DK154221B - Tripeptidderivater og fremgangsmaade til kvantitativt at analysere faktor xa i et xa-holdigt medium, faktor x i blodplasma, heparin i hepariniseret blodplasma eller antifaktor xa i blodplasma - Google Patents
Tripeptidderivater og fremgangsmaade til kvantitativt at analysere faktor xa i et xa-holdigt medium, faktor x i blodplasma, heparin i hepariniseret blodplasma eller antifaktor xa i blodplasma Download PDFInfo
- Publication number
- DK154221B DK154221B DK451981AA DK451981A DK154221B DK 154221 B DK154221 B DK 154221B DK 451981A A DK451981A A DK 451981AA DK 451981 A DK451981 A DK 451981A DK 154221 B DK154221 B DK 154221B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- arg
- gly
- factor
- acoh
- millimoles
- Prior art date
Links
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 title claims abstract description 82
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 title claims description 71
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 title claims description 32
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 title claims description 32
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 24
- -1 methoxy, methyl Chemical group 0.000 claims abstract description 38
- 239000000460 chlorine Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 claims abstract description 11
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims abstract description 10
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims abstract description 7
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Chemical group O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 claims abstract description 5
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical group [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims abstract description 4
- 229910052801 chlorine Chemical group 0.000 claims abstract description 4
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims abstract description 4
- 125000003143 4-hydroxybenzyl group Chemical group [H]C([*])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 claims abstract description 3
- 125000004453 alkoxycarbonyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 125000004390 alkyl sulfonyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 125000001589 carboacyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 125000006639 cyclohexyl carbonyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 229910052736 halogen Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 150000002367 halogens Chemical group 0.000 claims abstract description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims abstract description 3
- 125000003170 phenylsulfonyl group Chemical group C1(=CC=CC=C1)S(=O)(=O)* 0.000 claims abstract description 3
- 125000004210 cyclohexylmethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims abstract 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 282
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 50
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 35
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 25
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 claims description 20
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 20
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 18
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 17
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 17
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 12
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 claims description 8
- DEKPYXUDJRABNK-UHFFFAOYSA-N dimethyl 5-aminobenzene-1,3-dicarboxylate Chemical compound COC(=O)C1=CC(N)=CC(C(=O)OC)=C1 DEKPYXUDJRABNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 7
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 claims description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 6
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 5
- 230000005588 protonation Effects 0.000 claims description 5
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 claims description 4
- 239000002574 poison Substances 0.000 claims description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 3
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- CIUQDSCDWFSTQR-UHFFFAOYSA-N [C]1=CC=CC=C1 Chemical compound [C]1=CC=CC=C1 CIUQDSCDWFSTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000004019 antithrombin Substances 0.000 claims description 2
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 2
- HHFAWKCIHAUFRX-UHFFFAOYSA-N ethoxide Chemical compound CC[O-] HHFAWKCIHAUFRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- QUPDWYMUPZLYJZ-UHFFFAOYSA-N ethyl Chemical compound C[CH2] QUPDWYMUPZLYJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000002795 guanidino group Chemical group C(N)(=N)N* 0.000 claims description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 125000001160 methoxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC(*)=O 0.000 claims description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 2
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 claims description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 claims 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 claims 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 claims 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 claims 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 23
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 23
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 abstract description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 abstract description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 abstract description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 abstract description 2
- 125000004183 alkoxy alkyl group Chemical group 0.000 abstract 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 abstract 1
- 150000002431 hydrogen Chemical group 0.000 abstract 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 abstract 1
- 125000002768 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 abstract 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract 1
- 125000005146 naphthylsulfonyl group Chemical group C1(=CC=CC2=CC=CC=C12)S(=O)(=O)* 0.000 abstract 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 87
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 79
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 48
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 38
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 38
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 26
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 26
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 25
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 25
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 23
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 23
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 23
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 23
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 22
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 19
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 15
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Substances C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 13
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 10
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000004213 tert-butoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(O*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 9
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 7
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 6
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 6
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 5
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 5
- JBIJLHTVPXGSAM-UHFFFAOYSA-N 2-naphthylamine Chemical compound C1=CC=CC2=CC(N)=CC=C21 JBIJLHTVPXGSAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 4
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 4
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 4
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 4
- GLNDAGDHSLMOKX-UHFFFAOYSA-N coumarin 120 Chemical compound C1=C(N)C=CC2=C1OC(=O)C=C2C GLNDAGDHSLMOKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 4
- GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N hexamethylphosphoric triamide Chemical compound CN(C)P(=O)(N(C)C)N(C)C GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-N phthalic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical group C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SFKZPTYRENGBTJ-UHFFFAOYSA-N 4-methoxynaphthalen-2-amine Chemical compound C1=CC=C2C(OC)=CC(N)=CC2=C1 SFKZPTYRENGBTJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 150000008574 D-amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 3
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 3
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 3
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 3
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 3
- FANCTJAFZSYTIS-IQUVVAJASA-N (1r,3s,5z)-5-[(2e)-2-[(1r,3as,7ar)-7a-methyl-1-[(2r)-4-(phenylsulfonimidoyl)butan-2-yl]-2,3,3a,5,6,7-hexahydro-1h-inden-4-ylidene]ethylidene]-4-methylidenecyclohexane-1,3-diol Chemical compound C([C@@H](C)[C@@H]1[C@]2(CCCC(/[C@@H]2CC1)=C\C=C\1C([C@@H](O)C[C@H](O)C/1)=C)C)CS(=N)(=O)C1=CC=CC=C1 FANCTJAFZSYTIS-IQUVVAJASA-N 0.000 description 2
- AZZRYXNWFZSSTO-NSHDSACASA-N (2S)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-5-(diaminomethylideneamino)-N-(4-nitrophenyl)pentanamide Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 AZZRYXNWFZSSTO-NSHDSACASA-N 0.000 description 2
- PHDIJLFSKNMCMI-ITGJKDDRSA-N (3R,4S,5R,6R)-6-(hydroxymethyl)-4-(8-quinolin-6-yloxyoctoxy)oxane-2,3,5-triol Chemical compound OC[C@@H]1[C@H]([C@@H]([C@H](C(O1)O)O)OCCCCCCCCOC=1C=C2C=CC=NC2=CC=1)O PHDIJLFSKNMCMI-ITGJKDDRSA-N 0.000 description 2
- QKLXBIHSGMPUQS-FGZHOGPDSA-M (3r,5r)-7-[4-(4-fluorophenyl)-2,5-dimethyl-1-phenylpyrrol-3-yl]-3,5-dihydroxyheptanoate Chemical compound CC1=C(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC([O-])=O)C(C=2C=CC(F)=CC=2)=C(C)N1C1=CC=CC=C1 QKLXBIHSGMPUQS-FGZHOGPDSA-M 0.000 description 2
- PNHBRYIAJCYNDA-VQCQRNETSA-N (4r)-6-[2-[2-ethyl-4-(4-fluorophenyl)-6-phenylpyridin-3-yl]ethyl]-4-hydroxyoxan-2-one Chemical compound C([C@H](O)C1)C(=O)OC1CCC=1C(CC)=NC(C=2C=CC=CC=2)=CC=1C1=CC=C(F)C=C1 PNHBRYIAJCYNDA-VQCQRNETSA-N 0.000 description 2
- QLVGHFBUSGYCCG-UHFFFAOYSA-N 2-amino-n-(1-cyano-2-phenylethyl)acetamide Chemical compound NCC(=O)NC(C#N)CC1=CC=CC=C1 QLVGHFBUSGYCCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OVDGUTHABMXVMI-UHFFFAOYSA-N 3-nitro-4-(propylamino)benzoic acid Chemical compound CCCNC1=CC=C(C(O)=O)C=C1[N+]([O-])=O OVDGUTHABMXVMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 4-toluenesulfonyl chloride Chemical compound CC1=CC=C(S(Cl)(=O)=O)C=C1 YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N D-OH-Asp Natural products OC(=O)C(N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N D-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N D-histidine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N D-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-SCSAIBSYSA-N D-valine Chemical compound CC(C)[C@@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 2
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TZYWCYJVHRLUCT-VABKMULXSA-N N-benzyloxycarbonyl-L-leucyl-L-leucyl-L-leucinal Chemical compound CC(C)C[C@@H](C=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 TZYWCYJVHRLUCT-VABKMULXSA-N 0.000 description 2
- TZCCKCLHNUSAMQ-DUGSHLAESA-N NC(=O)C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H](Cc2ccc(F)cc2)NC(=O)[C@H](Cc3c[nH]c4ccccc34)NC(=O)Cc5cccs5)C(=O)N Chemical compound NC(=O)C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCNC(=N)N)NC(=O)[C@H](Cc2ccc(F)cc2)NC(=O)[C@H](Cc3c[nH]c4ccccc34)NC(=O)Cc5cccs5)C(=O)N TZCCKCLHNUSAMQ-DUGSHLAESA-N 0.000 description 2
- 101100491597 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) arg-6 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 2
- SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N Quinoline Chemical compound N1=CC=CC2=CC=CC=C21 SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940125907 SJ995973 Drugs 0.000 description 2
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 2
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 241000271897 Viperidae Species 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 2
- SRVFFFJZQVENJC-IHRRRGAJSA-N aloxistatin Chemical compound CCOC(=O)[C@H]1O[C@@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCCC(C)C SRVFFFJZQVENJC-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N benzyl bromide Chemical compound BrCC1=CC=CC=C1 AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- OSVHLUXLWQLPIY-KBAYOESNSA-N butyl 2-[(6aR,9R,10aR)-1-hydroxy-9-(hydroxymethyl)-6,6-dimethyl-6a,7,8,9,10,10a-hexahydrobenzo[c]chromen-3-yl]-2-methylpropanoate Chemical compound C(CCC)OC(C(C)(C)C1=CC(=C2[C@H]3[C@H](C(OC2=C1)(C)C)CC[C@H](C3)CO)O)=O OSVHLUXLWQLPIY-KBAYOESNSA-N 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 229920001429 chelating resin Polymers 0.000 description 2
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940125796 compound 3d Drugs 0.000 description 2
- 229940125872 compound 4d Drugs 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- TWYRZWVFWYSNBU-JTQLQIEISA-N l-arg p-nitroanilide Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TWYRZWVFWYSNBU-JTQLQIEISA-N 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- QAPTWHXHEYAIKG-RCOXNQKVSA-N n-[(1r,2s,5r)-5-(tert-butylamino)-2-[(3s)-2-oxo-3-[[6-(trifluoromethyl)quinazolin-4-yl]amino]pyrrolidin-1-yl]cyclohexyl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1C[C@H](NC(C)(C)C)CC[C@@H]1N1C(=O)[C@@H](NC=2C3=CC(=CC=C3N=CN=2)C(F)(F)F)CC1 QAPTWHXHEYAIKG-RCOXNQKVSA-N 0.000 description 2
- XZMHJYWMCRQSSI-UHFFFAOYSA-N n-[5-[2-(3-acetylanilino)-1,3-thiazol-4-yl]-4-methyl-1,3-thiazol-2-yl]benzamide Chemical compound CC(=O)C1=CC=CC(NC=2SC=C(N=2)C2=C(N=C(NC(=O)C=3C=CC=CC=3)S2)C)=C1 XZMHJYWMCRQSSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 2
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 2
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 description 2
- RWWYLEGWBNMMLJ-YSOARWBDSA-N remdesivir Chemical compound NC1=NC=NN2C1=CC=C2[C@]1([C@@H]([C@@H]([C@H](O1)CO[P@](=O)(OC1=CC=CC=C1)N[C@H](C(=O)OCC(CC)CC)C)O)O)C#N RWWYLEGWBNMMLJ-YSOARWBDSA-N 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 2
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- HBENZIXOGRCSQN-VQWWACLZSA-N (1S,2S,6R,14R,15R,16R)-5-(cyclopropylmethyl)-16-[(2S)-2-hydroxy-3,3-dimethylpentan-2-yl]-15-methoxy-13-oxa-5-azahexacyclo[13.2.2.12,8.01,6.02,14.012,20]icosa-8(20),9,11-trien-11-ol Chemical compound N1([C@@H]2CC=3C4=C(C(=CC=3)O)O[C@H]3[C@@]5(OC)CC[C@@]2([C@@]43CC1)C[C@@H]5[C@](C)(O)C(C)(C)CC)CC1CC1 HBENZIXOGRCSQN-VQWWACLZSA-N 0.000 description 1
- WAMWSIDTKSNDCU-SSDOTTSWSA-N (2r)-2-azaniumyl-2-cyclohexylacetate Chemical compound OC(=O)[C@H](N)C1CCCCC1 WAMWSIDTKSNDCU-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- ORQXBVXKBGUSBA-MRVPVSSYSA-N (2r)-2-azaniumyl-3-cyclohexylpropanoate Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CC1CCCCC1 ORQXBVXKBGUSBA-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- AKVBCGQVQXPRLD-SSDOTTSWSA-N (2r)-2-azaniumyloctanoate Chemical compound CCCCCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O AKVBCGQVQXPRLD-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- FMCAFXHLMUOIGG-IWFBPKFRSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2r)-2-formamido-3-sulfanylpropanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxy-2,5-dimethylphenyl)propanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoic acid Chemical compound O=CN[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O)CC1=CC(C)=C(O)C=C1C FMCAFXHLMUOIGG-IWFBPKFRSA-N 0.000 description 1
- HUGAWXCWXHSPBW-RRQHEKLDSA-N (2s)-2-amino-3-(4-hydroxycyclohexyl)propanoic acid Chemical group OC(=O)[C@@H](N)CC1CCC(O)CC1 HUGAWXCWXHSPBW-RRQHEKLDSA-N 0.000 description 1
- TVENQUPLPBPLGU-NRFANRHFSA-N (4-nitrophenyl) (2s)-3-phenyl-2-(phenylmethoxycarbonylamino)propanoate Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1OC(=O)[C@@H](NC(=O)OCC=1C=CC=CC=1)CC1=CC=CC=C1 TVENQUPLPBPLGU-NRFANRHFSA-N 0.000 description 1
- QOLHWXNSCZGWHK-BWBORTOCSA-N (6r,7r)-1-[(4s,5r)-4-acetyloxy-5-methyl-3-methylidene-6-phenylhexyl]-4,7-dihydroxy-6-(11-phenoxyundecylcarbamoyloxy)-2,8-dioxabicyclo[3.2.1]octane-3,4,5-tricarboxylic acid Chemical compound C([C@@H](C)[C@H](OC(C)=O)C(=C)CCC12[C@@H]([C@@H](OC(=O)NCCCCCCCCCCCOC=3C=CC=CC=3)C(O1)(C(O)=O)C(O)(C(O2)C(O)=O)C(O)=O)O)C1=CC=CC=C1 QOLHWXNSCZGWHK-BWBORTOCSA-N 0.000 description 1
- JNPGUXGVLNJQSQ-BGGMYYEUSA-M (e,3r,5s)-7-[4-(4-fluorophenyl)-1,2-di(propan-2-yl)pyrrol-3-yl]-3,5-dihydroxyhept-6-enoate Chemical compound CC(C)N1C(C(C)C)=C(\C=C\[C@@H](O)C[C@@H](O)CC([O-])=O)C(C=2C=CC(F)=CC=2)=C1 JNPGUXGVLNJQSQ-BGGMYYEUSA-M 0.000 description 1
- GFNKTLQTQSALEJ-UHFFFAOYSA-N 1-isocyanato-4-nitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(N=C=O)C=C1 GFNKTLQTQSALEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NOGFHTGYPKWWRX-UHFFFAOYSA-N 2,2,6,6-tetramethyloxan-4-one Chemical compound CC1(C)CC(=O)CC(C)(C)O1 NOGFHTGYPKWWRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JGMXNNSYEFOBHQ-OWOJBTEDSA-N 2-[(e)-4-morpholin-4-ylbut-2-enyl]-1,1-dioxothieno[3,2-e]thiazine-6-sulfonamide Chemical compound O=S1(=O)C=2SC(S(=O)(=O)N)=CC=2C=CN1C\C=C\CN1CCOCC1 JGMXNNSYEFOBHQ-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- IKCLCGXPQILATA-UHFFFAOYSA-N 2-chlorobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1Cl IKCLCGXPQILATA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropyl carbonochloridate Chemical compound CC(C)COC(Cl)=O YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HIHOEGPXVVKJPP-JTQLQIEISA-N 5-fluoro-2-[[(1s)-1-(5-fluoropyridin-2-yl)ethyl]amino]-6-[(5-methyl-1h-pyrazol-3-yl)amino]pyridine-3-carbonitrile Chemical compound N([C@@H](C)C=1N=CC(F)=CC=1)C(C(=CC=1F)C#N)=NC=1NC=1C=C(C)NN=1 HIHOEGPXVVKJPP-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 208000000412 Avitaminosis Diseases 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- CYSWUSAYJNCAKA-FYJFLYSWSA-N ClC1=C(C=CC=2N=C(SC=21)OCC)OC1=CC=C(C=N1)/C=C/[C@H](C)NC(C)=O Chemical compound ClC1=C(C=CC=2N=C(SC=21)OCC)OC1=CC=C(C=N1)/C=C/[C@H](C)NC(C)=O CYSWUSAYJNCAKA-FYJFLYSWSA-N 0.000 description 1
- 229940126559 Compound 4e Drugs 0.000 description 1
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYIFNHCXNCRBQI-SCSAIBSYSA-N D-2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-SCSAIBSYSA-N D-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-RFZPGFLSSA-N D-Isoleucine Chemical group CC[C@@H](C)[C@@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-RFZPGFLSSA-N 0.000 description 1
- LESXFEZIFXFIQR-ZCFIWIBFSA-N D-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O LESXFEZIFXFIQR-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWCKQJZIFLGMSD-GSVOUGTGSA-N D-alpha-aminobutyric acid Chemical group CC[C@@H](N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-SSDOTTSWSA-N D-alpha-phenylglycine Chemical group OC(=O)[C@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 229930182847 D-glutamic acid Natural products 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N D-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 125000004077 D-glutamic acid group Chemical group [H]N([H])[C@@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])=O 0.000 description 1
- 229930195721 D-histidine Natural products 0.000 description 1
- 229930182819 D-leucine Natural products 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-RXMQYKEDSA-N D-leucine Chemical compound CC(C)C[C@@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 125000003301 D-leucyl group Chemical group N[C@@H](C(=O)*)CC(C)C 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-RXMQYKEDSA-N D-norleucine Chemical group CCCC[C@@H](N)C(O)=O LRQKBLKVPFOOQJ-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- 229930182832 D-phenylalanine Natural products 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-STHAYSLISA-N D-threonine Chemical compound C[C@H](O)[C@@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-STHAYSLISA-N 0.000 description 1
- 229930182822 D-threonine Natural products 0.000 description 1
- 125000000197 D-threonyl group Chemical group N[C@@H](C(=O)*)[C@H](C)O 0.000 description 1
- 229930182831 D-valine Natural products 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 108010029144 Factor IIa Proteins 0.000 description 1
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 1
- 108010074864 Factor XI Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010021135 Hypovitaminosis Diseases 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- QWCKQJZIFLGMSD-VKHMYHEASA-N L-alpha-aminobutyric acid Chemical group CC[C@H](N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710131583 Trypsin-10 Proteins 0.000 description 1
- 229910052770 Uranium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 125000004106 butoxy group Chemical group [*]OC([H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 150000008049 diazo compounds Chemical class 0.000 description 1
- DOBMPNYZJYQDGZ-UHFFFAOYSA-N dicoumarol Chemical compound C1=CC=CC2=C1OC(=O)C(CC=1C(OC3=CC=CC=C3C=1O)=O)=C2O DOBMPNYZJYQDGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001912 dicoumarol Drugs 0.000 description 1
- HIZKPJUTKKJDGA-UHFFFAOYSA-N dicumarol Natural products O=C1OC2=CC=CC=C2C(=O)C1CC1C(=O)C2=CC=CC=C2OC1=O HIZKPJUTKKJDGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004678 hydrides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- OJURWUUOVGOHJZ-UHFFFAOYSA-N methyl 2-[(2-acetyloxyphenyl)methyl-[2-[(2-acetyloxyphenyl)methyl-(2-methoxy-2-oxoethyl)amino]ethyl]amino]acetate Chemical compound C=1C=CC=C(OC(C)=O)C=1CN(CC(=O)OC)CCN(CC(=O)OC)CC1=CC=CC=C1OC(C)=O OJURWUUOVGOHJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVOISEJVFFIGQE-YCZSINBZSA-N n-[(1r,2s,5r)-5-[methyl(propan-2-yl)amino]-2-[(3s)-2-oxo-3-[[6-(trifluoromethyl)quinazolin-4-yl]amino]pyrrolidin-1-yl]cyclohexyl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1C[C@H](N(C)C(C)C)CC[C@@H]1N1C(=O)[C@@H](NC=2C3=CC(=CC=C3N=CN=2)C(F)(F)F)CC1 GVOISEJVFFIGQE-YCZSINBZSA-N 0.000 description 1
- 238000006396 nitration reaction Methods 0.000 description 1
- VFXVAXFIFHSGNR-UHFFFAOYSA-N octyl carbonochloridate Chemical compound CCCCCCCCOC(Cl)=O VFXVAXFIFHSGNR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001820 oxy group Chemical group [*:1]O[*:2] 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- XMIAFAKRAAMSGX-UHFFFAOYSA-N quinolin-5-amine Chemical compound C1=CC=C2C(N)=CC=CC2=N1 XMIAFAKRAAMSGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- XYGBKMMCQDZQOZ-UHFFFAOYSA-M sodium;4-hydroxybutanoate Chemical compound [Na+].OCCCC([O-])=O XYGBKMMCQDZQOZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- XTHPWXDJESJLNJ-UHFFFAOYSA-N sulfurochloridic acid Chemical compound OS(Cl)(=O)=O XTHPWXDJESJLNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000007070 tosylation reaction Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- DNYWZCXLKNTFFI-UHFFFAOYSA-N uranium Chemical compound [U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U][U] DNYWZCXLKNTFFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 1
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 1
- 208000030401 vitamin deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0819—Tripeptides with the first amino acid being acidic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/10—Tetrapeptides
- C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
- C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
- C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
- C12Q2337/10—Anilides
- C12Q2337/12—Para-Nitroanilides p-NA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
- C12Q2337/20—Coumarin derivatives
- C12Q2337/22—7-Amino-4-methylcoumarin, i.e. AMC, MCA
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
- G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
- G01N2333/96444—Factor X (3.4.21.6)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/81—Packaged device or kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/802—Chromogenic or luminescent peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/28—Bound to a nonpeptide drug, nonpeptide label, nonpeptide carrier, or a nonpeptide resin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
- Y10T436/106664—Blood serum or blood plasma standard or control
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
- Y10T436/108331—Preservative, buffer, anticoagulant or diluent
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
- Y10T436/109163—Inorganic standards or controls
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
i
DK 154221 B
Den foreliggende opfindelse angår tripeptidderivater, som meget let spaltes med visse enzymer af enzymklassen 3.4.21, især faktor Xa. De hidtil ukendte tripeptidderivater er derfor beregnet til anvendelse som substrater til kvantitativ analyse af sådanne enzymer, især faktor Xa.
5 Faktor Xa er et proteolytisk enzym, som dannes ved blodkoagule ringskaskaden ved aktivering af proenzymfaktoren X, og som sammen med phospholipid og calciumioner proteolytisk spalter faktor II (prothrombin) to steder i peptidkæden og omdanner denne faktor til faktor Ila (thrombin), som til slut forårsager koagulering. Ved visse 10 patologiske sygdomme, f.eks. leversygdomme og vitaminmangel, og ved dicumarolterapi, er dannelsen af faktor X reduceret. Ved nedarvede forstyrrelser i syntesen af faktor X er dannelsen af faktor Xa naturligvis også reduceret tilsvarende. Det er derfor vigtigt at have en direkte enzymatisk analysemetode til rådighed, som muliggør foto-15 metrisk analyse af faktor Xa i blodplasma på en simpel og nøjagtig måde.
De vigtigste metoder til analyse af faktor Xa er følgende: a) Den biologiske analysemetode (jfr. "Thrombosis and Bleeding Disorders", Nils U. Bang, Georg Thieme Verlag, side 196 (1971)): 20 Faktor X aktiveres til faktor Xa ved hjælp af gift fra Russel-hugorme og calciumioner. Ved en ét-trinsoperation aktiveres prothrombin til thrombin af faktor Xa i nærværelse af faktor V og phospholipider, og thrombin omdanner indikatorfibrinogen til fibrin. Koaguleringstiden måles. De nødvendige faktorer II og V og fibrinogen fås fra et 25 substrat, som ikke indeholder faktor X. Koaguleringstiden påvirkes af faktor X's aktiveringsgrad. Aktiveringsgraden er, under i øvrigt konstante betingelser, en funktion af koncentrationen af faktor X i prøven. Denne biologiske metode tillader kun en grov analyse, da koaguleringstiden aflæses subjektivt af laboranten. Ydermere skal der 30 anvendes behandlet plasma under fremstillingen, hvorfor fejl kan optræde. Desuden dannes det fibrinogen, som virker som indikator, ikke direkte, men via aktiveret thrombin (indirekte metode).
DK 154221 B
2 b) Biokemisk metode (j'fr. "Thrombosis and Bleeding Disorders", Niels U. Bang, Georg Thieme Verlag, side 196/197 (1971)): Hvis de faktor X-præparater, der skal testes, er tilstrækkeligt rene, kan der anvendes en mere nøjagtig analysemetode. Esnouf og Williams (1962) har 5 vist, at faktor Xa har en esteraseaktivitet og derfor spalter syntetiske aminosyreestere. Der er til denne analyse imidlertid behov for 50 - 100 yg faktor X. På den anden side kan lave koncentrationer af faktor Xa bestemmes ved at anvende benzyloxycarbonyl-phenylalanin-p-nitrophenylester og måle den frigjorte mængde af p-nitrophenol/-10 tidsenhed. Denne analysemetode har følgende ulemper: Den anvendte ester undergår autohydrolyse ved den anvendte pH-værdi på 8, og den er desuden ikke specifik for faktor Xa, da den også reagerer på mange andre enzymer. Esteren er ikke opløselig i vand, hvorfor der skal anvendes acetone. På grund af alle disse ulemper er denne 15 analysemetode unøjagtig og kostbar.
c) I dansk patentskrift nr. 145.461 B er beskrevet tri- og tetrapep-tidderivater, som er bestemt til anvendelse som substrater til analyse af visse enzymer, f.eks. faktor Xa. Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA.HCI er angivet som eksempel på et tetrapeptidderivat, som spaltes af faktor 20 Xa under dannelse af p-nitroanilin. Dannelsen af p-nitroanilin kan følges spektrofotometrisk. Denne metode til analyse af faktor Xa er noget mere nøjagtig end de ovenfor beskrevne biologiske og biokemiske analysemetoder.
De i det nævnte danske patentskrift beskrevne tri- og tetrapeptrd-25 derivater er imidlertid ikke tilstrækkeligt opløselige i vandige medier til at muliggøre analyse af faktor Xa under optimale betingelser, dvs. ved substratmætning. I det tilfælde, hvor der skal bestemmes ekstremt lave koncentrationer af faktor Xa, f.eks. i patologisk plasma, er de nævnte peptidderivater ikke tilstrækkeligt følsomme til, at man 30 kan opnå rimeligt nøjagtige måleværdier. Hvis den mængde faktor Xa, der skal måles, forøgedes ved tilsætning af en yderligere plasmamængde, ville tetrapeptidsubstratet blive udfældet under indflydelsen af plasmaproteiner, hvorfor det ville være umuligt at udføre enzymanalysen .
DK 154221 B
3
Der er nu fundet hidtil ukendte tripeptidderivater, som er meget let opløselige i vandige medier, og som har en overraskende høj sensitivitet over for faktor Xa.
De omhandlede tripeptidderivater har den almene formel I
5 0 0
R1 - D - NH - CH - C - N - CH - (? - Arg - R5 I
fR1 R3 R4 hvor R1 betegner en alkanoylgruppe med 2-4 carbonatomer, en phenylalkanoylgruppe med 2-4 carbonatomer i alkanoyldelen, og hvis 10 phenylradikal kan være substitueret med en aminogruppe i p-stillin-gen, en cyclohexylcarbonylgruppe, en benzoylgruppe, som kan være substitueret med methyl eller halogen såsom chlor eller brom i o- eller p-stillingen, en alkoxycarbonylgruppe med 1 - 8 carbonatomer i alkoxydelen, en benzyloxycarbonylgruppe, som kan være substitueret 15 med methoxy, methyl eller chlor i p-stillingen, en alkylsulfonylgruppe med 1 - 4 carbonatomer, en phenylsulfonylgruppe, der kan være methyleret i p-stillingen, eller en <x- eller β-naphthylsulfonylgruppe, R1 betegner et ligekædet ejler forgrenet alkylradikal med 2-6, fortrinsvis 2-4, carbonatomer, et 1-hydroxyethylradikal, et 1-alk-20 oxyethyl radikal med 1 - 4 carbonatomer i alkoxydelen, et 1-benzyl- oxyethylradikal, et ω-carboxyalkyl-eller ω-alkoxycarbonylal kyl radikal med 1-3 carbonatomer i alkyldelen, og hvis alkoxygruppe er ligekædet eller forgrenet og indeholder 1-4 carbonatomer, et w-benzyl-oxycarbonylalkylradikal med 1-3 carbonatomer i alkyldelen eller et 25 cyclohexyl-, cyclohexyimethyl-, 4-hydroxycycl9hexylmethyl-, phenyl-, benzyl-, 4-hydroxybenzyl- eller imidazol-4-yl-methylradikal, R3 betegner hydrogen eller et ligekædet eller forgrenet alkylradikal med 1 - 4 carbonatomer, R4 betegner hydrogen eller et methyl- eller ethylradikal, og 30 R5 betegner p-nitrophenyJamino, β-naphthylamino, 4-methoxy-p-naph-thylamino, 5-nitro-o-naphthylamjno, quinon-5-yl-amino, 8-nitro-qui-non-5-yl-amino, 4-methyl-cumar-7-yl-amino eller 1,3-di(.methoxycar- bonyl)phen-5-yl-amino (afledt af 5-amino-isophthalsyre-dimethylester),
1 2 bortset fra tripeptidderivater, hvori R er benzyloxycarbonyl, og R
35 er isopropyl eller cyclohexyl, eller er salte deraf.
DK 154221 B
4
Den stærkt basiske guanidinogruppe i arginin er fortrinsvis stabiliseret, f.eks. ved protonering med en mineralsyre såsom HCI, HBr, H2S0* eller Η3ΡΟ* eller en organisk syre såsom myresyre, eddikesyre, propionsyre, mælkesyre, citronsyre, oxalsyre, vinsyre, ben-5 zoesyre, phthalsyre, trichloreddikesyre eller trifluoreddikesyre. Protoneringens art har ingen indflydelse på tri peptidsubstratets følsomhed (susceptibilitet) over for enzymerne.
Tripeptidderivaterne med formlen I kan fremstilles ved i og for sig kendte metoder som nedenfor beskrevet: 10 1) Den chromogene gruppe R5 er knyttet til carboxygruppen i det C-terminale arginin, medens dens o-aminogruppe er beskyttet af en beskyttelsesgruppe, f.eks. en benzyloxycarbonyl- eller tert.buto-xycarbonylgruppe, og δ-guanidylgruppen i arginin er beskyttet ved protonering, f.eks. med HCI, nitrering eller tosylering. Den C-ter-15 minale gruppe R5- tjener altså som beskyttelsesgruppe under den trinsvise opbygning af peptidkæden. De resterende beskyttelsesgrupper kan fjernes selektivt efter behov for at knytte de næste aminosyrederivater til, indtil den ønskede peptidkæde er helt opbygget. Til slut kan de resterende beskyttelsesgrupper fjernes helt, 20 uden at gruppen R5- påvirkes (jfr. f.eks. Miklos Bodansky et al., "Peptide Synthesis", Interscience Publishers, side 163 - 165, 1966). 1 Først og fremmest opbygges peptidkæden (iflg. Bodansky, Ioc. cit.), medens den C-terminale carboxygruppe i arginin beskyttes med en sædvanlig estergruppe, f.eks. en methoxy-, ethoxy- eller ben-25 zyloxygruppe. Estergrupperne kan fjernes ved basisk hydrolyse, bortset, fra den tert.butoxygruppe, som skal fjernes selektivt ved hjælp af trifluoreddikesyre. Hvis δ-guanidylgruppen i arginin er protoneret, kan denne estergruppe fjernes med trypsin, og der foregår ingen racemisering i dette tilfælde. Derefter indføres den 30 chromogene gruppe R5-. Hvis δ-guanidinogruppen i arginin er beskyttet med en nitro- eller tosylgruppe, og den N-terminale a-ami-nogruppe i tripeptidderivatet er beskyttet med en benzyloxycarbo-nylgruppe eller en p-methyl-, p-methoxy- eller p-chlor-benzyloxy-carbonylgruppe eller med en tert.butoxygruppe, kan alle disse be-
DK 154221 B
5 skyttelsesgrupper fjernes simultant. Fjernelsen kan foretages ved at behandle det beskyttede tripeptidderivat med vandfrit HF ved stuetemperatur, hvorved alle de ovenfor anførte amino- og 6-guanidino-beskyttelsesgrupper fjernes. Fjernelsen kan også udføres ved be-5 handling med 2N HBr i iseddike ved stuetemperatur, hvis det beskyttede tripeptidderivat ikke indeholder nitro eller tosyl som beskyttelsesgrupper.
Tripeptidderivaterne med formlen I er betydeligt lettere opløselige i vand end de i dansk patentskrift nr. 145.461 B beskrevne tetrapep-10 tidderivater og tillader således, at enzymanalyser udføres ved en substratmætning, der er nødvendig til opnåelse af pålidelige måleresultater. Desuden er tripeptidsubstraterne med formlen I signifikant mere følsomme end de i det danske patentskrift beskrevne tetrapep-tidderivater, og de kan derfor også anvendes til analyse af ekstremt 15 lave koncentrationer af faktor Xa.
I offentliggjort hollandsk patentansøgning nr. 76 07 433 er der beskrevet tripeptidderivater med den almene formel
H-D-A1-A2-A3-NH-R
(hvor Αχ, A2 og A3 er aminosyreradikaler), som er meget følsomme 20 over for enzymer af enzymklassen E.C. 3.4.21, f.eks. thrombin og plasmin. Denne høje følsomhed skyldes det forhold, at den N-terminale D-aminosyre har en usubstitueret o-aminogruppe. Hvis o-aminogrup-pen i den N-terminale D-aminosyre er substitueret, dvs. hvis hydrogen i formlen er erstattet med en beskyttelsesgruppe eller en bloke-25 rende gruppe, f.eks. med benzoyl eller benzyloxycarbonyI, reduceres tripeptidderivatets følsomhed over for enzymer af enzymklassen 3.4.21 drastisk. På grund heraf kunne det ventes, at de hidtil ukendte tripeptidderivater med formlen I, hvor a-aminogruppen i den N-terminale D-aminosyre bærer en beskyttelsesgruppe eller en blokerende 30 gruppe, ikke ville eller kun vanskeligt ville blive spaltet af enzymer af enzymklassen 3.4.21. I modsætning til alle forventninger har de hidtil ukendte tripeptidderivater imidlertid overraskende nok meget høj følsomhed over for faktor Xa.
DK 154221 B
6
En yderligere fordel ved de omhandlede tripeptidderivater i forhold til de tetrapeptidderivater, som er beskrevet i dansk patentskrift nr.
145.461 B, er, at syntesen deraf er lettere og billigere.
De omhandlede tripeptidderivater kan anvendes til kvantativ analyse 5 af visse enzymer af enzymklassen E.C. 3.4.21 (jfr. "Enzyme Nomenclature", Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam, 1973, side 238 ff), f.eks. faktor Xa i blodplasma, og via faktor Xa tillige til kvantitativ analyse af andre biologisk vigtige faktorer, f.eks. faktor X (proenzym for faktor Xa), antifaktor Xa (= antithrombin III eller 10 heparin-cofaktor) eller heparin i blodplasma.
Opfindelsen angår derfor endvidere en fremgangsmåde til kvantitativt at analysere faktor Xa i et medium, der indeholder faktor Xa, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at mediet omsættes med et salt af et tripeptidderivat med formlen I, og at der udføres fotometrisk, 15 s pekt rofotometri sk, fluorescens-spektrofotometrisk eller elektrokemisk måling til bestemmelse af mængden af det farvede eller fluorescerende spaltningsprodukt H-R , som frigøres pr. tidsenhed ved den katalytisk hydrolytiske indvirkning af faktor Xa på tripeptidderivatet. Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til kvantitativt at analysere 20 faktor X i blodplasma, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at blodplasma fra mennesker eller varmblodede dyr behandles med en aktivator for kvantitativt at omdanne faktor X til faktor Xa, hvorefter det aktiverede plasma omsættes med et salt af et tripeptidderivat med 5 formlen I i et puffersystem, og den mængde spaltningsprodukt H-R , 25 der pr. tidsenhed frigøres ved indvirkning af faktor Xa på tripeptidderivatet, bestemmes. Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til kvantitativ analyse af heparin i hepariniseret blodplasma via heparin-antithrombin-lll-complexet, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at en mængde af faktor Xa, som overstiger den mængde af 30 faktor Xa, som skal neutraliseres af det heparin-antithrombin-lll-com-plex, der forekommer i det i testsystemet anvendte plasma, inkuberes med blodplasma, vundet fra en patient i heparinbehandling, i et puffersystem, den mængde af faktor Xa, som ikke er neutraliseret af heparin-antithrombin-lll-complexet i plasmaet, måles ved at omsætte 35 denne med et salt af et tripeptidderivat med formlen I og bestemme 5
DK 154221 B
7 den mængde spaltningsprodukt H-R , som frigøres pr. tidsenhed ved indvirkning af ikke-neutraliseret faktor Xa, og heparinniveauet beregnes ud fra forskellen mellem den overskydende mængde af den i starten værende faktor Xa og mængden af den ikke-neutraliserede 5 faktor Xa. Endelig angår opfindelsen en fremgangsmåde til kvantitativ analyse af antifaktor Xa i humant blodplasma, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der dels fremstilles en testprøve ved fortynding af citreret humant plasma med en pufferopløsning, tilsætning af heparin og derefter en bestemt mængde faktor Xa til den fortyndede 10 opløsning, dels fremstilles en blindprøve på samme måde, men under anvendelse af samme volumetriske mængde puffer i stedet for fortyndet plasma, hvorefter begge prøver omsættes med et salt af et tripep-tidderivat med formlen I, og forøgelsen i optisk densitet/tidsenhed foråsaget af dannelsen af spaltningsprodukt H-R og derudfra mæng-15 den af faktor Xa bestemmes, hvorpå mængden af antifaktor Xa i plasmaet beregnes ud fra forskellen mellem faktor Xa-mængden i blindprøven og testprøven.
Disse forskellige analyser kan udføres som nedenfor beskrevet: 1) Analyse af faktor Xa og faktor X: 20 Citreret humant plasma anvendes og aktiveres først med Russel hugorme-gift (RW = Russel hugormegift) for at omdanne i plasmaet tilstedeværende faktor X til faktor Xa. Der anvendes følgende reagenser:
Puffer: TRIS-lmidazolpuffer, pH-værdi 8,4, ionstyrke 0,3; 25 RW: Frysetørret Russel-hugormegiftpræparat (fra Laboratoire
Stago, 92600 Asniéres s/Seine, Frankrig) opløst i 2 ml puffer indeholdende CaCI2 ved en koncentration på 0,015 M.
Substrat - Cbo-D-Leu-Sar-Arg-pNA. AcOH, opløst i destilleret 30 vand, koncentration: 2 x 10 3 M.
I en testcuvette hældes 0,2 ml RW-reagens opvarmet til 37°C og derefter 0,02 ml humant citreret plasma. De to komponenter blandes øjeblikkelig og inkuberes derefter i 60 sek. ved 37°C. Den resul-
DK 154221 B
8 terende aktiveringsblanding fortyndes med 1,6 ml puffer, der er opvarmet til 37°C, og blandes med 0,2 ml 2 x 10 3 M substratopløsning. Derefter måles den ændring i optisk densitet i blandingen, der forårsages af det frigjorte p-nitroanilin, spektrofotometrisk ved en 5 bølgelængde på 405 nm. Den målte forøgelse af den optiske densi-tet/minut er direkte proportional med mængden af tilstedeværende faktor Xa i det aktiverede plasma. Den målte forøgelse af den optiske densitet/minut er også et mål for mængden af faktor X i udgangsplasmaet, da en given mængde faktor X som et resultat af aktiveringen 10 omdannes støkiometrisk til den tilsvarende mængde faktor Xa.
2) Analyse af antifaktor Xa:
En testprøve fremstilles ved at fortynde citreret humant plasma med TRIS-imidazolpuffer i et forhold på 1:10. 100 yl af en heparinopløs-ning i TRIS-imidazolpuffer (indeholdende 3 USP-enheder heparin/ml 15 puffer) sættes til 100 yl af det fortyndede plasma, og blandingen inkuberes i 2 minutter ved 37°C. 100 yl af en opløsning af faktor Xa-præparat "Diagen" (fra Diagnostic Reagents, Thame, Storbritannien) indeholdende 8,5 enheder faktor Xa/ml sættes til inkubatet. Blandingen inkuberes i 3 minutter ved 37°C. Inkubatet fortyndes med 20 0,6 ml TRIS-imidazolpuffer, der er opvarmet til 37°C, og blandes øjeblikkelig med 100 yl af en 2 x 10 3 M opløsning af Cbo-D-Leu-Sar-Arg-pNa.AcOH (substrat) i destilleret vand, der er opvarmet til 37°C.
I et parallelforsøg fremstilles en blind-testprøve på samme måde, men 25 under anvendelse af samme volumenmængder puffer i stedet for fortyndet plasma.
Forøgelsen i den optiske densitet ved 405 nm måles spektrofotometrisk i begge prøver (testprøve og blind-prøve). Forskellen mellem forøgelsen i den optiske densitet i blind-prøven/minut (AOD ^j^^/minut) og 30 forøgelsen i den optiske densitet i testprøven/minut (AOD ,^^/minut) er et mål for den mængde faktor Xa, der inhiberes af antifaktor Xa-heparincomplexet, og således et mål for den mængde antifaktor Xa (= antithrombin III), der er i plasmaet.
DK 154221 B
9 3) Analyse af heparin i blodplasma:
En testprøve fremstilles ved at fortynde plasma fra en heparinbe-handlet patient med TRIS-imidazolpuffer i et forhold på 1:10. Det fortyndede plasma inkuberes i 1 - 2 minutter ved 37°C. 100 μΙ af en 5 opløsning af faktor Xa-præparat "Diagen" (fra Diagnostic Reagents,
Thame, Storbritannien) indeholdende 8,5 enheder faktor Xa/ml sættes til 200 vi af inkubatet, og blandingen inkuberes i 3 minutter ved 37°C. Inkubatet fortyndes med 0,6 ml TRIS-imidazolpuffer, der er opvarmet til 37°C, og blandes øjeblikkeligt med 100 μ! af en 2 x 10 3 10 M opløsning af Cbo-D-Leu-Sar-Arg-pNA.AcOH (substrat) i destilleret vand.
I et parallelforsøg fremstilles en blind-testprøve på samme måde, men under anvendelse af samme mængde, på tilsvarende måde fortyndet normalt plasma (heparinfrit) i stedet for det fortyndede heparinise-15 rede plasma.
Forøgelsen af den optiske densitet/minut ved 405 nm måles spektro-fotometrisk i begge prøver. Forskellen mellem forøgelsen i den optiske densitet i blind-prøven/minut (AOD ^j^j/minut) og forøgelsen i den optiske densitet i testprøven/minut (AOD ^^/minut) er et mål for den 20 inhiberende virkning af heparin bundet til heparin-cofaktoren (anti-thrombin III).
Antifaktor Xa (= heparin-cofaktor eller antithrombin III) alene inhi-berer faktor Xa, men langsomt, så at kun små mængder faktor Xa inhiberes inden for en kort in kuberingsperiode (f.eks. 3 minutter).
25 Hvis antifaktor Xa imidlertid kommer i kontakt med heparin, danner de to komponenter et complex, som er en hurtig inhibitor for faktor Xa, og som helt vil blive kombineret med faktor Xa inden for en kort inkuberingstid (f.eks. 3 minutter).
Da inhiberingen af faktor Xa er proportional med den tilstedeværende 30 mængde heparin, når der blot er en tilstrækkelig mængde antifaktor Xa til stede, kan mængden af heparin i patientens plasma bestemmes ved hjælp af en kalibreringskurve, der opstilles med normalt plasma og stigende mængder tilsat heparin, på grundlag af den forstærkende virkning af det tilsatte heparin.
DK 154221 B
10
Ved målingen af mængden af farvet spaltningsprodukt H - R5 (p-ni-troanilin), som frigøres ved omsætning mellem faktor Xa og tripep-tidderivater (-substrater) ifølge opfindelsen, udnyttes det forhold, at spaltningsproduktet har et UV-spektrum, som er forskelligt fra sub-5 stratets, og som forskydes mod højere bølgelængder. Substraterne ifølge opfindelsen har et absorptionsmaksimum på ca. 310 nm og en molær ekstinktionskoefficient på ca. 13.000. Absorptionen af substratet ved 405 nm er stort set 0. Spaltningsproduktet H - R5, dvs. p-nitroanilin, der dannes ved enzymatisk hydrolyse af substratet, har 10 et absorptionsmaksimum ved 380 nm og en molær ekstinktionskoefficient på ca. 13.200. Ved 405 nm er ekstinktionskoefficienten kun moderat reduceret, dvs. til ca. 10.400.
I tilfælde af substrater, som indeholder en β-naphthylamino-, 4-meth-oxy-p-naphthylamino-, cumar-7-yl-amino- eller isophthalylaminogruppe 15 som den chromogene gruppe, måles mængden af spaltningsprodukt H -R5, der frigøres af faktor Xa, ved fluorescens-spektrofotometri. I et testsystem omfattende faktor Xa, puffer og substrat måles det energifattigere udsendte lys kontinuert ved 400 - 470 nm, efter at det fluorescerende spaltningsprodukt er blevet kontinuert påvirket af 20 energirigere lys ved 300 - 400 nm. Den mængde spaltningsprodukt, der dannes pr. tidsenhed, er et mål for den eksisterende faktor Xa-aktivitet. Ifølge definitionen svarer 1 ymol spaltningsprodukt dannet pr. minut til 1 enzymenhed faktor Xa baseret på et givet substrat.
25 De ovenfor beskrevne analysemetoders følsomhed kan yderligere forøges ved at omdanne spaltningsproduktet H - R5, før måling af mængden deraf, til en mere intenst farvet forbindelse ved kobling med en diazoforbindelse i de tilfælde, hvor R5 er en p-nitrophenyl-amino-, 5-nitro-o-naphthylamino- eller 8-nitro-quinon-5-yl-amino-30 gruppe.
Fremstillingen af tripeptidderivaterne ifølge opfindelsen beskrives nærmere i nedenstående eksempler:
DK 154221 B
11
Analysen af eluaterne og de produkter, der fås ifølge eksemplerne, udføres ved tyndtlagschromatografi under anvendelse af glasplader, der er overtrukket med siliciumdioxidgel (Merck, F 254). Tyndtlags-chromatogrammerne fremkaldes ved hjælp af følgende opløsningssy-5 stem: n-butanol/eddikesyre/vand i forholdet 3:1:1.
Der anvendes følgende forkortelser: D-Aadi = D-a-amino-adipinsyre,
AcOH = eddikesyre,
Ala = L-alanin, 10 AOA = D-a-amino-octansyre.
Arg = L-arginin, D-Asp = D-asparaginsyre, BOC = tert.butoxycarbonyl,
Bu = butyl, 15 But = L-2-aminosmørsyre, D-But = D-2-aminosmørsyre,
Bz = benzoyl,
Bzl = benzyl,
Bz20 = benzoesyre-anhydrid, 20 ChA = quinonyl-amid, D-CHA = D-3-cyclohexylalanin, D-CHG = D-2-cyclohexylglycin, D-CHT = D-3-(4-hydroxycyclohexyl)alanin = hexahydrotyrosin,
Cbo = benzyloxycarbonyl, 25 DPA = dimethylesteren af 5-amido-isophthalsyre, TLC = tyndtlagschromatografi eller tyndtlagschromatogram,
Et = ethyl,
Et3N = triethylamin,
Gly = glycin, 30 D-Glu = D-glutaminsyre, D-His = D-histidin, HMPTA = N,N,N',N',N",N"-hexylmethyl-phosphorsyre-triamid, D-lle = D-isoleucin,
DK 154221 B
12 D-Leu = D-Ieucin, MCA = 7-amido-4-methylcumarin,
Me = methyl,
MeO = methoxy, 5 ΝΑ = naphthylamid, D-Nleu = D-norleucin, D-Nval = D-norvalin,
OtBu = tert.butoxy,
OpNP = p-nitrophenoxy, 10 pNA - p-nitroanilid,
Pr = propyl, D-Ph'Gly = D-2-phenylglycin, D-Phe “ D-phenylalanin,
Sar = sarkosin = N-methylglycin, 15 THF = tetrahydrofuran, D-Thr = D-threonin,
Tos = p-toluensulfonyl, D-Val = D-valin.
Hvis intet andet er angivet, har aminosyrerne L-form.
20 Eksempel 1.
Cbo-D-Leu-Gly-Arg-pNa. HBr. la. Cbo-Arg-pNA.HCI.
I en 250 ml tre-halset kolbe opløses 16,0 g (47 millimol) Cbo-Arg-OH.HCI, som er blevet tørret i vakuum over ^2^5' 1 ^ aksolut 25 HMPTA ved 20°C under udelukkelse af fugtighed. Til den resulterende opløsning sættes ved stuetemperatur først en opløsning af 4,74 g (47,0 millimol) EtgN i 10 ml HMPTA og derefter portionsvis 16,4 g (100 millimol) p-nitrophenyl-isocyanat (100%'s overskud). Efter 24 timers reaktionstid ved 20°C fjernes størstedelen af HMPTA ved 30 destillation i vakuum. Remanensen ekstraheres flere gange med 30%'s
DK 154221 B
13 eddikesyre. Remanensen kasseres. De samlede eddikesyreekstrakter renses yderligere ved at blive hældt gennem en kolonne af "Sepha-dex" G-15, der er ækvilibreret med 30%'s eddikesyre, og der elueres med 30%'s eddikesyre. Den fraktion af eddikesy reel uatet, som spaltes 5 ved behandling med trypsin under frigørelse af p-nitroanilin, frysetørres. På denne måde fås 12,6 g af et amorft pulver, som er homogent i opløsningsmiddelsystemet ifølge TLC.
Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel ^20^25^6^5^ giver følgende resultater: 10 Beregnet: C 51,67 H 5,42 N 18,08 Cl 7,63.
Fundet: C 51,29 H 5,48 N 17,92 Cl 7,50.
Ib. 2HBr.H-Arg-pNA.
4,65 g (10 millimol) af forbindelse la behandles under omrøring med 40 ml 2N HBr i iseddike i 45 minutter ved 20°C under udelukkelse af 15 fugtighed. Aminosyrederivatet opløses under udvikling af CC^. Reaktionsopløsningen sættes dråbevis under kraftig omrøring til 250 ml absolut ether, hvilket fører til udfældning af 2HBr. H-Arg-pNA. Den etheriske fase frasuges, hvorefter den faste fase vaskes 4 gange med portioner på 100 ml absolut ether for i det væsentlige at fjerne ben-20 zylbromid, som er dannet som biprodukt, samt overskydende HBr og eddikesyre. Remanensen opløses i 50 ml methanol, pH-værdien indstilles på 4,5 ved tilsætning af Et^N, og opløsningen inddampes til tørhed i vakuum ved 30°C. Det resulterende produkt opløses i 75 ml
3D
methanol og hældes gennem en kolonne af "Sephadex" LH-20 (tvær-25 bundet dextrangel), som er ækvilibreret med methanol. Af en fraktion af eluatet fås 4,18 g (91,6% af det teoretiske) af en amorf forbindelse Ib, som i opløsningsmiddelsystemet er homogent ifølge TLC.
Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel C12H20N6°3B ^ giver følgende resultater: 30 Beregnet: C 31,60 H 4,42 N 18,43 Br 35,03.
Fundet: C 31,15 H 4,35 N 18,84 Br 34,81.
DK 154221 B
14 lc. Cbo-Gly-Arg-pNA. HBr.
4.56 g (10 millimol) af forbindelse 1b opløses i 30 ml frisk destilleret dimethylformamid, og opløsningen afkøles til -10°C. 1,40 ml (10 millimol) EtgN sættes til opløsningen under omrøring. Det dannede 5 EtgN.HBr fjernes ved filtrering og vaskes med en lille mængde koldt dimethylformamid. 3,65 g (11 millimol) Cbo-Gly-OpNP sættes ved -10°C til filtratet under omrøring, og reaktionen lades løbe i 2 - 3 timer under udelukkelse af fugtighed, hvorved temperaturen i reaktionsopløsningen gradvis stiger til ca. 20°C. Opløsningen afkøles igen 10 til -10°C og pufres med 0,70 ml (5 millimol) EtgN. Reaktionsopløsningen lades reagere i ca. 2 timer ved -10°C og i 3 timer ved stuetemperatur. Denne procedure gentages med 0,70 ml EtgN, og efter 16 timer inddampes reaktionsopløsningen til tørhed i vakuum ved 50°C. Remanensen opløses i 75 ml 50%'s eddikesyre og renses ved gelfil-15 trering på en kolonne af "Sephadex" G-15, der er ækvilibreret med 50%'s eddikesyre. Den fraktion af eddikesy reel uatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af p-nitroanilin, inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C. Remanensen opløses i 150 ml methanol og inddampes igen til tørhed. Den vundne remanens tørres i vakuum-20 exsiccator ved 60°C over ^2^5' hvorved der fås 5,85 g (88,3% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse 1c, som i opløsningsmiddelsystemet er homogent ifølge TLC.
Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel C22H28^7^6®r 9iver føl9enc*e resultater: 25 Beregnet: C 46,65 H 4,98 N 17,31 Br 14,11.
Fundet: C 46,33 H 5,04 N 17,88 Br 14,20.
ld. 2HBr.H-Gly-Arg-pNA.
4.56 g (8 millimol) af forbindelse 1c behandles under omrøring med 32 ml 2N HBr i iseddike i 40 minutter ved 20°C. Dipeptidderivatet oplø- 30 ses gradvis under udvikling af CC^. Reaktionsopløsningen dryppes under kraftig omrøring til 250 ml absolut ether, hvilket fører til udfældning af 2HBr.H-Gly-Arg-pNA. Den etheriske fase afsuges, hvorefter den faste fase vaskes fire gange med portioner på 100 ml <
DK 154221 B
15 absolut ether for i det væsentlige at fjerne benzylbromid, som er dannet som biprodukt, samt overskydende HBr og eddikesyre. Remanensen opløses i 50 ml methanol. pH-Værdien indstilles på 4,5 ved hjælp af EtgN, og opløsningen inddampes til tørhed i vakuum ved 5 30°C. Den vundne remanens opløses i 50 ml methanol og renses på en kolonne af "Sephadex" LH-20, der er ækvilibreret med methanol. Den fraktion af methanoleluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af p-nitroanilin, inddampes til tørhed i vakuum ved 30°C. Den vundne remanens tørres i vakuumexsiccator ved 40°C over 10 ^2*^5' hvorved der 3,78 g (92,1% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse 1d, som i opløsningsmiddelsystemet er homogen ifølge TLC.
Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel ^14^23^7^4^2 giver følgende resultater: 15 Beregnet: C 32,77 H 4,52 N 19,11 Br 31,14.
Fundet: C 32,31 H 4,59 N 19,47 Br 30,78.
1e. Cbo-D-Léu-Gly-Arg-pNA.HBr.
2,57 g (5 millimol) af forbindelse Id opløses i 20 ml frisk destilleret dimethylformamid, og opløsningen afkøles til -10°C. 0,70 ml (5 milli-20 mol) EtgN sættes til opløsningen under omrøring. Det dannede EtgN.HBr fjernes ved filtrering og vaskes med en lille mængde koldt dimethylformamid. 2,13 g (5,5 millimol) Cbo-D-Leu-OpNP sættes ved -10°C til filtratet under omrøring. Reaktionsblandingen lades reagere i 2-3 timer under udelukkelse af fugtighed, hvorved temperaturen i 25 reaktionsopløsningen gradvis stiger til ca. 20°C. Opløsningen afkøles igen til -10°C og pufres med 0,35 ml (2,5 millimol) Et^N. Reaktionsopløsningen lades reagere i ca. 2 timer ved -20°C og i yderligere 3 timer ved stuetemperatur. Denne procedure gentages med 0,35 ml EtgN, og efter 16 timers forløb inddampes reaktionsopløsningen til 30 tørhed i vakuum ved 50°C. Remanensen opløses i 50 ml 50%’s eddike-
S
syre og renses ved gelfiltrering på en kolonne af "Sephadex" G-15, der er ækvilibreret med 50%’s eddikesyre. Den fraktion af eddikesy-reeluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af p-nitroanilin, inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C. Remanensen
DK 154221 B
16 opløses i 100 ml methanol, og opløsningen inddampes igen til tørhed.
Den vundne remanens tørres i vakuumexsiccator ved 60°C over P2O5/ hvorved der fås 3,08 g (90,6% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse le, som i opløsningsmiddelsystemet er homogen ifølge TLC.
5 Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel ^28^39^8^7^r 9,ver følger,de resultater:
Beregnet: C 49,49 H 5,78 N 16,49 Br 11,76.
Fundet: C 49,06 H 5,82 N 16,85 Br 11,59.
Aminosyreanalysen bekræfter tilstedeværelsen af de forventede amino-10 syrer i de korrekte forhold: Gly : 1,00 - D-Leu : 0,99 - Arg : 0,97.
Eksempel 2.
Cbo-D-Leu-Gly-Arg-MCA.HBr.
2b. 2HBr.H-Arg-MCA.
13,0 g (25,9 millimol) kommercielt tilgængeligt Cbo-Arg-MCA.HCI 15 afblokeres ifølge eksempel Ib ved hjælp af 104 ml (208 millimol) af en opløsning af 2N HBr i iseddike. Den tørre remanens opløses i 400 ml methanol og renses på en kolonne af "Sephadex" LH-20. Den fraktion af metha-noleluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af 4-methyl-7-amino-cumarin, inddampes til tørhed i vakuum 20 ved 30°C. Den vundne remanens tørres i vakuumexsiccator ved 40°C over P2O5/ hvorved der fås 11,2 g (87,7% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse 2b, som i opløsningsmiddelsystemet er homogen ifølge TLC.
Élementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel 25 ^16^23^5^3^Γ2 9'ver føl9encle resultater:
Beregnet: C 38,96 H 4,70 N 14,20 Br 32,40.
Fundet: C 39,40 H 4,61 N 14,48 Br 31,90.
2c. Cbo-Gly-Arg-MCA.HBr.
DK 154221 B
17 4/93 g (10 millimol) af forbindelsen 2b og 3,65 g (11 millimol) Cbo-Gly-OpNP sættes til 75 ml frisk destilleret dimethylformamid.
Efter afkøling til -10°C tilsættes under omrøring først 1,40 ml (10 5 millimol) og derefter 0,70 ml (5 millimol) Et^N. Blandingen lades reagere under udelukkelse af fugtighed først i 3 timer ved -10°C og derefter i 4 timer ved stuetemperatur. Reaktionsopløsningen afkøles igen til -10°C, pufres med 0,70 ml Et^N og omrøres natten over ved 20°C. Reaktionsblandingen inddampes til tørhed i vakuum ved 50°C, 10 og remanensen opløses i 200 ml 50%'s eddikesyre og renses på en kolonne af "Sephadex" G-15. Den fraktion af eddikesyreeluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af 4-methyl-7-amino-cumarin, inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C. Den således vundne remanens tørres i vakuumexsiccator ved 60°C over ^^5' 15 hvorved der fås 4,98 g (82,5% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse 2c, som i opløsningsmiddelsystemet er homogen ifølge TLC.
Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel *"26^31 ^6^6^ r 9'ver fødende resultater:
Beregnet: C 51,75 H 5,18 N 13,93 Br 13,24.
20 Fundet: C 51,48 H 5,24 N 13,70 Br 13,14.
2d. 2HBr.H-Gly-Arg-MCA.
4,83 g (8 millimol) af forbindelse 2c afblokeres ifølge eksempel Id ved hjælp af 32 ml 2N HBr i iseddike. Det vundne råprodukt opløses i 100 ml methanol og renses på en kolonne af "Sephadex"® LH-20. Den 25 fraktion af methanoleluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af 4-methyl-7-amino-cumarin, inddampes til tørhed i vakuum ved 30°C. Den vundne remanens tørres i vakuumexsiccator ved 40°C over P2®5' hvorved der fås 4,05 g (92,0% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse 2d, som i opløsningsmiddelsystemet er 30 homogen ifølge TLC.
Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel C18H26N604Br2 giver følgende resultater:
Beregnet: C 39,29 H 4,76 N 15,27 Br 29,04.
r OO ni U Λ 70 M IR OO D ·. OQ 70 2e. Cbo-D-Leu-Gly-Arg-MCA.HBr.
DK 154221 B
18 2,75 g (5 mi I limol) af forbindelse 2d omsættes med 2,13 g (5,5 milli-mol) Cbo-D-Leu-OpNP som beskrevet i eksempel le. Det resulterende råprodukt opløses i 75 ml 50%'s eddikesyre og renses på en kolonne af « 5 "Sephadex" G-15. Den fraktion af eddikesyreeluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af 4-methyl-7-amino-cumarin, inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C. Remanensen tørres i va-kuumexsiccator ved 60°C over P2®5' hvorved der fås 2,91 g (81,2% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse 2e, som i opløsningsmiddel-10 systemet er homogen ifølge TLC.
Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel C32H42N yOyBr giver følgende resultater:
Beregnet: C 53,63 H 5,91 N 13,68 Br 11,15.
Fundet: C 53,13 H 6,01 N 13,91 Br 10,88.
15 Aminosyreanalysen bekræfter tilstedeværelsen af de ventede aminosyrer i det korrekte forhold:
Gly : 1,00 - Leu : 1,02 - Arg : 0,98.
Eksempel 3.
Cbo-D-Leu-Gly-Arg-DPA. HBr.
20 3a. Cbo-Arg-DPA.HCI.
34,48 g (0,1 mol) tørret Cbo-Arg-OH.HCI opløses i en 1000 ml's 3-halset kolbe i en blanding af 150 ml frisk destilleret vandfrit di-methylformamid og 300 ml absolut tetrahyd rof uran ved 20°C. Opløsningen afkøles til -10°C, og under omrøring tilsættes 10,2 g (0,1 mol) 25 EtgN under udelukkelse af fugtighed. Derefter dryppes en opløsning af 13,65 g (0,1 mol) chlormyresyre-isobutylester i 50 ml tetrahydro-furan til blandingen i løbet af 20 minutter, hvorhos reaktionstemperaturen ikke lades stige til over -5°C. Efter yderligere 10 minutters reaktionstid ved en temperatur på mellem -10 og -5°C dryppes en
DK 154221 B
19 opløsning af 20,92 g (0,1 mol) dimethyl-5-amino-isophthalat i 75 ml dimethylformamid til reaktionsblandingen i løbet af 30 minutter, hvorhos reaktionstemperaturen hele tiden holdes på under -5°C. Reaktionsblandingen lades reagere i yderligere 1 time ved -5°C. Den om-5 røres derefter natten over ved 20°C og afkøles til -15°C for at lade EtgN.HCI krystallisere. Det dannede EtgN.HCI frafiltreres og vaskes med en lille mængde koldt dimethylformamid. Filtratet og vaskevæsken inddampes til tørhed i vakuum ved 50°C. Remanensen opløses i 1000 ml 50%'s eddikesyre og renses ved gelfiltrering på en kolonne af 10 "Sephadex" G-15, der er ækvilibreret med 50%’s eddikesyre. Den fraktion af eddikesyreeluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af dimethyl 5-amino-isophthalat, inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C. Remanensen tørres i en vakuumexsiccator ved 50°C over p2^5' hvorved der fås 24,6 g (45,9% af det teoretiske) af 15 den amorfe forbindelse 3a, som i opløsningsmiddelsystemet er homogen ifølge TLC.
Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel C24H30N5O7CI giver følgende resultater:
Beregnet: C 53,78 H 5,64 N 13,07 Cl 6,62.
20 Fundet: C 53,21 H 5,71 N 13,20 Cl 6,52.
3b. 2HBr.H-Arg-DPA.
21,44 g (40 millimol) af forbindelse 3a afblokeres som beskrevet i eksempel Ib. Efter den sædvanlige behandling opløses det resulte rende råprodukt i 250 ml methanol og renses ved gelfiltrering på en 25 kolonne af "Sephadex"® LH-20. Den fraktion af methanoleluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af dimethyl 5-amino-isophthalat, inddampes til tørhed i vakuum. Remanensen tørres i en vakuumexsiccator ved 40°C over P2O,., hvorved der fås 19,63 g (93,1% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse 3b, som i 30 opløsningsmiddelsystemet er homogen ifølge TLC.
Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel C16H25^5^5Br2 9'ver følgende resultater:
Beregnet: C 36,45 H 4,78 N 13,28 Br 30,31.
Fundet: C 36,82 H 4,67 N 13,45 Br 29,85.
3c. Cbo-Gly-Arg-DPA.HBr.
DK 154221 B
20 5,27 g CIO millimol) af forbindelsen 3b omsættes som beskrevet i eksempel 1c med 3,65 g (11 millimol) Cbo-Gly-OpNP. Det vundne råprodukt opløses efter den sædvanlige behandling i 200 ml 50%'s 5 eddikesyre og renses på en kolonne af "Sephadex" G-15. Den fraktion af eddikesyreeluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af dimethyl 5-amino-isophthalat, inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C. Remanensen tørres i en vakuumexsiccator ved 60°C over P2O5, hvorved der fås 5,29 g (83,0% af det teoretiske) af 10 den amorfe forbindelse 3c, som i opløsningsmiddelsystemet er homogen ifølge TLC.
Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel ^26^33^6^8^r 9'ver føtøende resultater:
Beregnet: C 48,99 H 5,22 N 13,18 Br 12,53.
15 Fundet: C 48,50 H 5,28 N 12,92 Br 12,33.
3d. 2HBr.H-Gly-Arg-DPA.
5,10 g (8 millimol) af forbindelse 3c afblokeres som beskrevet i eksempel Id ved hjælp af 32 ml 2N HBr i iseddike. Efter den sædvanlige behandling opløses det vundne råprodukt i 100 ml methanol og renses 20 på en kolonne af "Sephadex" LH-20. Den fraktion af methanoleluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af dimethyl 5-amino-isophthalat, inddampes til tørhed i vakuum ved 30°C. Remanensen tørres i en vakuumexsiccator ved 40°C over P2O5' hvorved der fås 4,25 g (90,9% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse 3d, 25 som i opløsningsmiddelsystemet er homogen ifølge TLC.
Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel C)gf^sNgOøBr2 giver følgende resultater:
Beregnet: C 37,00 H 4,83 N 14,38 Br 27,35.
Fundet: C 36,85 H 4,90 N 14,72 Br 26,95.
3e. Cbo-D-Leu-Gly-Arg-DPA-HBr.
DK 154221 B
21 2,92 g (5 millimol) af forbindelsen 3d omsættes som beskrevet i eksempel le med 2,13 g (5,5 millimol) Cbo-D-Leu-OpNP. Efter den sædvanlige behandling opløses råproduktet i 100 ml 50%'s eddikesyre 5 og renses på en kolonne af "Sephadex"® G-15. Den fraktion af eddikesyreel uatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af dimethyl 5-amino-isophthalat, inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C. Remanensen tørres i en vakuumexsiccator ved 60°C over P2O5, hvorved der fås 3,11 g (82,9% af det teoretiske) af den amorfe 10 forbindelse 3e, som i opløsningsmiddelsystemet er homogen ifølge TLC.
Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel C32H44N yOgBr giver følgende resultater:
Beregnet: C 51,20 H 5,91 N 13,08 Br 10,64,
Fundet: C 50,88 H 5,99 N 13,26 Br 10,48.
15 Aminosyreanalysen bekræfter tilstedeværelsen af de forventede aminosyrer i det korrekte forhold:
Gly : 1,00 - Leu : 1,00 - Arg : 0,97.
Eksempel 4.
Cbo-D-Leu-Sar-Arg-2-NA. HBr.
20 4b. 2HBr.H-Arg-2-NA.
9,40 g (20 millimol) kommercielt tilgængeligt Cbo-Arg-2-NA.HCI afblokeres som beskrevet i eksempel 1b med en opløsning af 80 ml 2N HBr i iseddike. Efter sædvanlig behandling opløses det vundn.e produkt i 150 ml methanol og renses på en kolonne af "Sephadex" LH-20, Den 25 fraktion af methanoleluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af 2-naphthyIamin, inddampes til tørhed i vakuum ved 30°C. Remanensen tørres i en vakuumexsiccator ved 40°C over ?2θ^, hvorved der fås 8,60 g (93,2% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse 4b, som i opløsningsmiddelsystemet er homogen ifølge 30 TLC.
DK 154221 B
22
Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel C16^23N5OBr2 9'ver ^tøende resultater:
Beregnet: C 41,67 H 5,03 N 15,19 Br 34,65.
Fundet: C 42,08 H 5,12 N 14,68 Br 33,96.
5 4c. Cbo-Sar-Arg-2-NA.HBr.
4,6 g (10 millimol) af forbindelse 4b omsættes som beskrevet i eksempel 1c med 3,80 g (11 millimol) Cbo-Sar-OpNP. Råproduktet opløses efter den sædvanlige behandling i 150 ml 50%'s eddikesyre og renses på en kolonne af "Sephadex" G-15. Denne fraktion af eddikesyre-10 eluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af 2-naphthylamin, inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C. Remanensen tørres i vakuumexsiccator ved 60°C over hvorved der fås 4,95 g (84,5% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse 4c, som i opløsningsmiddelsystemet er homogen ifølge TLC.
15 Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel ^27^33^6^4Br 9'ver fø!9ende resultater:
Beregnet: C 55,39 H 5,68 N 14,35 Br 13,65.
Fundet: C 55,72 H 6,73 N 14,68 Br 13,42.
4d. 2HBr.H-Sar-Arg-2-NA.
20 4,68 g (8 millimol) af forbindelse 4c afblokeres som beskrevet i ek sempel Id ved hjælp af 28 ml 2N HBr i iseddike. Råproduktet opløses efter den sædvanlige behandling i 100 ml methanol og renses på en kolonne af "Sephadex" LH-20. Den fraktion af methanoleluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af 2-naphthyl-25 amin, inddampes til tørhed i vakuum ved 30°C. Remanensen tørres i en vakuumexsiccator ved 40°C over P2^)5/ hvorved der fås 4,08 g (95,8% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse 4d, som i opløsningsmiddelsystemet er homogen ifølge TLC.
Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel 30 CjgHjgNgC^B^ giver følgende resultater:
Beregnet: C 42,87 H 5,30 N 15,79 Br 30,02.
Fundet: C 43,9 H 5,32 N 16,02 Br 29,68.
4e. Cbo-D-Leu-Sar-Arg-2-NA.HBr.
DK 154221 B
23 2,66 g (5 millimol) af forbindelse 4d omsættes som beskrevet i eksempel le med 2,13 g (5,5 millimol) Cbo-D-Leu-OpNP. Råproduktet opløses efter den sædvanlige behandling i 100 ml 50%'s eddikesyre og 5 renses på en kolonne af "Sephadex" G-15. Den første hovedfraktion af eddikesyreeluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af 2-naphthylamin, inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C og tørres i vakuumexsiccator ved 60°C over P2O5· På denne måde fås 3,01 g (86,2% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse 4e, som i 10 opløsningsmiddelsystemet er homogen ifølge TLC.
Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel (^33^44^7()5^ giver følgende resultater:
Beregnet: C 56,73 H 6,35 N 14,03 Br 11,44.
Fundet: C 57,05 H 6,40 N 14,30 Br 11,12.
15 Aminosyreanalysen bekræfter tilstedeværelsen af de forventede aminosyrer i de korrekte forhold:
Sar : 1,00 - Leu : 1,02 - Arg : 0,97.
Eksempel 5.
Cbo-D-Leu-Sar-Arg-4-MeO-2-NA. HBr.
20 5b. 2HBr.H-Arg-4-MeO-2-NA.
10,0 g (20 millimol) kommercielt tilgængeligt Cbo-Arg-4-MeO-2-NA.HCI afblokeres som beskrevet i eksempel Ib ved hjælp af 80 ml 2N HBr i iseddike. Råproduktet opløses efter den sædvanlige behandling i 150 ml methanol og renses på en kolonne af "Sephadex" LH-20. Hoved-25 fraktionen af methanoleiuatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af 4-methoxy-2-naphthylamin, inddampes til tørhed i vakuum ved 30°C. Remanensen tørres i en vakuumexsiccator ved 40°C over P2O5' hvorved der fås 8,98 g (91,4% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse 5b, som i opløsningsmiddelsystemet er homogen 30 ifølge TLC.
DK 154221 B
24
Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel ^17H25^5°2Br2 9'ver føl9encle resultater:
Beregnet: C 41,57 H 5,13 N 14,26 Br 32,53.
Fundet: C 41,22 H 5,19 N 14,40 Br 32,01.
5 5c. Cbo-Sar-Arg-4-MeO-2-NA.HBr.
4,91 g CIO millimol) af forbindelse 5b omsættes som beskrevet i eksempel 1c med 3,80 g (11 millimol) Cbo-Sar-OpNP. Råproduktet opløses efter den sædvanlige behandling i 150 ml 50%'s eddikesyre og renses på en kolonne af "Sephadex" G-15. Den første hovedfraktion 10 af eddikesy reel uatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af 4-methoxy-2-napthylamin, inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C. Remanensen tørres i vakuumexsiccator ved 60°C over hvorved der fås 4,86 g (79,0% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse 5c, som i opløsningsmiddelsystemet er homogen ifølge TLC.
15 Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel (^28*-*35^6^5Br giver følgende resultater:
Beregnet: C 54,64 H 5,73 N 13,65 Br 12,98.
Fundet: C 54,38 H 5,81 N 13,93 Br 12,75.
5d. 2HBr.H-Sar-Arg-4-MeO-2-NA.
20 4,31 g (7 millimol) af forbindelsen 5c afblokeres som beskrevet i eksempel Id med 28 ml 2N HBr i iseddike. Det vundne råprodukt opløses efter sædvanlig behandling i 100 ml methanol og renses på en kolonne af "Sephadex" LH-20. Hovedfraktionen af methanoleluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under dannelse af 4-meth-25 oxy-2-naphthylamin, inddampes til tørhed i vakuum ved 30°C. Remanensen tørres i vakuumexsiccator ved 40°C over P2O5/ hvorved der fås 3,74 g (95,0% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse 5d, som i opløsningsmiddelsystemet er homogen ifølge TLC.
Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel 30 ^20^30^6¾Br2 9'ver bølgende resultater:
Beregnet: C 42,72 H 5,38 N 14,95 Br 28,42.
Fundet: C 43,01 H 5,44 N 15,25 Br 28,03.
DK 154221 B
25
Aminosyreanalysen bekræfter tilstedeværelsen af de forventede aminosyrer i de korrekte forhold:
Sar : 1,00 - Leu : 1,01 - Arg : 0,98.
5e. Cbo-D-Leu-Sar-Arg-4-MeO-2-NA.HBr.
5 2,81 g (5 millimol) af forbindelsen 5d omsættes som beskrevet i ek sempel le med 2,13 g (5,5 millimol) Cbo-D-Leu-OpNP. Det vundne råprodukt opløses efter sædvanlig behandling i 125 ml 50%’s eddike-syre og renses på en kolonne af "Sephadex" G-15. Den første hovedfraktion af eddikesy reel uatet, som spaltes ved behandling med trypsin 10 under frigørelse af 4-methoxy-2-naphthylamin, inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C. Remanensen tørres i vakuumexsiccator ved 60°C over P2^5r hvorved der fås 2,98 g (81,8% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse 5e, som i opløsningsmiddelsystemet er homogen ifølge TLC.
15 Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel C34H46^7^6^r 9'ver føtøende resultater:
Beregnet: C 56,04 H 6,36 N 13,46 Br 10,97.
Fundet: C 56,28 H 6,34 N 13,75 Br TO,68.
Eksempel 6.
20 Cbo-D-Leu-Gly-Arg-pNA.AcOH.
6,80 g (10 millimol) Cbo-D-Leu-Gly-Arg-pNA.HBr (fremstillet som beskrevet i eksempel 1) opløses i 75 ml 60%'s vandigt methanol. Opløsningen hældes på en kolonne af "Amberlite"® JRA-401 i acetatform. Kolonnen elueres ved hjælp af 60%'s vandigt methanol, hvorhos HBr 25 erstattes med eddikesyre ved ionbytning. Eluatet inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C. Efter tørring i vakuumexsiccator ved 40°C over P2O5 fås 6,62 g bromidfrit Cbo-D-Leu-Gly-Arg-pNA.AcOH (99,0% af det teoretiske). Andre salte med organiske syrer, f.eks. myresyre, propionsyre, oxalsyre, vinsyre, citronsyre, mælkesyre, benzoesyre,
DK 154221 B
26 chlor-benzoesyre, salicylsyre eller phthalsyre, kan også fremstilles ud fra det ovennævnte tripeptidderivat efter samme metode, lonbytteren kan f.eks. være "Amberlite" JRA-401 i sin hydrochloridform, og den ønskede syresaltform kan fås ved at omdanne denne ionbytter til den 5 basiske OH-form ved behandling med natriumhydroxidopløsning og derefter med en opløsning af en l:1-blanding af den ønskede organiske syre og dennes natriumsalt i 60%’s vandigt methanol.
Eksempel 7.
Tos-D-Leu-GIy-Arg-pNA. HBr.
10 6,26 g (10 millimol) 2HBr.H-D-Leu-Gly-Arg-pNA (fremstillet som beskrevet i eksempel 7f, se tabel III), opløses i 30 ml destilleret dimethylformamid. Opløsningen afkøles til -15°C, og der tilsættes først 2,80 ml (20 millimol) EtgN og umiddelbart derefter 1,91 g (10 millimol) tosylchlorid under omrøring og under udelukkelse af fugtighed. Efter 15 en reaktionstid på ca. 2 - 3 timer ved -15°C lades reaktionsblandingen reagere videre natten over ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen afkøles igen til -15°C. Den udfældede blanding af Et^N.HBr og EtgN-HCI fjernes ved filtrering og vaskes med en lille mængde koldt dimethylformamid. Filtratet og vaskeopløsningen sammenhældes og 20 inddampes til tørhed i vakuum ved 50°C. Remanensen opløses i 75 ml 50%'s eddikesyre. Opløsningen renses på en kolonne af "Sephadex" G-15, der er ækvilibreret med 50%'s eddikesyre. Hovedfraktionen af eddikesyreeluatet, som spaltes ved behandling med trypsin under frigørelse af p-nitroanilin, inddampes til tørhed i vakuum ved 40°C.
25 Remanensen opløses i 100 ml methanol, og opløsningen inddampes igen til tørhed. Remanensen tørres i en vakuumexsiccator ved 60°C over *V^5' hvorved ^er 6,65 g (95,0% af det teoretiske) af den amorfe forbindelse Tos-D-Leu-Gly-Arg-pNA.HBr, som i opløsningsmiddelsystemet er homogen ifølge TLC.
30 Elementæranalyse og beregning ud fra den empiriske formel ^27^39^8^7^r 9lver følgende resultater:
Beregnet: C 46,35 H 5,62 N 16,02 S 4,58 Br 11,42.
Fundet: C 46,85 H 5,66 N 16,28 S 4,43 Br 11,22.
DK 154221 B
27
Tabel I
Elementæranalyse Metode, fundet %, ber. %
Eks. Udgangsproduk- udbytte ----------------- 5 nr. Slutprodukt ter (millimol) % Aminosyreanalyse 8 Cbo-D-Nleu-Gly- Id (5 mol) eks. le C 48,95 49,49
Arg-pNa. HBr Cbo-D-Nleu-OpNP 82,8 H 5,83 5,78 C28H39N8°7Br (5'5 miliimo1) N 16'80 16/49 10 Br 11,55 11,76
Gly:Nleu:Arg 1,00:0,99:0,97 15 9 Cbo-D-Nval-Gly- Id (5 millimol) eks. le C 48,58 48,73
Arg-pNa.HBr Cbo-D-Nval-OpNP 84,2 H 5,66 5,60 C27H37N8°7Br (5/5 millimol) N 1 2 3 4 5 6'98 16/84
Br 11,86 12,01 20 Gly:Nval:Arg 1,00:1,02:0,98 10 Cbo-D-But-Gly- Id (5 millimol) eks. le C 47,73 47,93
Arg-pNA. HBr Cbo-D-But-OpNP 83,8 H 5,48 5,41 25 C26H35N8°7Br (5'5 miIlimo1) N 17'48 17/20
Br 12,11 12,26
Gly: But: Arg 1,00:0,99:0,97 30 _ 11 Cbo-D-CHA-Gly- Id (5 millimol) eks. 1e C 50,75 51,07
Arg-pNA. HBr Cbo-D-CHA-OpNP 82,7 H 5,93 5,86 C30H41N8°7Br (5,5 millimo1) N 16'10 15'88
Br 11,18 11,32 35 -----------------
Gly:CHA:Arg 1,00:0,98:0,99
Cbo-D-CHG-Gly- Id C5 millimol) eks. 1e C 50,18 50,36 2 40 Arg-pNA.HBr Cbo-D-CHG-OpNP 83,5 H 5,69 5,68 3 C29H39N8°7Br (5,5 millimo1^ N 16'38 16'20
Br 11,29 11,55 4 (udgangsmateriale) ----------------- 5
Gly:CHG: Arg 6 45 1,00:0,97:0,99
DK 154221 B
28 13 Cbo-D-CHT-Gly- Id (5 millimol) eks. 1e C 49,62 49,93
Arg-pNA.HBr Cbo-D-CHT-OpNP 82,0 H 5,80 5,73 C30H41N8°8Br (5,5 millimol) N 15'76 15'53
Br 10,88 11,07 5 -----------------
Gly:CHT:Arg 1,00:0,96:1,01 14 Cbo-D-Ph'Gly- ld (5 millimol) eks. le C 50,60 50,81 10 Gly-Arg-pNA.HBr Cbo-D-Ph’Gly- 81,3 H 4,88 4,85 C29H33N8°7Br OpNP N 16,63 16,35 (5,5 millimol) Br 11,48 11,66
Gly: Ph'Gly: Arg 15 1,00:0,98:0,98 15 Cbo-D-Phe-Gly- Id (5 millimol) eks. 1e C 51,20 51,51
Arg-pNA.HBr Cbo-D-Phe-OpNP 80,0 H 5,07 5,04 ^30^35^8^7Br (5,5 millimol) N 16,28 16,02 20 Br 11,35 11,42
Gly:Phe:Arg 1,00:1,01:0,98 25 16 Cbo-D-Val-Gly- Id (5 millimol) eks. le C 48,71 48,72
Arg-pNA.HBr Cbo-D-Val-OpNP 82,8 H 5,62 5,60 ^27^37^8^7Br (5,5 millimol) N 17,08 16,84
Br 11,90 12,01 (udgangsmateriale) ----------------- 30 Gly.Val: Arg 1,00:1,02:1,00 17 Cbo-D-IIe-Gly- Id (5 millimol) éks. le C 49,12 49,49
Arg-pNA.HBr Cbo-D-lle-OpNP 81,2 H 5,80 5,78 35 C28H3gN807Br (5,5 millimol) N 16,66 16,49
Br 11,58 11,76
Gly: Ile: Arg 1,00:0,99:0,98 40 _____ 1
Cbo-D-Glu(2T- 1d (5 millimol) eks. le C 49,18 49,54
OtBu)-GIy-Arg- Cbo-D-Glu(Y- 78,2 H 5,82 5,77 pNA.HBr OtBu)-OpNP N 15,12 14,91 ^31^43^8^9Br (5,5 millimol) Br 10,50 10,63 45 -----------------
Gly:Glu: Arg 1,00:0,96:0,98
DK 154221 B
29 19 Cbo-D-Asp(3- Id (5 millimol) eks. le C 48,70 48,85
OtBu)-Gly-Arg- Cbo-D-Asp(&- 77,6 H 5,66 5,60 pNA.HBr OtBu)-OpNP N 15,02 15,19 C30H41N8°9Br (5,5 millimol) Br 10'65 10*83 5 .................
Gly: Asp: Arg 1,00:0,97:1,00 20 Cbo-D-His-Gly- Id (5 millimol) eks. 1e C 42,71 42,87 10 Arg-pNA.2HBr Cbo-D-His-OpNP 68,5 H 4,70 4,63 C28H36N10°7Br2 (5'5 millimol) N 18'05 17'86
Br 20,12 20,37
Gly:His:Arg 15 1,00:0,94:0,99 21 Cbo-D-Leu-Sar- 21d (5 millimol) eks. le C 50,48 50,22
Arg-pNA.HBr Cbo-D-Leu-OpNP 82,2 H 6,02 5,96 C29H4iN8°7Br (5,5 millimol) N 16,38 16,16 20 Br 11,33 11,52
Sar: Leu: Arg 1,00:1,01:0,97 25 22 Cbo-D-Leu-Ala- 22d (5 millimol) eks. le C 50,48 50,22
Arg-pNA.HBr Cbo-D-Leu-OpNP 83,5 H 6,03 5,96 C29H41N8°7Br (5,5 millimo|i N 16'28 16'16
Br 11,40 11,52 30 Ala: Leu: Arg 1,00:1,01:0,98 23 CH3S02-D-Nleu- 23f (3 millimol) eks. 7 C 45,66 45,84
Gly-Arg-pNA.- CHgSCyCI & 6 H 6,41 6,36 35 AcOH (3,3 millimol) 83,1 N 18,93 18,59 C23H38N8°9S S 5,24 5,32
Gly:Nleu:Arg 1,00:1,01:0,98 40 ___ 24 Isobutoxy-CO-D- 23f (3 millimol) eks. 7 C 51,63 51,91
Nleu-Gly-Arg- isobutoxy-CO-CI & 6 H 7,12 7,10 pNA.AcOH (3,3 millimol) 81,4 N 18,17 17,94 C27H44N8°9 45 Gly:Nleu:Arg 1,00:1,02:0,99
DK 154221 B
30 25 Cbo-D-Leu-N(Et)- 25d (5 millimol) eks. 1e C 51,30 50,92
Gly-Arg-pNA. HBr Cbo-D-Leu-OpNP 80,6 H 6,15 6,13 C30H43N8°7Br (5,5 millimol) N 16,10 15,84
Br 11,12 11,29 5 -----------------
Leu:N(Et)Gly:Arg 1,00:0,98:0,99 26 Cbo-D-Leu-N(Pr)- 26d (5 millimol) eks. le C 51,95 51,59 10 Gly-Arg-pNA. HBr Cbo-D-Leu-OpNP 77,5 H 6,34 6,29 C31H45N8°7Br (5'5 millimo1) N 15'80 15'53
Br 10,83 11,07
Leu: N(Pr)Gly: Arg 15 1,00:0,96:0,98 27 Cbo-D-CHA-Sar- 21d (5 millimol) eks. le C 51,48 51,74
Arg-pNA.HBr Cbo-D-CHA-OpNP 84,2 H 6,08 6,02 C31H43N8°7Br (5,5 miI,imo1) N 15'76 15'57 20 Br 10,95 11,10
Sar:CHA: Arg 1,00:0,98:0,98 25 28 Cbo-D-CHT-Sar- 21d (5 millimol) eks. le C 50,33 50,61
Arg-pNA.HBr Cbo-D-CHT-OpNP 80,9 H 5,96 5,89 C31H43N8°8Br C5'5 millimol) N 15'48 15'23
Br 10,70 10,86 30 Sar: CHT :Arg 1,00:0,97:0,99 29 Cbo-D-NIeu-Sar- 21 d (5 millimol) eks. 1e C 50,31 50,22
Arg-pNA.HBr Cbo-D-NIeu-OpNP 80,6 H 6,00 5,96 35 C29H41N8°7Br (5,5 millimol) N 16,40 16,16
Br 11,38 11,52
Sar: Nleu:Arg 1,00:1,02:0,98 40 _ 30 Cbo-D-Nval-Sar- 21d (5 millimol) eks. le C 49,33 49,49
Arg-pNA.HBr Cbo-D-Nval-OpNP 82,7 H 5,80 5,78 C28H39N8°7Br N 16,74 16,49
Br 11,62 11,76 45 -----------------
Sar: Nval: Arg 1,00:1,00:0,98
DK 154221 B
31 31 Benzensulfonyl-D- 7f (5 millimol) eks. 7 C 45,85 45,55
Leu-Gly-Arg- benzensulfochlo- & 6 H 5,47 5,44 pNA.HBr rid 92 N 16,58 16,34 C26H37N8°7SBr (5 millimol) S 4'53 4'68 5 Br 11,30 11,65
Gly: Leu: Arg 1,00:1,01:0,99 10 32 Methansulfonyi-D- 7f (5 millimol) eks. 7 C 40,90 40,45
Leu-Gly-Arg- methansulfo- & 6 H 5,71 5,66 pNA.HBr chlorid 90,5 N 18,28 17,97 ^21 ^35^8^7^Br ^ millimol) S 5,01 5,14
Br 12,55 12,82 15 .................
Gly: Leu: Arg 1,00:1,02:0,99 33 α-Naphthalensul- 7f (5 millimol) eks. 7 C 49,38 48,98 20 forty!-D-Leu-Gly- α-naphthalen- & 6 H 5,40 5,34
Arg-pNA.HBr sulfochlorid 88 N 15,55 15,23 ^30^39^8^7^Br ^ millimol) S 4,25 4,36
Br 10,62 10,86 25 Gly: Leu: Arg 1,00:1,01:0,98 34 n-Butansulfonyl- 7f (5 millimol) eks. 7 C 43,55 43,31 D-Leu-Gly-Arg- n-butansulfo- & 6 H 6,28 6,21 30 pNA.HBr chlorid 88,3 N 17,08 16,84 C24H41N8°7SBr (5 miliimol) S 4'73 4'82
Br 11,84 12,00
Gly: Leu: Arg 35 1,00:0,99:0,99 35 2-Phenylacetyl-D- 35f (5 millimol) eks. 7 C 51,62 51,40
Leu-Sar-Arg- 2-phenyleddike- & 6 H 6,12 6,10 pNA.HBr syre-OpNP 80,4 N 16,80 16,54 40 C29H41N8°6Br (5,5 mi,limol) Br 11'53 n'79
Sar: Leu: Arg 1,00:1,02:1,00
DK 154221B
32 36 4-Phenylbutyryl- 35f (5 millimol) eks. 7 C 52,99 52,76 D-Leu-Sar-Arg- 4-phenylsmør- & 6 H 6,47 6,43 pNA.HBr syre-OpNP 79,2 N 16,05 15,88 ^31^45^8^6Br (5,5 millimol) Br 11,18 11,32 5 -----------------
Sar: Leu: Arg 1,00:0,99:0,98 37 Cyclohexylcarbo- 35f (5 millimol) eks. 7 C 50,51 50,22 10 nyl-D-Leu-Sar- cyclohexancarb- & 6 H 6,81 6,77
Arg-pNA.HBr oxylsyre-OpNP 82,3 N 16,75 16,73 C28H45N8°6Br (5,5 millimol) Br 11'81 11'93
Sar: Leu: Arg 15 1,00:1,01:1,00 38 Bz-D-Nval-Gly- 38f (5 millimol) eks. 7 C 49,25 49,14
Arg-pNA.HBr benzoesyre-an- & 6 H 5,59 5,55 C26H35N8°6Br hydrid (Bz2<0) 77,5 N 17,90 17,63 20 (7,5 millimol) Br 12,33 12,57
Gly:Nval:Arg 1,00:0,99:0,98 25 39 4-Methy I benzoyl- 38f (5 millimol) eks. 7 C 50,18 49,93 D-Nval-Gly-Arg- 4-methylbenzoe- & 6 H 5,78 5,74 pNA.HBr syre anhydrid 76,8 N 17,35 17,25 C27H37N8°6Br (7,5 millimol) Br 12'18 12'30 30 Gly: Nval: Arg 1,00:1,01:0,98 40 2-ChIorbenzoyl- 38f (5 millimol) eks. 7 C 50,33 49,92 D-Nval-GIy-Arg- 2-chlorbenzoe- & 6 H 5,46 5,48 35 pNA.HCI syre-anhydrid 76,4 N 18,09 17,91 C26H34N8°6CI2 (7'5 millimol) cl n'18 1Ί'34
Gly:Nval:Arg 1,00:0,99:0,99 40 _ 41 CH3OCO-D-Nval- 41f (5 millimol) eks. 7 C 43,59 43,79
Sar-Arg-pNA.- methylchlorformiat & 6 H 5,92 5,85 HBr (5,5 millimol) 83,6 N 18,76 18,57 C22H35N8°7Br Br 12,95 13,24 45 ..................
Sar: Nval: Arg 1,00:0,98:0,99
DK 154221 B
33 42 CH3-(CH2)y-0- 41 f (5 millimol) eks. 7 C 49,51 49,64 CO-D-Nval-Sar- octylchlorformiat & 6 H 7,08 7,04
Arg-pNA.HBr (5,5 millimol) 79,8 N 16,22 15,97 C29H49N8°7Br Br 11,19 11,39 5 ..............—
Sar:Nval:Arg 1,00:1,00:0,98 43 BOC-D-Leu-Gly- Id (5 millimol) eks. 1e C 46,88 46,51 10 Arg-pNA.HBr BOC-D-Leu-OpNP 84,2 H 6,41 6,40 ^25^41^8^7Br (5,5 millimol) N 17,71 17,36
Br 12,20 12,38 G ly: Leu: Arg 15 1,00:1,00:0,99 44 4-MeO-Cbo-D- Id (5 millimol) eks. le C 48,81 49,09
Leu-Gly-Arg- 4-MeO-Cbo-D- 80,5 H 5,90 5,82 pNA.HBr Leu-OpNP N 16,00 15,79 20 C29H41N8°8Br (5,5 millimol) Br 11,05 11,26
Gly: Leu: Arg 1,00:1,01:0,98 25 45 CH30-CO-D-CHA- 45f (5 millimol) eks. 7 C 52,60 52,08
Gly-Arg-pNA.- CHgO-CO-CI & 6 H 6,88 6,80
AcOH (5,5 millimol) 85,6 N 18,30 18,00 C27H42N8°9 ............
Gly:CHA: Arg 30 1,00:0,97:0,99 46 C2H50-C0-D- 45f (5 millimol) eks. 7 C 52,48 52,82 CHA-Gly-Arg- C2H50-C0-CI & 6 H 7,03 6,97 pNA.AcOH (5,5 millimol) 84,3 N 17,75 17,60 35 C28H44N8°9
Gly: CHA: Arg 1,00:0,98:0,98 47 CH3S02-D-CHA- 45f (5 millimol) eks. 7 G 48,22 48,59 40 Gly-Arg-pNA.- CHgSO^CI & 6 H 6,66 6,59
AcOH (5,5 millimol) 86,8 N 17,58 17,44 C26H42N8°9S S 4,80 4,99
Gly:CHA: Arg 45 1,00:0,97:0,97
DK 154221 B
34 48 Cbo-D-Leu-Gly- 48d (5 millimol) eks. le C 55,78 56,14
Arg-2-NA.HBr Cbo-D-Leu-OpNP 79,5 H 6,24 6,18 C32H42N7°5Br (5'5 mil,imo1) N 14'48 14'32
Br 11,45 11,67 5 .................
G ly: Leu: Arg 1,00:1,01:0,99 49 CH30-C0-D-Leu- 49f (5 millimol) eks. 7 C 57,02 57,23 10 Gly-Arg-2-Na.AcOH CHgO-CO-CI &6 H 7,10 7,03 C28H41N7°7 (5,5 millimo|i 75,9 N 16,83 16'68
Gly: Leu: Arg 1,00:1,00:0,98 15 _ 50 CH3S02-D-Leu- 49f (5 millimol) eks. 7 C 53,08 53,36
Gly-Arg-2-NA.- CH3S02-CI & 6 H 6,84 6,80
AcOH (5 millimol) 82,1 N 16,25 16,13 C27H41N7°7S S 5,15 5,28 20 -----------------
Gly: Leu: Arg 1,00:1,01:0,98 51 Cbo-D-Leu-Gly- 51d (5 millimol) eks. 1e C 55,16 55,46 25 Arg-4-MeO-2- Cbo-D-Leu-OpNP 84,0 H 6,25 6,21 NA.HBr (5,5 millimol) N 13,96 13,72 C33H44N7°6Br Br 11'°° 11'18
Gly: Leu:Arg 30 1,00:1,01:0,99 52 CH30-CO-D-Leu- 52f (5 millimol) eks. 7 C 56,18 56,39
Giy-Arg-4-MeO-2- CH30-CO-CI & 6 H 7,08 7,02 NA.AcOH (5,5 millimol) 82,4 N 16,09 15,87 35 C29H43N7°8
Gly: Leu: Arg 1,00:0,99:0,99 53 CH3S02-D-Leu- 52f (5 millimol) eks. 7 C 52,58 52,73 40 Gly-Arg-4-MeO-2- CH3S02-CI &6 H 6,85 6,80 NA.AcOH (5,5 millimol) 77,4 N 15,58 15,37 C28H43N7°8S S 4,92 5/03
Gly: Leu: Arg 45 1,00:1,01:0,98
DK 154221 B
35 54 CHgO-CO-D-Leu- 54f (5 millimol) eks. 7 C 51,23 51,45
Gly-Arg-DPA.- CH30-C0"CI & 6 H 6,65 6,63
AcOH (5,5 millimol) 79,3 N 15,18 15,00 C28H43N7°11 ........
5 Gly:Leu:Arg 1,00:0,99:0,99 55 CHgSC^-D-Leu- 54f (5 millimol) eks. 7 C 47,88 48,13
Gly-Arg-DPA.- CH3S02-CL &6 H 6,50 6,43 10 AcOH (5,5 millimol) 81,2 N 14,75 14,55 C27H43N7°11S S 4,68 4,76
Gly: Leu: Arg 1,00:1,00:0,98 15 _ 56 CHgO-CO-D-Leu- 56f (5 millimol) eks. 7 C 54,48 54,27
Gly-Arg-MCA.- CH30-CO-CI & 6 H 6,72 6,67
AcOH (5,5 millimol) 83,2 N 16,03 15,82 C28H41N7°9 20 Gly: Leu: Arg 1,00:1,01:1,00 57 CH3S02-D-Leu- 56f (5 millimol) eks. 7 C 50,93 50,69
Gly-Arg-MCA.- CH3S02-CI & 6 H 6,51 6,46 25 AcOH (5,5 millimol) 78,4 N 15,53 15,33 C27H41N7°9S S 4,92 5/01
Gly: Leu: Arg 1,00:0,99:0,98 30 _:_ 58 Cbo-D-Leu-Gly- 58d (5 millimol) eks. 1e C 52,88 52,68
Arg-5-N02-1-NA.- Cbo-D-Leu-OpNP 75,8 H 5,69 5,66 HBr (5,5 millimol) N 15,53 15,36 C32H41N8°7Br Br 10,82 10,95 35 -----------------
Gly: Leu: Arg 1:,00:1,01:0,99 1 2 3 4 5 CH3S02-D-Leu- 59f (5 millimol) eks. 7 C 50,08 49,68 2 40 Gly-Arg-5-N02- CH3S02-CI & 6 H 6,24 6,18 3 1-NA.AcOH (5,5 millimol) 80,8 N 17,29 17,17 4 C27H40N8°9S S 4,82 4,91
Gly: Leu: Arg 5 45 1,00:1,00:0,97
DK 154221B
36 60 Cbo-D-Leu-Gly- 60d (5 miliimol) eks. 1e C 54,28 54,31
Arg-5-ChA.HBr Cbo-D-Leu-OpNP 78,5 H 6,07 6,03 C31H41N8°5Br (5'5 millimo1) N 16'48 16'34
Br 11,54 11,65 5
Gly: Leu: Arg 1,00:0,98:0,98 61 CH3S02-D-Leu- 61f (5 miliimol) eks. 7 C 51,68 51,30 10 Gly-Arg-5-ChA.- CH3S02-CI & 6 H 6,67 6,62
AcOH (5,5 miliimol) 76,5 N 18,52 18,41 C26H40N7°4S S 5/18 5'27
Gly:Leu:Arg 15 1,00:0,99:0,98 62 Cbo-D-Leu-Gly- 62d (5 miliimol) eks. 1e C 51,11 50,96
Arg-8-N02-5- Cbo-D-Leu-OpNP 79,0 H 5,54 5,52
ChA.HBr (5,5 miliimol) N 17,48 17,25 20 C31H40NgO7Br Br 10,76 10,94
Gly: Leu: Arg 1,00:0,98:0,97 25 63 CH3S02-D-Leu- 63f (5 miliimol) eks. 7 C 48,03 47,77
Gly-Arg-8-N02- CH3SC>2-CI & 6 H 6,07 6,01 5-ChA.AcOH (5,5 miliimol) 75,7 N 19,44 19,28 C26H39N9°9S S 4/83 4'91 30 Gly: Leu: Arg 1,00:0,98:0,97 1 BOC-D-Nval-But- 64d (5 miliimol) eks. 1e C 47,45 47,34
Arg-pNA.HBr BOC-D-Nval-OpNP 74,6 H 6,61 6,57 35 C26H43Ng07Br (5,5 miliimol) N 17,24 16,99
Br 11,88 12,11
Nval: But: Arg 1,00:0,98:0,98 40 _:_;_
DK 154221 B
37 65 BOC-D-Nval-N(n- 65d (5 millimol) eks. le C 49,08 48,91
Bu)Gly-Arg- BOC-D-Nval-OpNP 66,3 H 6,95 6,89 pNA.HBr (5,5 millimol) N 16,53 16,30 C28H47N8°7Br Br 11,41 11,62 5 —--------------
Nval: Arg 1,00:0,98 66 3-Naphthyl-S02_ 7f (5 millimol) eks. 7 C 49,25 48,98 10 D-Leu-Gly-Arg- &-NA-S02-CI 80,2 H 5,41 5,34 pNA.HBr (5,5 millimol) N 15,43 15,23 C30H39N8°7SBr Br 10,70 10,86 S 4,15 4,36 15 Gly:Leu:Arg 1,00:0,98:0,97 67 4-Me-Cbo-D-Leu- Id (5 millimol) eks. le C 55,68 55,35
Gly-Arg-pNA.AcOH 4-Me-Cbo-D-Leu- & 6 H 6,64 6,59 20 C31H44N8°9 0pNP 75,0 N 16,85 16,66 (5,5 millimol) ----------------
Gly: Leu: Arg 1,00:1,01:0,99 25 68 4-CI-Cbo-D-Leu- 1d (5 millimol) eks. le C 52,18 51,98
Gly-Arg-pNA.- 4-Cl-Cbo-D-Leu- & 6 H 5,99 5,96
AcOH OpNP 69,3 N 16,25 16,17 C30H4TN8°9CI (5,5 mi!limoI) Cl 5'03 5'12 30 Gly: Leu: Arg 1,00:1,01:0,98 69 BOC-D-(a)-AOA- Id (5 millimol) eks. 1e C 53,45 53,36
Gly-Arg-pNA.- BOC-D-(a)-AOA- & 6 H 7,51 7,41 35 AcOH OpNP 65,4 N 17,38 17,17 C29H48N8°9 (5,5 ................
Gly: Arg 1,00:0,99 1 2 3 4 5 6 70 Cbo-D-Thr(OtBu)- Id (5 millimol) eks. 1e C 54,19 54,69 2
Gly-Arg-pNA.- Cbo-D-Thr- & 6 H 6,66 6,60 3
AcOH (OtBu)OpNP 78,4 N 16,17 15,95 4 ^32^46^8^10 5,5 ---------------- 5
Gly:Thr: Arg 6 1,00:0,96:0,98
DK 154221 B
38 71 Cbo-D-Thr-Gly- 70 (5 millimol) eks. Id C 51,88 52,01
Arg-pNA.AcOH CF3COOH & 6 H 5,95 5,92 C28H38N8°10 C1° mil,imol) 82,0 N 17'45 17'33 5 Gly:Thr:Arg 1,00:0,97:0,98 72 Cbo-D-Thr(OMe)- 1d (5 millimol) eks. le C 52,15 52,72
Gly-Arg-pNA.- Cbo-D-Thr(OMe)- & 6 H 6,13 6,10 10 AcOH OpNP 75,5 N 17,20 16,96 C29H40N8°10 (5/5 millimol) ................
Gly:Arg 1,00:0,98 15 73 Cbo-D-Thr(OBzl)- 1d (5 millimol) eks. 1e C 56,50 57,06
Gly-Arg-pNA.- Cbo-D-Thr(OBzl)- S 6 H 6,07 6,02
AcOH OpNP 81,2 N 15,45 15,21 C35H44N8°10 (5.5 millimol) ................
Gly:Arg 20 1,00:1,00 74 Cbo-D-Asp-Gly- 19 (5 millimol) eks. Id C 51,66 52,00
Arg-pNA CFgCOOH & 6 H 5,43 5,37 C26H32N8°9 05 miIlimo1) 85,0 N 18'95 18,66 25 ----------------
Gly: Asp: Arg 1,00:0,98:1,01 75 Cbo-D-Glu-Gly- 18 (5 millimol) eks. 1d C 52,21 52,76 30 Arg-pNA CFgCOOH & 6 H 5,61 5,58 C27H34N8°9 Π5 mi,limo|5 82,4 N 18,48 18,23
Gly:Glu: Arg 1,00:0,97:0,99 35 -_ 76 Cbo-D-Glu(y- 1d (5 millimol) eks. le C 51,84 52,32 OMe)-Gly-Arg- Cbo-D-Glu- & 6 H 5,89 5,85 pNA.AcOH (i-OMe)-OpNP 78,6 N 16,47 16,27 C30H40N8°11 (5*5 ---------------- 40 GIy:Glu:Arg 1,00:1,01:0,98
DK 154221 B
39 77 Cbo-D-Asp(&- Id (5 millimol) eks. le C51,48 51,63 OMe)-Gly-Arg- Cbo-D-Asp- & 6 H 5,71 5,68 pNA.AcOH (β-ΟΜβ)-ΟρΝΡ 78,9 N 16,93 16,61 C29H38N8°11 (5,5 millimol) ---------------- 5 Gly:Asp:Arg 1,00:1,02:1,00 78 Cbo-D-G!u(2f- 1d (5 millimol) eks. le C 55,38 55,99 OBzi)-Gly-Arg- Cbo-D-Glu(*- & 6 H 5,68 5,64 10 pNA.AcOH OBzl)-OpNP 76,7 N 15,09 14,93 ^35^42^8^11 (5,5 ----------------
Gly:Glu:Arg 1,00:0,98:0,99 15 79 Cbo-D-Asp(3- Id (5 millimol) eks. 1e C 55,03 55,43 OBzl)-Gly-Arg- Cbo-D-Asp({5- & 6 H 5,51 5,47 pNA.AcOH OBzl)-OpNP 74,8 N 15,48 15,21 C34H40N8°11 (5'5 miliimo^ ................
Gly: Asp: Arg 20 1,00:0,99:0,97 80 Cbo-D-Aadi(6- 1d (5 millimol) eks. le C 54,13 54,83
OtBu)-Gly-Arg- Cbo-D-Aadi(6- & 6 H 6,57 6,50 pNA.AcOH OtBu)-OpNP 71,5 N 15,29 15,05 25 C34^48N8°11 (5,5 ----------------
Gly: Arg 1,00:0,98 81 Cbo-D-Aadi-Gly- 80 (5 millimol) eks. 1d C 52,97 53,50 30 Arg-pNA CFgCOOH & 6 H 5,83 5,77 C28H36N8°9 (15 millimol) 81,1 N 18,05 17,83
Gly: Arg 1,00:0,99 35 _ 82 Cbo-D-Aadi(6- 1d (5 millimol) eks. 1e C 56,53 57,06 OBzl)-Gly-Arg- Cbo-D-Aadi(6- & 6 H 6,00 5,95 pNA.AcOH OBzl)-OpNP 73,9 N 14,65 14,39 <"37t^46N8011 (5,5 millimol) 40 Gly: Arg 1,00:0,99
Tabel II
DK 154221 B
40
Eks. Aminosyre- eller Udgangspro- nr. dipeptidmellem- dukt Metode, Elementæranalyse produkt (millimol) udbytte % fundet %, ber. % 5 - 21c Cbo-Sar-Arg-pNA.- Ib (10 mmol) eks. le C 47,88 47,59 HBr Cbo-Sar-OpNP 84,1 H 5,25 5,21 C23H30N7°6Br (1Ί mmol) N 17'08 16'89
Br 13,50 13,77 10 21d 2HBr.H-Sar-Arg- 21c (7 mmol) eks. 1d C 34,50 34,17 pNA 2N HBr/AcOH 91,2 H 4,82 4,78 C15H25N7°4Br2 N 18,91 18,60
Br 30,06 30,31 22c Cbo-Ala-Arg-pNA.- Ib (10 mmol) eks. 1c C 47,69 47,59 15 HBr Cbo-Ala-OpNP 83,6 H 5,28 5,21 C23H30N7°gBr (11 mmol) N 16,95 16,89
Br 13,46 13,77 22d 2HBr.H-Ala-Arg- 22c (7 mmol) eks. Id C 34,28 34,17 pNA 2N HBr/AcOH 93,6 H 4,79 4,78 20 Cl5H25N7°4Br2 N 18,90 18,60
Br 29,88 30,31 25c Cbo-N(Et)Gly-Arg- 1b (10 mmol) eks. 1c C 48,62 48,49 pNA.HBr Cbo-N(Et)Gly- 86,0 H 5,48 5,43 C24H32N7°6Br 0pNP N 16,55 16,49 25 (11 mmol) Br 13,25 13,44 25d 2HBr.H-N(Et)Gly- 25c (7 mmol) eks. Id C 35,70 35,51
Arg-pNA 2N HBr/AcOH 94,0 H 5,09 5,03 C16H27N7°4Br2 N 18,30 18,12
Br 29,22 29,53
DK 154221 B
41 26c Cbo-N(Pr)Gly-Arg- Ib (10 mmol) eks. 1c C 50,08 49,35 pNA.HBr Cbo-N(Pr)Gly- 82,5 H 5,69 5,63 C25H34N7°6Br 0pNP N 16,36 16,11 (11 mmol) Br 12,88 13,13 5 26d 2HBr.H-N(Pr)Gly- 26c (7 mmol) eks. 1d C 36,68 36,77
Arg-pNA 2N HBr/AcOH 88,5 H 5,31 5,26 C17H9QN70,Br9 N 17,96 17,66
Br 28,58 28,78 48c Cbo-Gly-Arg-2- 4b (5 mmol) eks. 4c C 54,24 54,64 10 NA.HBr Cbo-Gly-OpNP 75,6 H 5,52 5,47 C26H31N6°4Br (5,5 mmol) N 14,95 14,71
Br 13,75 13,98 48d 2HBr.H-Gly-Arg-2- 48c (5 mmol) eks. 4d C 41,50 41,72 ΝΑ 2N HBr/AcOH 90,6 H 5,10 5,06 15 C18H26N6°2Br2 N 16,62 16,22
Br 30,15 30,84 51c Cbo-Gly-Arg-4- 5b (5 mmol) eks. 5c C 53,41 53,91
MeO-2-NA.HBr Cbo-Gly-OpNP 88,4 H 5,55 5,53 ^27^33^6^5Br (5,5 mmo^ N 14,22 13,97 20 Br 12,95 13,28 51 d 2HBr.H-Gly-Arg-4- 51c (5 mmol) eks. 5d C 41,32 41,62
MeO-2-NA 2N HBr/AcOH 90,9 . H 5,19 5,15 C19H28N6°3Br2 N 15,54 15,33
Br 28,85 29,15 25 58a Cbo-Arg-5-N02-1- Cbo-Arg-OH.HCI eks. 3a C 55,65 55,98 NA.HCI (25 mmol) 38,7 H 5,31 5,28 C24H27N6°5Cl 5-N02-1-naph- N 16,54 16,32 thylamin Cl 6,77 6,89 (25 mmol) 58b 2HBr.H.Arg-5-N02- 58a C5 mmol) eks. 4b C 37,85 37,96 1-NA 2N HBr/AcOH 88,5 H 4,41 4,38
DK 154221 B
42 C16H22N6°3Br2 N 16,78 16,60
Br 31,10 31,57 5 58c Cbo-Gly-Arg-5-N02- 58b (3 mmol) eks. 4c C 50,25 50,66 1-NA.HBr Cbo-Gly-OpNP 78,6 H 4,99 4,91 ^26^30^7^6Br (3,3 N 16,10 15,91
Br 12,76 12,96 58d 2HBr.H-Gly-Arg-5- 58c (2,5 mmol) eks. 1d C 38,17 38,38 10 N02-1-NA 2N HBr/AcOH 91 H 4,51 4,47 C18H25N7°4Br2 N 17,68 17,41
Br 28,00 28,37 60a Cbo-Arg-5-ChA.HCI Cbo-Arg-OH.HCI eks. 3a C 58,09 58,66 C23H27N6°3CI (25 mmo,) 81,9 H 5,84 5,78 15 5-aminoquinolin N 18,06 17,85 (25 mmol) Cl 7,44 7,53 60b 2HBr.H-Arg-5-ChA 60a (5 mmol) eks. Id C 38,75 38,98 C15H22N6OBr2 2N HBr/Ac0H 81'8 H ^88 4'80 N 18,45 18,18 20 Br 33,88 34,58 60c Cbo-Gly-Arg-5- 60b (3 mmol) eks. 4c C 52,17 52,45
ChA.HBr Cbo-Gly-OpNP 68,5 H 5,32 5,28 C25H30N7°4Br (8,8 mmol) N 17,17 17,18
Br 13,63 13,96 25 60d 2HBr.H-Gly-Arg-5- 60c (2,5 mmol) eks. Id C 39,19 39,32
ChA 2N HBr/AcOH 78,3 H 4,90 4,85 C17H25N7°2Br2 N 19,11 18,88
Br 30,45 30,78
DK 154221 B
43 62a Cbo-Arg-8-N02-5- Cbo-Arg-OH.HCI eks. 3a C 53,14 53,54
ChA.HCI (25 mmol) 33,0 H 5,11 5,08 C23H26N7°5CI 5-NH2-8-N02- N 19,21 19,00 quinolin Cl 6,80 6,87 5 (25 mmol) 62b 2HBr.H-Arg-8-N02- 62a (5 mmol) eks. 1d C 35,42 35,52 5-ChA 2N HBr/AcOH 84,2 H 4,20 4,17 C15H21N7°3Br2 N 19,50 19,33
Br 30,99 31,51 10 62c Cbo-Gly-Arg-8-N02- 62b (3 mmol) eks. 4c C 48,32 48,63 5-ChA.HBr Cbo-Gly-OpNP 68,5 H 4,77 4,73 ^25^29^8^6Br (3,3 mmo^ N 18,28 18,15
Br 12,74 12,94 62d 2HBr.H-Gly-Arg-8- 62c (2,5 mmol) eks. Id C 36,00 36,19 15 N02-5-ChA 2N HBr/AcOH 76,9 H 4,33 4,29 C17H24N8°4Br2 N 20,05 19,86
Br 27,95 28,32 64c Cbo-But-Arg-pNA.- 1b (5 mmol) eks. 1c C 48,55 48,49 HBr Cbo-But-OpNP 80,4 H 5,47 5,43 20 C24H32N7°6Br (5,5 mmol) N 16,75 16,49
Br 13,20 13,44 64d 2HBr.H-But-Arg- 64c (3 mmol) eks. Id C 35,27 35,51 pNA 2N HBr/AcOH 84,8 H 5,03 5,03 C16H27N7°4Br2 N 18,38 18,12 25 Br 29,25 29,53
DK 154221 B
44 65c Cbo-N(n-Bu)Gly- Ib (5 mmol) eks. 1c C 49,75 50,16
Arg-pNA. HBr Cbo-N(n-Bu)- 68,2 H 5,85 5,83 C26H36N7°6Br Gly-OpNP N 15,90 15,75 (5,5 mmol) Br 12,63 12,84 5 65d 2HBr.H-N(n-Bu)- 65c (2,5 mmol) eks. 1d C 37,88 37,97
Gly-Arg-pNA 2N HBr/AcOH 80,7 H 5,54 5,49 C18H31N7°4Br2 N 17,50 17,22
Br 27,70 28,07
Tabe! Ill 10 Eks. Tripeptidmellem- Udgangsprodukt Metode, Elementæranalyse nr. produkt (millimol) udbytte %fundet % ber. % 7f 2HBr.H-D-Leu- 1 (5 millimol) eks. 2d C 38,09 38,35
Gly-Arg-pNA 2N HBr/AcOH 96,3 H 5,41 5,47 15 C20H34N8°5Br2 N 17,95 17,89
Br 25,42 25,51 23f 2HBr.H-D-NIeu- 8 (5 millimol) eks. 2d C 38,18 38,35
Gly-Arg-pNA 2N HBr/AcOH 93,4 H 5,52 5,47 C20H34N8°5Br2 N 18,06 17,89 20 Br 25,20 25,51 35f 2HBr.H-D-Leu- 22 (5 millimol) eks. 2d C 39,15 39,39
Sar-Arg-pNA 2N HBr/AcOH 92,1 H 5,70 5,67 C21H36N8°5Br2 N 17,81 17,50
Br 24,81 24,96 25 38f 2HBr.H-D-Nval- 9 (5 millimol) eks. 2d C 37,02 37,27
Gly-Arg-pNA 2N HBr/AcOH 91,8 H 5,33 5,27 C19H32N8°5Br2 N 18,55 18,30
Br 25,88 26,10 / 41f 2HBr. H-D-Nval- 30 (5 millimol) eks. 2d C 38,38 38,35
Sar-Arg-pNA 2N HBr/AcOH 95,5 H 5,54 5,47
DK 154221 B
45 C20H34N8°5Br2 N 18,10 17,89
Br 25,25 25,51 5 45f 2HBr.H-D-CHA- 11 (5 millimol) eks. Id C 41,50 41,45
Gly-Arg-pNA 2N HBr/AcOH 82,3 . H 5,77 5,75 C23H38N8°5Br2 N 17,07 16,82
Br 23,71 23,98 49f 2HBr.H-D-Leu- 48 (5 millimol) eks. 1d C 45,43 45,73 10 Gly-Arg-2-NA 2N HBr/AcOH 78,5 H 5,81 5,76 C24H36N7°3Br2 N 15,81 15,55
Br 25,05 25,35 52f 2HBr.H-D-Leu-Gly- 51 (5 millimol) eks. Id C 45,18 45,47
Arg-4-MeO-2-NA 2N HBr/AcOH 76,9 H 5,83 5,80 15 C25H38N7°4Br2 N 15,03 14,85
Br 23,85 24,20 54f 2HBr.H-D-Leu-Gly- 3e (5 millimol) eks. Id C 41,20 41,39
Arg-DPA 2N HBr/AcOH 76,9 H 5,55 5,50 C24H38N7°7Br2 N 14,23 14,08 20 Br 22,66 22,95 56f 2HBr.H-D-Leu-Gly- 2e (5 millimol) eks. Id C 43,17 43,52
Arg-MCA 2N HBr/AcOH 80,8 H 5,51 5,48 C24H36N7°5Br2 N 15,00 14,80
Br 23,81 24,13 25 59f 2HBr.H-D-Leu-Gly- 58 (5 millimol) eks. Id C 42,51 42,68
Arg-5-N02-1-NA 2N HBr/AcOH 68,4 H 5,24 5,22 C24H35N8°5Br2 N 16,83 16,59
Br 23,45 23,66 61f 2HBr.H-D-Leu-Gly- 60 (5 millimol) eks. 1d C 43,68 43,75
Arg-5-ChA 2N HBr/AcOH 75,3 H 5,61 5,59
DK 154221 B
46 C23H35N8°3Br2 N 17,95 17,75
Br 25,08 25,31 5 63f 2HBr.H-D-Leu-Gly- 62 (5 millimol) eks. Id C 40,75 40,84
Arg-8-N02-5-CKA 2N HBr/AcOH 72,7 H 5,10 5,07 C23H34N9°5Br2 N 18,95 18,64
Br 23,30 23,63
Opløseligheden af forbindelserne, der er beskrevet i de forudgående 10 eksempler, og som er anvendt som substrat til bestemmelse af faktor Xa, blev bestemt ved følgende testteknik:
En overskydende mængde af substratet blev omrørt sammen med 1 ml destilleret vand i 10 minutter ved stuetemperatur. I kke-opløst substrat blev fjernet ved centrifugering. 0,1 ml af den resterende op-15 løsning eller, i tilfælde af høj opløselighed af substratet, 0,1 ml af den resterende opløsning fortyndet i forholdet 1:10, blev sat til en blanding af 1,8 ml Tris-imidazolpuffer (pH-værdi 8,4, ionstyrke 0,2) og 0,1 ml trypsinopløsning (indeholdende 450 NF enheder Trypure®
Novo, København, pr. ml) i testkuvetter ved 37°C. Substratets 20 hydrolyse blev fulgt i et spektrofotometer ved 405 nm, indtil substratet var fuldstændigt hydrolyseret af trypsin, dvs. indtil den optiske tæthed (OD) af testblandingen var konstant. Forskellen mellem den konstante optiske tæthed og den optiske tæthed i starten kaldes ODtota|· Værdien af er et mål for mængden af p-nitroanilin, 25 der er frigjort fra substratet ved hjælp af trypsin. Da det støkiometriske forhold mellem frigjort p-nitroanilin og substratet er 1:1, kan opløseligheden af substratet i vand beregnes i mg/ml ifølge nedenstående formel:
DK 154221 B
47 ODtotai x dil x V x mwt = mg/ml ε405 x v x 1000 hvor 5 dil = fortynding V = slutvolumen af testblandingen i ml mwt = substratets molekylvægt ε405 = m'0im°lær ekstinktionskoefficient for p-nitroanilin ved 405 -1 -1 nm = 10,4 liter x mmol x cm 10 v = tilsat volumen substratopløsning.
De ifølge eksempel 9, 23, 32, 45, 46 og 47 fremstillede forbindelser samt HCI.Bz-lle-Gly-Gly-Arg-pNA (forbindelse I) (markedsført under betegnelsen S-2222 som substrat for Xa) beskrevet i dansk patentskrift nr. 145.461 B og Cbo-p-Glu-Gly-Arg-nNA (forbindelse XII) beskrevet 15 i dansk patentskrift nr. 147.495B blev underkastet den ovenfor beskrevne opløselighedstest. Testresultaterne fremgår af nedenstående fabel:
Eksempel Opløselighed i mg/ml vand 20 9 29 23 189 32 265 45 168 46 120 25 47 192 I 9,6 XII 13
Denne tabel viser, at de ifølge eksemplerne 9, 23, 32, 45, 46 og 47 fremstillede forbindelser, som er repræsentative forbindelser ifølge 30 krav 1, signifikant er mere opløselige i vand end de i dansk patentskrift nr. 145.461 B og dansk patentskrift nr. 147.495B, beskrevne forbindelser, henholdsvis forbindelser I og forbindelser XII.
DK 154221B
48
De omhandlede tripeptiderivaters følsomhed overfor faktor Xa illustreres numerisk i nedenstående tabel IV og sammenlignes med følsomheden hos det kendte substrat Bz-lle-Glu(Y-OH)-Gly-Arg-pNA.HCI.
5 Tabe! IV
Aktivitet af 1 ml vandig opløsning af bovinfaktor Xa og af faktor Xa opnået ved aktivering af faktor X i 1 ml normalt humant blodplasma ved hjælp af RW, udtrykt i nanomol spaltningprodukt H-R frigjort pr. minut.
10 Substratkoncentration Bovinfaktor Humanfaktor 2 x 10"4 Xa Xa
Substrater ifIg. eks.
1 2560 1520 15 2 1180 760 3 1405 985 4 1290 895 5 1140 815 6 2550 1520 20 7 950 705 8 2780 1568 9 2010 1105 10 1332 825 11 1960 1528 25 12 1526 1800 13 1936 1548 14 1436 1468 15 1630 1320 16 1320 1285 30 17 1385 1235 18 1290 660 19 1045 595
DK 154221 B
49 20 1675 795 21 1555 1432 22 985 580 23 2214 ί000 5 24 2280 820 25 1205 495 26 1025 435 27 2028 1656 28 1940 1840 10 29 1986 1608 30 1160 1016 31 1070 695 32 1560 987 33 1040 560 15 34 1380 890 35 980 620 36 825 570 37 600 420 38 550 420 20 39 560 425 40 555 415 41 980 1200 42 850 1060 43 2440 1360 25 44 2540 1430 45 2260 1260 46 3230 1420 47 2660 1770 48 1420 995 30 49 1540 1065 50 1520 985 51 1280 1025 52 1370 965 53 1410 1005 35 54 1490 1010 55 1515 1030
DK 154221 B
50 56 1235 795 57 1280 810 58 1180 830 59 1265 875 5 60 1005 660 61 1145 745 62 965 715 63 1080 735 64 795 440 10 65 850 360 66 940 635 67 2530 1380 68 2480 1365 69 2210 1690 15 70 915 830 71 610 415 72 780 630 73 1020 845 74 750 465 20 75 830 505 76 1880 1420 77 1230 1080 78 1990 1515 79 1280 1055 25 80 2080 1290 81 1030 905 82 2260 1460
Sammenligningsubstrat0 490 820 30 0 Bz-lle-Glu(y-OH)-Gly-Arg-pNA.HCI (beskrevet i dansk patentskrift nr. 145.461 B).
Værdierne for aktiviteten af faktor Xa i tabel IV bestemmes eksperimentelt pi følgende måde:
DK 154221 B
51
Eksempel 83.
Analyse af faktor X I blodplasma 0,01 ml normalt humant blodplasma inkuberes sammen med 0,20 ml af en 25 millimolær vandig CaC^-opløsning indeholdende 0,01 mg renset 5 Russel-hugormegift (RW) i 75 sekunder ved 37°C for at aktivere faktor X i plasmaet til dannelse af faktor Xa. Til det resulterende in kubat sættes 1,6 ml Tris-imidazolpuffer (pH 8,4, ionstyrke 0,3, 37°C) og derefter 0,20 ml af en 4 millimolær vandig opløsning af den ifølge eksempel 47 fremstillede forbindelse. Efter omrøring af blan-10 dingen optegnes forøgelsen i den optiske tæthed (AOD) pr. minut. AOD-værdien pr. minut har en værdi på 0,092. Ud fra denne værdi beregnes mængden af faktor Xa i 1 ml plasma i enzymenheder ifølge nedenstående formel:
AOD/minut x V
15 - ε405 x v hvbr V betegner slutvolumenet af testblandingen, ε betegner den molære ekstinktions koefficient (10,4) målt ved 405 nm, og v betegner plasmavolumenet. Den beregnede værdi er 1,77 enzymenheder som målt 20 med substratet fra eksempel 47 pr. ml plasma.
1 enzymenhed er den mængde enzym, som hydrolyserer 1 ymol substrat pr. minut under givne testbetingelser.
Eksempel 84.
Bestemmelse af antifaktor Xa 25 Der fremstilles en testprøve, idet humant citratplasma fortyndes med Tris-imidazolpuffer, pH 8,4, ionstyrke 0,3, i forholdet 1:10. 3 ml "Liquémine" (heparinpræparat markedsført af Hoffmann-La Roche,
Basel, Schweiz) fortyndes med Tris-imidiazolpuffer (pH 8,4, ionstyrke
DK 154221 B
52 0,3) til 1 liter. Til 0,10 ml af den vundne heparinopløsning sættes 0,10 ml af det fortyndede plasma, og blandingen inkuberes i 2 minutter ved 37°C.
Til inkubatet sættes 0,05 ml af en 8,5 enheders faktor Xa/ml vand-5 holdig opløsning af faktor Xa-præparatet "Diagen" (fra Diagnostic Reagents Ltd., Thame, Storbritannien). Blandingen inkuberes i 3 minutter ved 37°C.
Inkubatet fortyndes med 0,65 ml Tris-imidazolpuffer ved 37°C og _3 blandes straks med 0,10 ml af en til 37°C opvarmet 4 x 10 molær, 10 vandig opløsning af CFLO-CO-D-CHA-Gly-Arg-pNA.AcOH (eksempel 45).
I et parallelforsøg fremstilles en blindprøve på samme måde, idet der dog i stedet for det fortyndede plasma anvendes samme volumenmængde puffer.
15 For begge prøver (testprøve og blindprøve) måles forøgelsen i den optiske tæthed spektrofotometrisk ved 405 nm.
Ifølge nedenstående formel kan antifaktor Xa (= antithrombin 111) udregnes i enzymatiske inhibitorenheder (IU) pr. ml citratplasma.
Disse lU-værdier gælder kun for det ovennævnte substrat: 20 lU/ml plasma = (AOD/minut/blindprøve - AOD/mi nut/testprøve) 405 nm x V x f v x ερΝΑ I formlen angiver: 25 V = testvolumenet i kuvetten (1,0 ml) f = fortyndingsfaktor 1:10 (10) v = volumen for plasmafortynding (0,1 ml) ερΝΑ = millimolær ekstinktionskoefficient for p-nitroanilin ved 405 -1 -1 nm (liter x miliimol x cm ) (10,4).
53
DK 154221 B
TabeI V
Bestemmelsesmængde AOD/minut Udregnet antifaktor Xa-enheder pr. ml plasma ifølge ovenstående formel 5 _:_„___
Blindprøve 0,1487 — 0,0 ml plasma
Prøve med
10 0,10 ml plasma 0,0077 2,63 IU
Eksempel 85.
\
Bestemmelse af heparin i blodplasma
Citratplasma fra to patienter, som er i hepa ri nterapi, anvendes som 15 prøve til bestemmelse af heparin. Til 0,10 ml af en med Tris-imidazol-puffer (pH-værdi 8,4, ionstyrke 0,3) i forholdet 1:10 fortyndet plasmaprøve sættes 0,03 ml af en vandig opløsning af bovinfaktor Xa i diagen-opløsning opløst i 1,0 ml destilleret vand (1 ampul "Diagen", Lot XA 32; fra Firma Diagnostic Reagents Ltd., Thame, Storbritannien).
20 Blandingen inkuberes i 3 minutter ved 37°C.
Inkubatet fortyndes med 0,77 ml Tris-imidazolpuffer ved 37°C. Det fortyndede inkubat blandes straks med 0,10 ml af en til 37°C opvarmet 4 x 10 ^ molær vandig opløsning af CH^O-CO-D-CHA-Gly-Arg-pNA.-AcOH (eksempel 45), hvorefter forøgelsen i optisk tæthed ved 405 25 nm/minut måles.
En første blindprøve fremstilles på samme måde, idet der dog i stedet for det fortyndede plasma anvendes den samme volumenmængde puffer.
En anden blindprøve fremstilles på samme måde under anvendelse af plasma i stedet for patientplasma.
»
DK 154221 B
54
Der fremstilles en antifaktor Xa-prøve, idet der til 0,1 ml af en 1:10 med puffer fortyndet prøve af patientplasma sættes 0,10 ml af en hepa-rinopløsning i Tris-imidazolpuffer, som indeholder 0,3 USP-enheder heparin/ml, og blandingen inkuberes i 2 minutter.
5 Til inkubatet sættes 0,03 ml faktor Xa-opløsning, og der inkuberes i 3 minutter ved 37°C.
Derefter fortyndes inkubatet med 0,67 ml Tris-imidazolpuffer ved 37°C og blandes straks derefter med 0,10 ml af en til 37°C forvarmet 4 x _3 10 molær CHgO-CO-D-CHA-Gly-Arg-pNA.AcOH-opløsning (eksempel 10 45), hvorefter forøgelsen i optisk tæthed ved 405 nm/minut måles.
Tabel VI
Testprøve AOD/minut (AOD blindprøve - Antifaktor Xa
AOD testprøve)- IU
/minut 15 _
Blindprøve 1 0,1610
Blindprøve 2 0,1315 0,0295 0,55
Testprøve 1 0,1161 0,0449 0,84
Testprøve 2 0,0906 0,0704 1,32 20 Antifaktor Xa
Testprøve 1 0,0068 0,1542 2,88
Antifaktor Xa
Testprøve 2 0,0083 0,1527 2,85 25 lU-Værdierne beregnes ved den i eksempel 84 angivne formel.
Forskellen; mellem de ved blindprøve 1 (uden plasma) og med antifaktor Xa-prøve vundne værdier viser det totale hæmningsområde, dvs. henholdsvis 2,88 IU og 2,85 IU.
Antifaktor Xa (= heparincofaktor) alene uden heparin hæmmer kun 30 faktor Xa langsomt, så at der ved kort inkubationstid kun hæmmes
Claims (9)
1. Tripeptidderivater, kendetegnet ved, at de har den almene formel I O O R1 - D - NH - CH - C - N - CH - ί - Arg - R5 I 25 k2 R3 R4 hvor R1 betegner en alkanoylgruppe med 2-4 carbonatomer, en phenylalkanoylgruppe med 2-4 carbonatomer i alkanoyldelen, og hvis phenylradikal kan være substitueret med en aminogruppe i p-stillin-gen, en cyclohexylcarbonylgruppe, en benzoylgruppe, som kan være 30 substitueret med methyl eller halogen såsom chlor eller brom i o- eller DK 154221 B p-stijlingen, en alkoxycarbonylgruppe med 1-8 carbonatomer i alkoxydelen, en benzyloxycarbonylgruppe, som kan være substitueret med methoxy, methyl eller chlor i p-stillingen, en alkylsulfonylgruppe med 1-4 carbonatomer, en phenylsulfonylgruppe, der kan være 5 methyleret i p-stillingen, eller en a- eller β-naphthylsulfonylgruppe, R2 betegner et ligekædet eller forgrenet alkylradikal med 2-6 carbonatomer, et 1-hydroxyethylradikal, et 1-alkoxyethylradikal med 1 -4 carbonatomer i alkoxydelen, et 1-benzyloxyethylradikal, et ω-car-boxyalkyl- eller w-alkoxycarbonylalkylradikal med 1-3 carbonatomer i 10 alkyldelen, og hvis alkoxygruppe er ligekædet eller forgrenet og indeholder 1-4 carbonatomer, et ω-benzyloxycarbonylalkylradikal med 1 - 3 carbonatomer i alkyldelen eller et cyclohexyl-, cyclohexyl-methyl-, 4-hydroxycyclohexylmethyl-, phenyl-, benzyl-, 4-hydroxy-benzyl- eller imidazol-4-yl-methylradikal,
15 R3 betegner hydrogen eller et ligekædet eller forgrenet alkylradikal med 1-4 carbonatomer, R1 betegner hydrogen eller et methyl- eller ethylradikal, og RB betegner p-nitrophenylamino, 3-naphthylamino, 4-methoxy-3-naph-thylamino, 5-nitro-a-naphthylamino, quinon-5-yl-amino, 8-nitro-qui-20 non-5-yl-amino, 4-methyl-cumar-7-yl-amino eller 1,3-di(methoxycar-bonyl)phen-5-yl-amino (afledt af 5-amino-isophthalsyre-dimethylester), bortset fra tripeptidderivater, hvori R1 er benzyloxycarbonyl, og R2 er isopropyl eller cyclohexyl, eller er salte deraf med syrer.
2. Salte af tripeptidderivater ifølge krav 1, 25 kendetegnet ved, at den stærkt basiske quanidinogruppe i arginin er stabiliseret ved protonering med en mineralsyre eller en organisk syre.
3. Tripeptidderivater ifølge krav 1 og 2, kendetegnet ved, at guanidinogruppen i arginin er stabili-30 seret ved protonering med eddikesyre. Tripeptidderivater ifølge krav 1, kendetegnet ved, at de er benzyloxycarbonyl-D-Leu-Gly-Arg-p-nitroanilid-AcOH, benzyloxycarbonyl-D-Leu-Sar-Arg-p-nitroanilid-AcOH, DK 154221 B benzyloxycarbonyl-D-Ph'Gly-Gly-Arg-p-nitroanilid-AcOH, benzyloxyca rbonyl-D-Nleu-Gly-Arg-p-nitroanifid-AcOH, benzyloxyca rbonyl-D-Nleu-Sar-Arg-p-nitroanilid-AcOH, benzyloxyca rbonyl-D-Nval-G ly-Arg-p-nitroanilid-AcQH, 5 benzyloxycarbonyl-D-3-cyclohexylalanin-Gly-Arg-p-nitroanilid-AcOH, benzyloxyca rbonyl-D-3-cyclohexylalanin-Sar-Arg-p-nitroanilid-AcOH, benzyloxyca rbonyl-D-3-(4-hydroxycyclohexyl )alan i n-Gly-Arg-p-nitro-anilid-AcOH, benzyloxycarbonyl-D-3-(4-hydroxycyclohexyl)alanin-Sar-Arg-p-nitro-10 anilid-AcOH, CHgSC^-D-Nleu-Gly-Arg-p-nitroanilid-AcOH, isobutoxy-CO-D-Nleu-Gly-Arg-p-nitroanilid-AcOH, tert.butoxycarbonyl-D-Leu-Gly-Arg-p-nitroanilid-HBr, 4-methoxybenzyloxycarbonyl-D-Leu-Gly-Arg-p-nitroanilid-HBr,
15 CHgO-CO-D-S-cyclohexylalanin-Gly-Arg-p-nitroanHid-AcOH, ^2^5^-S-cyclohexylalanin-G ly-Arg-p-nitroanilid-AcOH, CH^SC^- D-3-cycIohexylalani n-Gly- Arg-p-nitroanilid-AcOH, 4-methylbenzyloxycarbonyl-D-Leu-Gly-Arg-p-nitroanilid-AcOH,
4-CI-benzyloxycarbonyl-D-Leu-Gly-Arg-p-nitroanHid-AcOH, og 20 tert.butoxycarbonyl-D-a-aminooctanoyl-Gly-Arg-p-nitroanilid-AcOH.
5. Fremgangsmåde til kvantitativt at analysere faktor Xa i et medium, som indeholder faktor Xa, kendetegnet ved, at mediet omsættes med et salt af et tripeptidderivat ifølge krav 1, og at der udføres fotometrisk, spektro-25 fotometrisk, fluorescens-spektrofotometrisk eller elektrokemisk måling til bestemmelse af mængden af det farvede eller fluorescerende spalt- 5 ningsprodukt H-R , som frigøres pr. tidsenhed ved den katalytisk hydrolytiske indvirkning af faktor Xa på tripeptidderivatet.
6. Fremgangsmåde til kvantitativt at analysere faktor X i blodplasma, 30 kendetegnet ved, at blodplasma fra mennesker eller varmblodede dyr behandles med en aktivator for kvantitativt at omdanne faktor X til faktor Xa, hvorefter det aktiverede plasma omsættes med DK 154221 B et salt af et tripeptidderivat ifølge krav 1 i et puffersystem, og den 5 mængde spaltningsprodukt H-R , der pr. tidsenhed frigøres ved indvirkning af faktor Xa på tri peptidderivatet, bestemmes.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, 5 kendetegnet ved, at der som aktivator anvendes Russel-hugormegift (RW) eller et thromboplastin reagens.
8. Fremgangsmåde til kvantitativ analyse af heparin i hepariniseret blodplasma via heparin-antithrombin-lll-complexet, kendetegnet ved, at en mængde af faktor Xa, som over- 10 stiger den mængde af faktor Xa, som skal neutraliseres af det heparin-antithrombin-lll-complex, der forekommer i det i testsystemet anvendte plasma, inkuberes med blodplasma, vundet fra en patient i heparin-behandling, i et puffersystem, den mængde af faktor Xa, som ikke er neutraliseret af heparin-antithrombin-lll-complexet i plasmaet, måles 15 ved at omsætte denne med et salt af et tripeptidderivat ifølge krav 1 5 og bestemme den mængde spaltningsprodukt H-R , som frigøres pr. tidsenhed ved indvirkning af ikke-neutraliseret faktor Xa, og heparin-niveauet beregnes ud fra forskellen mellem den overskydende mængde af den i starten værende faktor Xa og mængden af den ikke-neutrali-20 serede faktor Xa.
9. Fremgangsmåde til kvantitativ analyse af antifaktor Xa i humant blodplasma, kendetegnet ved, at der dels fremstilles en testprøve ved fortynding af citreret humant plasma med en pufferopløsning, tilsæt-25 ning af heparin og derefter en bestemt mængde faktor Xa til den fortyndede opløsning, dels fremstilles en blindprøve på samme måde, men under anvendelse af samme volumetriske mængde puffer i stedet for fortyndet plasma, hvorefter begge prøver omsættes med et salt af et tripeptidderivat ifølge krav 1, og forøgelsen i optisk densitet/tids-30 enhed foråsaget af dannelsen af spaltningsprodukt H-R og derudfra mængden af faktor Xa bestemmes, hvorpå mængden af antifaktor Xa i plasmaet beregnes ud fra forskellen mellem faktor Xa-mængden i blindprøven og testprøven.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH113080 | 1980-02-12 | ||
| CH113080 | 1980-02-12 | ||
| CH8100014 | 1981-02-06 | ||
| PCT/CH1981/000014 WO1981002294A1 (fr) | 1980-02-12 | 1981-02-06 | Derives tripeptidiques et leur utilisation pour la determination d'enzymes |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK451981A DK451981A (da) | 1981-10-12 |
| DK154221B true DK154221B (da) | 1988-10-24 |
| DK154221C DK154221C (da) | 1989-05-22 |
Family
ID=4203192
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK451981A DK154221C (da) | 1980-02-12 | 1981-10-12 | Tripeptidderivater og fremgangsmaade til kvantitativt at analysere faktor xa i et xa-holdigt medium, faktor x i blodplasma, heparin i hepariniseret blodplasma eller antifaktor xa i blodplasma |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4440678A (da) |
| EP (1) | EP0034122B1 (da) |
| JP (2) | JPH032879B2 (da) |
| AT (1) | ATE4702T1 (da) |
| AU (1) | AU581050B2 (da) |
| CA (1) | CA1161432A (da) |
| DE (1) | DE3160903D1 (da) |
| DK (1) | DK154221C (da) |
| ES (1) | ES8302780A1 (da) |
| IL (1) | IL62096A (da) |
| NO (1) | NO151787C (da) |
| WO (1) | WO1981002294A1 (da) |
| ZA (1) | ZA81789B (da) |
Families Citing this family (33)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3244030A1 (de) * | 1982-11-27 | 1984-05-30 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Chromogene verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| JPS59112952A (ja) * | 1982-12-21 | 1984-06-29 | Taisho Pharmaceut Co Ltd | ペプチド誘導体 |
| DE3311287A1 (de) * | 1983-03-28 | 1984-10-04 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Verfahren zur fotometrischen bestimmung der aktivierten partiellen thromboplastinzeit und reagenz dazu |
| DE3484912D1 (de) * | 1983-06-03 | 1991-09-19 | Pentapharm Ag | Peptidderivate und deren verwendung als substrate zur quantitativen bestimmung von enzymen. |
| JPS60241900A (ja) * | 1984-05-16 | 1985-11-30 | Nitto Boseki Co Ltd | 新規な第Ｘａ因子活性測定用基質 |
| DE3504405A1 (de) * | 1985-02-08 | 1986-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Bestimmung von prokallikrein |
| GB8504522D0 (en) * | 1985-02-21 | 1985-03-27 | Genetics Int Inc | Electrochemistry of mediators |
| FI860043L (fi) * | 1986-01-06 | 1987-07-07 | Orion Yhtymae Oy | Peptidsubstrat samt foerfarande foer kvantitativ analys av endotoxin. |
| SE8601327D0 (sv) * | 1986-03-21 | 1986-03-21 | Kabivitrum Ab | Nya peptidderivat |
| SE461494B (sv) * | 1986-03-21 | 1990-02-19 | Thorsman & Co Ab | Faestanordning foer en elektrisk kopplingsdosa |
| DE3783966T2 (de) * | 1986-07-29 | 1993-05-27 | Sunstar Inc | Reagens zur pruefung von periodentalen erkrankungen. |
| DE3629175A1 (de) * | 1986-08-28 | 1988-03-17 | Behringwerke Ag | Chromogene verbindungen, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung |
| US5110727A (en) * | 1987-04-03 | 1992-05-05 | Cardiovascular Diagnostics, Inc. | Method for performing coagulation assays accurately, rapidly and simply, using dry chemical reagents and paramagnetic particles |
| US5115099A (en) * | 1988-06-14 | 1992-05-19 | Nitto Boseki Co., Ltd. | Substrates for determination of enzyme activity and intermediates for synthesis of the substrates as well as process for producing the intermediates |
| JPH06104079B2 (ja) * | 1988-07-14 | 1994-12-21 | 日東紡績株式会社 | 新規な酵素活性測定用基質 |
| WO1990003577A1 (en) | 1988-09-30 | 1990-04-05 | The University Of Vermont And State Agricultural College | Immunoassays for catalytically-active, serine proteases |
| US5320945A (en) * | 1989-07-14 | 1994-06-14 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method and reagent for the determination of antithrombin III |
| EP0440775B1 (en) * | 1989-08-17 | 1995-08-30 | Dade Produktions AG | Factor ix chromogenic assay |
| FR2658519B1 (fr) * | 1990-02-19 | 1995-07-07 | Serbio | Substrats peptidiques pour identification du facteur xa. |
| US6348570B1 (en) * | 1991-08-16 | 2002-02-19 | Merck & Co., Inc. | Chromophore containing compounds and their use in determining interleukin-1β convertase activity |
| US5308756A (en) * | 1991-11-20 | 1994-05-03 | Baxter Diagnostics Inc. | Protein S chromogenic assay |
| DE59702830D1 (de) * | 1996-10-31 | 2001-02-01 | Roche Diagnostics Gmbh | VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG DER KATALYTISCHEN AKTIVITÄT VON FAKTOR IXa |
| US6297024B1 (en) | 1998-10-15 | 2001-10-02 | Cell Activation, Inc. | Methods for assessing complement activation |
| US6235494B1 (en) | 1999-02-08 | 2001-05-22 | The Scripps Research Institute | Substrates for assessing mannan-binding protein-associated serine protease activity and methods using the substrates |
| IL144839A0 (en) * | 1999-02-23 | 2002-06-30 | Pentapharm Ag | Oligopeptide derivatives for the electrochemical measurement of protease activity |
| DE50215004D1 (de) * | 2001-09-10 | 2011-05-26 | Novel Science Internat Gmbh | Organische verbindungen mit biologischer wirkung als thrombinhemmer und ihre verwendung |
| DE102005003145B4 (de) | 2005-01-21 | 2006-10-19 | Dade Behring Marburg Gmbh | Stablies, chromogenes Flüssigreagenz und dessen Verwendung in gerinnungsdiagnostischen Tests |
| US8941631B2 (en) | 2007-11-16 | 2015-01-27 | Qualcomm Mems Technologies, Inc. | Simultaneous light collection and illumination on an active display |
| EP2333555A1 (de) | 2009-12-09 | 2011-06-15 | Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH | Heterogener Gerinnungstest |
| EP2465941A1 (de) | 2010-12-20 | 2012-06-20 | Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH | Verfahren zur simultanen Bestimmung mehrerer Gerinnungsproteasen |
| EP2484775A1 (de) | 2011-02-07 | 2012-08-08 | Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH | Heparin-insensitives Verfahren zur Bestimmung von direkten Gerinnungsfaktorinhibitoren |
| EP2843416A1 (de) | 2013-09-02 | 2015-03-04 | Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH | Kontroll- und Kalibratormaterial für die Bestimmung von direkten Antikoagulanzien |
| EP3348649A1 (de) | 2017-01-16 | 2018-07-18 | Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH | Universales kontrollmaterial für gerinnungsfaktorinhibitor-teste |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK145461B (da) * | 1974-12-05 | 1982-11-22 | Kabi Ab | Peptider eller salte deraf til anvendelse som substrat ved diagnostisk bestemmelse af srinproteaser isaer faktor xa |
| DK147495B (da) * | 1978-02-07 | 1984-09-03 | Kabi Ab | Tripeptider til anvendelse som enzymsubstrat til kvantitativ beste mmelse af proteaser og fremgangsmaade til laboratoriediagnosticering af proteaser |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL42124A (en) * | 1972-05-02 | 1977-02-28 | Kabi Ab | Substrate for the determination of proteolytic enzymes |
| US4162941A (en) * | 1974-12-05 | 1979-07-31 | Ab Kabi | Method for determining a proteolytic enzyme |
| CH622286A5 (da) * | 1975-06-23 | 1981-03-31 | Pentapharm Ag | |
| SE407571B (sv) * | 1975-07-11 | 1979-04-02 | Kabi Ab | Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser |
| US4137225A (en) * | 1975-07-11 | 1979-01-30 | Ab Kabi | Novel chromogenic enzyme substrates |
| US4061625A (en) * | 1975-07-11 | 1977-12-06 | Ab Kabi | Novel chromogenic thrombin substrates |
| SE419871B (sv) * | 1975-12-01 | 1981-08-31 | Pharmacia Ab | Sett att bestemma aktiviteten hos faktor xa-inhibitor i blod |
| CH634662A5 (de) * | 1976-05-28 | 1983-02-15 | Pentapharm Ag | Verwendung von tripeptidderivaten zur quantitativen bestimmung von plasminogen-aktivatoren. |
| SE437153B (sv) * | 1976-12-01 | 1985-02-11 | Kabi Ab | Specifika kromogena enzymsubstrat for serinproteaser |
| US4275153A (en) * | 1978-08-03 | 1981-06-23 | American Hospital Supply Corporation | Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes |
| US4229540A (en) * | 1979-07-02 | 1980-10-21 | Cutter Laboratories, Inc. | Hydrolase purified from human plasma |
-
1981
- 1981-02-05 CA CA000370232A patent/CA1161432A/en not_active Expired
- 1981-02-06 JP JP56500604A patent/JPH032879B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1981-02-06 AT AT81810036T patent/ATE4702T1/de not_active IP Right Cessation
- 1981-02-06 US US06/302,420 patent/US4440678A/en not_active Expired - Lifetime
- 1981-02-06 ZA ZA00810789A patent/ZA81789B/xx unknown
- 1981-02-06 WO PCT/CH1981/000014 patent/WO1981002294A1/de not_active Ceased
- 1981-02-06 EP EP81810036A patent/EP0034122B1/de not_active Expired
- 1981-02-06 DE DE8181810036T patent/DE3160903D1/de not_active Expired
- 1981-02-09 IL IL62096A patent/IL62096A/xx not_active IP Right Cessation
- 1981-02-11 ES ES499343A patent/ES8302780A1/es not_active Expired
- 1981-10-09 NO NO813418A patent/NO151787C/no unknown
- 1981-10-12 DK DK451981A patent/DK154221C/da not_active IP Right Cessation
-
1982
- 1982-09-15 US US06/418,257 patent/US4480030A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-12-28 JP JP60299814A patent/JPS63300A/ja active Granted
-
1986
- 1986-01-13 AU AU52204/86A patent/AU581050B2/en not_active Ceased
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK145461B (da) * | 1974-12-05 | 1982-11-22 | Kabi Ab | Peptider eller salte deraf til anvendelse som substrat ved diagnostisk bestemmelse af srinproteaser isaer faktor xa |
| DK147495B (da) * | 1978-02-07 | 1984-09-03 | Kabi Ab | Tripeptider til anvendelse som enzymsubstrat til kvantitativ beste mmelse af proteaser og fremgangsmaade til laboratoriediagnosticering af proteaser |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3160903D1 (en) | 1983-10-27 |
| JPS63300A (ja) | 1988-01-05 |
| ES499343A0 (es) | 1983-01-16 |
| ATE4702T1 (de) | 1983-10-15 |
| JPH032879B2 (da) | 1991-01-17 |
| EP0034122B1 (de) | 1983-09-21 |
| AU5220486A (en) | 1986-05-15 |
| JPS56501849A (da) | 1981-12-17 |
| ZA81789B (en) | 1982-03-31 |
| JPH0253040B2 (da) | 1990-11-15 |
| DK451981A (da) | 1981-10-12 |
| US4440678A (en) | 1984-04-03 |
| IL62096A0 (en) | 1981-03-31 |
| ES8302780A1 (es) | 1983-01-16 |
| EP0034122A1 (de) | 1981-08-19 |
| CA1161432A (en) | 1984-01-31 |
| IL62096A (en) | 1986-09-30 |
| NO813418L (no) | 1981-10-09 |
| NO151787C (no) | 1985-06-05 |
| DK154221C (da) | 1989-05-22 |
| AU581050B2 (en) | 1989-02-09 |
| WO1981002294A1 (fr) | 1981-08-20 |
| NO151787B (no) | 1985-02-25 |
| US4480030A (en) | 1984-10-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK154221B (da) | Tripeptidderivater og fremgangsmaade til kvantitativt at analysere faktor xa i et xa-holdigt medium, faktor x i blodplasma, heparin i hepariniseret blodplasma eller antifaktor xa i blodplasma | |
| US3884896A (en) | New substrates for diagnostic use, with high susceptibility to thrombin and other proteolytic | |
| US4070245A (en) | Substrate for the quantitative determination of proteolytic enzymes | |
| EP0004256B1 (en) | Easily split substrates for the quantification of proteases, a process for their production and a method for the quantification of proteases | |
| US4508644A (en) | Chromogenic compounds, a process for their preparation and their use | |
| US4190574A (en) | Substrate for the quantitative determination of plasminogen activators | |
| PL89227B1 (da) | ||
| DK163671B (da) | Reagens og fremgangsmaade til fotometrisk bestemmelse af thromboplastintiden, reagensets fremstilling og anvendelse | |
| US4428874A (en) | Tripeptide derivatives | |
| US4510241A (en) | Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin | |
| US4568636A (en) | Tripeptide derivatives | |
| JPH0411199B2 (da) | ||
| US4406832A (en) | Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin | |
| DK145799B (da) | Tripeptider eller salte deraf til anvendelse som diagnostisk kromogent substrat med hoej specificitet overfor thrombin og thrombinlignende enzymer | |
| DK168574B1 (da) | Peptidderivater og salte deraf med mineralsyrer eller organiske syrer samt anvendelsen heraf som substrat til kvantitativ bestemmelse af C1-esterase | |
| JPH059068B2 (da) | ||
| US4569907A (en) | Thiopeptolide substrates for vertebrate collagenase | |
| US5063152A (en) | Synthetic peptidic substrate for determination of trypsin and α1 | |
| JP2929555B2 (ja) | 色素原基質 | |
| NO155540B (no) | Nye tripeptidderivater, og anvendelse derav for kvantitativ paavisning av proteolytiske enzymer. | |
| CH641761A5 (en) | Tripeptide derivatives for the determination of plasminogen activators and trypsin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PBP | Patent lapsed |