JPH0244518B2 - Tanpakubunkaikosooteiryobunsekisuruhoho - Google Patents
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Landscapes
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Description
本発明は、蛋白分解酵素、特に酵素部類E.
C.3.4.21.の酵素、例えば器官又は腺カリクレイ
ン、トロンビン及びプラズミンを定量分析する方
法に関する。 所謂器官カリクレイン又は腺カリクレインは、
種々の器官及び腺、例えば分泌腺、唾液腺、腎
臓、消化管粘膜等によつて得られ、前酵素の形又
は活性形で分泌される。これらの器官又は腺カリ
クレインは、化学的及び生理学的に血漿カリクレ
インとは異なるものである。一定の病理学的条件
下で器官カリクレイン分泌物濃度は、正常値より
も低下するか又は正常値よりも上昇する。すなわ
ち、例えば尿のカリクレイン分泌は、腎臓疾病の
患者の正常値よりも実質的に減少する。腎臓硬化
症の患者においてカリクレイン分泌は、殆んど完
全に抑圧されている。特発性高血圧症の患者にお
いて、24時間−尿のカリクレイン分泌は、正常値
の50％平均として有効に減少されている（例え
ば、H.S.Margolius著）“Chemistry and
Biology of the Kallikrein−Kinin System in
Health and Disease”、1974年、第399〜409頁、
参照）。それ故、簡単な処理方法で器官カリクレ
インを迅速に定量分析することは重要である。例
えば、一定のアルギニンエステル、例えばトジル
−アルギニンメチルエステル（TAME）をエス
テル分解することによつて尿カリクレインを分析
することは、公知である。改善されたエステル分
解法では、三重水素で標識されたトジル−アルギ
ニンメチルエステルを使用し、エステル分解によ
つて放出されるメタノールの放射能を測定する。
しかし、これらのエステル分解法は、該方法がカ
リクレインがルエステル分解によらずアミド分解
により天然のペプチド鎖を分解する蛋白分解酵素
である程度に非生理学的であるという欠点を有す
る。更に、エステル基質は、該基質が多数の他の
酵素によつて分解されている、すなわちカリクレ
インによつて不明確に分解されているという欠点
を有する。三重水素で標識されたTAMEを用い
る方法は、三重水素で標識されたメタノールの放
射能測定よりも前に、エステル分解混合物中にな
お存在する三重水素で標識された残留TAMEが
測定を邪魔するのでメタノールをエステル分解混
合物から水と不飽和性の液体で抽出しなければな
らない程度に複雑である。 審査されずに公告された西ドイツ国特許出願公
開第2527932号明細書には、式：R1−Pro−Ｘ−
Arg−NH−R2（但し、R1は保護基を表わし、−
NH−R2は発色団を表わし、Ｘはフエニルアラニ
ル基、β−シクヘキシルアラニル基、フエニルグ
リシル基又はチロシル基を表わす）で示される基
質が記載されている。該基質は、血漿カリクレイ
ンによつて極めて簡単に分解され、有色の分解生
成物R2−NH2を生じ、この場合この分解生成物
の量は、測光法、分光測光法又は蛍光測光法によ
つて測定することができる。また、器官又は腺カ
リクレインクを分析するために該基質を使用する
ことも試みられた。しかし、意外なことに、該基
質は、器官又は腺カリクレインに対して敏感でな
い、すなわち器官又は腺カリクレインによつて分
解されないか又は少量が分解されるにすぎないこ
とが判明した。 審査されずに公告された西ドイツ国特許出願公
開第2629067号明細書には、特定の蛋白分解酵素、
例えば腺又は器官カリクレイン及びプラズミンを
分析するための基質として有用なトリペプチド誘
導体が記載されている。すなわち、Ｈ−Ｄ−バリ
ル−ロイシル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド
ジヒドロクロリド及びＨ−Ｄ−バリル−ロイシル
−リジル−ｐ−ニトロアニリドジヒドロクロリド
が２つの例として挙げられている。第１のトリペ
プチド誘導体は、腺カリクレインのための基質で
あり、第２のトリペプチド誘導体は、プラズミン
のための基質である。これら２つの化合物は、該
酵素によつて分解され、ｐ−ニトロアニリンを生
じ、この場合このｐ−ニトロアニリンの量は、測
光法又は分光測光法により測定することができ
る。しかしながら、Ｈ−Ｄ−バリル−ロイシル−
アルギニル−ｐ−ニトロアニリドジヒドロクロリ
ドの感受率は、濃縮されてない尿中の尿カリクレ
インを正確に分析するのに必要な限界値に到達す
る。しかし、該アミド基質を濃縮された尿中で使
用する場合には、ｐ−ニトロアニリンの測光法に
よる測定は、尿の独自の色によつて強固に阻止さ
れる。 前記の西ドイツ国特許明細書に記載された２つ
のトリペプチド誘導体のトリペプチド鎖中の第１
の２つのアミノ酸は、α−又はβ位に阻水性イソ
プロピル基を有する。この阻水性を増大させ、そ
の後に腺カリクレインに対する感受性を増大させ
るために、ジペプチド鎖の基本構造を維持しなが
ら、イソプロピル基を芳香族基、例えばフエニル
基に代えることが試みられた。しかし、この試み
は失敗した。芳香族基を装入することによつて得
られるトリペプチド基質は、腺カリクレインによ
つて全く分解されないか又は多くの場合極めて少
量が分解されるにすぎない。しかし、芳香族基を
有するこれらのトリペプチド基質は、プラズミン
に対して驚異的に高い感受性を有する。更に、意
外なことに、該トリペプチドプラズミン基質にお
ける芳香族基の水素添加は、器官又は腺カリクレ
インに対して驚異的に高い感受性を有する新規部
類のトリペプチド基質を生じることが見い出され
た。トリペプチド鎖を増加させるには、蛋白分解
酵素によつて分解される基質を得るために天然に
生じるアミノ酸だけを使用することができること
が判明していた。それ故、シクロヘキシル基を含
有しかつ天然に生じないアミノ酸を使用すること
により、器官又は腺カリクレイン及びその他の蛋
白分解酵素、例えば血漿カリクレインによつて簡
単に分解される発色団基質を得ることができるこ
とが見い出されたことは意外なことであつた。 本発明方法によれば、特定の蛋白分解酵素、特
に酵素部類E.C.3.4.21.の酵素、例えば器官又は腺
カリクレイン、プラズミン及びトロンビンに対し
て高い感受性を有し、したがつて該酵素を定量分
析するための基質として有用な新規の発色団基質
に関連する。該基質は、一般式： Ｈ−Ｄ−Ｘ−Ｙ−Arg−Ｒ 〔式中、 Ｘはアラニル基、α−ブチリルアミノ基、バリ
ル基、ノルバリル基、ロイシル基、ノルロイシル
基又はイソロイシル基を表わし、 Ｙはシクロヘキシルアラニル基又はシクロヘキ
シルチロシル基を表わし、 Ｒはｐ−ニトロフエニルアミノ基、２−ナフチ
ルアミノ基、４−メトキシ−２−ナフチルアミノ
基、４−メチル−クマリル−７−アミノ又は１，
３−ジ（メトキシカルボニル）−フエニル−５−
アミノ基を表わす〕で示されるトリペプチド誘導
体である。 式のトリペプチド誘導体は、水性媒体に対し
て難溶性であり、したがつてその酸との塩の形
で、殊に鉱酸、例えばHCl、HBr、H2SO4、
H3PO4等、又は有機酸、例えば蟻酸、酢酸、プ
ロピオン酸、トリメチル酢酸、メトキシ酢酸、ト
リクロル−又はトリフルオル酢酸のようなハロゲ
ン化酢酸、アミノ酢酸、乳酸、蓚酸、マロン酸、
クエン酸、安息香酸、核中で置換された芳香族
酸、例えばトリイル酸、クロル−又はブロム安息
香酸、メトキシ安息香酸及びアミノ安息香酸、フ
タル酸等との塩の形で有利に使用される。該酸の
性質は、該酸が基質と酵素との間の反応に関与し
ないので重要ではない。 式の基質及びその酸との塩は、特定の蛋白分
解酵素、特に酵素部類E.C.3.4.21.の酵素
（“Enzyme Nomenlature”、Elsevier Scientific
publishing Company（Amsterdam）社刊、1973
年、第238頁以降、参照）、例えば器官カリクレイ
ン及び腺カリクレイン、プラズミン及びトロンビ
ンの作用によつて加水分解により分解され、その
結果式：Ｒ−NH2の有色性又は蛍光性分解生成
物が形成され、この場合この分解生成物の量は、
測光法、分光測光法、蛍光分光測光法又は電気化
学的方法によつて測定することができる。従つ
て、この新規の基質は、蛋白分解酵素、殊にアル
ギニンないしはリジンのカルボキシル側鎖上の天
然のペプチド鎖を分解する酵素部類E.C.3.4.21.の
酵素、例えば器官又は腺カリクレイン、プラズミ
ン、血漿カリクレイン、トロンビンないしはそれ
らの抑制因子及び前酵素、ならびに該酵素の形成
又は抑制に関与するその他の因子を定量分析する
のに有用である。 トリペプチド誘導体の優れた群は、 Ｙがシクロヘキシルアラニル基又はシクロヘキ
シルチロシル基を表わし、 Ｘがアラニル基、α−アミノブチリル基、バリ
ル基、ノルバリル基、ロイシル基、ノルロイシル
基又はイソロイシル基を表わす式の化合物から
なる。 次の実施例３、５、７、９、12、13、36、37、
38、40及び41に記載のトリペプチド誘導体は、殊
に尿カリクレインを分析するための基質として有
用である。 ヒトの中のカリクレインを分析するには、次の
実施例３、５、７、９、12、13、36、37、38、40
及び41に記載のトリペプチド誘導体を使用するこ
とができる。 次の実施例36、37及び41に記載のトリペプチド
誘導体は、プラズミンを分析するのに使用するこ
とができる１群の基質を構成する。 本発明は、蛋白分解酵素、殊にアルギニンない
しはリジンのカルボキシル側鎖上の天然のペプチ
ド鎖を分解する酵素部類E.C.3.4.21.の酵素、例え
ば器官又は腺カリクレイン、プラズミン及びトロ
ンビンを定量分析する方法に関する。本発明によ
る方法は、前記要素を含有するか又は該酵素を形
成又は消費する物質を、式のトリペプチド誘導
体と反応させ、このトリペプチド誘導体における
酵素の加水分解作用によつて形成される有色又は
蛍光性分解生成物Ｒ−NH2の量を、測光法、分
光測光法、蛍光分光測光法又は電気化学的方法に
よつて測定することを特徴とする。本発明方法
は、例えば酵素標本の酵素含量又はヒトの体液及
び哺乳動物の体液、例えば尿、膵液、腸粘液、乳
腺分泌物、汗腺分泌物、喀痰及び血液中の酵素濃
度を分析することができる。本発明方法は、殊に
前記体液中の器官又は腺カリクレイン及び血漿カ
リクレインを定量分析するのに有用である。この
方法によれば、遊離器官カリクレイン及び粘膜カ
リクレインないしプレカリクレインから形成され
たカリクレイン、さらにカリクレインの生理学的
又は非生理学的抑制因子及びプレカリクレインの
生理学的又は非生理学的賦活体を分析することが
できる。 式のトリペプチド誘導体は、以下に記載した
方法により製造することができる： (1) 発色団Ｒを、Ｃ−末端アルギニンのカルボキ
シル基に結合させ、その際にα−アミノ基を保
護基、例えばカルボベンゾキシ基又はｔ−ブト
キシカルボニル基によつて保護し、δ−グアニ
ジル基を、例えばHClを用いるプロトン化、ニ
トロ化又はトジル化によつて保護する。また、
Ｃ−末端Ｒ−NH基は、トリペプチド鎖を段階
的に合成する間保護基として役立つ。その他の
保護基は、必要な場合には所望のペプチド鎖が
完全に合成されるまで他のアミノ酸誘導体を結
合させるために選択的に除去することができ
る。最後に、残留する保護基を、Ｒ−NH−基
を作用させることなしに完全に分解する（例え
ば、Miklos Bodansky他、“Peptide
Synthesis”、Interscience Publishers社刊、
1966年、第163〜165頁）。 (2) 第１にトリペプチド鎖を（Bodansky他によ
る方法、上記引用文中、により）合成するが、
その際にアルギニンのＣ−末端カルボキシル基
を常用のエステル基、例えばメトキシ基、エト
キシ基又はベンジルオキシ基（アルギニンの場
合）、又はｔ−ブトキシ基（リジンの場合）に
よつて保護する。該エステル基は、トリフルオ
ル酢酸により選択的に分解しなければならない
ｔ−ブトキシ基を除いて、アルカリ加水分解に
よつて除去することができる。アルギニンのδ
−グアニジル基をプロトン化する場合には、該
エステル基をトリプシンを用いて酵素により除
去し、この場合ラセミ化は起こらない。次に、
発色団Ｒ−NHを結合させる。アルギニンのδ
−グアニジノ基をニトロ基又はトシル基によつ
て保護し、トリペプチド誘導体のＮ−末端α−
アミノ基をカルボベンゾキシ基又はｐ−メチル
−、ｐ−メトキシ−又はｐ−クロルベンジルオ
キシカルボニル基又はｔ−ブトキシ基によつて
保護する場合には、全ての保護基を同時に除去
する。この除去は、保護されているトリペプチ
ド誘導体を無水HFで室温で処理することによ
つて実施することができ、したがつてこの場合
にはアミノ基δ−グアニジノ基の全ての前記保
護基が除去される。また、この除去は、保護さ
れているトリペプチド誘導体が保護ニトロ基又
はトシル基を含有しない場合、氷酢酸中の
2NHBrで室温で処理することによつて実施す
ることもできる。 本発明方法により用いられるトリペプチド誘導
体の製造は、次の実施例に詳記されている。 実施例によつて得られた溶出液及び生成物の分
析は、シリカゲルで被覆されたガラス板
（Merck社、F254）を用いて薄層クロマトグラフ
イーによつて行なわれた。薄層クロマトグラム
は、次の溶剤系によつて展開した： Ａ クロロホルム／メタノール（９：１） Ｂ ｎ−プロパノール／酢酸エチル／水（７：
１：２） Ｃ ｎ−ブタノール／酢酸／水（３：１：１） 次の略語を使用する： AcOH＝酢酸 Ala＝アラニン Arg＝アルギニン BOC＝ｔ−ブトキシカルボニル But＝α−アミノ酪酸 Cbo＝カルボベンゾキシ CHA＝シクロヘキシルアラニン CHG＝シクロヘキシルグリシン CHT＝シクロヘキシルチロシン＝ｐ−ヒドロキ
シシクロヘキシルアラニン DMF＝ジメチルホルムアミド DPA＝１，３−ジ（メトキシカルボニル）−フエ
ニル−(5)アミド TLC＝薄層クロマトグラフイー Et3N＝トリエチルアミン HMPTA＝燐酸Ｎ，Ｎ，N′，N′，N″，N″−ヘ
キサメチルトリアミド Ile＝イソロイシン Leu＝ロイシン SS＝溶剤系 Lys＝リジン MCA＝４−メチル−クマリル−(7)−アミド MeOH＝メタノール ４−MeO−２−NA＝４−メトキシ−２−ナフチ
ルアミド Nleu＝ノルロイシン Nval＝ノルバリン OpNP＝ｐ−ニトロフエノキシ Phe＝フエニルアラニン Ph′Gly＝フエニルグリシン Pip＝ピペコリン酸 pNA＝ｐ−ニトロアニリド Pro＝プロリン THF＝テトラヒドロフラン Tyr＝チロシン Val＝バリン 特に記載しない限り、ペプチド鎖中のアミノ酸
はＬ−形を有する。 例 １ Ｈ−Ｄ−Val−CHA−Arg−pNA.2HBr 1a Cbo−Arg−pNA.HCl 250mlの三首フラスコ中で（真空中でP2O5上
で乾燥した）Cbo−Arg−OH.HCl16.0ｇ（47.0
ミリモル）を20℃で無水HMPTA90mlに溶解
し、この場合フラスコ中の雰囲気は湿分を含ま
ないように保持した。得られた溶液に室温でま
ずHMPTA10ml中のEt3N4.74ｇ（47.0ミリモ
ル）の溶液を添加し、次に（100％過剰の）ｐ
−ニトロフエニルイソシアネート16.4ｇ（100
ミリモル）を滴加した。20℃での24時間の反応
時間後、HMPTAの大部分を真空中で蒸留す
ることによつて除去した。この残滓を30％
AcOHで数回抽出した。この残滓を廃棄した。
合した酢酸抽出液を30％AcOHで平衝させかつ
30％AcOHで溶離せしめる“セフアデツクス
（Sephadex）Ｇ−15”（登録商標）のカラムを
通すことによつてさらに精製した。ｐ−ニトロ
アニリンの遊離下にトリプシンで処理すること
によつて分解されたAcOH溶出液の画分を凍結
乾燥した。こうして、TLCによつて示される
ようにSSC中で均一な無定形粉末12.6ｇが得ら
れた。元素分析及び実験式C20H25N6O5Clから
の計算により次の値が得られた（実験式からの
値は括弧内のものである）：Ｃ＝51.29％
（51.67％）、Ｈ＝5.48％（5.42％）、Ｎ＝17.92％
（18.08％）、Cl＝7.50％（7.63％）。 1b 2HBr.H−Arg−pNA 化合物1a4.65ｇ（10ミリモル）を撹拌下で氷
酢酸中の2NHBr40mlで20℃で湿分の不在下に
45分間処理した。アミノ酸誘導体はCO2の発生
下に溶解した。この反応溶液を強力撹拌下で無
水エーテル250mlに滴加した。この溶液は、
2HBr.H−Arg−pNAの沈殿物を生じた。エー
テル相を吸引過し、その上固体相を副生成物
として形成された臭化ベンジルならびに過剰の
HBr及びAcOHを除去するために無水エーテ
ル100mlの量で４回洗浄した。この残滓をメタ
ノール50mlに溶解し、そのPHをEt3Nを添加す
ることによつて4.5に調節し、この溶液を真空
中で30℃で濃縮乾燥した。得られた生成物を
MeOH75mlに溶解し、MeOHで平衝させた
“セフアデツクス（Sephadex）LH−20”（架
橋デキストランゲル）のカラムを通した。この
溶出液の画分から、TLCによつて示されるよ
うにSSC中で均一な無定形化合物1b4.18ｇ（理
論値の91.6％）が得られた。元素分析及び実験
式C12H20N6O3Br2からの計算により次の値が
得られた：Ｃ＝31.15％（31.60％）、Ｈ＝4.35％
（4.42％）、Ｎ＝18.84％（18.43％）及びBr＝
34.81％（35.03％）。 1c Cbo−CHA−Arg−pNA.HBr 化合物1b4.56ｇ（10ミリモル）を新しく蒸留
したDMF30mlに溶解し、この溶液を−10℃に
冷却した。この溶液に撹拌下でEt3N1.40ml
（10ミリモル）を添加した。形成したEt3N.
HBrを過することによつて除去し、冷たい
DMFの少量で洗浄した。この液に−10℃で
Cbo−CHA−OpNP4.69ｇ（11ミリモル）を添
加し、反応を湿分の不在下に２〜３時間継続さ
せ、この場合反応溶液の温度は次第に約20℃に
到達した。この溶液を再び−10℃に冷却し、
Et3N0.70ml（５ミリモル）で緩衝し、−10℃で
約２時間反応させ、室温で約３時間反応させ
た。この方法をHt3N0.70mlを用いて繰り返し、
16時間この反応溶液を真空中で50℃で濃縮乾燥
した。この残滓を50％AcOH75mlに溶解し、50
％AcOHで平衡させた“セフアデツクス
（Sephadex）Ｇ−15”のカラムでゲル過する
ことによつて精製した。ｐ−ニトロアニリンの
遊離下でトリプシンで処理することによつて分
解されたAcOH溶出液の主画分を真空中で40℃
で濃縮乾燥した。この残滓をMeOH150mlに溶
解し、再び濃縮して乾燥した。得られた残滓を
真空デシケーター中で60℃でP2O5上で乾燥し、
TLCによつて示されるようにSSC中で均一な
無定形化合物1c5.85ｇ（理論値の88.3％）を得
た。元素分析及び実験式C29H40N7O6Brからの
計算により次の値が得られた：Ｃ＝52.28％
（52.57％）、Ｈ＝6.16％（6.09％）、Ｎ＝15.09％
（14.80％）及びBr＝11.85％（12.06％）。 1d 2HBr.H−CHA−Arg−pNA 化合物1c5.30ｇ（８ミリモル）を撹拌下で氷
酢酸中の2NHBr32mlで20℃で40分間処理した。
ペプチド誘導体は、CO2の発生下に次第に溶解
した。この反応溶液を強力撹拌下で無水エーテ
ル250mlに滴加した。この溶液は、2HBr.H−
CHA−Arg−pNAの沈殿物を生じた。エテー
ル相を吸引過し、その上固体相を副生成物と
して形成した臭化ベンジルならびに過剰の
HBr及びAcOHを除去するために無水エーテ
ル100mlの量で４回洗浄した。この残滓を
MeOH50mlに溶解した。PHをEt3Nを用いて4.5
に調節し、この溶液を真空中で30℃で濃縮乾燥
した。得られた残滓をMeOH50mlに溶解し、
MeOHで平衡させた“セフアデツクス
（Sephadex）LH−20”のカラムで精製した。
ｐ−ニトロアニリンの遊離下でトリプシンで処
理することによつて分解されたMeOH溶出液
の画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。得られ
た残滓を真空デシケーター中で40℃でP2O5上
で乾燥し、TLCによつて示されるようにSSC
中で均一な無定形化合物1d4.48ｇ（理論値の
91.9％）を得た。元素分析及び実験式
C21H35N7O4Brからの計算により次の値が得ら
れた：Ｃ＝41.80％（41.39％）、Ｈ＝5.86％
（5.79％）、Ｎ＝16.31％（16.09％）及びBr＝
25.85％（26.23％）。 1e Cbo−Ｄ−Val−CHA−Arg−pNA.HBr 化合物1d3.05ｇ（５ミリモル）を新しく蒸留
したDMF20mlに溶解し、この溶液を−10℃に
冷却した。この溶液にEt3N0.70ml（５ミリモ
ル）を撹拌下で添加した。形成したEt3N.HBr
を過することによつて除去し、冷たいDMF
の少量で洗浄した。この液に−10℃でCbo−
Ｄ−Val.OpNP2.05ｇ（5.5ミリモル）を撹拌下
で添加した。この反応混合物を湿分の不在下で
２〜３時間反応させ、この場合この反応溶液の
温度は約20℃に到達した。この溶液を再び−10
℃に冷却し、Et3N0.35ml（2.5ミリモル）で緩
衝し、−10℃で約２時間反応させ、室温でさら
に３時間反応させた。この方法をEt3N0.35ml
を用いて繰り返し、16時間後この反応溶液を真
空中で50℃で濃縮乾燥した。この残滓を50％
AcOH50mlに溶解し、50％AcOHで平衡させた
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラ
ムでゲル過することによつて精製した。ｐ−
ニトロアニリンの遊離下でトリプシンで処理す
ることによつて分解されたAcOH溶出液の主画
分を真空中で40℃で濃縮乾燥した。この残滓を
MeOH100mlに溶解し、この溶液を再び濃縮し
て乾燥した。得られた残滓を真空デシケーター
中で60℃でP2O5上で乾燥し、TLCによつて示
されるようにSSC中で均一な無定形化合物
1e3.15ｇ（理論値の82.7％）を得た。元素分析
及び実験式C34H49N8O7Brからの計算により次
の値が得られた：Ｃ＝52.88％（53.61％）、Ｈ
＝6.54％（6.48％）、Ｎ＝15.08％（14.71％）及
びBr＝10.25％（10.49％）。 1f 2HBr.H−Ｄ−Val−CHA−Arg−pNA 化合物1e2.29ｇ（３ミリモル）を撹拌下で氷
酢酸中の2NHBr12mlで20℃で湿分の不在下に
40分間処理した。トリペプチド誘導体は、脱カ
ルボキシル化下及びCO2の発生下で次第に溶解
した。この反応溶液を強力撹拌下で無水エーテ
ル120mlに滴加した。この溶液は、2HBr.H−
Ｄ−Val−CHA−Arg−pNAの沈殿物を生じ
た。エーテル相を過棒を通して吸引過し、
次に固体相を無水エーテル50mlの量で４回洗浄
した。得られた残滓をMeOH40mlに溶解した。
PHをEt3Nを用いて4.5に調節し、この溶液を真
空中で30℃で濃縮乾燥した。この残滓を
MeOH30mlに溶解し、MeOHで平衡させた
“セフアデツクス（Sephadex）LH−20”のカ
ラムで精製した。ｐ−ニトロアニリンの遊離下
でトリプシンで処理することによつて分解され
たMeOH溶出液の画分を真空中で30℃で濃縮
乾燥した。後精製するために、予備精製された
残滓を33％AcOH30mlに溶解し、33％AcOHで
平衡させた“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ
−15”のカラムでゲル過することによつて精
製した。ｐ−ニトロアニリンの遊離下でトリプ
シンで処理することによつて分解されたAcOH
溶出液の主画分を真空中40℃で濃縮乾燥した。
得られた残滓を真空デシケーター中で40℃で
P2O5上で乾燥し、TLCによつて示されるよう
にSSC中で均一な無定形化合物1f1.84ｇ（理論
値の86.4％）を得た。元素分析及び実験式
C26H44N8O5Br2からの計算により次の値が得
られた：Ｃ＝43.60％（44.08％）、Ｈ＝6.41％
（6.26％）、Ｎ＝16.15％（15.82％）及びBr＝
22.21％（22.56％）。 アミノ酸分析により次の正確な比率で所望のア
ミノ酸の存在が確認された： Arg：1.00−CHA：0.96−Ｄ−CHG：0.98。Rf
値0.46。 例 ２ 2HBr.H−Ｄ−Val−CHA−Arg−MCA 2b 2HBr.H−Arg−MCA 市販のCbo−Arg−MCA.HCl13.0ｇ（25.9ミ
リモル）を氷酢酸中の2NHBrの溶液104ml
（208ミリモル）を用いて例1bにより解封鎖し
た。この乾燥残滓をMeOH400mlに溶解し、こ
の溶液を“セフアデツクス（Sephadex）LH
−20”のカラムで精製した。４−メチル−７−
アミノ−クマリンの遊離下でトリプシンで処理
することによつて分解されたMeOH溶出液の
画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。得られた
残滓を真空デシケーター中で40℃でP2O5上で
乾燥し、TLCによつて示されるようにSSC中
で均一な無定形化合物3b11.2ｇ（理論値の87.7
％）を得た。元素分析及び実験式
C16H23N5O3Br2からの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝39.40％（38.96％）、Ｈ＝4.61％
（4.70％）、Ｎ＝14.48％（14.20％）及びBr＝
31.90％（32.40％）。 2c Cbo−CHA−Arg−MCA.HBr 化合物2b4.93ｇ（10ミリモル）及びCbo−
CHA−OpNP4.69ｇ（11ミリモル）を新しく
蒸留したDMF75mlに添加した。−10℃への冷却
後、撹拌下でEt3Nをまず1.40ml（10ミリモ
ル）、次に0.70ml（５ミリモル）添加した。こ
の混合物を、湿分の不在下で、まず−10℃で３
時間反応させ、次に室温で４時間反応させた。
この反応溶液を再び−10℃に冷却し、
Et3N0.70mlで緩衝し、かつ20℃で１晩撹拌し
た。この反応混合物を真空中で50℃で濃縮乾燥
し、この残滓を50％AcOH200mlに溶解し、こ
の溶液を“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−
５”のカラムで精製した。４−メチル−７−ア
ミノ−クマリンの遊離下でトリプシンで処理す
ることによつて分解されたAcOH溶出液の画分
を真空中で40℃で濃縮乾燥した。こうして得ら
れた残滓を真空デシケーター中で60℃でP2O5
上で乾燥し、TLCによつて示されるように
SSC中で均一な結晶性化合物2c5.95ｇ（理論値
の85.0％）を得た。元素分析及び実験式
C33H43N6O6Brからの計算により、次の値が得
られた：Ｃ＝56.33％（56.65％）、＝6.28％
（6.19％）、Ｎ＝12.25％（12.01％）及びBr＝
11.30％（11.42％）。 2d 2HBr.H−CHA−Arg−MCA 化合物2c5.60ｇ（８ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr32mlを用いて例1dにより解封鎖した。
得られた粗製生成物をMeOH100mlに溶解し、
この溶液を“セフアデツクス（Sephadex）
LH−20”のカラムで精製した。４−メチル−
７−アミノ−クマリンの遊離下でトリプシンで
処理することによつて分解されたMeOH溶出
液の画分で真空中で30℃で濃縮乾燥した。得ら
れた残滓を真空デシケーター中で40℃でP2O5
上で乾燥し、TLCによつて示されるように
SSC中で均一な無定形化合物2d4.76ｇ（理論値
の92.1％）を得た。元素分析及び実験式
C25H38N6O4Br2からの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝47.02％（46.45％）、Ｈ＝6.02％
（5.93％）、Ｎ＝13.21％（13.00％）及びBr＝
24.48％（24.72％）。 2e Cbo−Ｄ−Val−CHA−Arg−MCA.HBr 化合物2d3.23ｇ（５ミリモル）を例1eにより
Cbo−Ｄ−Val−OpNP2.05ｇ（5.5ミリモル）
と反応させた。得られた粗製生成物を50％
AcOH75mlに溶解し、この溶液を“セフアデツ
クス（Sephadex）Ｇ−15”のカラムで精製し
た。４−メチル−７−アミノ−クマリンの遊離
下でトリプシンで処理することによつて分解さ
れたAcOH溶出液の画分を真空中で40℃で濃縮
乾燥した。この残滓を真空デシケーター中で60
℃でP2O5上で乾燥し、TLCによつて示される
ようにSSC中で均一な無定形化合物2e3.21ｇ
（理論値の80.4％）を得た。元素分析及び実験
式C38H52N7O7Brからの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝57.05％（57.14％）、Ｈ＝6.61％
（6.56％）、Ｎ＝12.49％（12.28％）及びBr＝
9.82％（10.00％）。 2f 2HBr.H−Ｄ−Val−CHA−Arg−MCA 化合物2d2.40ｇ（３ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr12mlを用いて例1fにより解封鎖した。
得られた粗製生成物をMeOH50mlに溶解し、
この溶液を““セフアデツクス（Sephadex）
LH−20”のカラムで精製した。４−メチル−
７−アミノ−クマリンの遊離下でトリプシンで
処理することによつて分解されたMeOH溶出
液の画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。更
に、精製するために、予備精製された生成物を
50％AcOH40mlに溶解し、この溶液を“セフア
デツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラムでゲ
ル過することによつて精製した。４−メチル
−７−アミノ−クマリンの遊離下でトリプシン
で処理することによつて分解されたAcOH溶出
液の主画分を真空中で40℃で濃縮乾燥した。こ
の残滓を真空デシケーター中で40℃でP2O5で
乾燥し、TLCによつて示されるようにSSC中
で均一な無定形化合物2f1.73ｇ（理論値の77.3
％）を得た。元素分析及び実験式
C30H47N7O5Br2からの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝48.12％（48.33％）、Ｈ＝6.43％
（6.35％）、Ｎ＝13.38％（13.15％）及びBr＝
21.18％（21.44％）。 アミノ酸分析により正確な比率で所望のアミノ
酸の存在が確認された： Val：1.00−Arg：1.02−Ｄ−CHA：0.97。 Rf値：0.42。 例 ３ 2HBr.H−Ｄ−Val−CHA−Arg−DPA 3a Cbo−Arg−DPA.HCl 無水Cbo−Arg−OH.HCl34.48ｇ（0.1モル）
を1000mlの三首フラスコ中で新しく蒸留した無
水DMF150mlと無水300mlとの混合物に20℃で
溶解した。−10℃に冷却した該溶液に撹拌下で
Et3N10.2ｇ（0.1モル）を湿分の不在下で添加
した。更に、THF50ml中のクロル蟻酸イソブ
チル16.65ｇ（0.1モル）の溶液を20分間で滴加
し、その後に反応温度は−５℃を決して越えな
いようにした。−10℃〜−５℃の温度で10分間
の付加的な反応時間後、DMF75ml中のジメチ
ル５−アミノ−イソフタレート20.92ｇ（0.1モ
ル）の溶液を30分間で滴加し、その後に反応温
度はいつも−５℃以下に保持した。この反応混
合物を−５℃でさらに１時間反応させた。この
反外混合物を、Et3N.HClを晶出させるために、
20℃で１晩撹拌し、次に−15℃に冷却した。形
成したEt3N、HClを別し、冷たいDMFの小
量で洗浄した。この液と洗浄液を一緒に真空
中で50℃で濃縮乾燥した。この残滓を50％
AcOH1000mlに溶解し、この溶液を50％AcOH
で平衡させた“セフアデツクス（Sephadex）
Ｇ−15”のカラムでゲル過することによつて
精製した。ジメチル５−アミノ−イソフタレー
トの遊離下でトリプシンで処理することによつ
て分解されたAcOH溶出液の主画分を真空中で
40℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケー
ター中で50℃でP2O5上で乾操し、TLCによつ
て示されるようにSSC中で均一な無定形化合物
3a24.6ｇ（理論値の4.59）を得た。元素分析及
び実験式C24H30N5O7Clからの計算により、次
の値が得られた：Ｃ＝53.21％（53.78％）、Ｈ
＝5.71％（5.64％）、Ｎ＝13.20％（13.07％）及
びCl＝6.52％（6.62％）。 3b 2HNr.H−Arg−DPA 化合物3a21.44ｇ（40ミリモル）を例1bによ
り解封鎖した。普通の処理後、得られた粗生成
物をMeOH250mlに溶解し、この溶液を“セフ
アデツクス（Sephadex）LH−20”のカラム
でゲル過することによつて精製した。ジメチ
ル５−アミノ−イソフタレートの遊離下でトリ
プシンで処理することによつて分解された
MeOHの画分を真空中で濃縮乾燥した。この
残滓を真空デシケーター中で40℃でP2O5上で
乾燥し、TLCによつて示されるようにSSC中
で均一な無定形化合物3b19.63％（理論値の
93.1％）を得た。元素分析及び実験式
C16H25N5O5Br2からの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝36.82％（36.45％）、Ｈ＝4.67％
（4.78％）、Ｎ＝13.45％（13.28％）及びBr＝
29.85％（30.31％）。 3c Cbo−CHA−Arg−DPA.HBr 化合物3b5.27ｇ（10ミリモル）を例1cにより
Cbo−CHA−OpNP4.69ｇ（11ミリモル）と反
応させた。普通の処理後に得られた粗製生成物
を50％AcOH200mlに溶解し、この溶液を“セ
フアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラム
で精製した。ジメチル５−アミノ−イソフタレ
ートの遊離下でトリプシンで処理することによ
つて分解されたAcOH溶出液の画分を真空中で
40℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケー
ター中で60℃でP2O5上で乾燥し、TLCによつ
て示されるようにSSC中で均一な無定形化合物
3c6.06ｇ（理論値の82.6％）を得た。元素分析
及び実験式C33H45N6O8Brからの計算により、
次の値が得られた：Ｃ＝53.74％（54.02％）、
Ｈ＝6.28％（6.18％）、Ｎ＝11.90％（11.46％）
及びBr＝10.68％（10.89％）。 3d 2HBr.H−CHA−Arg−DPA 化合物3c5.87ｇ（８ミリモル）を氷酢酸中で
2NHBr32mlを用いて例1dにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH100mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH−20”のカラムで精
製した。ジメチル５−アミノ−イソフタレート
の遊離下でトリプシンで処理することによつて
分解されたMeOH溶出液の画分を真空中で30
℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケータ
ー中で40℃でP2O5上で乾燥し、TLCによつて
示されるようにSSC中で均一な無定形化合物
534.79ｇ（理論値の88.0％）を得た。元素分析
及び実験式C25H40N6O6Brからの計算により次
の値が得られた：Ｃ＝43.75％（44.13％）、
H5.88％（5.93％）、Ｎ＝12.69％（12.35％）及
びBr＝23.22％（23.49％）。 3e Cbo−Ｄ−Val−CHA−Arg−DPA.HBr 化合物3d3.40ｇ（５ミリモル）を例1eにより
Cbo−Ｄ−Val−OpNP2.05ｇ（5.5ミリモル）
と反応させた。普通の処理後に得られた粗製生
成物を50％AcOH100mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラ
ムで精製した。ジメチル５−アミノ−イソフタ
レートの遊離下でトリプシンで処理することに
よつて分解されたAcOH溶出液の画分を真空中
で40℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケ
ーター中で60℃でP2O5上で乾燥し、TLCによ
つて示されるようにSSC中で均一な無定形化合
物3e3.25ｇ（理論値の78.1％）を得た。元素分
析及び実験式C38H54N7O9Brからの計算によ
り、次の値が得られた：Ｃ＝53.95％（54.80
％）、Ｈ＝6.65％（6.54％）、Ｎ＝12.07％
（11.77％）及びBr＝9.38％（9.59％）。 3f 2HBr.H−Ｄ−Val−CHA−Arg−DPA 化合物3e2.50ｇ（３ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr12mlを用いて例1fにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH50mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH−20”のカラムで予
備精製した。ジメチル５−アミノ−イソフタレ
ートの遊離下でトリプシンで処理することによ
つて分解されたMeOH溶出液の画分を真空中
で30℃で濃縮乾燥した。この予備精製された生
成物を50％AcOH50mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラ
ムでゲル過することによつて精製した。ジメ
チル５−アミノ−イソフタレートの遊離下でト
リプシンで処理することによつて分解された
AcOH溶出液の主画分を真空中で40℃で濃縮乾
燥した。この残滓を真空デシケーター中で40℃
でP2O5上で乾燥し、TLCによつて示されるよ
うにSSC中で均一な無定形化合物3f1.93ｇ（理
論値の82.6％）を得た。元素分析及び実験式
C30H49N7O7Br2からの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝46.84％（46.22％）、Ｈ＝6.42％
（6.34％）、Ｎ＝12.16％（12.58％）及びBr＝
20.22％（20.50％）。 アミノ酸分析により正確な比率で所望のアミノ
酸の存在が確認された： Ｄ−Val：1.00−Arg：0.98−CHA：1.02。 Rf値：0.44。 例 ４ 2HBr.H−Ｄ−Val−CHA−Arg−２−NA 4b 2HBr.H−Arg−２−NA 市販のCbo−Arg−２−NA.HCl9.40ｇ（20
ミリモル）を例1bにより氷酢酸中の2NHBr80
mlの溶液と反応させた。普通の処理後に得られ
た生成物をMeOH150mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）LH−20”のカ
ラムで精製した。２−ナフチルアミンの遊離下
でトリプシンで処理することによつて分解され
たMeOH溶出液の画分を真空中で30℃で濃縮
乾燥した。この残滓を真空デシケーター中で40
℃でP2O5上で乾燥し、TLCによつて示される
ようにSSC中で均一な無定形化合物4b8.60ｇ
（理論値の93.2％）を得た。元素分析及び実験
式C16H23N5OBr2からの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝42.08％（41.67％）、Ｈ＝5.12％
（5.03％）、Ｎ＝14.68％（15.19％）及びBr＝
33.96％（34.65％）。 4c Cbo−CHA−Arg−２−NA.HBr 化合物4b4.6ｇ（10ミリモル）を例1cにより
Cbo−CHA−OpNP4.69ｇ（11ミリモル）と反
応させた。普通の処理後に得られた粗製生成物
を50％AcOH150mlに溶解し、この溶液を“セ
フアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラム
で精製した。２−ナフチルアミンの遊離下でト
リプシンで処理することによつて分解された
AcOH溶出液の画分を真空中で40℃で濃縮乾燥
した。この残滓を真空デシケーター中で60℃で
P2O5上で乾燥し、TLCによつて示されるよう
にSSC中で均一な無定形化合物4c5.31ｇ（理論
値の79.5％）を得た。元素分析及び実験式
C33H43N6O4Brからの計算により、次の値が得
られた：Ｃ＝59.18％（59.37％）、Ｈ＝6.58％
（6.49％）、Ｎ＝12.87％（12.59％）及びBr＝
11.55％（11.97％）。 4d 2HBr.H−CHA−Arg−２−NA 化合物4c4.67ｇ（７ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr28mlを用いて例1dにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH100mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH−20”のカラムで精
製した。２−ナフチルアミンの遊離下でトリプ
シンで処理することによつて分解された
MeOH溶出液の画分を真空中で30℃で濃縮乾
燥した。この残滓を真空デシケーター中で40℃
でP2O5上で乾燥し、TLCによつて示されるよ
うにSSC中で均一な無定形化合物4d3.95ｇ（理
論値の91.8％）を得た。元素分析及び実験式
C25H38N6O2Br2からの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝49.22％（48.87％）、Ｈ＝6.30％
（6.23％）、Ｎ＝13.61％（13.68％）及びBr＝
25.84％（26.01％）。 4e Cbo−Ｄ−Val−CHA−Arg−２−NA.HBr 化合物4d3.07ｇ（５ミリモル）を例1eにより
Cbo−Ｄ−Val−OpNP2.05ｇ（5.5ミリモル）
と反応させた。普通の処理後に得られた粗製生
成物を50％AcOH100mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラ
ムで精製した。２−ナフチルアミンの遊離下で
トリプシンで処理することによつて分解された
AcOH溶出液の第１の主画分を真空中で40℃で
濃縮乾燥し、真空デシケーター60℃でP2O5上
で乾燥した。こうして、TLCによつて示され
るようにSSC中で均一な無定形化合物4e3.14ｇ
（理論値の81.9％）が得られた。元素分析及び
実験式C38H52N7O5Brからの計算により、次の
値が得られた：Ｃ＝58.92％（59.52％）、Ｈ＝
6.93％（6.84％）、Ｎ＝13.02％（12.79％）及び
Br＝10.18％（10.42％）。 4f 2HBr.H−Ｄ−Val−CHA.Arg−２−NA 化合物4e1.53ｇ（２ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr8mlを用いて例1fにより解封鎖した。普
通の処理後に得られた粗製生成物をMeOH40
mlに溶解し、この溶液を“セフアデツクス
（Sephadex）LH−20”のカラムで精製した。
２−ナフチルアミンの形成下でトリプシンで処
理することによつて分解されたMeOH溶出液
の主画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。この
生成物を50％AcOH50mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラ
ムで精製した。２−ナフチルアミンの形成下で
トリプシンで処理することによつて分解された
AcOH溶出液の主画分を真空中で40℃で濃縮乾
燥した。この残滓を真空デシケーター中で40℃
でP2O5上で乾燥し、TLCによつて示されるよ
うにSSC中で均一な無定形化合物4f1.05ｇ（理
論値の73.6％）を得た。元素分析及び実験式
C30H47N7O3Br2からの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝50.16％（50.50％）、Ｈ＝6.71％
（6.64％）、Ｎ＝14.00％（13.74％）及びBr＝
22.05％（22.40％）。 アミノ酸分析により正確な比率で所望のアミノ
酸の存在が確認された： Ｄ−Val：1.00−Arg：0.98−CHA：0.97。 Rf値：0.42。 例 ５ 2HBr.H−Ｄ−Val−CHA−Arg−４−MeO−
２−NA 5b 2HBr.H−Arg−４−MeO−２−NA 市販のCbo−Arg−４−MeO−２−NA.
HCl10.0ｇ（20ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr80mlを用いて例1bにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗生成物をMeOH150
mlに溶解し、この溶液を“セフアデツクス
（Sephadex）LH−20”のカラムで精製した。
４−メトキシ−２−ナフチルアミンの遊離下で
トリプシンで処理することによつて分解された
MeOH溶出液の主画分を真空中で30℃で濃縮
乾燥した。この残滓を真空デシケーター中で40
℃でP2O5上で乾燥した後、TLCによつて示さ
れるようにSSC中で均一な無定形化合物5b8.98
ｇ（理論値の91.4％）が得られた。元素分析及
び実験式C17H25N5O2Br2からの計算により、
次の値が得られた：Ｃ＝41.22％（41.57％）、
Ｈ＝5.19％（5.13％）、Ｎ＝14.40％（14.26％）
及びBr＝32.01％（32.53％）。 5c Cbo−CHA−Arg−４−MeO−２−Na.
HBr 化合物5b4.91ｇ（10ミリモル）を例1cにより
Cbo−CHA−OpNP4.69ｇ（11ミリモル）と反
応させた。普通の処理後に得られた粗製生成物
を50％AcOH150mlに溶解して、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラ
ムで精製した。４−メキシ−２−ナフチルアミ
ンの遊離下でトリプシンで処理することによつ
て分解されたAcOH溶出液の第１の主画分を真
空中で40℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デ
シケーター中で60℃でP2O5上で乾燥した後、
TLCによつて示されるようにSSC中で均一な
無定形化合物5c5.36ｇ（理論値の76.8％）が得
られた。元素分析及び実験式C34H45N6O5Brか
らの計算により、次の値が得られた：Ｃ＝
58.85％（58.53％）、Ｈ＝6.59％（6.50％）、Ｎ
＝11.91％（12.05％）及びBr＝11.32％（11.45
％）。 5d 2HBr.H−CHA−Arg−４−MeO−２−NA 化合物5c4.88ｇ（７ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr28mlを用いて例1dにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH100mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH−20”のカラムで精
製した。４−メトキシ−２−ナフチルアミンの
形成下でトリプシンで処理することによつて分
解されたMeOH溶出液の主画分を真空中で30
℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケータ
ー中で40℃でP2O5上で乾燥した後、TLCによ
つて示されるようにSSC中で均一な無定形化合
物5d4.12ｇ（理論値の91.3％）が得られた。元
素分析及び実験式C26H40N6O3Br2からの計算
により、次の値が得られた：Ｃ＝48.92％
（48.46％）、Ｈ＝6.36％（6.26％）、Ｎ＝12.84％
（13.04％）及びBr＝24.33％（24.80％）。 5e Cbo−Ｄ−Val−CHA−Arg−４−MeO−２
−NA.HBr 化合物5d3.22ｇ（５ミリモル）を例1eにより
Cbo−Ｄ−Val−OpNP2.05ｇ（5.5ミリモル）
と反応させる。普通の処理後に得られた粗製生
成物を50％AcOH125mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラ
ムで精製した。４−メトキシ−２−ナフチルア
ミンの遊離下でトリプシンで処理することによ
つて分解されたAcOH溶出液の第１の主画分を
真空中で40℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空
デシケーター中で60℃でP2O5上で乾燥した後、
TLCによつて示れるようにSSC中で均一な無
定形化合物5e3.15ｇ（理論値の79.1％）が得ら
れた。元素分析及び実験式C39H54N7O6Brから
の計算により、次の値が得られた：Ｃ＝58.35
％（58.79％）、Ｈ＝6.78％（6.83％）、Ｎ＝
12.68％（12.31％）及びBr＝9.82％（10.03％）。 5f 2HBr.H−Ｄ−Val−CHA−Arg−４−MeO
−２−NA 化合物5e1.59ｇ（２ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr8mlを用いて例1fにより解封鎖した。普
通の処理後に得られた粗製生成物をMeOH40
mlに溶解し、この溶液を“セフアデツクス
（Sephadex）LH−20”のカラムで予備精製し
た。４−メトキシ−２−ナフチルアミンの形成
下でトリプシンで処理することによつて分解さ
れたMeOH溶出液の主画分を真空中で30℃で
濃縮した。この予備精製された生成物を50％
AcOH60mlに溶解し、この溶液を“セフアデツ
クス（Sephadex）Ｇ−15”のカムムで精製し
た。４−メトキシ−２−ナフチルアミンの形成
下でトリプシンで処理することによつて分解さ
れたAcOH溶出液の主画分を真空中で40℃で濃
縮乾燥した。この残滓を真空デシケーター中で
40℃でP2O5上で乾燥した後、TLCによつて示
されるようにSSC中で均一な無定形化合物
5f1.09ｇ（理論値の73.3％）が得られた。元素
分析及び実験式C31H49N7O4Br2からの計算に
より、次の値が得られた：Ｃ＝49.63％（50.07
％）、Ｈ＝6.70％（6.64％）、Ｎ＝13.42％
（13.19％）及びBr＝21.22％（21.49％）。 アミノ酸分析により正確な比率で所望のアミノ
酸の存在が確認された： Ｄ−Val：1.00−Arg：1.01−Ｄ−CHA：0.98。 Rf値：0.47。 一連の他のトリペプチド誘導体を前記実施例に
記載の方法により製造した。これらのトリペプチ
ド誘導体は、次の第１表に纏められている。 第１表に示したトリペプチド誘導体の製造に使
用されたトリペプチド中間体は、第２表に記載さ
れている。
C.3.4.21.の酵素、例えば器官又は腺カリクレイ
ン、トロンビン及びプラズミンを定量分析する方
法に関する。 所謂器官カリクレイン又は腺カリクレインは、
種々の器官及び腺、例えば分泌腺、唾液腺、腎
臓、消化管粘膜等によつて得られ、前酵素の形又
は活性形で分泌される。これらの器官又は腺カリ
クレインは、化学的及び生理学的に血漿カリクレ
インとは異なるものである。一定の病理学的条件
下で器官カリクレイン分泌物濃度は、正常値より
も低下するか又は正常値よりも上昇する。すなわ
ち、例えば尿のカリクレイン分泌は、腎臓疾病の
患者の正常値よりも実質的に減少する。腎臓硬化
症の患者においてカリクレイン分泌は、殆んど完
全に抑圧されている。特発性高血圧症の患者にお
いて、24時間−尿のカリクレイン分泌は、正常値
の50％平均として有効に減少されている（例え
ば、H.S.Margolius著）“Chemistry and
Biology of the Kallikrein−Kinin System in
Health and Disease”、1974年、第399〜409頁、
参照）。それ故、簡単な処理方法で器官カリクレ
インを迅速に定量分析することは重要である。例
えば、一定のアルギニンエステル、例えばトジル
−アルギニンメチルエステル（TAME）をエス
テル分解することによつて尿カリクレインを分析
することは、公知である。改善されたエステル分
解法では、三重水素で標識されたトジル−アルギ
ニンメチルエステルを使用し、エステル分解によ
つて放出されるメタノールの放射能を測定する。
しかし、これらのエステル分解法は、該方法がカ
リクレインがルエステル分解によらずアミド分解
により天然のペプチド鎖を分解する蛋白分解酵素
である程度に非生理学的であるという欠点を有す
る。更に、エステル基質は、該基質が多数の他の
酵素によつて分解されている、すなわちカリクレ
インによつて不明確に分解されているという欠点
を有する。三重水素で標識されたTAMEを用い
る方法は、三重水素で標識されたメタノールの放
射能測定よりも前に、エステル分解混合物中にな
お存在する三重水素で標識された残留TAMEが
測定を邪魔するのでメタノールをエステル分解混
合物から水と不飽和性の液体で抽出しなければな
らない程度に複雑である。 審査されずに公告された西ドイツ国特許出願公
開第2527932号明細書には、式：R1−Pro−Ｘ−
Arg−NH−R2（但し、R1は保護基を表わし、−
NH−R2は発色団を表わし、Ｘはフエニルアラニ
ル基、β−シクヘキシルアラニル基、フエニルグ
リシル基又はチロシル基を表わす）で示される基
質が記載されている。該基質は、血漿カリクレイ
ンによつて極めて簡単に分解され、有色の分解生
成物R2−NH2を生じ、この場合この分解生成物
の量は、測光法、分光測光法又は蛍光測光法によ
つて測定することができる。また、器官又は腺カ
リクレインクを分析するために該基質を使用する
ことも試みられた。しかし、意外なことに、該基
質は、器官又は腺カリクレインに対して敏感でな
い、すなわち器官又は腺カリクレインによつて分
解されないか又は少量が分解されるにすぎないこ
とが判明した。 審査されずに公告された西ドイツ国特許出願公
開第2629067号明細書には、特定の蛋白分解酵素、
例えば腺又は器官カリクレイン及びプラズミンを
分析するための基質として有用なトリペプチド誘
導体が記載されている。すなわち、Ｈ−Ｄ−バリ
ル−ロイシル−アルギニル−ｐ−ニトロアニリド
ジヒドロクロリド及びＨ−Ｄ−バリル−ロイシル
−リジル−ｐ−ニトロアニリドジヒドロクロリド
が２つの例として挙げられている。第１のトリペ
プチド誘導体は、腺カリクレインのための基質で
あり、第２のトリペプチド誘導体は、プラズミン
のための基質である。これら２つの化合物は、該
酵素によつて分解され、ｐ−ニトロアニリンを生
じ、この場合このｐ−ニトロアニリンの量は、測
光法又は分光測光法により測定することができ
る。しかしながら、Ｈ−Ｄ−バリル−ロイシル−
アルギニル−ｐ−ニトロアニリドジヒドロクロリ
ドの感受率は、濃縮されてない尿中の尿カリクレ
インを正確に分析するのに必要な限界値に到達す
る。しかし、該アミド基質を濃縮された尿中で使
用する場合には、ｐ−ニトロアニリンの測光法に
よる測定は、尿の独自の色によつて強固に阻止さ
れる。 前記の西ドイツ国特許明細書に記載された２つ
のトリペプチド誘導体のトリペプチド鎖中の第１
の２つのアミノ酸は、α−又はβ位に阻水性イソ
プロピル基を有する。この阻水性を増大させ、そ
の後に腺カリクレインに対する感受性を増大させ
るために、ジペプチド鎖の基本構造を維持しなが
ら、イソプロピル基を芳香族基、例えばフエニル
基に代えることが試みられた。しかし、この試み
は失敗した。芳香族基を装入することによつて得
られるトリペプチド基質は、腺カリクレインによ
つて全く分解されないか又は多くの場合極めて少
量が分解されるにすぎない。しかし、芳香族基を
有するこれらのトリペプチド基質は、プラズミン
に対して驚異的に高い感受性を有する。更に、意
外なことに、該トリペプチドプラズミン基質にお
ける芳香族基の水素添加は、器官又は腺カリクレ
インに対して驚異的に高い感受性を有する新規部
類のトリペプチド基質を生じることが見い出され
た。トリペプチド鎖を増加させるには、蛋白分解
酵素によつて分解される基質を得るために天然に
生じるアミノ酸だけを使用することができること
が判明していた。それ故、シクロヘキシル基を含
有しかつ天然に生じないアミノ酸を使用すること
により、器官又は腺カリクレイン及びその他の蛋
白分解酵素、例えば血漿カリクレインによつて簡
単に分解される発色団基質を得ることができるこ
とが見い出されたことは意外なことであつた。 本発明方法によれば、特定の蛋白分解酵素、特
に酵素部類E.C.3.4.21.の酵素、例えば器官又は腺
カリクレイン、プラズミン及びトロンビンに対し
て高い感受性を有し、したがつて該酵素を定量分
析するための基質として有用な新規の発色団基質
に関連する。該基質は、一般式： Ｈ−Ｄ−Ｘ−Ｙ−Arg−Ｒ 〔式中、 Ｘはアラニル基、α−ブチリルアミノ基、バリ
ル基、ノルバリル基、ロイシル基、ノルロイシル
基又はイソロイシル基を表わし、 Ｙはシクロヘキシルアラニル基又はシクロヘキ
シルチロシル基を表わし、 Ｒはｐ−ニトロフエニルアミノ基、２−ナフチ
ルアミノ基、４−メトキシ−２−ナフチルアミノ
基、４−メチル−クマリル−７−アミノ又は１，
３−ジ（メトキシカルボニル）−フエニル−５−
アミノ基を表わす〕で示されるトリペプチド誘導
体である。 式のトリペプチド誘導体は、水性媒体に対し
て難溶性であり、したがつてその酸との塩の形
で、殊に鉱酸、例えばHCl、HBr、H2SO4、
H3PO4等、又は有機酸、例えば蟻酸、酢酸、プ
ロピオン酸、トリメチル酢酸、メトキシ酢酸、ト
リクロル−又はトリフルオル酢酸のようなハロゲ
ン化酢酸、アミノ酢酸、乳酸、蓚酸、マロン酸、
クエン酸、安息香酸、核中で置換された芳香族
酸、例えばトリイル酸、クロル−又はブロム安息
香酸、メトキシ安息香酸及びアミノ安息香酸、フ
タル酸等との塩の形で有利に使用される。該酸の
性質は、該酸が基質と酵素との間の反応に関与し
ないので重要ではない。 式の基質及びその酸との塩は、特定の蛋白分
解酵素、特に酵素部類E.C.3.4.21.の酵素
（“Enzyme Nomenlature”、Elsevier Scientific
publishing Company（Amsterdam）社刊、1973
年、第238頁以降、参照）、例えば器官カリクレイ
ン及び腺カリクレイン、プラズミン及びトロンビ
ンの作用によつて加水分解により分解され、その
結果式：Ｒ−NH2の有色性又は蛍光性分解生成
物が形成され、この場合この分解生成物の量は、
測光法、分光測光法、蛍光分光測光法又は電気化
学的方法によつて測定することができる。従つ
て、この新規の基質は、蛋白分解酵素、殊にアル
ギニンないしはリジンのカルボキシル側鎖上の天
然のペプチド鎖を分解する酵素部類E.C.3.4.21.の
酵素、例えば器官又は腺カリクレイン、プラズミ
ン、血漿カリクレイン、トロンビンないしはそれ
らの抑制因子及び前酵素、ならびに該酵素の形成
又は抑制に関与するその他の因子を定量分析する
のに有用である。 トリペプチド誘導体の優れた群は、 Ｙがシクロヘキシルアラニル基又はシクロヘキ
シルチロシル基を表わし、 Ｘがアラニル基、α−アミノブチリル基、バリ
ル基、ノルバリル基、ロイシル基、ノルロイシル
基又はイソロイシル基を表わす式の化合物から
なる。 次の実施例３、５、７、９、12、13、36、37、
38、40及び41に記載のトリペプチド誘導体は、殊
に尿カリクレインを分析するための基質として有
用である。 ヒトの中のカリクレインを分析するには、次の
実施例３、５、７、９、12、13、36、37、38、40
及び41に記載のトリペプチド誘導体を使用するこ
とができる。 次の実施例36、37及び41に記載のトリペプチド
誘導体は、プラズミンを分析するのに使用するこ
とができる１群の基質を構成する。 本発明は、蛋白分解酵素、殊にアルギニンない
しはリジンのカルボキシル側鎖上の天然のペプチ
ド鎖を分解する酵素部類E.C.3.4.21.の酵素、例え
ば器官又は腺カリクレイン、プラズミン及びトロ
ンビンを定量分析する方法に関する。本発明によ
る方法は、前記要素を含有するか又は該酵素を形
成又は消費する物質を、式のトリペプチド誘導
体と反応させ、このトリペプチド誘導体における
酵素の加水分解作用によつて形成される有色又は
蛍光性分解生成物Ｒ−NH2の量を、測光法、分
光測光法、蛍光分光測光法又は電気化学的方法に
よつて測定することを特徴とする。本発明方法
は、例えば酵素標本の酵素含量又はヒトの体液及
び哺乳動物の体液、例えば尿、膵液、腸粘液、乳
腺分泌物、汗腺分泌物、喀痰及び血液中の酵素濃
度を分析することができる。本発明方法は、殊に
前記体液中の器官又は腺カリクレイン及び血漿カ
リクレインを定量分析するのに有用である。この
方法によれば、遊離器官カリクレイン及び粘膜カ
リクレインないしプレカリクレインから形成され
たカリクレイン、さらにカリクレインの生理学的
又は非生理学的抑制因子及びプレカリクレインの
生理学的又は非生理学的賦活体を分析することが
できる。 式のトリペプチド誘導体は、以下に記載した
方法により製造することができる： (1) 発色団Ｒを、Ｃ−末端アルギニンのカルボキ
シル基に結合させ、その際にα−アミノ基を保
護基、例えばカルボベンゾキシ基又はｔ−ブト
キシカルボニル基によつて保護し、δ−グアニ
ジル基を、例えばHClを用いるプロトン化、ニ
トロ化又はトジル化によつて保護する。また、
Ｃ−末端Ｒ−NH基は、トリペプチド鎖を段階
的に合成する間保護基として役立つ。その他の
保護基は、必要な場合には所望のペプチド鎖が
完全に合成されるまで他のアミノ酸誘導体を結
合させるために選択的に除去することができ
る。最後に、残留する保護基を、Ｒ−NH−基
を作用させることなしに完全に分解する（例え
ば、Miklos Bodansky他、“Peptide
Synthesis”、Interscience Publishers社刊、
1966年、第163〜165頁）。 (2) 第１にトリペプチド鎖を（Bodansky他によ
る方法、上記引用文中、により）合成するが、
その際にアルギニンのＣ−末端カルボキシル基
を常用のエステル基、例えばメトキシ基、エト
キシ基又はベンジルオキシ基（アルギニンの場
合）、又はｔ−ブトキシ基（リジンの場合）に
よつて保護する。該エステル基は、トリフルオ
ル酢酸により選択的に分解しなければならない
ｔ−ブトキシ基を除いて、アルカリ加水分解に
よつて除去することができる。アルギニンのδ
−グアニジル基をプロトン化する場合には、該
エステル基をトリプシンを用いて酵素により除
去し、この場合ラセミ化は起こらない。次に、
発色団Ｒ−NHを結合させる。アルギニンのδ
−グアニジノ基をニトロ基又はトシル基によつ
て保護し、トリペプチド誘導体のＮ−末端α−
アミノ基をカルボベンゾキシ基又はｐ−メチル
−、ｐ−メトキシ−又はｐ−クロルベンジルオ
キシカルボニル基又はｔ−ブトキシ基によつて
保護する場合には、全ての保護基を同時に除去
する。この除去は、保護されているトリペプチ
ド誘導体を無水HFで室温で処理することによ
つて実施することができ、したがつてこの場合
にはアミノ基δ−グアニジノ基の全ての前記保
護基が除去される。また、この除去は、保護さ
れているトリペプチド誘導体が保護ニトロ基又
はトシル基を含有しない場合、氷酢酸中の
2NHBrで室温で処理することによつて実施す
ることもできる。 本発明方法により用いられるトリペプチド誘導
体の製造は、次の実施例に詳記されている。 実施例によつて得られた溶出液及び生成物の分
析は、シリカゲルで被覆されたガラス板
（Merck社、F254）を用いて薄層クロマトグラフ
イーによつて行なわれた。薄層クロマトグラム
は、次の溶剤系によつて展開した： Ａ クロロホルム／メタノール（９：１） Ｂ ｎ−プロパノール／酢酸エチル／水（７：
１：２） Ｃ ｎ−ブタノール／酢酸／水（３：１：１） 次の略語を使用する： AcOH＝酢酸 Ala＝アラニン Arg＝アルギニン BOC＝ｔ−ブトキシカルボニル But＝α−アミノ酪酸 Cbo＝カルボベンゾキシ CHA＝シクロヘキシルアラニン CHG＝シクロヘキシルグリシン CHT＝シクロヘキシルチロシン＝ｐ−ヒドロキ
シシクロヘキシルアラニン DMF＝ジメチルホルムアミド DPA＝１，３−ジ（メトキシカルボニル）−フエ
ニル−(5)アミド TLC＝薄層クロマトグラフイー Et3N＝トリエチルアミン HMPTA＝燐酸Ｎ，Ｎ，N′，N′，N″，N″−ヘ
キサメチルトリアミド Ile＝イソロイシン Leu＝ロイシン SS＝溶剤系 Lys＝リジン MCA＝４−メチル−クマリル−(7)−アミド MeOH＝メタノール ４−MeO−２−NA＝４−メトキシ−２−ナフチ
ルアミド Nleu＝ノルロイシン Nval＝ノルバリン OpNP＝ｐ−ニトロフエノキシ Phe＝フエニルアラニン Ph′Gly＝フエニルグリシン Pip＝ピペコリン酸 pNA＝ｐ−ニトロアニリド Pro＝プロリン THF＝テトラヒドロフラン Tyr＝チロシン Val＝バリン 特に記載しない限り、ペプチド鎖中のアミノ酸
はＬ−形を有する。 例 １ Ｈ−Ｄ−Val−CHA−Arg−pNA.2HBr 1a Cbo−Arg−pNA.HCl 250mlの三首フラスコ中で（真空中でP2O5上
で乾燥した）Cbo−Arg−OH.HCl16.0ｇ（47.0
ミリモル）を20℃で無水HMPTA90mlに溶解
し、この場合フラスコ中の雰囲気は湿分を含ま
ないように保持した。得られた溶液に室温でま
ずHMPTA10ml中のEt3N4.74ｇ（47.0ミリモ
ル）の溶液を添加し、次に（100％過剰の）ｐ
−ニトロフエニルイソシアネート16.4ｇ（100
ミリモル）を滴加した。20℃での24時間の反応
時間後、HMPTAの大部分を真空中で蒸留す
ることによつて除去した。この残滓を30％
AcOHで数回抽出した。この残滓を廃棄した。
合した酢酸抽出液を30％AcOHで平衝させかつ
30％AcOHで溶離せしめる“セフアデツクス
（Sephadex）Ｇ−15”（登録商標）のカラムを
通すことによつてさらに精製した。ｐ−ニトロ
アニリンの遊離下にトリプシンで処理すること
によつて分解されたAcOH溶出液の画分を凍結
乾燥した。こうして、TLCによつて示される
ようにSSC中で均一な無定形粉末12.6ｇが得ら
れた。元素分析及び実験式C20H25N6O5Clから
の計算により次の値が得られた（実験式からの
値は括弧内のものである）：Ｃ＝51.29％
（51.67％）、Ｈ＝5.48％（5.42％）、Ｎ＝17.92％
（18.08％）、Cl＝7.50％（7.63％）。 1b 2HBr.H−Arg−pNA 化合物1a4.65ｇ（10ミリモル）を撹拌下で氷
酢酸中の2NHBr40mlで20℃で湿分の不在下に
45分間処理した。アミノ酸誘導体はCO2の発生
下に溶解した。この反応溶液を強力撹拌下で無
水エーテル250mlに滴加した。この溶液は、
2HBr.H−Arg−pNAの沈殿物を生じた。エー
テル相を吸引過し、その上固体相を副生成物
として形成された臭化ベンジルならびに過剰の
HBr及びAcOHを除去するために無水エーテ
ル100mlの量で４回洗浄した。この残滓をメタ
ノール50mlに溶解し、そのPHをEt3Nを添加す
ることによつて4.5に調節し、この溶液を真空
中で30℃で濃縮乾燥した。得られた生成物を
MeOH75mlに溶解し、MeOHで平衝させた
“セフアデツクス（Sephadex）LH−20”（架
橋デキストランゲル）のカラムを通した。この
溶出液の画分から、TLCによつて示されるよ
うにSSC中で均一な無定形化合物1b4.18ｇ（理
論値の91.6％）が得られた。元素分析及び実験
式C12H20N6O3Br2からの計算により次の値が
得られた：Ｃ＝31.15％（31.60％）、Ｈ＝4.35％
（4.42％）、Ｎ＝18.84％（18.43％）及びBr＝
34.81％（35.03％）。 1c Cbo−CHA−Arg−pNA.HBr 化合物1b4.56ｇ（10ミリモル）を新しく蒸留
したDMF30mlに溶解し、この溶液を−10℃に
冷却した。この溶液に撹拌下でEt3N1.40ml
（10ミリモル）を添加した。形成したEt3N.
HBrを過することによつて除去し、冷たい
DMFの少量で洗浄した。この液に−10℃で
Cbo−CHA−OpNP4.69ｇ（11ミリモル）を添
加し、反応を湿分の不在下に２〜３時間継続さ
せ、この場合反応溶液の温度は次第に約20℃に
到達した。この溶液を再び−10℃に冷却し、
Et3N0.70ml（５ミリモル）で緩衝し、−10℃で
約２時間反応させ、室温で約３時間反応させ
た。この方法をHt3N0.70mlを用いて繰り返し、
16時間この反応溶液を真空中で50℃で濃縮乾燥
した。この残滓を50％AcOH75mlに溶解し、50
％AcOHで平衡させた“セフアデツクス
（Sephadex）Ｇ−15”のカラムでゲル過する
ことによつて精製した。ｐ−ニトロアニリンの
遊離下でトリプシンで処理することによつて分
解されたAcOH溶出液の主画分を真空中で40℃
で濃縮乾燥した。この残滓をMeOH150mlに溶
解し、再び濃縮して乾燥した。得られた残滓を
真空デシケーター中で60℃でP2O5上で乾燥し、
TLCによつて示されるようにSSC中で均一な
無定形化合物1c5.85ｇ（理論値の88.3％）を得
た。元素分析及び実験式C29H40N7O6Brからの
計算により次の値が得られた：Ｃ＝52.28％
（52.57％）、Ｈ＝6.16％（6.09％）、Ｎ＝15.09％
（14.80％）及びBr＝11.85％（12.06％）。 1d 2HBr.H−CHA−Arg−pNA 化合物1c5.30ｇ（８ミリモル）を撹拌下で氷
酢酸中の2NHBr32mlで20℃で40分間処理した。
ペプチド誘導体は、CO2の発生下に次第に溶解
した。この反応溶液を強力撹拌下で無水エーテ
ル250mlに滴加した。この溶液は、2HBr.H−
CHA−Arg−pNAの沈殿物を生じた。エテー
ル相を吸引過し、その上固体相を副生成物と
して形成した臭化ベンジルならびに過剰の
HBr及びAcOHを除去するために無水エーテ
ル100mlの量で４回洗浄した。この残滓を
MeOH50mlに溶解した。PHをEt3Nを用いて4.5
に調節し、この溶液を真空中で30℃で濃縮乾燥
した。得られた残滓をMeOH50mlに溶解し、
MeOHで平衡させた“セフアデツクス
（Sephadex）LH−20”のカラムで精製した。
ｐ−ニトロアニリンの遊離下でトリプシンで処
理することによつて分解されたMeOH溶出液
の画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。得られ
た残滓を真空デシケーター中で40℃でP2O5上
で乾燥し、TLCによつて示されるようにSSC
中で均一な無定形化合物1d4.48ｇ（理論値の
91.9％）を得た。元素分析及び実験式
C21H35N7O4Brからの計算により次の値が得ら
れた：Ｃ＝41.80％（41.39％）、Ｈ＝5.86％
（5.79％）、Ｎ＝16.31％（16.09％）及びBr＝
25.85％（26.23％）。 1e Cbo−Ｄ−Val−CHA−Arg−pNA.HBr 化合物1d3.05ｇ（５ミリモル）を新しく蒸留
したDMF20mlに溶解し、この溶液を−10℃に
冷却した。この溶液にEt3N0.70ml（５ミリモ
ル）を撹拌下で添加した。形成したEt3N.HBr
を過することによつて除去し、冷たいDMF
の少量で洗浄した。この液に−10℃でCbo−
Ｄ−Val.OpNP2.05ｇ（5.5ミリモル）を撹拌下
で添加した。この反応混合物を湿分の不在下で
２〜３時間反応させ、この場合この反応溶液の
温度は約20℃に到達した。この溶液を再び−10
℃に冷却し、Et3N0.35ml（2.5ミリモル）で緩
衝し、−10℃で約２時間反応させ、室温でさら
に３時間反応させた。この方法をEt3N0.35ml
を用いて繰り返し、16時間後この反応溶液を真
空中で50℃で濃縮乾燥した。この残滓を50％
AcOH50mlに溶解し、50％AcOHで平衡させた
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラ
ムでゲル過することによつて精製した。ｐ−
ニトロアニリンの遊離下でトリプシンで処理す
ることによつて分解されたAcOH溶出液の主画
分を真空中で40℃で濃縮乾燥した。この残滓を
MeOH100mlに溶解し、この溶液を再び濃縮し
て乾燥した。得られた残滓を真空デシケーター
中で60℃でP2O5上で乾燥し、TLCによつて示
されるようにSSC中で均一な無定形化合物
1e3.15ｇ（理論値の82.7％）を得た。元素分析
及び実験式C34H49N8O7Brからの計算により次
の値が得られた：Ｃ＝52.88％（53.61％）、Ｈ
＝6.54％（6.48％）、Ｎ＝15.08％（14.71％）及
びBr＝10.25％（10.49％）。 1f 2HBr.H−Ｄ−Val−CHA−Arg−pNA 化合物1e2.29ｇ（３ミリモル）を撹拌下で氷
酢酸中の2NHBr12mlで20℃で湿分の不在下に
40分間処理した。トリペプチド誘導体は、脱カ
ルボキシル化下及びCO2の発生下で次第に溶解
した。この反応溶液を強力撹拌下で無水エーテ
ル120mlに滴加した。この溶液は、2HBr.H−
Ｄ−Val−CHA−Arg−pNAの沈殿物を生じ
た。エーテル相を過棒を通して吸引過し、
次に固体相を無水エーテル50mlの量で４回洗浄
した。得られた残滓をMeOH40mlに溶解した。
PHをEt3Nを用いて4.5に調節し、この溶液を真
空中で30℃で濃縮乾燥した。この残滓を
MeOH30mlに溶解し、MeOHで平衡させた
“セフアデツクス（Sephadex）LH−20”のカ
ラムで精製した。ｐ−ニトロアニリンの遊離下
でトリプシンで処理することによつて分解され
たMeOH溶出液の画分を真空中で30℃で濃縮
乾燥した。後精製するために、予備精製された
残滓を33％AcOH30mlに溶解し、33％AcOHで
平衡させた“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ
−15”のカラムでゲル過することによつて精
製した。ｐ−ニトロアニリンの遊離下でトリプ
シンで処理することによつて分解されたAcOH
溶出液の主画分を真空中40℃で濃縮乾燥した。
得られた残滓を真空デシケーター中で40℃で
P2O5上で乾燥し、TLCによつて示されるよう
にSSC中で均一な無定形化合物1f1.84ｇ（理論
値の86.4％）を得た。元素分析及び実験式
C26H44N8O5Br2からの計算により次の値が得
られた：Ｃ＝43.60％（44.08％）、Ｈ＝6.41％
（6.26％）、Ｎ＝16.15％（15.82％）及びBr＝
22.21％（22.56％）。 アミノ酸分析により次の正確な比率で所望のア
ミノ酸の存在が確認された： Arg：1.00−CHA：0.96−Ｄ−CHG：0.98。Rf
値0.46。 例 ２ 2HBr.H−Ｄ−Val−CHA−Arg−MCA 2b 2HBr.H−Arg−MCA 市販のCbo−Arg−MCA.HCl13.0ｇ（25.9ミ
リモル）を氷酢酸中の2NHBrの溶液104ml
（208ミリモル）を用いて例1bにより解封鎖し
た。この乾燥残滓をMeOH400mlに溶解し、こ
の溶液を“セフアデツクス（Sephadex）LH
−20”のカラムで精製した。４−メチル−７−
アミノ−クマリンの遊離下でトリプシンで処理
することによつて分解されたMeOH溶出液の
画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。得られた
残滓を真空デシケーター中で40℃でP2O5上で
乾燥し、TLCによつて示されるようにSSC中
で均一な無定形化合物3b11.2ｇ（理論値の87.7
％）を得た。元素分析及び実験式
C16H23N5O3Br2からの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝39.40％（38.96％）、Ｈ＝4.61％
（4.70％）、Ｎ＝14.48％（14.20％）及びBr＝
31.90％（32.40％）。 2c Cbo−CHA−Arg−MCA.HBr 化合物2b4.93ｇ（10ミリモル）及びCbo−
CHA−OpNP4.69ｇ（11ミリモル）を新しく
蒸留したDMF75mlに添加した。−10℃への冷却
後、撹拌下でEt3Nをまず1.40ml（10ミリモ
ル）、次に0.70ml（５ミリモル）添加した。こ
の混合物を、湿分の不在下で、まず−10℃で３
時間反応させ、次に室温で４時間反応させた。
この反応溶液を再び−10℃に冷却し、
Et3N0.70mlで緩衝し、かつ20℃で１晩撹拌し
た。この反応混合物を真空中で50℃で濃縮乾燥
し、この残滓を50％AcOH200mlに溶解し、こ
の溶液を“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−
５”のカラムで精製した。４−メチル−７−ア
ミノ−クマリンの遊離下でトリプシンで処理す
ることによつて分解されたAcOH溶出液の画分
を真空中で40℃で濃縮乾燥した。こうして得ら
れた残滓を真空デシケーター中で60℃でP2O5
上で乾燥し、TLCによつて示されるように
SSC中で均一な結晶性化合物2c5.95ｇ（理論値
の85.0％）を得た。元素分析及び実験式
C33H43N6O6Brからの計算により、次の値が得
られた：Ｃ＝56.33％（56.65％）、＝6.28％
（6.19％）、Ｎ＝12.25％（12.01％）及びBr＝
11.30％（11.42％）。 2d 2HBr.H−CHA−Arg−MCA 化合物2c5.60ｇ（８ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr32mlを用いて例1dにより解封鎖した。
得られた粗製生成物をMeOH100mlに溶解し、
この溶液を“セフアデツクス（Sephadex）
LH−20”のカラムで精製した。４−メチル−
７−アミノ−クマリンの遊離下でトリプシンで
処理することによつて分解されたMeOH溶出
液の画分で真空中で30℃で濃縮乾燥した。得ら
れた残滓を真空デシケーター中で40℃でP2O5
上で乾燥し、TLCによつて示されるように
SSC中で均一な無定形化合物2d4.76ｇ（理論値
の92.1％）を得た。元素分析及び実験式
C25H38N6O4Br2からの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝47.02％（46.45％）、Ｈ＝6.02％
（5.93％）、Ｎ＝13.21％（13.00％）及びBr＝
24.48％（24.72％）。 2e Cbo−Ｄ−Val−CHA−Arg−MCA.HBr 化合物2d3.23ｇ（５ミリモル）を例1eにより
Cbo−Ｄ−Val−OpNP2.05ｇ（5.5ミリモル）
と反応させた。得られた粗製生成物を50％
AcOH75mlに溶解し、この溶液を“セフアデツ
クス（Sephadex）Ｇ−15”のカラムで精製し
た。４−メチル−７−アミノ−クマリンの遊離
下でトリプシンで処理することによつて分解さ
れたAcOH溶出液の画分を真空中で40℃で濃縮
乾燥した。この残滓を真空デシケーター中で60
℃でP2O5上で乾燥し、TLCによつて示される
ようにSSC中で均一な無定形化合物2e3.21ｇ
（理論値の80.4％）を得た。元素分析及び実験
式C38H52N7O7Brからの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝57.05％（57.14％）、Ｈ＝6.61％
（6.56％）、Ｎ＝12.49％（12.28％）及びBr＝
9.82％（10.00％）。 2f 2HBr.H−Ｄ−Val−CHA−Arg−MCA 化合物2d2.40ｇ（３ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr12mlを用いて例1fにより解封鎖した。
得られた粗製生成物をMeOH50mlに溶解し、
この溶液を““セフアデツクス（Sephadex）
LH−20”のカラムで精製した。４−メチル−
７−アミノ−クマリンの遊離下でトリプシンで
処理することによつて分解されたMeOH溶出
液の画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。更
に、精製するために、予備精製された生成物を
50％AcOH40mlに溶解し、この溶液を“セフア
デツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラムでゲ
ル過することによつて精製した。４−メチル
−７−アミノ−クマリンの遊離下でトリプシン
で処理することによつて分解されたAcOH溶出
液の主画分を真空中で40℃で濃縮乾燥した。こ
の残滓を真空デシケーター中で40℃でP2O5で
乾燥し、TLCによつて示されるようにSSC中
で均一な無定形化合物2f1.73ｇ（理論値の77.3
％）を得た。元素分析及び実験式
C30H47N7O5Br2からの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝48.12％（48.33％）、Ｈ＝6.43％
（6.35％）、Ｎ＝13.38％（13.15％）及びBr＝
21.18％（21.44％）。 アミノ酸分析により正確な比率で所望のアミノ
酸の存在が確認された： Val：1.00−Arg：1.02−Ｄ−CHA：0.97。 Rf値：0.42。 例 ３ 2HBr.H−Ｄ−Val−CHA−Arg−DPA 3a Cbo−Arg−DPA.HCl 無水Cbo−Arg−OH.HCl34.48ｇ（0.1モル）
を1000mlの三首フラスコ中で新しく蒸留した無
水DMF150mlと無水300mlとの混合物に20℃で
溶解した。−10℃に冷却した該溶液に撹拌下で
Et3N10.2ｇ（0.1モル）を湿分の不在下で添加
した。更に、THF50ml中のクロル蟻酸イソブ
チル16.65ｇ（0.1モル）の溶液を20分間で滴加
し、その後に反応温度は−５℃を決して越えな
いようにした。−10℃〜−５℃の温度で10分間
の付加的な反応時間後、DMF75ml中のジメチ
ル５−アミノ−イソフタレート20.92ｇ（0.1モ
ル）の溶液を30分間で滴加し、その後に反応温
度はいつも−５℃以下に保持した。この反応混
合物を−５℃でさらに１時間反応させた。この
反外混合物を、Et3N.HClを晶出させるために、
20℃で１晩撹拌し、次に−15℃に冷却した。形
成したEt3N、HClを別し、冷たいDMFの小
量で洗浄した。この液と洗浄液を一緒に真空
中で50℃で濃縮乾燥した。この残滓を50％
AcOH1000mlに溶解し、この溶液を50％AcOH
で平衡させた“セフアデツクス（Sephadex）
Ｇ−15”のカラムでゲル過することによつて
精製した。ジメチル５−アミノ−イソフタレー
トの遊離下でトリプシンで処理することによつ
て分解されたAcOH溶出液の主画分を真空中で
40℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケー
ター中で50℃でP2O5上で乾操し、TLCによつ
て示されるようにSSC中で均一な無定形化合物
3a24.6ｇ（理論値の4.59）を得た。元素分析及
び実験式C24H30N5O7Clからの計算により、次
の値が得られた：Ｃ＝53.21％（53.78％）、Ｈ
＝5.71％（5.64％）、Ｎ＝13.20％（13.07％）及
びCl＝6.52％（6.62％）。 3b 2HNr.H−Arg−DPA 化合物3a21.44ｇ（40ミリモル）を例1bによ
り解封鎖した。普通の処理後、得られた粗生成
物をMeOH250mlに溶解し、この溶液を“セフ
アデツクス（Sephadex）LH−20”のカラム
でゲル過することによつて精製した。ジメチ
ル５−アミノ−イソフタレートの遊離下でトリ
プシンで処理することによつて分解された
MeOHの画分を真空中で濃縮乾燥した。この
残滓を真空デシケーター中で40℃でP2O5上で
乾燥し、TLCによつて示されるようにSSC中
で均一な無定形化合物3b19.63％（理論値の
93.1％）を得た。元素分析及び実験式
C16H25N5O5Br2からの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝36.82％（36.45％）、Ｈ＝4.67％
（4.78％）、Ｎ＝13.45％（13.28％）及びBr＝
29.85％（30.31％）。 3c Cbo−CHA−Arg−DPA.HBr 化合物3b5.27ｇ（10ミリモル）を例1cにより
Cbo−CHA−OpNP4.69ｇ（11ミリモル）と反
応させた。普通の処理後に得られた粗製生成物
を50％AcOH200mlに溶解し、この溶液を“セ
フアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラム
で精製した。ジメチル５−アミノ−イソフタレ
ートの遊離下でトリプシンで処理することによ
つて分解されたAcOH溶出液の画分を真空中で
40℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケー
ター中で60℃でP2O5上で乾燥し、TLCによつ
て示されるようにSSC中で均一な無定形化合物
3c6.06ｇ（理論値の82.6％）を得た。元素分析
及び実験式C33H45N6O8Brからの計算により、
次の値が得られた：Ｃ＝53.74％（54.02％）、
Ｈ＝6.28％（6.18％）、Ｎ＝11.90％（11.46％）
及びBr＝10.68％（10.89％）。 3d 2HBr.H−CHA−Arg−DPA 化合物3c5.87ｇ（８ミリモル）を氷酢酸中で
2NHBr32mlを用いて例1dにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH100mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH−20”のカラムで精
製した。ジメチル５−アミノ−イソフタレート
の遊離下でトリプシンで処理することによつて
分解されたMeOH溶出液の画分を真空中で30
℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケータ
ー中で40℃でP2O5上で乾燥し、TLCによつて
示されるようにSSC中で均一な無定形化合物
534.79ｇ（理論値の88.0％）を得た。元素分析
及び実験式C25H40N6O6Brからの計算により次
の値が得られた：Ｃ＝43.75％（44.13％）、
H5.88％（5.93％）、Ｎ＝12.69％（12.35％）及
びBr＝23.22％（23.49％）。 3e Cbo−Ｄ−Val−CHA−Arg−DPA.HBr 化合物3d3.40ｇ（５ミリモル）を例1eにより
Cbo−Ｄ−Val−OpNP2.05ｇ（5.5ミリモル）
と反応させた。普通の処理後に得られた粗製生
成物を50％AcOH100mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラ
ムで精製した。ジメチル５−アミノ−イソフタ
レートの遊離下でトリプシンで処理することに
よつて分解されたAcOH溶出液の画分を真空中
で40℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケ
ーター中で60℃でP2O5上で乾燥し、TLCによ
つて示されるようにSSC中で均一な無定形化合
物3e3.25ｇ（理論値の78.1％）を得た。元素分
析及び実験式C38H54N7O9Brからの計算によ
り、次の値が得られた：Ｃ＝53.95％（54.80
％）、Ｈ＝6.65％（6.54％）、Ｎ＝12.07％
（11.77％）及びBr＝9.38％（9.59％）。 3f 2HBr.H−Ｄ−Val−CHA−Arg−DPA 化合物3e2.50ｇ（３ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr12mlを用いて例1fにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH50mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH−20”のカラムで予
備精製した。ジメチル５−アミノ−イソフタレ
ートの遊離下でトリプシンで処理することによ
つて分解されたMeOH溶出液の画分を真空中
で30℃で濃縮乾燥した。この予備精製された生
成物を50％AcOH50mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラ
ムでゲル過することによつて精製した。ジメ
チル５−アミノ−イソフタレートの遊離下でト
リプシンで処理することによつて分解された
AcOH溶出液の主画分を真空中で40℃で濃縮乾
燥した。この残滓を真空デシケーター中で40℃
でP2O5上で乾燥し、TLCによつて示されるよ
うにSSC中で均一な無定形化合物3f1.93ｇ（理
論値の82.6％）を得た。元素分析及び実験式
C30H49N7O7Br2からの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝46.84％（46.22％）、Ｈ＝6.42％
（6.34％）、Ｎ＝12.16％（12.58％）及びBr＝
20.22％（20.50％）。 アミノ酸分析により正確な比率で所望のアミノ
酸の存在が確認された： Ｄ−Val：1.00−Arg：0.98−CHA：1.02。 Rf値：0.44。 例 ４ 2HBr.H−Ｄ−Val−CHA−Arg−２−NA 4b 2HBr.H−Arg−２−NA 市販のCbo−Arg−２−NA.HCl9.40ｇ（20
ミリモル）を例1bにより氷酢酸中の2NHBr80
mlの溶液と反応させた。普通の処理後に得られ
た生成物をMeOH150mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）LH−20”のカ
ラムで精製した。２−ナフチルアミンの遊離下
でトリプシンで処理することによつて分解され
たMeOH溶出液の画分を真空中で30℃で濃縮
乾燥した。この残滓を真空デシケーター中で40
℃でP2O5上で乾燥し、TLCによつて示される
ようにSSC中で均一な無定形化合物4b8.60ｇ
（理論値の93.2％）を得た。元素分析及び実験
式C16H23N5OBr2からの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝42.08％（41.67％）、Ｈ＝5.12％
（5.03％）、Ｎ＝14.68％（15.19％）及びBr＝
33.96％（34.65％）。 4c Cbo−CHA−Arg−２−NA.HBr 化合物4b4.6ｇ（10ミリモル）を例1cにより
Cbo−CHA−OpNP4.69ｇ（11ミリモル）と反
応させた。普通の処理後に得られた粗製生成物
を50％AcOH150mlに溶解し、この溶液を“セ
フアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラム
で精製した。２−ナフチルアミンの遊離下でト
リプシンで処理することによつて分解された
AcOH溶出液の画分を真空中で40℃で濃縮乾燥
した。この残滓を真空デシケーター中で60℃で
P2O5上で乾燥し、TLCによつて示されるよう
にSSC中で均一な無定形化合物4c5.31ｇ（理論
値の79.5％）を得た。元素分析及び実験式
C33H43N6O4Brからの計算により、次の値が得
られた：Ｃ＝59.18％（59.37％）、Ｈ＝6.58％
（6.49％）、Ｎ＝12.87％（12.59％）及びBr＝
11.55％（11.97％）。 4d 2HBr.H−CHA−Arg−２−NA 化合物4c4.67ｇ（７ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr28mlを用いて例1dにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH100mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH−20”のカラムで精
製した。２−ナフチルアミンの遊離下でトリプ
シンで処理することによつて分解された
MeOH溶出液の画分を真空中で30℃で濃縮乾
燥した。この残滓を真空デシケーター中で40℃
でP2O5上で乾燥し、TLCによつて示されるよ
うにSSC中で均一な無定形化合物4d3.95ｇ（理
論値の91.8％）を得た。元素分析及び実験式
C25H38N6O2Br2からの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝49.22％（48.87％）、Ｈ＝6.30％
（6.23％）、Ｎ＝13.61％（13.68％）及びBr＝
25.84％（26.01％）。 4e Cbo−Ｄ−Val−CHA−Arg−２−NA.HBr 化合物4d3.07ｇ（５ミリモル）を例1eにより
Cbo−Ｄ−Val−OpNP2.05ｇ（5.5ミリモル）
と反応させた。普通の処理後に得られた粗製生
成物を50％AcOH100mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラ
ムで精製した。２−ナフチルアミンの遊離下で
トリプシンで処理することによつて分解された
AcOH溶出液の第１の主画分を真空中で40℃で
濃縮乾燥し、真空デシケーター60℃でP2O5上
で乾燥した。こうして、TLCによつて示され
るようにSSC中で均一な無定形化合物4e3.14ｇ
（理論値の81.9％）が得られた。元素分析及び
実験式C38H52N7O5Brからの計算により、次の
値が得られた：Ｃ＝58.92％（59.52％）、Ｈ＝
6.93％（6.84％）、Ｎ＝13.02％（12.79％）及び
Br＝10.18％（10.42％）。 4f 2HBr.H−Ｄ−Val−CHA.Arg−２−NA 化合物4e1.53ｇ（２ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr8mlを用いて例1fにより解封鎖した。普
通の処理後に得られた粗製生成物をMeOH40
mlに溶解し、この溶液を“セフアデツクス
（Sephadex）LH−20”のカラムで精製した。
２−ナフチルアミンの形成下でトリプシンで処
理することによつて分解されたMeOH溶出液
の主画分を真空中で30℃で濃縮乾燥した。この
生成物を50％AcOH50mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラ
ムで精製した。２−ナフチルアミンの形成下で
トリプシンで処理することによつて分解された
AcOH溶出液の主画分を真空中で40℃で濃縮乾
燥した。この残滓を真空デシケーター中で40℃
でP2O5上で乾燥し、TLCによつて示されるよ
うにSSC中で均一な無定形化合物4f1.05ｇ（理
論値の73.6％）を得た。元素分析及び実験式
C30H47N7O3Br2からの計算により、次の値が
得られた：Ｃ＝50.16％（50.50％）、Ｈ＝6.71％
（6.64％）、Ｎ＝14.00％（13.74％）及びBr＝
22.05％（22.40％）。 アミノ酸分析により正確な比率で所望のアミノ
酸の存在が確認された： Ｄ−Val：1.00−Arg：0.98−CHA：0.97。 Rf値：0.42。 例 ５ 2HBr.H−Ｄ−Val−CHA−Arg−４−MeO−
２−NA 5b 2HBr.H−Arg−４−MeO−２−NA 市販のCbo−Arg−４−MeO−２−NA.
HCl10.0ｇ（20ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr80mlを用いて例1bにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗生成物をMeOH150
mlに溶解し、この溶液を“セフアデツクス
（Sephadex）LH−20”のカラムで精製した。
４−メトキシ−２−ナフチルアミンの遊離下で
トリプシンで処理することによつて分解された
MeOH溶出液の主画分を真空中で30℃で濃縮
乾燥した。この残滓を真空デシケーター中で40
℃でP2O5上で乾燥した後、TLCによつて示さ
れるようにSSC中で均一な無定形化合物5b8.98
ｇ（理論値の91.4％）が得られた。元素分析及
び実験式C17H25N5O2Br2からの計算により、
次の値が得られた：Ｃ＝41.22％（41.57％）、
Ｈ＝5.19％（5.13％）、Ｎ＝14.40％（14.26％）
及びBr＝32.01％（32.53％）。 5c Cbo−CHA−Arg−４−MeO−２−Na.
HBr 化合物5b4.91ｇ（10ミリモル）を例1cにより
Cbo−CHA−OpNP4.69ｇ（11ミリモル）と反
応させた。普通の処理後に得られた粗製生成物
を50％AcOH150mlに溶解して、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラ
ムで精製した。４−メキシ−２−ナフチルアミ
ンの遊離下でトリプシンで処理することによつ
て分解されたAcOH溶出液の第１の主画分を真
空中で40℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デ
シケーター中で60℃でP2O5上で乾燥した後、
TLCによつて示されるようにSSC中で均一な
無定形化合物5c5.36ｇ（理論値の76.8％）が得
られた。元素分析及び実験式C34H45N6O5Brか
らの計算により、次の値が得られた：Ｃ＝
58.85％（58.53％）、Ｈ＝6.59％（6.50％）、Ｎ
＝11.91％（12.05％）及びBr＝11.32％（11.45
％）。 5d 2HBr.H−CHA−Arg−４−MeO−２−NA 化合物5c4.88ｇ（７ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr28mlを用いて例1dにより解封鎖した。
普通の処理後に得られた粗製生成物を
MeOH100mlに溶解し、この溶液を“セフアデ
ツクス（Sephadex）LH−20”のカラムで精
製した。４−メトキシ−２−ナフチルアミンの
形成下でトリプシンで処理することによつて分
解されたMeOH溶出液の主画分を真空中で30
℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空デシケータ
ー中で40℃でP2O5上で乾燥した後、TLCによ
つて示されるようにSSC中で均一な無定形化合
物5d4.12ｇ（理論値の91.3％）が得られた。元
素分析及び実験式C26H40N6O3Br2からの計算
により、次の値が得られた：Ｃ＝48.92％
（48.46％）、Ｈ＝6.36％（6.26％）、Ｎ＝12.84％
（13.04％）及びBr＝24.33％（24.80％）。 5e Cbo−Ｄ−Val−CHA−Arg−４−MeO−２
−NA.HBr 化合物5d3.22ｇ（５ミリモル）を例1eにより
Cbo−Ｄ−Val−OpNP2.05ｇ（5.5ミリモル）
と反応させる。普通の処理後に得られた粗製生
成物を50％AcOH125mlに溶解し、この溶液を
“セフアデツクス（Sephadex）Ｇ−15”のカラ
ムで精製した。４−メトキシ−２−ナフチルア
ミンの遊離下でトリプシンで処理することによ
つて分解されたAcOH溶出液の第１の主画分を
真空中で40℃で濃縮乾燥した。この残滓を真空
デシケーター中で60℃でP2O5上で乾燥した後、
TLCによつて示れるようにSSC中で均一な無
定形化合物5e3.15ｇ（理論値の79.1％）が得ら
れた。元素分析及び実験式C39H54N7O6Brから
の計算により、次の値が得られた：Ｃ＝58.35
％（58.79％）、Ｈ＝6.78％（6.83％）、Ｎ＝
12.68％（12.31％）及びBr＝9.82％（10.03％）。 5f 2HBr.H−Ｄ−Val−CHA−Arg−４−MeO
−２−NA 化合物5e1.59ｇ（２ミリモル）を氷酢酸中の
2NHBr8mlを用いて例1fにより解封鎖した。普
通の処理後に得られた粗製生成物をMeOH40
mlに溶解し、この溶液を“セフアデツクス
（Sephadex）LH−20”のカラムで予備精製し
た。４−メトキシ−２−ナフチルアミンの形成
下でトリプシンで処理することによつて分解さ
れたMeOH溶出液の主画分を真空中で30℃で
濃縮した。この予備精製された生成物を50％
AcOH60mlに溶解し、この溶液を“セフアデツ
クス（Sephadex）Ｇ−15”のカムムで精製し
た。４−メトキシ−２−ナフチルアミンの形成
下でトリプシンで処理することによつて分解さ
れたAcOH溶出液の主画分を真空中で40℃で濃
縮乾燥した。この残滓を真空デシケーター中で
40℃でP2O5上で乾燥した後、TLCによつて示
されるようにSSC中で均一な無定形化合物
5f1.09ｇ（理論値の73.3％）が得られた。元素
分析及び実験式C31H49N7O4Br2からの計算に
より、次の値が得られた：Ｃ＝49.63％（50.07
％）、Ｈ＝6.70％（6.64％）、Ｎ＝13.42％
（13.19％）及びBr＝21.22％（21.49％）。 アミノ酸分析により正確な比率で所望のアミノ
酸の存在が確認された： Ｄ−Val：1.00−Arg：1.01−Ｄ−CHA：0.98。 Rf値：0.47。 一連の他のトリペプチド誘導体を前記実施例に
記載の方法により製造した。これらのトリペプチ
ド誘導体は、次の第１表に纏められている。 第１表に示したトリペプチド誘導体の製造に使
用されたトリペプチド中間体は、第２表に記載さ
れている。
【表】
【表】
【表】
例 12
2AcOH.H−Ｄ−Val−CHA−Arg−pNA
2HBr・Ｈ−Ｄ−Val−CHA−Arg−pNA（例
38により製造）7.09ｇ（10ミリモル）を60％
MeOH水溶液75mlに溶解した。この溶液を酢酸
塩の形で“アンバーライト（Ameberlite）”（登
録商標）JRA−401のカラムに充填した。このカ
ラムを60％MeOH水溶液で溶離し、その後に
HBrをイオン交換することによつてAcOHに代
えた。この溶出液を真空中で40℃で濃縮乾燥し
た。この残滓を真空デシケーター中で40℃で
P2O5上で乾燥した後、臭化物不含の2AcOH.H−
Ｄ−Val−CHA−Arg−pNA6.33ｇ（理論値の
98.5％）が得られた。 上記方法によれば、有機酸、例えば蟻酸、プロ
ピオン酸、蓚酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、安息
香酸、クロル安息香酸、サリチル酸又はフタル酸
との他の塩は、前記のトリペプチド誘導体から製
造することができる。イオン交換体、例えば塩酸
塩の形の“アンバーライト（Ameberlite）”（登
録商標）JRA−401を使用することができ、これ
は苛性ソーダ液で処理することによつて該イオン
交換体を塩基性OH形に変換し、次に該塩基性イ
オン交換体を60％MeOH水溶液中の所望の有機
酸とそのナトリウム塩との１：１混合物の溶液で
処理することによつて所望の酸塩の形に変換する
ことができる。 本発明によるトリペプチド基質を用いての酵素
の定量分析は、次のようにして実施することがで
きる： １ 尿カリクレイン分析。 尿１mlならびにPH7.9及びイオン強度1.0を有
するTRIS−イミダゾール緩衝液１mlを37℃で
５分間恒温保持し、次に沈殿物を除去するため
に遠心分離する。 37℃に加熱した蒸留水1.4mlと遠心分離物0.4
mlをプラスチツク製キユベツト中で充分に混合
する。この混合物に２×10-3モルの基質水溶液
0.2mlを添加し、成分を迅速に混合する。この
混合物を37℃で正確に15分間恒温保持する。次
に、この反応混合物を酵素反応を停止させるた
めに氷酢酸0.2mlと混合する。色を計測するた
めには、同じ成分からなるが、酵素反応を阻止
するための基質添加前に添加された氷酢酸を有
する空試料を使用する。次に、形成された有色
化合物Ｒ−NH2の擁を空試料と試験試料との
差から405nｍで測光法又は分光測光法により
測定する。得られる値から尿における尿カリク
レイン活量を次式により測定する： △OD15分間×Ｖ×1000×Ｆ／15分間×ｖ×ε＝ｍＵ／尿
のml 数 △OD＝15分間の405nｍでの光学濃度の増加分 Ｖ＝試験混合物の全容量＝2.2ml 1000＝ＵをｍＵに変換するための変換係数 Ｆ＝尿(2)の釈係数 ｖ＝試料の容量＝0.4ml ε＝1000で割つた吸光係数＝10.4 尿における尿カリクレイン含量の計算は、形
成される生成物Ｒ−NH2（例えば、ｐ−ニトロ
アニリン）を連続的に測定することによつて実
施することもできる。この方法を喀痰中の腺カ
リクレインの分析に適用するように後記する。 尿カリクレイン以外に、尿も本発明による基
質を少量であるが分解することもできる蛋白分
解酵素としてのウロキナーゼを含有する。前記
分析方法においては、尿カリクレインとウロキ
ナーゼとの活量の合計が測定される。尿カリク
レイン活量の正確な値を得るためには、ウロキ
ナーゼ活量は差し引かなければならない。この
ウロキナーゼ活量は、比較試験において尿カリ
クレイン活量を完全に抑制するために緩衝液１
ml当りトリプシン抑制因子（牛の肺からのトリ
プシン抑制因子）0.075単位を添加し、かつ単
独にウロキナーゼ活量を測定することによつて
測定することができる。 ２ 喀痰における腺カリクレイン分析： 喀痰0.5mlをTRIS−イミダゾール緩衝液（イ
オン強度1.0）２mlと混合し、この混合物を37
℃で５分間予め恒温保持する。この恒温保持物
を遠心分離する。試験キユベツトに37℃の蒸留
水1.5mlを充填し、これ遠心分離物0.25mlを添
加する。これらの成分を充分に混合する。更
に、２×10-3モルの基質水溶液0.2mlを添加す
る。次に、405nｍでの吸光変化を録装置を用
いて５〜10分間連続的に追跡する。毎分の△
ODの測定値から喀痰１ml当りのカリクレイン
活量は、ｍＵで次式により計算される： △OD毎分数×Ｖ×100×Ｆ／ｖ×ε＝喀痰のｍＵ／ml数 Ｆ＝５ Ｖ＝1.95 ｖ＝0.25 lU（単位）＝PH、イオン強度、温度及び基質濃
度の最適条件下又は他に規定される条件に１
分間で基質１マイクロモルを分解することの
できる酵素量。 膵液において膵臓カリクレインは、主にプレ
カリクレインの形で存在し、活性化後でのみ、
例えばトリプシンを用いて分析することができ
る。プレカリクレインの活性後、トリプシン
は、大豆トリプシン抑制因子（SBTI）により
抑制されている。この活性化混合物中のカリク
レイン含量は、前記方法の１つによつて測定す
ることができる。 ３ プラズミン分析： TRIS−イミダゾール緩衝液（PH7.5、イオン
強度0.2）1.7mlを25％グリセロール中のプラズ
ミン溶液0.1mlと37℃で混合し、この混合物を
37℃で１分間恒温保持する。この混合物に37℃
の２×10-3モルの基質水溶液0.2mlを添加し、
成分を迅速に混合する。次に、単位時間当りの
基質から分離される分解生成物Ｒ−NH2の量
を連続的に測定する。試料１ml当りのプラズミ
ン活量は、毎分測定される値からｍＵで次式に
より計算される： △Ｅ／min.×Ｖ×1000／ｖ×ε＝試料のｍＵ／ml数 △Ｅ＝毎分分離される分解生成物の量 Ｖ＝試験混合物の全容量 ｖ＝試料の容量 ε＝1000で割つた吸光係数 ４ ヒトの血漿における抗プラズミン分析： １：20の比率でTRIS−イミダゾール緩衝液
で稀釈された血漿0.1mlを、25％グリセロール
１ml当りのヒトプラズミン（AB Kabi
（Stockholm、Sweden）社製）1.25CU及びヒ
ルジン（Pentapharm A.G.（Basle、
Switzerland）社製）50ATUの溶液0.02mlと混
合する。この混合物を37℃で90秒間恒温保持す
る。この恒温保持物に37℃のTRIS−イミダゾ
ール緩衝液（PH7.5、イオン強度0.2）1.7mlを混
合し、さらに２×10-3モルの基質水溶液0.2ml
を混合する。次に、単位時間当りの基質から分
離される分解生成物Ｒ−NH2の量を連続的に
測定する残留プラズミン活量は、測定値から前
記方法により計算される。 空試験では、血漿は換衝液の相当量に代える
が、それ以外はこの試験は前記方法により実施
される。測定されるプラズミン活量は、開始プ
ラズミン量に相当する。抗プラズミン活量は、
空試験で測定されるプラズミン活量と、血漿を
用いる試験で測定される残留プラズミン活量と
の差から次式により計算される： （△Ｅ空試料−Ｅ血漿試料）／min、×Ｖ×Ｆ
×1000／ｖ×ε＝血漿のｍIU／ml量 Ｆ＝血漿（20）の稀釈係数。 本発明による基質は、血漿中に存在するプラズ
ミノジエンを緩衝系中のウロキナーゼ又はストレ
プトキナーゼを用いて変換しかつ形成されるプラ
ズミンの量を前記プラズミン分析法により本発明
による基質の１つを用いて測定することによつて
ヒトの血漿中のプラズミノジエンを分析するのに
使用することもできる。血漿中に元来存在するプ
ラズミノジエンの量は、活性下でプラズミン１分
子がプラズミノジエン１分子から形成されるので
プラズミンに対する測定値から誘導される。 次の第４表には、器官又は腺カリクレイン、プ
ラズミン及びトロンビンに対する本発明による若
干の基質の感受性が示されている。
38により製造）7.09ｇ（10ミリモル）を60％
MeOH水溶液75mlに溶解した。この溶液を酢酸
塩の形で“アンバーライト（Ameberlite）”（登
録商標）JRA−401のカラムに充填した。このカ
ラムを60％MeOH水溶液で溶離し、その後に
HBrをイオン交換することによつてAcOHに代
えた。この溶出液を真空中で40℃で濃縮乾燥し
た。この残滓を真空デシケーター中で40℃で
P2O5上で乾燥した後、臭化物不含の2AcOH.H−
Ｄ−Val−CHA−Arg−pNA6.33ｇ（理論値の
98.5％）が得られた。 上記方法によれば、有機酸、例えば蟻酸、プロ
ピオン酸、蓚酸、酒石酸、クエン酸、乳酸、安息
香酸、クロル安息香酸、サリチル酸又はフタル酸
との他の塩は、前記のトリペプチド誘導体から製
造することができる。イオン交換体、例えば塩酸
塩の形の“アンバーライト（Ameberlite）”（登
録商標）JRA−401を使用することができ、これ
は苛性ソーダ液で処理することによつて該イオン
交換体を塩基性OH形に変換し、次に該塩基性イ
オン交換体を60％MeOH水溶液中の所望の有機
酸とそのナトリウム塩との１：１混合物の溶液で
処理することによつて所望の酸塩の形に変換する
ことができる。 本発明によるトリペプチド基質を用いての酵素
の定量分析は、次のようにして実施することがで
きる： １ 尿カリクレイン分析。 尿１mlならびにPH7.9及びイオン強度1.0を有
するTRIS−イミダゾール緩衝液１mlを37℃で
５分間恒温保持し、次に沈殿物を除去するため
に遠心分離する。 37℃に加熱した蒸留水1.4mlと遠心分離物0.4
mlをプラスチツク製キユベツト中で充分に混合
する。この混合物に２×10-3モルの基質水溶液
0.2mlを添加し、成分を迅速に混合する。この
混合物を37℃で正確に15分間恒温保持する。次
に、この反応混合物を酵素反応を停止させるた
めに氷酢酸0.2mlと混合する。色を計測するた
めには、同じ成分からなるが、酵素反応を阻止
するための基質添加前に添加された氷酢酸を有
する空試料を使用する。次に、形成された有色
化合物Ｒ−NH2の擁を空試料と試験試料との
差から405nｍで測光法又は分光測光法により
測定する。得られる値から尿における尿カリク
レイン活量を次式により測定する： △OD15分間×Ｖ×1000×Ｆ／15分間×ｖ×ε＝ｍＵ／尿
のml 数 △OD＝15分間の405nｍでの光学濃度の増加分 Ｖ＝試験混合物の全容量＝2.2ml 1000＝ＵをｍＵに変換するための変換係数 Ｆ＝尿(2)の釈係数 ｖ＝試料の容量＝0.4ml ε＝1000で割つた吸光係数＝10.4 尿における尿カリクレイン含量の計算は、形
成される生成物Ｒ−NH2（例えば、ｐ−ニトロ
アニリン）を連続的に測定することによつて実
施することもできる。この方法を喀痰中の腺カ
リクレインの分析に適用するように後記する。 尿カリクレイン以外に、尿も本発明による基
質を少量であるが分解することもできる蛋白分
解酵素としてのウロキナーゼを含有する。前記
分析方法においては、尿カリクレインとウロキ
ナーゼとの活量の合計が測定される。尿カリク
レイン活量の正確な値を得るためには、ウロキ
ナーゼ活量は差し引かなければならない。この
ウロキナーゼ活量は、比較試験において尿カリ
クレイン活量を完全に抑制するために緩衝液１
ml当りトリプシン抑制因子（牛の肺からのトリ
プシン抑制因子）0.075単位を添加し、かつ単
独にウロキナーゼ活量を測定することによつて
測定することができる。 ２ 喀痰における腺カリクレイン分析： 喀痰0.5mlをTRIS−イミダゾール緩衝液（イ
オン強度1.0）２mlと混合し、この混合物を37
℃で５分間予め恒温保持する。この恒温保持物
を遠心分離する。試験キユベツトに37℃の蒸留
水1.5mlを充填し、これ遠心分離物0.25mlを添
加する。これらの成分を充分に混合する。更
に、２×10-3モルの基質水溶液0.2mlを添加す
る。次に、405nｍでの吸光変化を録装置を用
いて５〜10分間連続的に追跡する。毎分の△
ODの測定値から喀痰１ml当りのカリクレイン
活量は、ｍＵで次式により計算される： △OD毎分数×Ｖ×100×Ｆ／ｖ×ε＝喀痰のｍＵ／ml数 Ｆ＝５ Ｖ＝1.95 ｖ＝0.25 lU（単位）＝PH、イオン強度、温度及び基質濃
度の最適条件下又は他に規定される条件に１
分間で基質１マイクロモルを分解することの
できる酵素量。 膵液において膵臓カリクレインは、主にプレ
カリクレインの形で存在し、活性化後でのみ、
例えばトリプシンを用いて分析することができ
る。プレカリクレインの活性後、トリプシン
は、大豆トリプシン抑制因子（SBTI）により
抑制されている。この活性化混合物中のカリク
レイン含量は、前記方法の１つによつて測定す
ることができる。 ３ プラズミン分析： TRIS−イミダゾール緩衝液（PH7.5、イオン
強度0.2）1.7mlを25％グリセロール中のプラズ
ミン溶液0.1mlと37℃で混合し、この混合物を
37℃で１分間恒温保持する。この混合物に37℃
の２×10-3モルの基質水溶液0.2mlを添加し、
成分を迅速に混合する。次に、単位時間当りの
基質から分離される分解生成物Ｒ−NH2の量
を連続的に測定する。試料１ml当りのプラズミ
ン活量は、毎分測定される値からｍＵで次式に
より計算される： △Ｅ／min.×Ｖ×1000／ｖ×ε＝試料のｍＵ／ml数 △Ｅ＝毎分分離される分解生成物の量 Ｖ＝試験混合物の全容量 ｖ＝試料の容量 ε＝1000で割つた吸光係数 ４ ヒトの血漿における抗プラズミン分析： １：20の比率でTRIS−イミダゾール緩衝液
で稀釈された血漿0.1mlを、25％グリセロール
１ml当りのヒトプラズミン（AB Kabi
（Stockholm、Sweden）社製）1.25CU及びヒ
ルジン（Pentapharm A.G.（Basle、
Switzerland）社製）50ATUの溶液0.02mlと混
合する。この混合物を37℃で90秒間恒温保持す
る。この恒温保持物に37℃のTRIS−イミダゾ
ール緩衝液（PH7.5、イオン強度0.2）1.7mlを混
合し、さらに２×10-3モルの基質水溶液0.2ml
を混合する。次に、単位時間当りの基質から分
離される分解生成物Ｒ−NH2の量を連続的に
測定する残留プラズミン活量は、測定値から前
記方法により計算される。 空試験では、血漿は換衝液の相当量に代える
が、それ以外はこの試験は前記方法により実施
される。測定されるプラズミン活量は、開始プ
ラズミン量に相当する。抗プラズミン活量は、
空試験で測定されるプラズミン活量と、血漿を
用いる試験で測定される残留プラズミン活量と
の差から次式により計算される： （△Ｅ空試料−Ｅ血漿試料）／min、×Ｖ×Ｆ
×1000／ｖ×ε＝血漿のｍIU／ml量 Ｆ＝血漿（20）の稀釈係数。 本発明による基質は、血漿中に存在するプラズ
ミノジエンを緩衝系中のウロキナーゼ又はストレ
プトキナーゼを用いて変換しかつ形成されるプラ
ズミンの量を前記プラズミン分析法により本発明
による基質の１つを用いて測定することによつて
ヒトの血漿中のプラズミノジエンを分析するのに
使用することもできる。血漿中に元来存在するプ
ラズミノジエンの量は、活性下でプラズミン１分
子がプラズミノジエン１分子から形成されるので
プラズミンに対する測定値から誘導される。 次の第４表には、器官又は腺カリクレイン、プ
ラズミン及びトロンビンに対する本発明による若
干の基質の感受性が示されている。
【表】
【表】
基質の酵素加水分解によつて形成される分解生
成物Ｒ−NH2の測定は、この分解生成物が基質
の柴外スペクトルとは異なる柴外スペクトルを有
しかつより高い波長に向つて移動するという前提
条件に基づく。405nｍにおける基質の吸収は、
実際に皆無である。分解生成物としてのｐ−ニト
ロアニリンは、380nｍでの吸収最高及びモル吸
光係数13200を示す。しかし、該吸光係数は405n
ｍで僅かに低下する、すなわち9650になる。分離
されるｐ−ニトロアニリン量に比例する基質の酵
素加水分解による量は、405nｍで分光測光法に
より測定することによつて測定することができ
る。過剰の基質の存在下であつても405nｍにお
ける測定には支障がない。 分解生成物Ｒ−NH2の量は、２−ナフチルア
ミノ基、４−メトキシ−２−ナフチルアミノ基、
４−メチル−クマリル−(7)−アミノ基又は１，３
−ジ（メトキシカルボニル）−フエニル−(5)−ア
ミノ基を含有する基質を用いて蛍光分光測光法に
より測定される。酵素、緩衝液及び基質からなる
試験系において、低エネルギー量の輻射線は、形
成された蛍光性分解生成物が高エネルギー量の光
線によつて励起された後、400〜470nｍで連続的
に測定される。単位時間当りに形成される分解生
成物の量は、存在する酵素活量に対して測定され
る。前記のように、毎分の分解生成物１ミクロン
モルは、所定の基質に基づく１酵素単位に相当す
る。
成物Ｒ−NH2の測定は、この分解生成物が基質
の柴外スペクトルとは異なる柴外スペクトルを有
しかつより高い波長に向つて移動するという前提
条件に基づく。405nｍにおける基質の吸収は、
実際に皆無である。分解生成物としてのｐ−ニト
ロアニリンは、380nｍでの吸収最高及びモル吸
光係数13200を示す。しかし、該吸光係数は405n
ｍで僅かに低下する、すなわち9650になる。分離
されるｐ−ニトロアニリン量に比例する基質の酵
素加水分解による量は、405nｍで分光測光法に
より測定することによつて測定することができ
る。過剰の基質の存在下であつても405nｍにお
ける測定には支障がない。 分解生成物Ｒ−NH2の量は、２−ナフチルア
ミノ基、４−メトキシ−２−ナフチルアミノ基、
４−メチル−クマリル−(7)−アミノ基又は１，３
−ジ（メトキシカルボニル）−フエニル−(5)−ア
ミノ基を含有する基質を用いて蛍光分光測光法に
より測定される。酵素、緩衝液及び基質からなる
試験系において、低エネルギー量の輻射線は、形
成された蛍光性分解生成物が高エネルギー量の光
線によつて励起された後、400〜470nｍで連続的
に測定される。単位時間当りに形成される分解生
成物の量は、存在する酵素活量に対して測定され
る。前記のように、毎分の分解生成物１ミクロン
モルは、所定の基質に基づく１酵素単位に相当す
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ アルギニンないしはリジンの媒体中に蛋白分
解酵素を含有するか又はその媒体中で該蛋白分解
酵素を形成又は消費するアルギニンないしはリジ
ンのカルボキシル側鎖上の天然のペプチド鎖を分
解する蛋白分解酵素、殊に酵素部類E.C.3.4.21.の
酵素を定量分析する方法において、該媒体を、一
般式： Ｈ−Ｄ−Ｘ−Ｙ−Arg−Ｒ 〔式中、 Ｘはアラニル基、α−ブチリルアミノ基、バリ
ル基、ノルバリル基、ロイシル基、ノルロイシル
基又はイソロイシル基を表わし、 Ｙはシクロヘキシルアラニル基又はシクロヘキ
シルチロシル基を表わし、 Ｒはｐ−ニトロフエニルアミノ基、２−ナフチ
ルアミノ基、４−メトキシ−２−ナフチルアミノ
基、４−メチル−クマリル−７−アミノ又は１，
３−ジ（メトキシカルボニル）−フエニル−５−
アミノ基を表わす〕で示されるトリペプチド誘導
体及びその酸との塩と反応させ、トリペプチド誘
導体上の酵素の加水分解作用によつて形成された
有色又は蛍光性分解生成物Ｒ−NH2の量を、測
光法、分光測光法、蛍光分光測先法又は電気化学
的方法により測定することを特徴とする、蛋白分
解酵素を定量分析する方法。 ２ ヒトの体液、例えば尿、膵液、腸粘液、乳腺
分泌物、汗腺分泌物、喀痰又は血液中の器官又は
腺カリクレインを分析する、特許請求の範囲第１
項記載の方法。 ３ 血液又は血漿中のプラズミンを分析する、特
許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ 血液又は血漿中のトロンビンを分析する、特
許請求の範囲第１項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH3515/80-9 | 1980-05-06 | ||
| CH351580 | 1980-05-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62296899A JPS62296899A (ja) | 1987-12-24 |
| JPH0244518B2 true JPH0244518B2 (ja) | 1990-10-04 |
Family
ID=4257649
Family Applications (4)
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|---|---|---|---|
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Family Applications Before (2)
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|---|---|---|---|
| JP6431581A Granted JPS572253A (en) | 1980-05-06 | 1981-04-30 | Tripeptide derivative and quantitative analysis of proteinase |
| JP5224187A Granted JPS62294696A (ja) | 1980-05-06 | 1987-03-09 | トリペプチド誘導体 |
Family Applications After (1)
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|---|---|---|---|
| JP5224087A Granted JPS62294695A (ja) | 1980-05-06 | 1987-03-09 | トリペプチド誘導体 |
Country Status (3)
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