina -CH₂-, skupina -0-, skupina -S(=O)-, skupina -S(O)₂nebo skupina -S-, která je popřípadě na kruhu mono-, di-, nebo trisubstituovaná skupinou Y_1Z Y₂, a/nebo Y₃, (6) arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku, která je popřípadě na kruhu mono-, di-, nebo trisubstituovaná skupinou Y_lz Y₂, a/nebo Y₃, (7) heteroarylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, kterými jsou atomy uhlíku a heteroatomy, přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, a která je popřípadě na kruhu mono-, di-, nebo trisubstituovaná skupinou Y_lz Y₂, a/nebo Y_3z

161 (8) arylalkylová skupina obsahující 7 až 15 atomů uhlíku, která je popřípadě na arylovém kruhu mono-, di-, nebo trisubstituovaná skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, (9) heteroarylalkylová skupina obsahující 5 až 14 kruhových atomů, kterými jsou atomy uhlíku nebo heteroatomy,' přičemž heteroatomy jsou vybrané ze skupiny, kterou tvoří atom kyslíku, dusíku a síry, a která je popřípadě substituovaná na alkylovém řetězci hydroxyskupinou nebo atomem halogenu a popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná na kruhu skupinou Y_x, Y₂, a/nebo Y₃, a (10) atom vodíku, s výhradou, že R₉ není atom vodíku, pokud A₂ je skupina -C(=O)OR₉;

(d) R, . je vybrán ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku nebo methylová skupina, nebo R₃ a R₄ jsou vybrány tak, jak uvádí bod (f) ;

(e) R₄ je v S konfiguraci a je vybrán ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku, skupina -CH₂-S-CH₃, skupina -CH₂OH, skupina -CH₂CN, nižší alkylová skupina obsahující 1 až 3 atomy uhlíku, skupina -CH₂C=CH, skupina -CH₂CH=CH₂ a skupina -CH=CH₂ nebo R₃ a R₄ jsou vybrány tak, jak je uvedeno v bodu (f);

(f) alternativně jsou R₃ a R₄ spolu vybrány tak, že jsou v S konfiguraci a tvoří v pozici P2 skupinu z množiny, kterou tvoří prolylová skupina, pipecholylová skupina, azetidin-2-karbonylová skupina, 4-hydroxyprolylová skupina, 3-hydroxyprolylová skupina a 3,4-dehydroprolylová skupina;· (g) R_s je vybrán ze skupiny, kterou tvoří ··· · · · · 9 9 9· 99 1

162

Η a

kde R₇ je vybrán ze skupiny, kterou tvoří kde d je celé číslo od 1 do 3 a W je skupina -N- nebo skupina

-CH-; a (h) A_x je skupina -NHR_a, kde R_a je alkylová skupina obsahující 1 až 12 atomů uhlíku, arylová skupina obsahující 6 až 14 atomů uhlíku nebo arylalkylová skupina obsahující 6 až 15 atomů uhlíku, všechny popřípadě mono-, di- nebo tri-substituované skupinou Y_x, Y₂ a/nebo Y₃, nebo je atom vodíku; a její farmaceuticky upotřebitelné soli.
2. Sloučenina podle nároku 1, kde R_s je:

O
3. Sloučenina podle nároku 2, kde R₇ je:

NH

X

HN NH, > ·
4. Sloučenina podle nároku 3, kde d je 2 • · · · · • ··· tt «

163
5. Sloučenina podle nároku 4, kde R₂ je atom vodíku, skupina - CHj, skupina -CH₂CH₃, skupina -CH₂NH(X') (R_s) nebo skupina -CH(R_S)OH) .
6. Sloučenina podle nároku 5, kde R_s je atom vodíku, alkylová skupina popřípadě substituovaná skupinou Y_x nebo arylalkylová’ skupina popřípadě mono-, di- nebo tri-substituovaná skupinou Y_x, Y₂ a/nebo Y₃.
7. Sloučenina podle nároku 6, kde R₂ je atom vodíku, skupina -CH-OH nebo skupina -CH(CH₃)OH.
8. Sloučenina podle nároku 7, kde R₂ je skupina -CH(CH₃)OH a má konfiguraci R.
9. Sloučenina podle nároku 7, kde R₃ je atom vodíku.
10. Sloučenina podle nároku 9, kde R₄ je methylová skupina nebo propargylová skupina.
11. Sloučenina podle nároku 7, kde R₃ a R₄ jsou vybrány společně tak, že v pozici P₂ tvoří skupinu vybranou ze skupiny, kterou tvoří prolylová skupina, pipecholilová skupina, azetidin-2 -karbonylová skupina, 4-hydroxyprolylová skupina, 3-hydroxyprolylová skupina a 3,4-dehydroprolylová skupina;
12. Sloučenina podle nároku 11, kde R₃ a R₄ jsou vybrány společně tak, že v pozici P₂ tvoří skupinu vybranou ze skupiny, kterou tvoří 4-cis-hydroxyprolylová skupina, 3,4-dehydroprolylová skupina a azetidin-2-karbonylová'skupina.
13. Sloučenina podle nároku 5, kde R_s je atom vodíku.
14. Sloučenina podle nároku 1, kde X je vybraná ze skupiny, kterou tvoří skupina -S(0)₂-, -OC(=0)-, skupina -NH-C(=O)- a přímá vazba.

• 0 0 · · 0 0 ♦0 • · * 0000 0 · 0

0000 00 0 · ·

164
15. Sloučenina podle nároku 14, kde X je skupina -S(0)₂- nebo skupina -0C(=0)-.
16. Sloučenina podle nároku 15, kde R_x je vybraná ze skupiny, kterou tvoří fenylová skupina, benzylová skupina, 2-fenylethylová skupina, isobutylová skupina a 3 -fenylpropylová skupina.
17. Sloučenina podle nároku 16, kde R_x-X- je vybraná ze skupiny, kterou tvoří skupina fenyl-S(0)₂-, skupina benzyl-S (0)₂-, skupina 2-fenylethyl-S (0) ₂-, skupina 3-fenylpropyl-S-(O)₂-, skupina benzyl-0C(=0) a skupina isobutyl-0C(=0)-.
18. Sloučenina podle nároku 1, kde R₂ je vybraná ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku, methylová skupina, ethylová skupina, skupina -CH₂NH(X') (R_g) a skupina -CH(R_S)OH.
19. Sloučenina podle nároku 18, kde R₆ je vybraná ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku, alkylová skupina popřípadě substituovaná skupinou Y₃ a arylalkylová skupina popřípadě mono-, dinebo tri-substituovaná skupinou Y_x, Y₂ a/nebo Y₃.
20. Sloučenina podle nároku 19, kde R₂ je vybraná tak, že v pozici P3 tvoří skupinu vybranou ze skupiny, kterou tvoří glycylová skupina, D-serylová skupina, (R,R)D-allothreonylová skupina, D-2-aminobutyrylová skupina, Ν-β-methyloxykarbonyl-D-2,3 diaminopropionylová skupina, Ν-β-(2-fenylethylkarbonyl)-D-2,3 diaminopropionylová skupina a Ν-β-benzyloxykarbonyl-D-2,3-diaminopropionylová skupina.
21. Sloučenina podle nároku 20, kde P3 je D-serylová skupina nebo (R,R)D-allothreonylová skupina.
22. Sloučenina podle nároku 1, kde R₃ je atom vodíku.

• 9 · · ·· 9 ·

9 9 9·· 9 · • 99 · 9 · ··

165 • 99 99
23. Sloučenina podle nároku 1, kde R₄ je methylová skupina nebo propargylová skupina.
24. Sloučenina podle nároku 1, kde R₃ a R₄ jsou spolu vybrány tak, že v pozici P2 tvoří skupinu vybranou z prolylové skupiny, pipecholylové skupiny, azetidin-2-karbonylové skupiny, 4-hydro-xyprolylové skupiny, 3-hydroxyprolylové skupiny a 3,4-dehydroprolylové skupiny.
25. Sloučenina podle nároku 24, kde R₃ a R₄ jsou spolu vybrány tak, že v pozici P2 tvoří skupinu vybranou z prolylové skupiny, 4-cis-hydroxyprolylové skupiny, 3,4-dehydroprolylové skupiny a azetidin-2-karbonylové skupiny.
26. Sloučenina podle nároku 1, kde R₂ je vybraná tak, že v pozici P3 tvoří skupinu vybranou z D-serylu a (R,R)D-allothreonvlu, a R_s je vybraná za vzniku argininaldehydu v Pl.
27. Sloučenina podle nároku 26, kde R₃ je atom vodíku a R₄ je methylová skupina.

23. Sloučenina podle nároku 26, kde R₃· a R₄ jsou spolu vybrány tak, že v pozici P2 tvoří skupinu vybranou z prolylové skupiny, azetidin-2-karbonylové skupiny a 3,4-dehydroprolylové skupiny.
29. Sloučenina podle nároku 1, kde R₅ je skupina

H

O
30. Sloučenina podle nároku 1 vybraná ze skupiny, kterou tvoří • · · ·· ·· · · ··· ···· '· · · ···· · · · ··

167 ··· · · ·· ···· ·· ·
31. Sloučenina podle nároku 7, konfiguraci R.

kde R₂ je skupina

-CH₂OH a má nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.
33. Sloučenina podle nároku 1, kde R₂ je skupina -(CH₂)₂OA₂ nebo skupina -CH(R_S)OA₂.
34. Sloučenina podle nároku 33, kde R₂ je skupina - CH (R._s) 0A₂.

168
35. Sloučenina podle nároku 34, kde R_s je vybraná ze skupiny, kterou tvoří atom vodíku, alkylová skupina popřípadě substituovaná skupinou Y_x a arylalkylová skupina popřípadě mono-, dinebo tri - substituovaná skupinou Y_x, Y₂ a/nebo Y₃.
36. Sloučenina podle nároku 35, kde R₂ je vybraná tak, že v pozici P3 tvoří skupinu vybranou z acylové skupiny a karbonátesteru D-serylové skupiny.
37. Sloučenina podle nároku 36, kde R₃ je atom vodíku.
38. Sloučenina podle nároku 37, kde R₄ je methylová skupina nebo propargylová skupina.
39. Sloučenina podle nároku 36, kde R₃ a R₄ jsou společně vybrány tak, že vpozici P2 tvoří skupinu vybranou ze skupiny, kterou tvoří prolylová skupina, pipecnoiylová skupina, azetidin-2-karbonylová skupina, 4-hvdroxyorolylcvá skupina, 3-hydroxyprolylová skupina a 3,4-dehydroprolylová skupina.
40. Sloučenina podle nároku 1, kde R₂ je vybraná tak, že v pozici P3 tvoří skupinu vybranou ze skupiny, kterou tvoří acylová skupina a karbonátestery D-serylové skupiny a R_s je vybraná za získání argininaldehydu v PÍ.
41. Sloučenina podle nároku 40, kde R₃ je atom vodíku a R₄ je methylová skupina.
42. Sloučenina podle nároku 40, kde R₃ a R₄ jsou společně vybrané tak, že v pozici P2 tvoří skupinu vybranou z prolylové skupiny, azetidin-2-karbonylové skupiny a 3,4-dehydroprolylové skupiny.
43. Sloučenina podle nároku 4, kde R₂ je skupina -(CH₂)₂OA₂ nebo skupina -CH(R₆)OA₂.

169
44. Sloučenina podle nároku 4, kde R₂ je vybraná tak, že v pozici P3 tvoří skupinu vybranou ze skupiny, kterou tvoří acylová skupina a karbonátestery D-serylu.
45. Sloučenina podle nároku 29, kde R₂' je atom vodíku, skupina -CH₃, skupina -CH₂CH₃, skupina -CH₂NH(X') (R_s) nebo skupina -CH(RJOH.
46. Sloučenina podle nároku 29, kde R₂ je skupina - (CH₂) ₂OA₂nebo skupina -CH(R₆)OA₂.
47. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a terapeuticky účinné množství sloučeniny podle nároku 1.
48. Farmaceutická kompozice, vyznačuj ící že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a přijatelné množství sloučeniny - podle nároku 4.
49. Farmaceutická kompozice, vyznačuj ící že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a přijatelné množství sloučeniny podle nároku 12.
50. Farmaceutická kompozice, vyznačuj ící že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a přijatelné množství sloučeniny podle nároku 17.
51. Farmaceutická kompozice, vyznačuj ící že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a přijatelné množství sloučeniny podle nároku 21.
52. Farmaceutická kompozice, vyznačuj ící že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a přijatelné množství sloučeniny podle nároku 24.

se tím, terapeuticky se tím, terapeuticky se tím, terapeuticky se tím, terapeuticky se tím, terapeuticky

170
53. Farmaceutická kompozice, vy/značující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a terapeuticky přijatelné množství sloučeniny podle nároku 26.
54. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a terapeuticky přijatelné množství sloučeniny podle nároku 30.
55. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a terapeuticky účinné množství sloučeniny podle nároku 32.
56. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič a terapeuticky účinné množství sloučeniny podle nároku 33.
57. Farmaceutická kompozice, vyznačuj ící že obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič· a účinné množství sloučeniny podle nároku 40.

se tím, teraoeutickv
58. Způsob léčení onemocnění , které se zlepší inhibici nebo snížením aktivity urokinázy u potřebuje, vyznačuj ící savce, který takovou léčbu tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství sloučeniny podle nároku 1 tomuto savci.
59. Způsob léčení onemocnění, které še zlepší inhibici nebo který takovou léčbu tím, že zahrnuje snížením aKtivity uroKmazy u savce, potřebuje, vyznačující se podávání terapeuticky účinného množství sloučeniny podle nároku 4 tomuto savci.
60. Způsob léčení onemocnění, které se zlepší inhibici nebo snížením aktivity urokinázy u savce, který takovou léčbu potřebuje, vyznačující se s e tím,' že zahrnuje

171 podávání terapeuticky účinného množství sloučeniny podle nároku

12 tomuto savci.
61. Způsob léčení onemocnění, snížením aktivity urokinázy potřebuje, vyznačuj íc podávání terapeuticky účinného 17 tomuto savci.
62. Způsob léčení onemocnění, snížením aktivity urokinázy potřebuje, vyznačuj íc podávání terapeuticky účinného 21 tomuto savci.
63. Způsob léčení onemocnění, snížením aktivity urokinázy potřebuje, vyznačuj i o podávání terapeuticky účinného 24 tomuto savci.
64. Způsob léčení onemocnění, snížením aktivity urokinázy potřebuje, vyznačuj íc podávání terapeuticky účinného 26 tomuto savci.
65. Způsob léčení onemocnění, snížením aktivity urokinázy potřebuje, vyznačuj íc podávání terapeuticky účinného 30 tomuto savci.

které se zlepší inhibici nebo u savce, který takovou léčbu i se tím, že zahrnuje množství sloučeniny podle nároku které se zlepší inhibici nebo u savce, který takovou léčbu i se tím, že zahrnuje množství sloučeniny podle nároku které se u savce, zlepší inhibici nebo který takovou léčbu množství sloučeniny podle nároku které se zlepší inhibici nebo u savce, který takovou léčbu i se tím, že zahrnuje množství sloučeniny podle nároku které se zlepší inhibici nebo u savce, který takovou léčbu i se tím, že zahrnuje množství sloučeniny podle nároku

172
66. Způsob léčení onemocnění, snížením aktivity urokinázy potřebuje, vyznačuj íc podávání terapeuticky účinného 32 tomuto savci.

které se zlepší inhibici nebo u savce, který takovou léčbu i se tím, že zahrnuje množství sloučeniny podle nároku
67. Způsob snížení nebo inhibice vzniku cév u savce, který takovou léčbu potřebuje, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství sloučeniny podle nároku 32 tomuto savci.
68. Způsob podle nároku 67, vyznačující se tím, že jmenovaný vznik cév souvisí s patologickým stavem.
69. Způsob léčení snížením aktivity potřebuje, v y z n podáváni terapeucíc 33 tomuto savci.

onemocnění, urokinázy a č u j i c ky ucmneho které se zlepší inhibici nebo u savce, který takovou léčbu tím, že zahrnuj e množství sloučeniny podle nárok
70. Způsob léčení onemocnění, snížením aktivity urokinázy potřebuje, vyznačuj íc podávání terapeuticky účinného 40 tomuto savci.

které se zlepší inhibici nebo u savce, který takovou léčbu i se tím, že zahrnuje množství sloučeniny podle nároku