DK147495B - Tripeptider til anvendelse som enzymsubstrat til kvantitativ beste mmelse af proteaser og fremgangsmaade til laboratoriediagnosticering af proteaser - Google Patents

Tripeptider til anvendelse som enzymsubstrat til kvantitativ beste mmelse af proteaser og fremgangsmaade til laboratoriediagnosticering af proteaser Download PDF

Info

Publication number
DK147495B
DK147495B DK420879AA DK420879A DK147495B DK 147495 B DK147495 B DK 147495B DK 420879A A DK420879A A DK 420879AA DK 420879 A DK420879 A DK 420879A DK 147495 B DK147495 B DK 147495B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
iii
proteases
meoh
cryst
hoac
Prior art date
Application number
DK420879AA
Other languages
English (en)
Other versions
DK147495C (da
DK420879A (da
Inventor
Karl Goeran Claeson
Leif Erik Aurell
Leif Roger Simonsson
Salo Arielly
Original Assignee
Kabi Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kabi Ab filed Critical Kabi Ab
Publication of DK420879A publication Critical patent/DK420879A/da
Publication of DK147495B publication Critical patent/DK147495B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK147495C publication Critical patent/DK147495C/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
    • C07K5/0825—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp and Glp-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/20—Coumarin derivatives
    • C12Q2337/22—7-Amino-4-methylcoumarin, i.e. AMC, MCA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/30—Naphthyl amides, e.g. beta-NA, 2-NA, 4-methoxy-beta-naphthylamine, i.e. 4MNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
    • G01N2333/96444—Factor X (3.4.21.6)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/968—Plasmin, i.e. fibrinolysin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/972—Plasminogen activators
    • G01N2333/9723—Urokinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/972—Plasminogen activators
    • G01N2333/9726—Tissue plasminogen activator
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/802—Chromogenic or luminescent peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

147495
Teknisk område
Opfindelsen angår nye tripeptider til anvendelse som enzymsubstrat til kvantitativ bestemmelse af proteaser. De nye tripeptider er særligt egnede til bestemmelse af serinproteaser og SH-proteaser eller til studium af reaktioner, hvor der dannes, inhiberes eller forbruges serinproteaser, eller til bestemmelse af faktorer, der influerer på eller deltager i sådanne reaktioner.
Teknik, hvorpå opfindelsen bygger
Der er fornylig blevet beskrevet et antal af syntetiske peptidsubstra ter. Hovedparten af disse har en tripeptidkæde, hvor aminogruppen i den N-terminale aminosyre enten blokeres med en acylgruppe eller er fri men da har D-konfiguration. Den C-terminale aminosyre blokeres med en chromogen gruppe eller en fluorogen gruppe, som fraspaltes i enzymreaktionen med substratet. Den således dannede, frigjorte chromofore gruppe eller fluorescerende gruppe kan bestemmes kvantitativt ved fotometriske eller fluorescens-fotometriske metoder. Den enzymatiske aktivitet kan beregnes ved måling af mængden af spaltningsprodukt, der frigøres pr. tidsenhed.
Fra svensk fremlæggelsesskrift nr. 407.058 og nr. 407.571 samt fra tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.527.932 og fra Journal of Biochemistry, 82, 1495-1498 (1977) kendes chromogene tripeptider til bestemmelse af serinproteaser.
Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe nye peptidsubstrater, der hydrolyseres hurtigere end de kendte peptidsubstrater.
Forklaring af opfindelsen
Dette formål opnås med tripeptiderne ifølge den foreliggende opfindelse, hvilke tripeptider er ejendommelige ved, at de har den almene formel: R-, - p-Glu - A1 - A2 - NH - R2 hvor R- betegner hydrogen eller en benzyloxycarbonylgruppe, A.J betegner Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Pro, Pip, Phe eller
Tyr, 2 U7695
Ag betegner Arg eller Lys,
Rg betegner p-nitrophenyl, β-naphyl, 4-methoxy-β-naphthyl eller 4-methylcoumarin-7-yl.
Opfindelsen bygger på den erkendelse, at substrater med en N-terminal pyroglutaminsyregruppe meget nemt spaltes af en del serinproteaser. Pyroglutaminsyre, som har en α-aminogruppe, der ikke er fri, men acyleret ved ringslutning, dvs. er en lactam af glutaminsyre, er ikke tidligere blevet anvendt i peptider, der er beregnet til brug som substrat ved enzymbestemmelser.
Ved syntesen af de nye substrater ifølge den foreliggende opfindelse kan traditionelle beskyttende grupper og koblingsmetoder, der er velkendte i peptid kemi, bruges.
Synteseprincippet kan være en trinvis kobling af aminosyrerne til den C-terminale arginyl- eller lysylrest, der i begyndelsen enten er udstyret med en pikobfet bestemmelig gruppe (-Rg ifølge formlen), som tjener som en carboxylsyre-beskyttende gruppe, eller er udstyret med en carboxylsyre-beskyttende gruppe, som kan fjernes, og i dette tilfælde kobles den bestemmelige gruppe til det beskyttede tripeptid-derivat, eller den N-terminal-beskyttede dipeptidfraktion kan syntetiseres separat og derefter kobles til arginyl- eller lysylresten, med eller uden bestemmelig gruppe, ifølge det foregående.
Hvilken af disse synteseveje, der end vælges, renses mellem- og slutprodukterne ved omkrystallisering og/eller gelfiltreringskromatografi .
Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til laboratoriediagnostice-ring af proteaser, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der som substrat bruges et tripeptid med den almene formel: R.j - p-Glu - A^ - Ag - NH - Rg, hvor R.j betegner hydrogen eller en benzyloxycarbonyl-gruppe; A.j betegner Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Pro,
Pip, Phe eller Tyr;
Ag betegner Arg eller Lys;
Rg betegner pNA, β-ΝΑ, 4-ΜβΟ-β-ΝΑ eller 7-A-4-M-C.
Opfindelsen illustreres ved de efterfølgende eksempler.
3 147495 I tyndtlagskromatografianalysen af eluaterne og produktet bruges glasplader med silicagel F^ (Merck) som et absorptionsmedium. De anvendte solventsystemer er: A: n-butanol:HOAc:vand, 3:2:1 (volumen) 5 P^: chloroform:MeOH 9:1 (volumen)
Efter tyndtl ag s kromatografi studeres pladerne først i UV-lys (254 nm), og derefter sprøjtes de med ninhydrin og behandles dernæst med dicarboxidin/chlor. De angivne R^-værdier er resultaterne af 10 enkelte chromatografer.
Forkortelserne, der bruges nedenfor, er som følger:
Forkortelserne refererer til aminosyrerester. Den frie aminosyre eller det frie peptid angives med et H- ved aminogruppen og et -OH ved carboxylgruppen. Aminogruppen angives altid til venstre og carboxyl-15 gruppen til højre.
Med mindre andet er anført har aminosyrerne med undtagelse af Gly L-konfigurationen.
Ala = Alanin Phe = Phenylalanin 20 Arg = Arginin Pip = Pipecolinsyre
Gly = Glycin Pro = Prolin
Ile = isoleucin Ser = Serin
Leu = Leucin Thr = Threonin
Lys = Lysin Tyr = Tyrosin 25 p-Glu = pyroglutaminsyre Val = Valin
Yderligere forkortelser: HOAc = Eddikesyre 3q Bzl = Benzylgruppe
Bz = Benzoylgruppe OBzl = Benzyloxygruppe
Cbo = Carbobenzoxygruppe BOC = tert-butoxycarbonylgruppe 35 DCCI = Dicyclohexylcarbodiimid PCIg = Phosphortrichlorid DMF = Dimethylformamid
EtgN = Triethylamin HOBT = Hydroxybenzotriazol 147495 4 DCHA = Dicyclohexylamin DCU = Dicyclohexylurinstof
EtOH = Ethanol
MeOH = Methanol
EtOAc = Ethylacetat
OpNP = p-nitrophenoxy pNA = p-Nitroanilino TFA = Trifluoreddikesyre β-ΝΑ = β-NaphthyIamino 4-ΜβΟ-β-ΝΑ = 4-Methoxy^-naphthylamino 7-A-4-M-C = 4-methylcoumarin-7-amino TLC = Tyndtlagskromatografi.
Eksempel I: p-Glu-GIy-Arg-pNA . HCI (molekylvægt = 498,9) la Cbo-Gly-Arg(N02)-pNA (molekylvægt = 530,5) 175 ml koncentreret HOAc og 105 ml 5,6 M HBr i HOAc tilsættes til 35 g (0,074 mol) Cbo-Arg(N02)-pNA. Blandingen får lov til at reagere og omrøres i 30 minutter, efter at reaktionsopløsningen er klaret op. Blandingen hældes derefter over i ca. 2 I tørt ether, medens der røres kraftigt. Den resulterende udfældning filtreres, vaskes med tørt ether og vakuumtørres derefter over NaOH. Det opnåede HBr-salt af H-Arg(N02)-pNA opløses i 150 ml tørt, destilleret DMF og neutraliseres ved en lav temperatur (-10°C) med Et^N, indtil en svag basisk reaktion opnås på et befugtet pH-papir, der holdes over reaktionsblandingen. (Sædvanligvis neutraliseres ca. 1,5 ækvivalenter af HBr.)
Det resulterende EtgNHBr filtreres fra. Under kølige omstændigheder tilsættes 1,1 ækvivalent = 0,81 mol = 26,8 g Cbo-Gly-OpNP tif reaktionsblandingen; efter 30 minutter tilsættes yderligere 1/2 ækvivalent = 5,2 ml EtgN. Blandingen får lov til at reagere natten over ved stuetemperatur og inddampes derefter in vacuo under opnåelse af en olie. Olien tritureres i en vandig opløsning af 2% NaHCOg og opløses derefter i varmt MeOH og omkrystalliseres, medens det omrøres og afkøles. De resulterende krystaller filtreres fra og vaskes med koldt MeOH. TLC viser kun mindre forureninger, og produktet omkrystalliseres derfor i det samme solvent. Dette resulterer i hvide krystaller, der er rene ifølge TLC.
5 U7495
Udbytte: 34 g (86%) af la.
Rf = 0,20 (P1) [a]£3 - 35,4° (c 0,3 MeOH) 5 Ib' Cbo-p-Glu-OH (molekylvægt = 263,3) 56',3 g (0,20 mol) Cbo-Glu-OH opløses i 400 ml EtOAc, og 49,4 g (0,24 mol) af DCCI opløst i 60 ml EtOAc tilsættes og omrøres i et isbad. Efter to timer filtreres det resulterende DCU, og den tilbageværende opløsning inddampes til tørhed. Produktet (anhydrid af 10 Cbo-Glu-OH) omkrystalliseres fra EtOAc og petroleumether. Anhy-dridet opløses i 120 ml dioxan plus 260 ml ether, og derefter tilsættes 48 ml af DCHA opløst i ether til et volumen på 100 ml. Efter et stykke tid bundfælder Cbo-p-Glu*DCHA. Det omrøres i ca. 1 time, og derefter filtreres det dannede DCHA-salt fra og vaskes med ether og 15 EtOAc. DCHA-saltet suspenderes i EtOAc og rystes med 25 g (0,18 mol) KHSO^ opløst i vand, og det således dannede Cbo-p-Glu-OH går derefter over i EtOAc-fasen. EtOAc-fasen vaskes med 10% NaCI i HgO og tørres over Na2S04 (der er en risiko for, at produktet bundfælder). EtOAc-fasen inddampes til et lille volumen og bundfældes med 20 petroleumether; dette resulterer i tunge krystaller af Ib1, som er rene ifølge TLC.
Udbytte: 36,9 g (80%) af Ib1.
Rf = 0,45 (A) 25 [a}p4 - 30,3° (c 1,0 MeOH)
Ib Cbo-p-Glu-Gly-Arg(N02)-pNA (molekylvægt = 641,6) 10,25 g (18,3 mmol). H-Gly-Arg(N02)-pNA*HBr, opnået ved at fjerne beskyttelsen fra Cbo-Gly-Arg(N02)-pNA med HBr ifølge fremgangsmå-30 den beskrevet i la, opløses i 35 ml tørt DMF og neutraliseres ved en lav temperatur (-10°C) med Et^N, indtil en basisk reaktion opnås på befugtet pH-papir. Det resulterende Et^NHBr filtreres fra. 2,47 g (18,3 mmol) HOBT og 5,26 g (20 mmol) Cbo-p-Glu-OH (Ib1) tilsættes til reaktionsblandingen, og derefter tilsættes ved en lav temperatur 35 4,53 g (22 mmol) DCCI opløst i en lille mængde DMF. Blandingen får lov til at reagere natten over ved stuetemperatur; dernæst inddampes reaktionsopløsningen til en olie. Olien tritureres med 2% NaHCO^ i vand og med rent vand. Den opnåede faste forbindelse opløses i en lille mængde acetone, og derefter tilsættes varmt MeOH og en lille 147495 6 mængde vand. Produktet omkrystalliseres, medens det afkøles og omrøres, og de resulterende krystaller filtreres fra. Det opnåede Ib er rent ifølge TLC. Efter omhyggelig vakuumtørring opnås 8,90 g (76%) af Ib.
5
Rf = 0,06 (P1).
[α]ρΊ - 21,5° (c 0,8 DMF) I. Med 30 ml HF fjernes beskyttelsen fra 0,8 g (1,25 mmol) Ib ved 10 0°C 1 time i nærværelse af 0,6 ml anisol. Efter inddampning in vacuo opløses produktet i ca. 30 ml 2% HOAc og vaskes med en lille mængde ether. HgO-fasen kromatograferes på en kolonne med Sephadex G-15 (Pharmacia Fine Chemicals) i 2% HOAc med samme medium til eluering. Fraktionen med det rene acetat af I frysetørres og ionbyttes på en 15 søjle med QAE-25 (Pharmacia Fine Chemicals) i chloridform med EtOH-HgO (1:1) med samme medium til eluering.
Fraktionen med det rene hydrochlorid af I frysetørres.
Udbytte: 485 mg (78%) af I.
20 TLC [R^ = 0,29 (A)] viser kun én plet [cijp4 - 54,1° (c 1,0, 50% HOAc/H20)
Eksemplerne 11-XI11 som beskrevet i tabel 1 udføres i princippet på samme måde som de foregående eksempler; kun de fysiske data, 25 udbytter såvel som koblings- og rensningsmetoder er derfor opført i denne tabelform.
Eksempel XIV: p-Glu-Gly-Arg-4-ΜβΟ-β-ΝΑ . HCI (molekylvægt = 534,0) 30 XIVa p-Glu-Gly-Arg-OH . HCI (molekylvægt = 378,8)
Trypsin (Novo, 400 μΙ af en opløsning af 2,0 mg trypsin pr. ml 1 mM HCI) tilsættes til en opløsning af 250 mg (0,50 mmol) p-Glu-Gly-Arg-pNA . HCI (S-2444) i 100 ml 0,1 M NaHCOs i H20. Frigørelsen af 35 p-nitroanilin følges i et spektrofotometer ved 405 nm. Frigørelsen afsluttes efter ca. 45 minutter, og opløsningen gøres herefter sur med HOAc til en pH-værdi på ca. 4. Den inddampes derefter til tørhed, opløses i MeOH og chromatograferes på en søjle med LH-20 (Pharmacia 7 147495
Fine Chemicals) i MeOH med det samme medium til eluering. Fraktionen med det rene sure XIVa inddampes, opløses i F^O og frysetørres .
Udbytte: 167 mg (88%) XIVa, som er rent ifølge TLC.
5 Rf = 0,08 (A).
XIV:
En opløsning af 27 μΙ (0,25 mmol) PCI^ i 450 μ! tørt pyridin tilsættes under fugtfrie betingelser og i et isbad til en opløsning af 105 mg 10 (0,50 mmol) 4-methoxy^-naphthylamin*HCI i 2,25 ml tørt pyridin.
Efter henstand i ca. 45 minutter ved stuetemperatur tilsættes alt det XIVa, der er fremstillet ifølge det foregående. Når reaktionen ophører (efter ca. 1 time) inddampes reaktionsblandingen til en mørkerød olie (reduceret tryk). Olien opløses i en lille mængde EtOH-FLO (1:1) og jc ^ påføres en kolonne med QAE-25 (Pharmacia Fine Chemicals) i chlorid-form i EtOH-HgO (1:1) med det samme medium til eluering. Fraktionen med det næsten rene hydrochlorid af XIV inddampes, opløses igen i en liile mængde EtOH-F^O (1:1), og fremgangsmåden gentages. Det således opnåede hydrochlorid af XIV er rent, og det frysetørres, 20 efter at al alkohol er blevet afdampet.
Udbytte: 85 mg (36%) XIV.
TLC (R.J. = 0,24 mg (A) viser kun én plet.
[a] 22 - 45,7° (c 0,6, 50% HOAc/H20) 25
Eksempel XV: p-Glu-Gly~Arg-7-A-4-M-C (molekylvægt' = 536,0) 2Q Fremgangsmåde analog til eksempel XIV men med 88 mg (0,50 mmol) 7-amino-4-methylcoumarin som amin i stedet for 4-methoxy-p-naphthyl-amin-FICI.
Udbytte: 84 mg (32%) XV.
TLC [Rf = 0,25 (A)] viser kun én plet.
35 [ff]p5 - 51,5° (c 1, 50% HOAc/H20).
Eksemplerne XVI-XVIII
Udføres i princippet på samme måde som eksempel I; derfor er kun de fysiske data, udbytter såvel som koblings- og rensningsmetoder opført i tabel 1 og tabel 1A.
8 U7A9S
o\° ; ; ! ί !
I I I I I
j£ CO CO CD I r— ’ςΤΟΟΙ CNJ LO LO « CO CD CO I CO ΙΛ » | $j r^cor^-i co co lo i r^· oo to i in co oo i looo^ti | i i i i Ό i i i i 1 D i i i J !
i I I I
,111 1,11' I I I I 1
I > I I
u ! U T ! u -p ! u 1 < i < 5 i < dr i < ' < 1 c O ! O 2 ! O 2 ! O ! O ! > ^^ulJ . ll ll ' — o\° y «? I c\° O\o 5T i o\° o\° ^ 1 0\° ^ ^ 1 tfP 5 5 O o ^ « O LO g I O LD “ i O # ^ I O 5 ^ CO loSOi LO GO O I LO G> O 1 toQQl LOLjQi i i i 1 1 /111* I I I I * i i i i i 1111' i i i * * I 1 I 1 *
I I I I I
I i i I I
i i i ' oo . _ ' r ^ in i n ro in i r^· cvj i ro ^ ro ι o "τ σ> > i—. ^τιλι-ι co ^ ο) i ro ro ro i to m r- , ocmoi a ronwi rowri rowNi ro w ι ,001
_ | | I I I I I I I I I I I + I I I +' I
,111' 1,11' I , ι I i o ! ! ! ι i c 1,11'
<13 r- r-, r- r-| r- r- ι r- r-1 v T I
ti <0.0., <0.0.1 <0.0.1 <0.0., <0-0-, S? , , , , i > oooco, ro ro ro , ojooco, cooooo, in ro ro , 10 (VI W O i OJ v— v— , (Ό ι— i— 1 Γ0 CO O , CVJCVJO, W ....... ~ ~ 1 -.---, - - " _ 000,000,000,000,000, M— 1,1,1
OC , I I I I
_j 1 I I I · LU J j I j ! .1 I I i *
CD , , , I
ι ι ι ι I
c I J I I i Γ" 1111' * ΐ n ! rø «Q i ra .Ω i inr>' z _”£!= = =! = = =!^--!>>>! i ι i r i I I I 1 I 1 I I 1 i c 1 <i ' » i -U I Z 1 ' . 1 I z I ~z ι ι i ι Q. ι , ι i i i il * i ι i ι ^ ι ^l.i « 1 < ; < o™ i O ! < ! < * Z| Z-5' Z 2 i z1 Z ' P ! ^ 3 ! P ~ ! o.: Q-! /-ni Λ®1 --- F Λ ' Λ· < oWi Ϊ oXJ< ' < nW' < nw' I i ! § Λ! i -! S g I z°! < Λ o! < Λ o>! α o < ! 3 < O ! ^<£! o. o™ < ' o. qw< ' 05>: »At! g» 5 ^ ί ό 5 i ! <p?: <^ω! < ^ κ i £p>: <?<! >,<2; £.02: d=S-H! ^ < 2 ! rå < 2 ! S o * ?! Æ ^ h £ «! > ± <?! < « <?! S i??"j 2 ? P; 2frP;2:?Pj2iPj n o o o | O u o j o υ o | oooj O o o j io auu, acQU, acau, auu, aou, 9 147495 o\° j ! ! ! !
I I I I I
Ά 00 Μ (O I (O ^ 1Λ I (O CO CM I (O (Μ (Ο I OO cp 1 P h-oocioi co ro tn i moor^i lococdi to h h 1 I i i i i : Ό i i i i 1 D i ' 1 ' !
I I I I
I 1 I I ' I I I I 1
I I I I I
,111' I | | I f i u i u i υ i o i I < I < 11 < ! < ! E ! o ! o | o ! o ! 0)1 il i I I i I ' = i S oLLLLI LL Li— i f-ι LL I Li-LLI li li- 1
— y c— c— I 0\0 C- c- I θ\° y s: 1 o\° ^ ^ i o\° =; ^ I
co SQQi m Ω Ω i to I Ο i loQQi lo Ω Ω i III·' 1111'
, I I I I
i I I I > III'1 il·'' l i i i ' 1111' i i i l ' i i i 1 __ 1 ςοοοοι oom^i oo r— < oot^-ι r^^coi
s s s | «*S.**1 s ·» ·* I *» *· *- I *· s ^ I
LO CO CD I OJinr^l r LO LO 1 O) CO I CO M CO l
>< (7> OO CD , C\i I ^ CO l G) 00 CO I C\J I
u—i I I ,1 | + I I I I II I I II I + ' I
1,111 I i I I 1
i I I I I
"? ! i ! ! ' c iiii' G) r— i c~ r~i r~ r-, . r- r-| r- r-,
ti < CL < I <CLCLl < CL CL l < Q- CL » < CL CL I
^ ^ i l I I I
Y c cotncroi cocncoi r^ocoi m to o i onirjo;
[5 C/) (I) cf (O I CO CVJ O ' CM CM O I CO'Ct’e-' co in et I
,22 w v. i ^ - » - i - --- 1
T OOOl o O O I O O O I o o o I o o o I
η 1- i I ' 1 1 ig QC I I i ' ' •w- ,ιΐ'ΐ 1111' 1111' _J i i i I *
I I I I I
lu 1 ! ! ! ! CQ ! ! η ja ! ! ! <C . „.o! - -251= = =: roo! mn! h z >>>! >>>! >>>! — — — ! x x x |
I i I I I
I I I i I
IIII' I I I I ·
IIII' i i i I
I i I I i : : <: <: < i . \ -r i ^ i έ- I Z i < i <1 α I o. I q_i 2 I Z I II II ,' n i α i ^ i JL. i
i i , I CMI CM' Π I
A ; ^ o ; o j < ϋ ! < η°Λ < i < 2 ' < “^ ' Z U ' 50, -7^1 Q. I » ?ZI ?Zi D)I 0)1 i CO* α C, I 2 0- s- I 2 Q.I., ^ ' < a p: | a p: ^ a < : ^ a < : < ° £: α oW < : ^ cT1 < ! ® ow>! ? owg! Q- V T1 i p 5 2 i Έ ^ si\ ? 5 ? i <5^: £.3^: <i ci o. i < P a i > p 2 1 o p .3 ' -i £ 1 ,S-II | g: I I —- *— f r\ ' S- g / η 1 1 > ' ' Q < 3 I φ<3'Ο<γΐ0-<γ' 0) -J □ '
C £ ° <? ί £ £ <?! 2 > ?! Ξ E ?ΐ ξ * <? I
+S i, ο. α ' 3 α. α. ' OOQ! ΰ a Dj 3 cl cl ; ιο Y i i — i i i i i i i i — i ' .Ω noo ooo aoo aoo ^oo, 3 T Λ JD 7 Λ -Q i -Ω .Ω I i U -Q i i O H | in αυυ! αυυι Quu« QUUi aooui 10 147495
Λ0 ! ! ! ! ; j I
.2 lo ura i cvjoi > cvi ^ ! ω oo i oj i co o oj i £> oo oo |
Jj oo oo lo ίο*-· ioooloi co oo i ooi i'- co > i in > co
>. Il I I i I I
s ! * ! ! ! ! Ό «i i i i i i x ii 1 ! ! ! ! II III I !
II III I
II III I j U i U i i ! U ι ! U ! U 1 9 1 < I < I I I < I I < I < I < | cO ! o ; i : o ; ! o : o ! o !
Φ X i X I I x r X ( ι X ι X |X. I
> U- IL I II pi LL LL l Λ I I I IL LL I LL LL j — 0\° ^ * 0\° i* V, ^ ^ I o\0 II 0\° I &P ^ ^ 1 ^ 5[ ' 0 o§§i o ii ,ϊ ^ e i o ii o i O ^ ^ I o é ^ CO LD Ω D I LO II Ω Ω I LO II LO I mCjLJl 1/)LJQ| I I I I I I I i i III | I I I I i III | I I I i 1
III I I I I I I
III I I I I I i
III i I I i I I
iii i i i i i i n. lo c\j i ii oi u) i r*’- ii lo i r*-o^fi c\joi ».IICD **.·» I I I *-1 ^ I pv. κ κ |
i—, ^ ^ i LO 11 O ^ CO I ΙΟ II r- I O CO LO i O CO LO I
s CO CNjl^llt-^^fl^lILOlCO OJ I r C\J I
._I I I | | 1 1 l I 1 I I 1 I I I I I I 1 I i i I I
II Ilt I I
II III I I
II III i I
/-V II III I I
(— Il |II 1 ·
C il III I I
<l> T— τ— i i r-r-| . i ^ ι . i— r-| . r- r-i +i <CLO.i < < . < CL 0- i < . < i <i <0-0-1 <0-0.1 ^ 5? II III i i
r co i CMC\!l ’nJ’CVJCOi 't CO I I/) I O W 00 I CO O O I
£ C/) CO'sT'nTI C0CVJI C\1 LO CO I CVJOI Cvj I CO LO ^ I CO LO r- I
<-/ κ κ κ i κ κ | κ κ κ | κ κ | k| *.kk| " - - 1
T OOOl OOI o O O I ooi O I O O OI o o o I
n Il III i i £ IX il iii i i
S-y l( III I I
Il III I I
II III I I
li III i I
m 11 j ; j ] j ω I i m .a J ro J ! ro ^ | ™ 2 ; < l _ro^! - ™ ! = = = ! >>! > ! >>>! > > > ! z χχχ!χχ!χχχ!χχ!χ!χχχίχχχ·
I II I I I I I
II III I I
II III I I
II III I I
II III i i
II III I I
< I I I II I I
i i <1 II <1 I
η ' ' Z 1 11 Z I <1 9-1 I I I II TL I Z 1 Λ j 1 ca; < ! ! , i a; <tS! * A ί z iu. - . Λ | $ 1 <f 1 < cm1 1 iii <r 9 i Oii* Z U I S I S η I 01 1 S 1 -5 2 1 < /-Γ1 n ! i Z i ZOi i ι,ι Z u I -» O i i to 1 Q. i ' Z i O ! 4· ! O- i ! nz! /—v^il | I <£ rp* s—i I Qj i ,i i to 9* | < O ω ; οι i ζΑσ>! Sx! <: < ^ ^ ! < A σ> i lu J| < :A0w<:^o!^iz-Q>!l.0w<! I i '1 i <r i i -X i i I II i , a U -J I i i' i i w to d i > ^ i di o i en σι i cn i ' · i, i σ> f- a ' >, i—^ a) i — „i u. s-i s_ i tn toj“i t_ ^ — i _l tn_j| o Q-I «3* Cl £L I C<fi <1 >* V — 1 <f 0)0-1 , >11 i l| I5- I« 111 i1 —li? 11 I*- 11 3-131 3θ)ι η < 3 1 L L i i >-3' L < 3 > 1 v i ? i ? < i ^ έ ? i ? ? i ? i I l ? i i L· ? | S hi?·· ?- a : 22: 2! 2 t ? · 2^1 V) acaui UXi aOUi aai ai acQUi aUUi 11 147495
o\P J
£> O LO LO 1 S CD O) 00 1 >> ; ώ ό i D i i υ i
< I
c o ; 0) X i > Λ li. LL ' “ o\© ^ *> 1
0 O X X I
co t n Q O i i OJ CO r- 1
i—i O OJ ^ I
S CO c~ i
'—I + I I
i i i Ϊ ! r- *“i ^ IS < o- “ j g w § ^ s :
t- , o o o I
£ o: !
v*> I
i _] i LU ’ m z = É j < t! > > > i
I- Z X X X I
< ! < z ! z α i o. 1 1 Λ CM;
cm O
o z ! z ^ I
< v_y 0> I
z 0) «= ! α s. < g» > b ! lsX\ 1 κ ϊ ? i •p 3 r Q.
to _ i i
° O O O
3 i -Q -Q , en α u u i TABEL ΙΑ 12 147495
Metode til kobling, rensning o.s.v., i de forudgående eksempler 5 Substans nr, ! HF, anisol, G-15 2% HOAc
la p-nitrophenol, kryst. MeOH
Ib HOBT, DCCI, kryst. MeOH
1Π II HF, anisol, G-15 2% HOAc
Ila HOBT, DCCI, kryst, ether
I Ib HOBT, DCCI, kryst. EtOH + HgO
III HF, anisol, G-15 2% HOAc 15 11 la HOBT, DCCI, kryst. EtOAc II Ib HOBT, DCCI, kryst. EtOAc + petr. ether IV HF, anisol, G-15 2% HOAc IVa p-nitrophenol, kryst. DMF, MeOH + ether 20 IVb HOBT, DCCI, kryst. EtOH + H£0 V HF, anisol, G-15 2% HOAc
Va p-nitrophenol, kryst. DMF, MeOH + ether
Vb HOBT, DCCI, kryst, acetone + MeOH
25 VI HF, anisol, QAE-25 95% MeOH
Via p-nitrophenol, kryst. EtOAc + ether
Vlb HOBT, DCCI, kryst. DMF + EtOAc VII HF, anisol, G-15 2% HOAc
3q Vita p-nitrophenol, kryst. MeOH + HgO
V i Ib HOBT, DCCI, kryst, acetone + MeOH + H^O
(fortsættes) 35 TABEL ΙΑ (fortsat) 147495 13 5 VIII HF, anisol, G-15 2% HOAc
Villa p-nitrophenol, kryst. MeOH
VII Ib HOBT, DCCI, kryst. MeOH + H20 IX HF, anisol, G-15 2% HOAc 10 IXa p-nitrophenol, kryst. EtOAc + ether
IXb HOBT, DCCI, kryst. MeOH + H2H
X HBr/HOAc, QAE 25 50% EtOH
Xa p-nitrophenol, kryst. MeOH + HgO
Xb HOBT, DCCI, kryst. MeOH + H„0 15 ..................................................................—
XI HBr/HOAc, QAE-25 50% EtOH
Xla p-nitrophenol, kryst. MeOH + H20
Xlb HOBT, DCCI, kryst, acetone + MeOH
2Q XII HOBT, DCCI, kryst. 50% EtOH
XIla HF, anisol, G-15 2% HOAc XIII HF, anisol, G-15 10% HOAc XII la p-nitrophenol, kryst. EtOAc + EtOEt
XII Ib HOBT, DCCI, kryst. CHCL
25 .......—......—......—.........-................-...............
XIV 4-methoxy-p-naphthylamin + PCI3 (pyridin) + syre XIVa ifølge pNA-derivat + trypsin XV 7-amino-4-methylcoumarin + PCI^ (pyridin) + syre
XVI HBr/HOAc, QAE-25 50% EtOH
XVIa p-nitrophenol, kryst.fra MeOH + H20
XVIb HOBT, DCCI, kryst.fra acetone + MeOH
XVII HF/anisol, QAE-25 95% MeOH
35 XVIIa p-nitrophenol, kryst.fra EtOAc + ether XVIIb HOBT, DCCI, kryst.fra DMF + EtOAc
XVIII HF/anisol, QAE-25 50% EtOH
XVII la p-nitrophenol, kryst.fra MeOH + Η,,Ο
XVII Ib p-nitrophenol, kryst.fra EtOH + HgO
147495 14
Bestemmelse af proteaser ved hjælp af substrater med en fjernelig og fysisk-kemisk bestemmelig gruppe
Substraterne, der er fremstillet ifølge eksemplerne, bruges til 5 bestemmelse af forskellige enzymer pi følgende mide.
Bestemmelsesprincippet er baseret pi det faktum, at spaltningssubstratet, der er opnået ved enzymatisk hydrolyse, udviser et UV-spektrum, der er væsentligt forskelligt fra substratets spektrum.
Således har f.eks. alle p-nitroanilidsubstrater ifølge opfindelsen deres 10 absorptionsmaxima ved 310 nm med en molær ekstinktionskoefficient på ca. 12000. Ved 405 nm er disse substraters absorption næsten ophørt. p-Nitroanilin, som frigøres fra substraterne i den enzymatiske hydrolyse, har dets absorptionsmaximum ved 380 nm med en molær ekstinktionskoefficient på 13200, som ved 405 nm kun er formindsket til 9620.
15 Ved at måle spektrofotometrisk ved 405 nm er det derfor let at følge mængden af dannet p-nitroanilin, der er proportional med den enzymatiske hydrolysehastighed, som igen er et mål for den aktive enzymmængde.
For at beregne mængden af dannet fluorescerende amin bestråles 20 prøverne i et fluorescensfotometer med et lys, der har en excitations-bølgelængde (ca. 350 nm for β-naphthylamin og 4-methoxy^-naphthyl-amin og 380 nm for 7-amino-4-methyl-coumarin), og mængden af fra-spaltningsprodukt fastslås derefter ved at måle det udsendte lys (ca.
420 nm for β-naphthylamin og 4-methoxy-6-naphthylamin, og 440 nm 25 for 7-amino-4-methyl-coumarin).
Tabel II og III viser de syntetiske substraters reaktionshastigheder med forskellige enzymer. Reaktionshastigheden relateres til et referencesubstrat (reaktionshastighed = 100) for hvert enzym. Nogle af referencesubstraterne kendes allerede og er tilgængelige på marke-30 det.
35
TABEL II
147495 15
Relative reaktionshastigheder 5 Enzym
Pli Try FXa UK TA
Substrat
Reference
Substrat (=100) S-2251 S-2160 S-2222 I I
10 _ - I 10 330 7 100 100 II 100 360 5 65 130 V 140 370 2 65 150 VI 310 250 15 50 170 15 VII 440 240 10 8 40 X 450 40 0 0 10 XI 230 60 0 0 10 XII 15 340 260 15 120 20 S-2251 = H-D-Val-Leu-Lys-pNA, S-2160 = Bz-Phe-Val-Arg-pNA, S-2222 = Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA (alle Kabi Diagnostica, Stockholm,
Sverige).
Pli = Plasmin, Try = Trypsin, FXa = Koagulationsfaktor Xa, 25 UK = Urokinase, TA = Plasminogen vævsaktivator.
Referencesubstraternes følsomhed overfor det pågældende enzym:
Aktivitet (ΔΟϋ/min) 30 opnået med 4 . 10 ^mol/l
Enzym Substrat enzym
Plasmin S-2251 0,040
Trypsin S-2160 0,150 35 FXa S-2222 0,200
Urokinase I 0,040 Vævsaktivator I 0,040 (OD = optisk densitet) 16 14 7 Λ 9 5 Χ-\ α> ^ ιΛ Ο Ο 3 Τ Ο υ ^ ο ο 3 ^ Ο
^ +J
s- ro φ > (Λ .— ro *- (1) φ +J ^ Τ3
Ο Ώ I
λ ^ ™ ^ < α 3 ίο in Ζ φ α = 5 . 3 -2 3 W ξ φ £ X S S η ο ο $ Γ -g | - 1 Ζ < £ 10 = ε 2 ? «_ w 11 , s_ p- £ a 5 Ν - —J Φ υ_ <η _ -η SM ' -π <5 ί Ε ro ν « ιιΐφΧ ιη ο ο 3 ° — ,ό ·5τ r U- 00 «Ο Ο (/) <Λ -, ΐΛ φ ω σι Ν »- c ^ w w ^ <τ -ζ Ε S 2 Ο) ο) 1-5 2 S - ό Ό w ^ α > c c ο ·°φ Ί ® Ρ. «J i 2 £, i Η X cm co r- ω o O) σ> m 3 Ϊ. -C φ m
S 0) ro c 1 C
2 -° . 5 i i - ca s ro -S ^ . s_ Φ (Λ v f-*· _. m C /'~N f**. * 4_> OiD oflj Φ f o σ> ω ro α Q.
5,~o o o o C £ - +» 4-> — tf) oq > tf) £ r r- g s 1*2^010) 1 E ? c il £ « g i σι i « “ ϊ ε £ «S | $ o 2 2 ° ° E* ' ^ *" ro ° oq φ φ f5 M gr 2 - 5 s P . * S ε 3 1 m i N ’L -L °°m C +j — ^+- <1) 0) S W ^ . t- L.
*“ 3 ^ pr tt i» i- o 0 ^ (Λ (Λ < 7n O & & < ο^Ό.ΪΟϊσ) å P P 1 g Ϊ- o. — co -J m o in cvj · co υ c .? ° nuoo-5;>,(/)inin(/)ojoj ^ 2 o o o — — ^ j* .* i i Q.CQCQOQOOtuujuJaiiotn i— cvj ro 3 3 φ 17 ims5
Nytten af de nye substrater ifølge opfindelsen og det faktum, at de hydrolyseres hurtigere af nogle enzymer end de hidtil tilgængelige substrater, er indlysende fra disse tabeller II og III.
DK420879A 1978-02-07 1979-10-05 Tripeptider til anvendelse som enzymsubstrat til kvantitativ beste mmelse af proteaser og fremgangsmaade til laboratoriediagnosticering af proteaser DK147495C (da)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE7801373A SE7801373L (sv) 1978-02-07 1978-02-07 Lett spjelkbara substrat for kvantifiering av proteaser
SE7801373 1978-02-07
SE7900024 1979-02-06
PCT/SE1979/000024 WO1979000602A1 (en) 1978-02-07 1979-02-06 Easily split substrates for the quantification of proteases

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK420879A DK420879A (da) 1979-10-05
DK147495B true DK147495B (da) 1984-09-03
DK147495C DK147495C (da) 1985-07-15

Family

ID=20333883

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK420879A DK147495C (da) 1978-02-07 1979-10-05 Tripeptider til anvendelse som enzymsubstrat til kvantitativ beste mmelse af proteaser og fremgangsmaade til laboratoriediagnosticering af proteaser

Country Status (18)

Country Link
US (2) US4279810A (da)
EP (1) EP0004256B1 (da)
JP (2) JPS6345397B2 (da)
AT (1) AT368773B (da)
AU (1) AU4394579A (da)
CA (1) CA1136124A (da)
DD (1) DD142550A5 (da)
DE (1) DE2963358D1 (da)
DK (1) DK147495C (da)
ES (1) ES477501A1 (da)
FI (1) FI790376A7 (da)
IL (1) IL56520A0 (da)
NO (1) NO790375L (da)
PL (1) PL116682B1 (da)
SE (1) SE7801373L (da)
SU (1) SU1277904A3 (da)
WO (1) WO1979000602A1 (da)
ZA (1) ZA79424B (da)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK154221B (da) * 1980-02-12 1988-10-24 Pentapharm Ag Tripeptidderivater og fremgangsmaade til kvantitativt at analysere faktor xa i et xa-holdigt medium, faktor x i blodplasma, heparin i hepariniseret blodplasma eller antifaktor xa i blodplasma

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4275153A (en) * 1978-08-03 1981-06-23 American Hospital Supply Corporation Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes
US4336186A (en) * 1978-08-03 1982-06-22 Gargiulo Robert J Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes
US4409140A (en) * 1979-04-23 1983-10-11 Smith Robert E Substrates and method for determining enzymes
DE3061860D1 (en) * 1979-04-24 1983-03-17 Marcel Jozefonvicz Process for the determination of proteases and antiproteases
DE2936543A1 (de) * 1979-09-10 1981-04-09 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Chromogene verbindungen
DE3164437D1 (en) * 1980-08-25 1984-08-02 Kabivitrum Ab Peptide substrates for determination of protease activity
FR2497798A1 (fr) * 1981-01-09 1982-07-16 Pharmindustrie Nouveaux peptides portant un fluorophore, procede pour leur preparation et leur application au dosage fluorimetrique des endotoxines
US4388233A (en) * 1981-05-15 1983-06-14 The Regents Of The University Of California Synthetic substrates for enzyme analysis
US4510241A (en) * 1981-09-03 1985-04-09 Mallinckrodt, Inc. Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin
JPS5863399A (ja) * 1981-10-14 1983-04-15 Nitto Boseki Co Ltd 新規なプラスミン測定用基質
US4448715A (en) * 1981-11-02 1984-05-15 University Of Miami Tagged pyroglu-L-Phe-L-Arg derivatives, substrates and assays for kallikrein
DE3211254A1 (de) * 1982-03-26 1983-09-29 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zum nachweis des vorliegens einer allergie und zum spezifischen nachweis des fuer die allergie verantwortlichen allergens
US4491541A (en) * 1982-11-10 1985-01-01 Farmitalia Carlo Erba Peptides
DE3244030A1 (de) * 1982-11-27 1984-05-30 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Chromogene verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DE3484912D1 (de) * 1983-06-03 1991-09-19 Pentapharm Ag Peptidderivate und deren verwendung als substrate zur quantitativen bestimmung von enzymen.
JPS6117956A (ja) * 1984-07-04 1986-01-25 Nitto Boseki Co Ltd 新規な尿中カリクレイン測定用基質
CA1293591C (en) * 1985-01-11 1991-12-24 Charles A. Kettner Peptide substrates for detecting virus-specified protease activity
US4801534A (en) * 1985-05-28 1989-01-31 Coulter Electronics, Inc. Water soluble zanthylium derivative substrates
US4694070A (en) * 1985-05-28 1987-09-15 Coulter Electronics, Inc. Water soluble xanthylium derivatives substrates
US5231006A (en) * 1986-10-16 1993-07-27 Behringwerke Aktiengesellschaft Method for the determination of plasminogen
DE3635191A1 (de) * 1986-10-16 1988-04-21 Behringwerke Ag Verfahren zur bestimmung von plasminogen
SE8701801L (sv) * 1987-04-30 1988-10-31 Kabivitrum Ab Foerfarande foer identifiering av mikroorganismer
US5115099A (en) * 1988-06-14 1992-05-19 Nitto Boseki Co., Ltd. Substrates for determination of enzyme activity and intermediates for synthesis of the substrates as well as process for producing the intermediates
JPH06104079B2 (ja) * 1988-07-14 1994-12-21 日東紡績株式会社 新規な酵素活性測定用基質
US5191065A (en) * 1988-11-22 1993-03-02 Hoechst Aktiengesellschaft Process for the preparation of tripeptides
DE3839379A1 (de) * 1988-11-22 1990-05-23 Hoechst Ag Verfahren zur herstellung von tripeptiden
SE8904188D0 (sv) * 1989-12-12 1989-12-12 Kabivitrum Ab Chromogenic substrate
JP2769243B2 (ja) * 1990-02-19 1998-06-25 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 溶液、特に発酵溶液から精製ｅｐｉ蛋白質の回収方法
US5871946A (en) * 1995-05-18 1999-02-16 Coulter Corporation Method for determining activity of enzymes in metabolically active whole cells
US5698411A (en) * 1995-05-18 1997-12-16 Coulter Corporation Method for determining activity of enzymes in metabolically active whole cells
US5733719A (en) * 1995-05-18 1998-03-31 Coulter Corporation Method of making an assay compound
US5776720A (en) * 1995-05-18 1998-07-07 Coulter Corporation Assay reagent
WO2001094332A1 (en) 2000-06-02 2001-12-13 Regents Of The University Of California Profiling of protease specificity using combinatorial fluorogenic substrate libraries
GB0208989D0 (en) * 2002-04-19 2002-05-29 Amersham Biosciences Uk Ltd Methods for measuring enzyme activity
CN115974752A (zh) * 2023-01-04 2023-04-18 郑州安图生物工程股份有限公司 一类对硝基苯胺类化合物的制备方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE380257B (sv) * 1972-05-02 1975-11-03 Bofors Ab Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser
IL42124A (en) * 1972-05-02 1977-02-28 Kabi Ab Substrate for the determination of proteolytic enzymes
DE2527932C2 (de) * 1974-07-02 1983-04-21 Pentapharm AG, 4052 Basel Säureadditionssalze von Tripeptidderivaten und deren Verwendung als Substrate zur Bestimmung von Plasmakallikrein
SE407058B (sv) * 1974-12-05 1979-03-12 Kabi Ab Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
CH622286A5 (da) * 1975-06-23 1981-03-31 Pentapharm Ag
SE407571B (sv) * 1975-07-11 1979-04-02 Kabi Ab Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
SE437153B (sv) * 1976-12-01 1985-02-11 Kabi Ab Specifika kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
US4215047A (en) * 1977-06-06 1980-07-29 Ajinomoto Company Incorporated 7-(Arginylamino)-4-methylcoumarins

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK154221B (da) * 1980-02-12 1988-10-24 Pentapharm Ag Tripeptidderivater og fremgangsmaade til kvantitativt at analysere faktor xa i et xa-holdigt medium, faktor x i blodplasma, heparin i hepariniseret blodplasma eller antifaktor xa i blodplasma

Also Published As

Publication number Publication date
CA1136124A (en) 1982-11-23
IL56520A0 (en) 1979-03-12
US4335204A (en) 1982-06-15
EP0004256A1 (en) 1979-09-19
ZA79424B (en) 1980-01-30
PL213217A1 (da) 1980-02-11
DE2963358D1 (en) 1982-09-09
FI790376A7 (fi) 1979-08-08
SE7801373L (sv) 1979-08-08
PL116682B1 (en) 1981-06-30
JPS55500076A (da) 1980-02-14
EP0004256B1 (en) 1982-07-21
NO790375L (no) 1979-08-08
AU4394579A (en) 1979-08-16
JPS63173600A (ja) 1988-07-18
ATA78279A (de) 1982-03-15
DK147495C (da) 1985-07-15
DD142550A5 (de) 1980-07-02
DK420879A (da) 1979-10-05
SU1277904A3 (ru) 1986-12-15
JPS6345397B2 (da) 1988-09-09
WO1979000602A1 (en) 1979-08-23
ES477501A1 (es) 1979-11-16
AT368773B (de) 1982-11-10
US4279810A (en) 1981-07-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK147495B (da) Tripeptider til anvendelse som enzymsubstrat til kvantitativ beste mmelse af proteaser og fremgangsmaade til laboratoriediagnosticering af proteaser
US4070245A (en) Substrate for the quantitative determination of proteolytic enzymes
US4457866A (en) Chromogenic compounds and their use as enzyme substrates
US4016042A (en) Substrate for the quantitative determination of enzymes
US4028318A (en) Chromogenic enzyme substrates
FI56524C (fi) Nya komogena substrat foer serinproteaser
Coggins et al. Affinity labelling of proteinases with tryptic specificity by peptides with C-terminal lysine chloromethyl ketone
KASAFÍREK et al. p‐Nitroanilides of 3‐Carboxypropionyl‐peptides: Their Cleavage by Elastase, Trypsin, and Chymotrypsin
JPH0253040B2 (da)
US4450105A (en) Substrates for measuring thrombin
NO156067B (no) Substrat for bestemmelse av plasminogenaktivatorer.
US4563305A (en) Radiolabelled substrates for assaying mammalian enzymes
Filippova et al. Fluorogenic peptide substrates for assay of aspartyl proteinases
EP0077124B1 (en) Novel substrates for measuring plasmin
Noda et al. A facile method for preparation of t‐butyloxycarbonylamino acid p‐nitroanilides
AU602527B2 (en) Chromogenic compounds, a process for their preparation and their use
US5723307A (en) Fluorogenic substrates for assay of angiotensin converting enzyme
Danalev et al. Synthesis and structure–activity relationship of new analogues of antistasin
Kasafírek et al. Di-and tripeptide N-alkyl-and N-aralkyl amides as chymotrypsin inhibitors
Tzougraki et al. Fluorogenic Substrates Containing 7‐Amino‐4‐methyl‐2‐quinolinone for Aminopeptidase M, Chymotrypsin, Elastase and Trypsin, Determination of Enzyme Activity
García-Echeverría et al. Kinetic studies of papain: effect of P3′ substituents and donor/acceptor pairs of intramolecularly quenched fluorogenic substrates
KR840001485B1 (ko) 펩타이드의 제조방법
Rijkers Synthetic substrates for thrombin: peptide p-nitroanilides in the continuous monitoring of the blood coagulation system
CS209740B1 (cs) Syntetické substráty pro proteolytické enzymy
JPH0244518B2 (ja) Tanpakubunkaikosooteiryobunsekisuruhoho

Legal Events

Date Code Title Description
PUP Patent expired