DK145461B - Peptider eller salte deraf til anvendelse som substrat ved diagnostisk bestemmelse af srinproteaser isaer faktor xa - Google Patents

Peptider eller salte deraf til anvendelse som substrat ved diagnostisk bestemmelse af srinproteaser isaer faktor xa Download PDF

Info

Publication number
DK145461B
DK145461B DK549475AA DK549475A DK145461B DK 145461 B DK145461 B DK 145461B DK 549475A A DK549475A A DK 549475AA DK 549475 A DK549475 A DK 549475A DK 145461 B DK145461 B DK 145461B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
substrate
factor
arg
gly
peptides
Prior art date
Application number
DK549475AA
Other languages
English (en)
Other versions
DK549475A (da
DK145461C (da
Inventor
L E Aurell
K G Claeson
Original Assignee
Kabi Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kabi Ab filed Critical Kabi Ab
Publication of DK549475A publication Critical patent/DK549475A/da
Publication of DK145461B publication Critical patent/DK145461B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK145461C publication Critical patent/DK145461C/da

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0819—Tripeptides with the first amino acid being acidic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/10—Anilides
    • C12Q2337/12—Para-Nitroanilides p-NA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/30—Naphthyl amides, e.g. beta-NA, 2-NA, 4-methoxy-beta-naphthylamine, i.e. 4MNA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
    • G01N2333/96444—Factor X (3.4.21.6)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/968—Plasmin, i.e. fibrinolysin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/974—Thrombin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/976—Trypsin; Chymotrypsin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/802—Chromogenic or luminescent peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/28—Bound to a nonpeptide drug, nonpeptide label, nonpeptide carrier, or a nonpeptide resin

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

(19) DANMARK (^)
|p (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT od 145461 B
DIREKTORATET FOR ,<
PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET
(21) Ansøgning nr. 5494/75 (51) Int.Ci.3 C 07 C 103/52 (22) Indleveringsdag 4. dec. 1975 C 12 Q 1/34 (24) Løbedag b. dec. 1975 (41) Aim. tilgængelig 6. jun. 1976 (44) Fremlagt 22. nov. 1982 (86) International ansøgning nr. - (86) International indleveringsdag (85) Videreførelsesdag - (62) Stamansøgning nr. -
(30) Prioritet 5. dec. 1974, 7415229, SE
(71) Ansøger AKTIEBOLAGET KABI, S-104 25 Stockholm, SE.
(72) Opfinder Leif Erik Aurell, SE: Karl Goeran CfLaeson, SE.
(74) Fuldmægtig ingeniørfirmaet Lehmann & Ree.
(54) peptider eller salte deraf til anvendelse som substrat ved di* agnostisk bestemmelse af serinp pro teas er, issar faktor Xa.
Opfindelsen angår hidtil ukendte peptider eller salte deraf til anvendelse som substrat ved diagnostisk bestemmelse af serinproteaser, især faktor Xa. De nye peptider er særligt egnede til bestemmelse af faktor Xa (E.C.3.4.21.6) eller til studium af reaktioner, hvori Xa dannes, inhiberes eller forbruges, eller til bestemmelse af faktorer, som påvirker eller deltager i disse reak-D tioner.
f ' ' j Faktoren X er en nøglekomponent i den reaktionssekvens, f som fører til blodets koagulation. Aktivering af faktoren X giver .'' i '. i anledning til dannelse af det proteolytiske enzym, faktor Xa, som ( - er direkte ansvarligt for prothrombinets omdannelse til thrombin. ?
En simpel måde til bestemmelse af koagulationsfaktoren Xa vil være af stor diagnostisk værdi.
2 145461
Hidtil anvendte reagenser til bestemmelse af faktoren Xa har sædvanligvis bestået af estersubstrater med noget uspecifik karakter. Et af disse er f.eks. p-nitrophenyl-p'-guanidinobenzoat (p-NPGB), som også er et godt substrat for thrombin, thrypsin og plasmin. Dets anvendelse i forbindelse med faktoren Xa begrænser sig til rensede enzymtilberedninger.
Med blod fås uanvendelige resultater som følge af tilstedeværelsen af andre esteraser med aktivitet overfor p-NPGB (R.L.Smith, J.Biol.Chem., 248, 2418 (1972)).
Særdeles gode chromogene amidsubstrater til thrombinlig-nende enzymer er beskrevet i beskrivelsen til svensk patent nr. 380.257. Et af disse, som har formlen benzoyl-Phe-Val-Arg-p-nitroanilid (S-2160), fungerer udmærket overfor thrombin, medens faktoren Xa kun spalter substratet ubetydeligt. For at kunne anvendes til diagnostiske blodanalyser bør et substrat for faktoren Xa kun i forsvindende lille udstrækning kunne påvirkes af thrombin.
Fra svensk fremlæggelsesskrift nr. 401.738, Archives of Biochemistry and Biophysics 108 (1964), 266-274, og Journal of Organic Chemistry 3_0 (1965), 1781-1785, kendes endvidere peptider indeholdende sekvensen Gly-Arg-βΝΑ, hvori βΝΑ betegner β-naphthylamin, til anvendelse som substrater ved bestemmelse af proteolytiske enzymer, såsom trypsin. Det som trypsinsubstrat bedste eksempel på et sådant peptid er det i ovennævnte Archives of Biochemistry and Biophysics og Journal of Organic Chemistry angivne peptid carbobenzoxydiglycyl-L-arginin-2-naphthylamid, Cbo-Gly-Gly-Arg-βΝΑ forkortet til GGANA.
Af en sammenlignende afprøvning mellem dette peptid og Bz-Phe-Val-Arg-βΝΑ som trypsinsubstrat omtalt i svensk fremlæggelsesskrift nr. 380.257, side 46, fremgår det imidlertid, at sidstnævnte peptid er et ca. dobbelt så godt trypsinsubstrat som GGANA. Bz-Phe-Val-Arg-βΝΑ er det med S-2160 (Bz-Phe-Val-Arg-p-nitroanilid) nærmest beslægtede peptid, som kan sammenlignes med GGANA som substrat for trypsin, idet såvel anvendelsen af GGANA som Bz-Phe-Val-Arg-βΝΑ som trypsinsubstrat er baseret på en fluorescensmåling af fraspaltet β-naphthylamin. Da anvendelsen af S-2160 som trypsinsubstrat imidlertid er baseret på en spektrofotometrisk måling af fraspaltet p-nitro-anilin, kan den ikke direkte sammenlignes med anvendelsen af GGANA men må dog således anses for at være det hidtil bedste, kendte trypsinsubstrat, i forhold til hvilket peptiderne ifølge nærværende opfindelse bør evalueres som substrat for trypsin, jvf. tabel 1 i nærværende beskrivelse.
3 U5461 GGANA har ikke hidtil været kendt som substrat for faktor Xa, og det har da også vist sig, at det ikke er anvendeligt som sådant. Dets Xa-aktivitet er mindre end 1 % af Xa-aktiviteten af peptiderne ifølge nærværende opfindelse.
Det ville således være ønskeligt at have et for faktoren . Xa mere specifikt substrat, som kun i ubetydelig grad spaltes af thrombin. Substratet bør måle enzymets biologiske funktion, nemlig spaltning afamidbindingerne. Desuden ønskes en hurtig spaltning af substratet til målelige produkter, f.eks. chromofore forbindelser, som let kan følges spektrofotometrisk.
Peptiderne ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de har den almene formel: .—-
Rl-Al“A2-Gly-Arg-NH \ /^2 hvor R^ er H eller benzoyl, A^ er en enkeltbinding, Ile, Leu, Val, Pro, Gly, Phe eller Tyr, og A2 er Glu, Gin, Asp eller Asn.
Saltene kan være af organiske eller uorganiske syrer, som f.eks. HC1, HBr, HF, HNC>3, HCOOH, ACOH, TFA (trifluoreddikesyre), benzoesyre, metansulfonsyre, fluorsulfonsyre og p-toluensulfonsyre.
Peptiderne kan fremstilles ved to principielt forskellige fremgangsmåder.
1. Den ene fremgangsmåde er baseret på, at den chromofore pNA-gruppe kobles til argininet, og at den ønskede peptidstruktur derefter opbygges trinvis ved successiv tilkobling af de øvrige aminosyrer. Den chromofore gruppe tjener derved som beskyttelsesgruppe for den C-terminale carboxylgruppe i den første aminosyre.
2. Den anden fremgangsmåde er baseret på en trinvis opbygning af den ønskede peptidstruktur og først-derefter fraspaltning af de anvendte beskyttelsesgrupper og tilkobling af den chromofore pNA-gruppe.
Ved den ifølge begge disse fremgangsmåder anvendte trinvise opbygning af peptidstrukturen kan man passende gennemføre en rensning ved hjælp af gelfiltrering efter hver tilkobling af en ny aminosyre.
Ved den trinvise opbygning af peptidderivaterne anvendes sædvanlige og inden for peptidkemien gennem lang tid kendte og anvendte koblingsmetoder. Som a-aminobeskyttelsesgrupper kan anvendes de sædvanlige, indenfor peptidkemien velkendte beskyttelsesgrupper som f.eks.
Cbo (carbobenzoxy) , MeOCbo (p-methoxycarbobenzoxy) , NC^Cbo (p-nitro*-carbobenzoxy), MCbo (p-methoxyphenylazo-carbobenzoxy), BOC (tert-butyl- , 145461 4 oxycarbonyl), trifluoracetyl eller formyl. α-Carboxylgruppen kan aktiveres ved, at den overføres til forskellige aktiverede, inden for peptidkemien velkendte og ofte anvendte derivater, som enten kan isoleres eller dannes in situ, såsom f.eks. p-nitrophenylester, trichlor- phenylester, pentachlorphenylester, N-hydroxysuccinimidester, syreazid eller /syreanhydrid, som enten kan være symmetrisk eller usymmetrisk,eller også kan den aktiveres med et carbodiimid, såsom Ν,Ν'-dicyclohexylcarbo-diimid. Den C-terminale carboxylgruppe i aminopeptidderivatet eller ami-nosyrederivatet kan beskyttes ved at forestre den til f.eks. methyl—, ethyl- eller isopropylester eller ved at overføre den til det chromofore anilinderivat, som således fungerer som beskyttelsesgruppe under opbygningen af peptidkæden. Frie funktionelle grupper, som ikke deltager i reaktionen, kan ved opbygningen af peptiderne eller peptidderivaterne beskyttes på følgende måde:
Til blokering af arginylrestens δ-guanidogruppe anvendes sædvanlige, indenfor peptidkemien brugte aminobeskyttelsesmåder eller -grupper, såsom f.eks. protonisering, NC>2 eller Tos (p-toluensulfonyl). Som beskyttelse for carboxylgruppen i glutaminsyre og asparaginsyre anvendes sædvanlige, indenfor peptidkemien brugte beskyttelsesgrupper som f.eks. benzyl- og tert.butylgrupper.
Opfindelsen vil blive beskrevet mere detaljeret i nedenstående udførelseseksempler, som viser fremstillingen af forskellige peptider ifølge opfindelsen ved trinvis syntese.
Ved den tyndtlagschromatografiske analyse (TLC) af eluat og produkter anvendes glasplader med kiselgel F254 (Merck) som absorptionsmiddel. Anvendte opløsningsmiddelsystemer betegnes som det fremgår af følgende tabel.
Betegnelse I systemet indgående opløsningsmidler Volumenforhold A: n-butanol: iseddike: vand (3:1:1) C: n-propanol: ethylacetat: vand (7:1:2) D: n-heptan: n-butanol: iseddike (3:2:1) P^: chloroform: methanol (9:1)
Efter tyndtlagschromatograferingen studeredes pladerne først i DV-lys (254 nm), og derefter anvendtes chlor/toluidinreaktionen ( G. Pataki: Dunnschichtchromatografie in der Amino såure- und
Peptidchemie, Walter de Gruyter & Co. Berlin, 1966, side 125) som fremkaldelsesmetode .
5 145461
De nedenfor anvendte forkortelser har følgende betydninger: Aminosyrer:
Forkortelserne angår aminosyrerester.Den frie aminosyre eller peptidet angives af H- ved aminogruppen og -OH ved carboxylgruppen. Aminogruppen angives altid til venstre og carboxylgruppen til højre.
Alle aminosyrer i forbindelserne har L-konfiguration/ hvis andet ikke er angivet.
Ile = Isoleucin
Arg = Arginin Leu Leucln
Asn = Asparagin
Asp = Asparaginsyre Phe «* Phenylalanin
Gin = Glutamin Pro = Prolin
Glu = Glutaminsyre Tyr = Tyrosin
Gly = Glycin Val = Valin Øvrige forkortelser:
Ac = Acetyl AC2O = Eddikesyreanhydrid
AcOH = Eddikesyre BOC = tert,Butyloxycarbonyl
Bz = Benzoyl
Bzl = Benzyl BZ2O = Benzoesyreanhydrid
Cbo = Carbobenzoxy DCCI = Dicyclohexylcarbodiimid DMF = Dimethylformamid
EtgN = Triethylamin MCbo = p-Methoxyphenylazocarbobenzoxy
MeOH = Methanol
OtBU = tert.-Butyloxy OET = Ethyloxy OMe = Methyloxy
OpNP = p-Nitrophenoxy
OisoPr = iso-Propyloxy pNA = p-Nitroanilid TFA = Trifluoreddikesvre
Tos = p-Toluensulfonyl 6 145461
De i eksemplerne anvendte temperaturangivelser er i °C, hvis andet ikke er angivet.
EKSEMPEL· X; HC1·Bz-Ile —Glu-Gly-Arg-pNA la Cbo-Gly-Arg (IK^-pNA (m.v. 530,4) 5,0 g (10,6 mmol) Cbo-ArgflTC^J-pNA opløses i 21 ml AcOH og 22 ml 4N HBr i AcOH under fugtighedsfrie betingelser. Reaktiopsopløs-ningen omrøres ved stuetemperatur i 1 time og hældes derefter langsomt ned i 200 ml tør ether under kraftig omrøring. Etherfasen skilles derefter fra den fremkomne udfældning, som vaskes yderligere 2 gange med 100 ml ether. Efter tørring i vakuum over P2°5 °9 KOH-tabletter ved 30° fås HBr-saltet af aminosyrederivatet i praktisk taget kvantitativt udbytte (4,95 g). Produktet er entydigt ved TLC i A.
Det ovenfor fremkomne produkt opløses i 50 ml destilleret DMP. Opløsningen afkøles til -10°C, og der tildryppes så meget Et^N, at opløsningen neutraliseres (2,1 ml). Udfældet Et^N'HBr filtreres fra, og filtratet afkøles igen til -10°. 3,9 g (11,8 mmol) Cbo-Gly-OpNP
tilsættes, og opløsningen får lov til langsomt at antage stuetemperatur. Efter ca. 3 timer afkøles reaktionsopløsningen igen til -10° og pufres med 0,54 g (5,3 mmol) EtgN. Denne fremgangsmåde gentages efter yderligere 2-3 timer. Efter reaktion natten over inddampes opløsningen til en sejtflydende olie i vakuum ved 40°. Remanensen opslæmmes i og omrøres med tre portioner destilleret vand. Vandet fradekanteres, og den tilbageværende olie opløses i MeOH, hvorfra produktet fås på krystallinsk form.
Udbytte: 4,2 g (75%) af la.
TLC i P^ (Rf = 0,16) viser kun én plet.
[<x3q4 - 36° (C 0,5, MeOH).
Ib t-BOC“Glu(γ-OBzl)-Gly-Arg(NO2)-pNA (m.v. 715,8) 2,65 g (5,0 mmol) la decarbobenzoxyleres samt kobles med 2,50 g (5,5 mmol) t-BOC-Glu(γ-OBzl)-opNP ifølge beskrivelsen under la. Råproduktet renses ved chromatografering på en kolonne med SEPHADEX ® LH-20 i MeOH med MeOH som elueringsmedium.
Udbytte: 3,25 g (91%) af Ib.
TLC i P. (R,. = 0,22) viser kun én plet.
24 x r [alp - 340 (c 1,0, MeOH).
7 145461
Ic Cbo-Ile — Glu(Y-OBzl)-Gly-Arg(N02)-pNA im.v. 862,9) 1,08 g (1,5 mmol) Ib opløses i 10 ml TFA. Reaktionsopløsningen omrøres i 45 minutter ved stuetemperatur og hældes derefter langsomt ned i 75 ml tør ether under kraftig omrøring. Fremkommet udfældning skilles fra etherfasen og vaskes yderligere to gange med 50 ml ether. Efter tørring i vakuum over P2°5 KOH-tabletter ved 30°C fås TFA-saltet af tri-peptidderivatet i praktisk taget kvantitativt udbytte (1,08 g). Produktet er entydigt ved tlc i A.
Det ovenfor fremkomne produkt opløses i 20 ml DMF, afkøles til -10° og neutraliseres med Et^N (0,23 ml). 0,65 g (1,68 mmol)
Cbo-Ile -OpNP tilsættes, og opløsningen får lov til langsomt at antage stuetemperatur. Efter ca. 3 timer afkøles reaktionsopløsningen igen til -10° og pufres med 0,12 ml Et^N. Denne procedure gentages efter yderligere 2-3 timer. Efterreaktion sker natten over. For at omsætte overskuddet af Cbo-Ile—OpNP og derved undgå, at det ønskede tetrapep-tidderivat ved den efterfølgende chromatografiske rensning forurenes af den aktive ester, sættes nu ca. 100 mg (ca. 1,4 mmol) n-butylamin til opløsningen. Efter ca. 30 minutter inddampes opløsningen til en sejtflydende olie i vakuum ved 40°C. Remanensen opslæmmes i og omrøres med.
3 portioner destilleret vand. Efter dekantering af vandet opløses olien i MeOH og renses på en kolonne med SEPHADEX ® LH-20 i MeOH med MeOH som elueringsmedium.
Udbytte: 1,07 g (83%).
TLC i P·, (R.p = 0,35) viser kun én plet.- [a]^ - 32° (C 0,3, MeOH:DMF 95:5).
Id Bz-Ile—Glu(Y-OBzl)-Gly-Arg(N02)-pNA (m.v. 832) 260 mg (0,30 mmol) Ic decarbobenzoxyleres ifølge beskrivelsen under Ib. Det fremkomne produkt viser ved TLC i A to pletter (Rf = henholdsvis 0,45 og 0,60) og ifølge IR er produktet en blanding af HBr*H-Ile —Glu(Y-OH)-Gly-Arg(N02)-pNA og HBr*H-Ile—Glu(Y-OBzl)-Gly--Arg(N02)-pNA. Den således fremkomne blanding kobles som under la med 800 mg (0,35 mmol) benzoesyreanhydrid. Råproduktet renses ved chromato-grafering på en kolonne med SEPHADEX 0 LH-20 i MeOH med réeOH som elue- 24 ringsmiddel. Derved isoleres to fraktioner a: 130 mg, [a]n - 15 24 u (C 0,5, CH^CN) og Rf = 0,20 i P1 samt β: 105 mg, [a]D - 11 (C 0,5, CH-jCN) og Rj = 0,06 i P^. IR viser produkterne Bz-Ile —Glu (γ-OBzl) -Gly--Arg(N02)-pNA og Bz-Ile —Glu-Gly-Arg(N02)-pNA. Ved reaktion med HF (se le) giver begge produkterne samme slutprodukt (le), 8 145461 le HCl-Bz-Ile— Glu-Gly-Arg-pNA {m.v. 734,3) XOO mg (0,12 mmol) af Id-fraktion α placeres i et reaktionsrør til et sakakibara-åpparat og tilsættes 0,5 ml anisol. Røret tilsluttes til apparatet, og efter evakuering kondenseres ca. 5 ml tør hydrogenfluorid i røret. Efter 75 minutters omsætning ved 0° under omrøring afdestilleres hydrogenfluoridet i vakuum. Den olieagtige remanens opløses i 10 ml 33% AcOH i vand og renses ved chromatografering på en kolonne med SEPHADEX ® G-15 i 33% AcOH i vand og med samme opløsningsmiddel som elueringsmiddel. Det således fremkomne tetrapeptidderivat, der ved TLC har vist sig at være entydigt, isoleres ved frysetørring. Stoffet opløses derefter i MeOH:destilleret vand 95:5 og chromatograferes på en svagt basisk anionbytter QAE-SEPHADEX ®A-25 på chloridform i MeOH:vand 95:5 og med samme opløsningsmiddel som elueringsmedium. Eluatet frysetørres for vand efter at MeOH er afdrevet ved 30° i vakuum.
Udbytte: 75 mg (85%).
TLC i A (R- = 0,48) viser kun én plet.
24 1 [α]β - 40 (C 0,5, 50% AcOH i destilleret vand).
Aminosyreanalyse: Ile : 0,98, Glu: 0,95, Arg: 0,98, Gly: 1,00.
EKSEMPEL II: 2HCl*H-Ile -Glu-Gly-Arg-pNA.
Ila 2HC1*H-Ile—Glu-Gly-Arg-pNA (m.v. 666,6) 100 mg (0,116 mmol) Ic omsættes med hydrogenfluorid samt renses og ionbyttes som beskrevet under le.
Udbytte: 56 mg (73%).
TLC i A (Rjr = 0,34) viser kun én plet.
24 n [a]D = -35° (C 0,5, 50% AcOH i destilleret vand).
Aminosyreanalyse: Ile : 0,96, Glu: 0,94, Arg: 0,96, Gly: 1,00.
EKSEMPEL III: HCl·Bz-Ile —Gln-Gly-Arg-pNA (m.v.733,2)
Illa: Cbo-Gln-Gly-Arg(N02)-pNA (m.v.658.5) 2,65 g (5,0 mmol) la blev beskyttet med HBr i AcOH og kobledes med 2,2 g (5,5 mmol) Cbo-Gln-OpNP ifølge beskrivelsen under la. Råproduktet blev renset ved omkrystallisation to gange i MeOH.
Udbytte: 2,07 g (63%) af Illa.
TLC i A (R_£=0,62) viser kun en plet.
[a]^4 -23° (C 0,5, MeOH/DMF 9/1).
9 145461
Hib: BOC-Ile —Gln-Gly-Arg(N02)-pNA (m.v.737,6) 0,66 g (1,0 mmol) Illa blev beskyttet med HBr og AcOH Ifølge la. Det således opnåede produkt blev opløst i 10 ml destilleret DMF. Opløsningen blev afkølet til -10°C, og der blev tildryppet så meget Et^N, at opløsningen blev neutraliseret. Udfældet Et^N* HBr blev filtreret fra, og filtratet blev påny afkølet til -10°C.
0,40 g (1,1 mmol) BOC -ile -OpNP blev tilsat, og opløsningen fik langsomt lov til at antage stuetemperatur. Efter ca. 3 timer af-r køledes reaktionsopløsningen påny til -10°C og blev pufret med 0,1 ml (0,7 mmol) Et^N. Denne procedure blev gentaget efter yderligere 2-3 timer. Efter reaktion natten over omsattes overskuddet af BOC-lle—OpNP med 0,1 ml (1,0 mmol) n-butylamin for at undgå, at det ønskede tetrapeptidderivat blev forurenet af aktiv ester ved samtidig eluering under den efterfølgénde chromatografiske rensning. Efter ca. 30 minutter inddampes opløsningen til en sejt flydende olie under vacuum ved 40°. Remanensen opslæmmedes i og " omrørtes med tre portioner destilleret vand. Efter dekantering af r vandet opløstes oliet} i MeOH og rensedes på en søjle af Sephadex ® LH-20 i MeOH med MeOH som elueringsmiddel. ' ^
Udbytte: 0,56 g (76%).
TLC i A (R^-0,66) viste kun en plet.
Illc: Bz-Ile-—Gln-Gly-Arg{N02)“PNA (m.v.741,,6) 0,56 g (0,76 mmol) Hib opløstes i 5 mf TPA. Reaktionsopløsningen omrørtes i 15 minutter ved stuetemperatur og udhældtes derefter langsomt i 100 ml tør ether tender kraftig omrøring. Den fremkomne udfældning fraskiltes etherfasen og vaskedes yderligere to gange med 50 ml ether. Efter tørring i vacuum over P2°5 0<3 KOH-piller ved 30°C opnåedes TFA-saltet af tetrapeptidderivatet i kvantitativt udbytte. Ved TLC i A er produktet ensartet.
Det ovenfor opnåede produkt blev opløst i 8 ml DMF, blev afkølet til -10°C og blev neutraliseret med Et^N. Der blev tilsat 0,23 g (1,0 mmol) benzoesyreanhydrid. Efter ca. 30 minutter til-sattes yderligere 100 ml EtgN. Efter reaktion patten over inddampedes opløsningen under vacuum ved 40°C til en sejt flydende olie, Remanensen slæmmedes og omrørtes med destilleret vand, som derefter 145461 : · 10 blev dekanteret af. Tilbagebleven olie blev opløst i MeOH og blev renset på en søjle af Sephadex ® LH-20 i MeOH med MeOH som eluerings-middel.
Odbytte: 0,55 g (95%).
TLG i A (R^=0,64) viste kun en plet.
IHd: Bz-Ile—Gln-Gly-Arg-pNA · HC1 (m.v.733,3) 0,55 g (0,75 mmol) Illc blev omsat med hydrogenfluorid, blev renset og ionbyttet ifølge beskrivelsen under le.
Udbytte: 0,34 g (62%).
TCL i A (R^=0,41) viste kun en plet.
[a]p4 -40° (C 0,5, 50% AcOH (aq)).
Øvrige mellem- og slutprodukter blev syntetiseret i analogi med fremgangsmåden, der er beskrevet under eksempel I-III.
De øvrige produkters fremstilling og deres egenskaber er sammenfattet i tabel A, hvor * angiver slutprodukter, der er anvendelige som substrat ifølge den foreliggende opfindelse.
De ifølge eksemplerne fremstillede substrater blev anvendt til bestemmelse af faktoren Xa som beskrevet i det følgende:
Princippet for bestemmelsen er baseret på, at det ved enzymatisk hydrolyse dannede spaltningsprodukt udviser et fra substratet helt forskelligt UV-spektrum. Således har substratet ifølge eksempel I Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA-HCl et absorptionsmaksimum ved 315 nm med en molær ekstinktionskoefficient på 12.000. Ved 405 nm er substratets absorption næsten helt ophørt. p-Nitroanilin (pNA), som dannes af substratet ved den enzymatiske hydrolyse, har et absorptionsmaksimum ved 380 nm med en molær ekstinktionskoefficient på 13.200,.der ved 405 nm kun er aftaget til 9.620.
Ved spektrofotometrisk at måle ved 405 nm kan man derfor let følge graden af den enzymatiske hydrolyse, der er proportional med mængden af dannet p-nitroanilin. Det tilstedeværende substratoverskud forstyrrer ikke målingen ved denne bølgelængde. For de øvrige substrater ifølge opfindelsen hersker der stort set samme forhold, hvorfor de spektrofotometriske målinger overvejende er blevet udført ved 405 nm.
Tabel 1 viser en sammenligning af reaktionshastighederne mellem det tidligere omtalte substrat S-2160 og substrat I, III, V, VII, IX, X, XI og XX ifølge opfindelsen med forskellige enzymer af serinproteasetypen (E.C. 3.4.21). Reaktionshastighederne blev bestemt ved den ovenfor beskrevne metode.
11 146461
Tabel 1
Kone. Substrat Relative reaktionshastigheder
Thrombin Xa Trypsin Plasmin 0,1 mJM S-2160 100 1 100 100 0,25 mM I 2 100 500 75 III 8 120 470 40 V 3 10 240 20 VII 3 70 350 20 IX 3 56 330 20 X 3 42 340 30 XI 3 64 280 40 XX 12 140 5
Af tabellen ses det, at faktor Xa spalter substrat I og III 100-120 gange bedre end S-2160, hvorimod I og III kun påvirkes ubetydeligt af thrombin sammenlignet med S-2160. Det fremgår således af denne sammenligning, at I og III er langt det bedste substrat til faktor Xa. Desuden fremgår det af tabellen, at I og III med fordel kan anvendes som trypsin-substrat. Da trypsin imidlertid normalt ikke forekommer i blod, er den gode trypsineffekt ikke nogen hindring for en bestemmelse af faktoren Xa i blodbestémmelser;.
De øvrige substrater ifølge opfindelsen fremviser tilsvarende, omend ikke helt så markante egenskaber, som dem, der er omtalt ovenfor for substraterne I og Ill's vedkommende.
12 145461 α) ω
ι—I
ι .
S S S 3 S SS S il t t ^ J o- o o o o' o' o- o' o' o' o o" o' o" o- O o o o o o
h3 I
H 1 C *! pT* C < < < < pT pT <3 pr* pT C pT < < pT* pT <j P5 |je£ ig oæo » “ co S SSSo^om”oo”ooooo rå t ^ w i „G> O Λ U u U o Cl
H JM ci O ^ cd η η Uh On U ,_, UH
,-I^'HhRI. η η h 1 hhImRihØIIhh! Λ +> 'fil .
I · tn tn tu ,y < Άφ B 1 ‘ · <SJ hh® ciriUU HUu"°0)UC) ou afl .*-· h .s η MMhh ΗκΗκΚ^ηκ^^ΚΒ® M ffl g
W
ffl . j3 - - - ϋ Ri ^2 ί-1 ^ ni o ci ,i*i ed i—< t—i
gg ^ ,_!?>·►>* Η5* h!>!>I> HfjPHfxJX^RRRHf’SdS
H °* *° ,9} cd,QU cd .n d & Mhhh
S* cd .Ω U 1—t I—I *—i f—J k.1 “ 1_,HHHHHH
!>>>> g £ > £ κ^Κχχχχχχχχχ* •H < <J s? < ^
Uf 0.¾¾^^¾ <?* g ^ i ft 1 Λ .1 PU ^ . Ί- p< ^ ag 0N< δ 3 < g g 0^3 § ° ^ ^ § O*» « bo I u ω η ^ ω , η cO Ί» ι!λ ^ bU[]j)^ &ΐ]Λ> bo>
g < * ώ 5 ο” Ν S
iJ *J ι ^ ΐί -i, F5 η' Ρί ±? i G η >, Ο >) pi "? 7 S > g ,¾ g5 g1 gosgSg^ogS^S^ S i. £? g >, å I ~°g« 1 S S 1 s si"?5? i'li i ' i i s S ^ ^ I i hc μ^φΙν tnu i? S I ' ^ . i .h 1 7 H d , h ri , * ϋ Γ. I rt
O Q O I pi ° Γ) > p) UnUQnOQnOhXnU
S SHwk Sgna gpQpfflpKfflpKcaSrtW
Φ "* * * * * * m 13 145461
S
H
j t ^ t-OlOOi—<00 (M00t>O00HC^Or-(C*3 C0l0C^ $ o d~ o" cT o- o' o' o' o- cf o- o cT o & <? o o' o si
Hg <ήρΓ'|5Γ<<ι;<;ίΐ(<ί<:«:<;*<<<!<·<*<Ρ<<< t+-<
K
s ,1
g, 1 o 0.0 P
CG) y j—, oj h-c ►—i TJ.O Q
P-j^glh-iKl I Μ H S I 1HHI |HH| I M I I
i) I
* ||
jJ (D o o o o P
ωΜΜθΦυΗ(υ^.Ρ®ΛΦΡοΐΡΡκω<11 S S μΚΚηηη-.μμΪ^ηηι-ηηηΜμμμ^μμμ * . Js w ® ti * d « PQ , « 01 m ^ d m S cts^nj^H01 m < ¢3¾ x„kxx~x>x>xx~>x>~x~
HH
> od cd * I rrt n ^ S >Z^ Cd ►—I HH ^ ^ ^ I xXxxxgxxxxxxxxxxxxx S ft ra < 3<i
§ < S
& x 5, Λ ft to ^ ρΝλΝ^ < < ^ i ^ O « ^ 1 5 ft Λ w- 2 C< ^ ^ ^ I «3^ ^ f f é § s I é 1t < o-t S ?l ti < i 1 f i g If i åi é?!ééiéi if i
f ffl llt illH? MS
o · j2 o PI . r^cQ^CQ' cCQ· 5 W · ϋ H
o O ’O
o Νυ^,ροάυ^ΝϋΚώυΚάυΚ
2 ,MS«SND®pflaNnK<NWCNpq-,N
W ψ 4: »c * * * Ί<* * * * *
DK549475A 1974-12-05 1975-12-04 Peptider eller salte deraf til anvendelse som substrat ved diagnostisk bestemmelse af serinproteaser,isaer faktor xa DK145461C (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE7415229 1974-12-05
SE7415229A SE407058B (sv) 1974-12-05 1974-12-05 Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DK549475A DK549475A (da) 1976-06-06
DK145461B true DK145461B (da) 1982-11-22
DK145461C DK145461C (da) 1983-04-18

Family

ID=20322900

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK549475A DK145461C (da) 1974-12-05 1975-12-04 Peptider eller salte deraf til anvendelse som substrat ved diagnostisk bestemmelse af serinproteaser,isaer faktor xa

Country Status (23)

Country Link
US (2) US4028318A (da)
JP (1) JPS5431397B2 (da)
AT (1) AT351565B (da)
BE (1) BE836085A (da)
CA (1) CA1048998A (da)
CH (1) CH619983A5 (da)
CS (1) CS187492B2 (da)
DD (1) DD123316A5 (da)
DE (1) DE2552570C3 (da)
DK (1) DK145461C (da)
ES (1) ES442997A1 (da)
FI (1) FI753246A7 (da)
FR (1) FR2293439A1 (da)
GB (1) GB1488987A (da)
HU (1) HU174263B (da)
IL (1) IL48506A (da)
IT (1) IT1052318B (da)
NL (1) NL188648C (da)
NO (1) NO142074C (da)
PL (1) PL99020B1 (da)
SE (1) SE407058B (da)
SU (1) SU957762A3 (da)
ZA (1) ZA757441B (da)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK154221B (da) * 1980-02-12 1988-10-24 Pentapharm Ag Tripeptidderivater og fremgangsmaade til kvantitativt at analysere faktor xa i et xa-holdigt medium, faktor x i blodplasma, heparin i hepariniseret blodplasma eller antifaktor xa i blodplasma

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE407058B (sv) * 1974-12-05 1979-03-12 Kabi Ab Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
SE407571B (sv) * 1975-07-11 1979-04-02 Kabi Ab Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
US4176009A (en) * 1976-01-24 1979-11-27 Ajinomoto Co., Inc. Method of measuring collagenase activity
SE431201B (sv) * 1976-01-24 1984-01-23 Ajinomoto Kk For anvendning vid metning av kollagenasaktivitet avsett peptidderivat jemte forfarande for nemnda metning
CH634662A5 (de) * 1976-05-28 1983-02-15 Pentapharm Ag Verwendung von tripeptidderivaten zur quantitativen bestimmung von plasminogen-aktivatoren.
SE437153B (sv) * 1976-12-01 1985-02-11 Kabi Ab Specifika kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
US4191809A (en) * 1977-02-26 1980-03-04 Ajinomoto Co., Inc. Method of measuring enzymatic activity using novel peptide derivatives
JPS5415797A (en) * 1977-06-14 1979-02-05 Seikagaku Kogyo Co Ltd Detection and measurement of toxin in cells
CA1087075A (en) * 1977-08-05 1980-10-07 Robert J. Gargiulo Composition and method for determining transferase and protease activity
US4438029A (en) 1978-01-19 1984-03-20 Research Corporation Synthetic peptides
SE7801373L (sv) * 1978-02-07 1979-08-08 Kabi Ab Lett spjelkbara substrat for kvantifiering av proteaser
US4275153A (en) * 1978-08-03 1981-06-23 American Hospital Supply Corporation Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes
US4336186A (en) * 1978-08-03 1982-06-22 Gargiulo Robert J Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes
JPS59499B2 (ja) * 1978-11-02 1984-01-07 味の素株式会社 ペプチド誘導体
FR2455083A1 (fr) * 1979-04-24 1980-11-21 Jozefonvicz Marcel Nouveau procede de dosage des proteases et des antiproteases et notamment des proteases et antiproteases des systemes de la coagulation et du complement
DE2921216A1 (de) * 1979-05-25 1980-12-04 Teschemacher Hansjoerg Pharmakologisch aktive peptide
DE2936543A1 (de) * 1979-09-10 1981-04-09 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Chromogene verbindungen
US4244865A (en) * 1979-12-03 1981-01-13 Abbott Laboratories α hydroxy tripeptide substrates
US4301245A (en) * 1980-05-29 1981-11-17 Dynasciences Corporation Chromogenic method of detecting endotoxins in blood
WO1982000641A1 (en) * 1980-08-25 1982-03-04 Ab Kabivitrum Peptide substrates for determination of protease activity
JPS5753446A (en) * 1980-09-16 1982-03-30 Torii Yakuhin Kk Peptide derivative
JPS5753445A (en) * 1980-09-16 1982-03-30 Torii Yakuhin Kk Peptide compound
US4406832A (en) * 1981-09-03 1983-09-27 Mallinckrodt, Inc. Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin
US4510241A (en) * 1981-09-03 1985-04-09 Mallinckrodt, Inc. Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin
US4448715A (en) * 1981-11-02 1984-05-15 University Of Miami Tagged pyroglu-L-Phe-L-Arg derivatives, substrates and assays for kallikrein
EP0078764B1 (de) * 1981-11-02 1986-01-02 Pentapharm A.G. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Blutgerinnungsfaktor XII in Humanplasma
CA1247086A (en) * 1982-02-17 1988-12-20 Francis R. Pfeiffer Renally active tetrapeptides
DE3211254A1 (de) * 1982-03-26 1983-09-29 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zum nachweis des vorliegens einer allergie und zum spezifischen nachweis des fuer die allergie verantwortlichen allergens
DE3244030A1 (de) * 1982-11-27 1984-05-30 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Chromogene verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
DE3312191A1 (de) * 1983-04-02 1984-10-11 Karl Mengele & Söhne Maschinenfabrik und Eisengießerei GmbH & Co, 8870 Günzburg Schutzvorrichtung fuer mechanische schraenke und dergleichen geraete bzw. maschinen
FR2546164B1 (fr) * 1983-05-16 1987-07-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux derives de peptides, leur preparation et leur application comme inhibiteurs de l'elastase
DE3446714A1 (de) * 1984-12-21 1986-06-26 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum nachweis des vorliegens einer allergie und zum spezifischen nachweis des fuer die allergie verantwortlichen allergens
US6297024B1 (en) 1998-10-15 2001-10-02 Cell Activation, Inc. Methods for assessing complement activation
US6235494B1 (en) 1999-02-08 2001-05-22 The Scripps Research Institute Substrates for assessing mannan-binding protein-associated serine protease activity and methods using the substrates
GB2492104A (en) * 2011-06-22 2012-12-26 Job Harenberg Assay for direct thrombin inhibitors
CN108089006B (zh) * 2016-11-23 2020-09-25 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 凝血因子ⅹ激活剂活性标定的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1042487A (en) * 1964-06-25 1966-09-14 Ici Ltd Polypeptide derivatives
US3778426A (en) * 1970-12-16 1973-12-11 Research Corp Therapeutically useful polypeptides
SE380257B (sv) * 1972-05-02 1975-11-03 Bofors Ab Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser
SE407058B (sv) * 1974-12-05 1979-03-12 Kabi Ab Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK154221B (da) * 1980-02-12 1988-10-24 Pentapharm Ag Tripeptidderivater og fremgangsmaade til kvantitativt at analysere faktor xa i et xa-holdigt medium, faktor x i blodplasma, heparin i hepariniseret blodplasma eller antifaktor xa i blodplasma

Also Published As

Publication number Publication date
CA1048998A (en) 1979-02-20
FI753246A7 (da) 1976-06-06
IT1052318B (it) 1981-06-20
AT351565B (de) 1979-08-10
JPS5183595A (da) 1976-07-22
SE7415229L (sv) 1976-06-08
IL48506A (en) 1979-05-31
HU174263B (hu) 1979-12-28
NL188648C (nl) 1992-08-17
DE2552570B2 (de) 1980-01-10
FR2293439A1 (fr) 1976-07-02
DD123316A5 (da) 1976-12-12
NO142074C (no) 1980-06-25
ZA757441B (en) 1976-11-24
SE407058B (sv) 1979-03-12
DE2552570A1 (de) 1976-06-10
GB1488987A (en) 1977-10-19
DK549475A (da) 1976-06-06
BE836085A (fr) 1976-03-16
CH619983A5 (da) 1980-10-31
JPS5431397B2 (da) 1979-10-06
CS187492B2 (en) 1979-01-31
ATA900775A (de) 1978-03-15
US4252715A (en) 1981-02-24
US4028318A (en) 1977-06-07
SU957762A3 (ru) 1982-09-07
IL48506A0 (en) 1976-01-30
DE2552570C3 (de) 1983-11-17
ES442997A1 (es) 1977-04-16
NO142074B (no) 1980-03-17
NL7513505A (nl) 1976-06-09
DK145461C (da) 1983-04-18
NO753945L (da) 1976-06-09
AU8687275A (en) 1977-06-02
NL188648B (nl) 1992-03-16
PL99020B1 (pl) 1978-06-30
FR2293439B1 (da) 1979-07-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK145461B (da) Peptider eller salte deraf til anvendelse som substrat ved diagnostisk bestemmelse af srinproteaser isaer faktor xa
US4061625A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
EP0004256B1 (en) Easily split substrates for the quantification of proteases, a process for their production and a method for the quantification of proteases
US4440678A (en) Tripeptide derivatives and their application in assaying enzymes
DK146937B (da) Tripeptider eller salte deraf til anvendelse som diagnostisk kromogent substrat for serinproteaser
EP0076042B1 (en) Novel substrates for measuring thrombin
US4247454A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
CA1068261A (en) Chromogenic thrombin substrates
JPS5877850A (ja) エンドトキシンの定量に有用なペプチド型基質
US4162941A (en) Method for determining a proteolytic enzyme
US4169015A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
JPH059068B2 (da)
JPS62126197A (ja) 新規な血漿キニノゲナーゼ測定用化合物
AU602527B2 (en) Chromogenic compounds, a process for their preparation and their use
US4894438A (en) Synthetic peptidic substrate for determination of trypsin and α1
JPH0755942B2 (ja) 酵素活性測定用ペプチド誘導体及びその使用法
JPH0776232B2 (ja) ペプチド誘導体及びその使用方法
JPH0244839B2 (da)
JPH0136480B2 (da)

Legal Events

Date Code Title Description
PUP Patent expired