CN108089006B - 凝血因子ⅹ激活剂活性标定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种凝血因子Ⅹ激活剂活性标定的方法,属于生物技术领域。步骤如下:(1)在酶标板中加入凝血因子Ⅹ、生色底物溶液和具有确定稀释倍数的待标样品,所述凝血因子X浓度为22.5μg/ml~27.5μg/ml,所述生色底物溶液为4.5mg/ml~5.5mg/ml生色底物溶液与CaCl2溶液按4:3体积比混匀的溶液,所述凝血因子Ⅹ、生色底物溶液和待标样品体积比为30:23:7,同一样品至少设置2个复孔;(2)将酶标板置于酶标仪中读取OD值;(3)取4~15min反应时段的OD值,将复孔的OD平均值与反应时间的平方做线性回归,得到反应曲线;(4)选择反应曲线斜率,定义活性单位,乘以待标样品的稀释倍数,得到待标样品的活性。本发明操作简单,反应速率稳定,标定精度和准确度高。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物制品标定方法,具体涉及一种凝血因子Ⅹ激活剂活性标定的方法,属于生物技术领域。
背景技术
凝血因子Ⅹ激活剂是一种能够作用于凝血因子Ⅹ和凝血因子IⅩ的具有蛋白水解酶特性的酶类。迄今为止,最早发现的也是活性最高的凝血因子Ⅹ激活剂是从圆斑蝰蛇(Vipera russelli)的毒液中发现的,英文缩写为RVV-Ⅹ。这是一种相对分子质量为92880,含有一条重链和两条轻链的糖蛋白,通过专一性切割凝血因子Ⅹ中194位的Arg-Ile之间的肽键,将无活性的凝血因子Ⅹ(FactorⅩ)转变为有酶学活性的凝血因子Ⅹa(FactorⅩa),从而发挥促凝血作用。
活性作为药物的关键质量属性,批间一致性非常重要,而活性参考品是活性测定中最重要试剂。因此,保证活性参考品标定的批间一致性,是保证活性稳定的前提。
现公开的活性测定技术主要有两种,其一为血浆凝固时间法,该方法通过测试血浆凝固时间并与活性参考品的凝血时间进行参比来确定活性。其二为生色底物连续速率法,该方法通过测试反应速率与活性参考品的反应速率进行参比来确定活性。其具体原理为:凝血因子Ⅹ激活剂可将无活性的凝血因子Ⅹ(FactorⅩ)转变为有水解活性的凝血因子Ⅹa(FactorⅩa),生成的FactorⅩa又可将人工合成生色底物Suc-Ile-Gly(γPip)Gly-Arg-pNA水解,被水解的底物会释放出在405nm处有特征吸收的对-硝基苯胺,可通过单位时间内产物生成的量评价反映速率,而酶活性与反应速率成正比。通过与活性参考品速率的参比可计算出测试样品的活性单位。
上述两个方法均采用与活性参考品参比的方法,但却没有对活性参考品标定方法的研究。同时凝血因子Ⅹ激活剂目前还没有国际或国家活性参考品。因此,建立稳定的活性标定方法对保证活性测定的稳定性至关重要。而本发明填补了这个技术的空白。
活性测定采用与活性参考品进行参比的方法,如此可以消除系统误差。而标定方法由于没有标准物质可以参比,对整体反应体系的稳定性提出了更高的要求。本发明利用了生色底物连续速率法原理,优化了《生色底物连续速率法测定圆斑蝰蛇凝血因子Ⅹ激活剂的活性》中的反应系统条件,使得反应速率可以稳定体现,因而得到更准确、一致的标定结果。现有生色底物连续速率法方法不适宜进行标定的主要原因是反应速率的体现不稳定,带来标定误差较大。主要原因来自以下两个方面:其一,此反应为两步级联反应,第一步为凝血因子Ⅹ激活剂激活FⅩ生成FⅩa,第二步FⅩa水解合成底物生成对硝基苯胺。只有当两步反应均进入0级时,反应速率才能不受底物含量的变化影响。目前方法的酶与底物比例设计不合理:第一步酶量较大,同时底物浓度较高,生成了大量的FⅩa,而第二步反应受底物溶解度限制,无法满足第二步酶催化反应进入0级。本方法的优化难点在于第一步反应不可见,即生成的FⅩa的量无法测得,只能通过第二步反应对硝基苯胺的生成量来评价。两步级联反应间相互制约。经过反复的实验摸索,才获得合适底物与酶的比例;其二,缓冲液pH不能保持稳定。本发明针对这两个问题制定解决方案,力图稳定反应速率。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种准确度高、精确度高、耐用性良好、实验材料质量可控、操作简便的标定凝血因子Ⅹ激活剂的方法。
为实现上述目的,本发明采用生色底物连续速率法对凝血因子Ⅹ激活剂活性进行标定,具体原理为:凝血因子Ⅹ激活剂可将无活性的凝血因子Ⅹ(FactorⅩ)转变为有水解活性的凝血因子Ⅹa(FactorⅩa),生成的FactorⅩa又可将人工合成生色底物Suc-Ile-Gly(γPip)Gly-Arg-pNA水解,被水解的底物会释放出在405nm处有特征吸收的对-硝基苯胺,可通过单位时间内产物生成的量评价反映速率,而酶活性与反应速率成正比,因此本方法通过标定反应速率,从而标定酶活性。
为实现上述目的,本发明的采用如下技术方案:
一种凝血因子Ⅹ激活剂活性标定的方法,步骤如下:
(1)在酶标板中加入凝血因子Ⅹ、生色底物溶液和具有确定稀释倍数的待标样品,所述凝血因子X浓度为22.5μg/ml~27.5μg/ml,所述生色底物溶液为4.5mg/ml~5.5mg/ml生色底物溶液与CaCl2溶液按4:3体积比混匀的溶液,所述凝血因子Ⅹ、生色底物溶液和待标样品体积比为30:23:7,同一样品至少设置2个复孔;
(2)将酶标板置于酶标仪中读取OD值;
(3)取4~15min反应时段的OD值,将复孔的OD平均值与反应时间的平方做线性回归,得到反应曲线;
(4)选择反应曲线斜率,定义活性单位,乘以待标样品的稀释倍数,得到待标样品的活性。
所述步骤(1)中CaCl2溶液浓度为30mmol/L~100mmol/L。
所述步骤(1)中凝血因子Ⅹ、生色底物溶液和待标样品体积分别为30μl、23μl、7μl。
所述步骤(4)中将反应曲线斜率在9.00±2.00×10-4之间,标定为0.1U/ml。
本反应曲线斜率是为了与本单位在获得本发明技术方案前采用血浆法标定标准品的活性单位相一致而定义的,具体可根据自己的实际需要定义任意活性单位的反应速率,本方法提供了稳定的反应速率。如可将反应曲线斜率在7±2.00×10-4之间或其他区间标定为0.1U/ml或1U/ml等任意单位,或将反应曲线斜率在1±2.00×10-3之间或其他区间标定为0.1U/ml或1U/ml等任意单位。
所述步骤(1)生色底物为人工合成生色底物Suc-Ile-Gly(γPip)Gly-Arg-pNA。
所述步骤(1)中凝血因子Ⅹ浓度为25μg/ml,所述生色底物溶液为5mg/ml生色底物溶液与75mmol/L CaCl2溶液按4:3体积比混匀的溶液。
所述步骤(1)中凝血因子Ⅹ是经Tris-HCl缓冲溶液稀释的,Tris-HCl缓冲溶液浓度大于150mmol/L,优选为200mmol/L,Tris-HCl缓冲溶液pH值为7.4~8.14,优选值为7.4。
所述Tris-HCl缓冲溶液中含人血清白蛋白,人血清白蛋白浓度为0.09%~0.11%,优选浓度为0.1%。
所述步骤(2)中的测定条件为30~45℃、405nm;优选地所述步骤(2)中的测定条件为37℃;所述步骤(3)中反应曲线R2大于0.98。
本发明还提供了一种凝血因子Ⅹ激活剂活性检测方法,所述检测方法的反应体系为上述凝血因子Ⅹ激活剂活性标定方法中步骤(1)提供的反应体系。
所述凝血因子Ⅹ激活剂活性检测方法,步骤如下:
(1)在酶标板中加入凝血因子Ⅹ、生色底物溶液和梯度稀释的标准品或待测样品,所述凝血因子X浓度为22.5μg/ml~27.5μg/ml,所述生色底物溶液为4.5mg/ml~5.5mg/ml生色底物溶液与CaCl2溶液按4:3体积比混匀的溶液,所述凝血因子Ⅹ、生色底物溶液和待标样品体积比为30:23:7;
(2)将酶标板置于酶标仪中读取OD值;
(3)取4~15min反应时段的OD值,将标准品的OD值与反应时间的平方进行线性回归作图,得每个浓度标准品的斜率值,再将标准品的浓度与斜率值作图,得标准品与斜率的标准曲线;
(4)将待测样品的OD值与反应时间的平方作图,得待测样品的斜率值,将待测样品的斜率值代入标准品的标准曲线中,得待测样品活性。
所述步骤(1)中凝血因子Ⅹ、生色底物溶液和待标样品体积分别为30μl、23μl、7μl;所述CaCl2溶液浓度为30mmol/L~100mmol/L。
所述步骤(1)中凝血因子Ⅹ浓度为25μg/ml,所述生色底物溶液为5mg/ml生色底物溶液与75mmol/L CaCl2溶液按4:3体积比混匀的溶液。
本发明具有如下有益效果:
1、本方法中大大提高了缓冲液浓度,使缓冲液Tris-HCL摩尔浓度在150mM以上,保证了反应体系具有较强的缓冲能力,从而使反应体系中pH值趋于稳定,为本方法提供稳定的反应速率。
2、本方法调整底物与酶浓度,使得两步反应在现有酶量的情况下底物足量,可使方法进入0级反应,即反应速率与底物浓度无关,只与酶量相关。从而使得以反应速率为标志的酶活性标定不受每次配制底物浓度的不同而干扰。提高了标定的精度,减少了活性标定的干扰因素。
本方法使用凝血因子Ⅹ的浓度与现有生色底物检测方法的反应体系相比大大降低,FⅩ消耗量减少使得标定成本急剧下降,同时保证第二步反应进入0级。
3、本标定方法得到的反应速率具有良好的精密度,板内精密度RSD<5%,中间精密度RSD<10%;准确度高,极值之比<140%。本标定方法以反应速率为指标,对活性进行标定。同等酶量下反应速率是否稳定,直接决定了标定结果的精度。本方法反应速率稳定,反应速率精密度良好,RSD可控制10%以内,在生物制品活性标定方法中应属性能较好者。极值之比反应了两批标定结果之间的最大差异,本方法极值之比小于140%,假设第一批标定值为1,第二批标定的结果不超过1.4,说明本标定方法准确度高。
4、本方法具有良好的耐用性:对凝血因子Ⅹ、生色底物、人血清白蛋白浓度不敏感,浓度可在10%范围内浮动,对测试结果无影响,从而屏蔽不同批次试剂及不同实验人员配制对标定结果的影响。
5、本方法可在一定温度范围内进行,在30-45℃之间反应速率变化不大,对标定影响较小。而目前使用的酶标仪控温精度一般能做到在设置温度±3℃范围内。因此,本方法受温度的影响较小,保证了每次标定的准确度。
6、本方法操作简便,利用两步生化反应完成标定,相对于血浆标定法实验材料质量可控,只需用到实验室常规的酶标仪。
7、本发明凝血因子Ⅹ激活剂活性标定方法的反应体系可用于检测凝血因子Ⅹ激活剂活性,检测浓度范围在0.025-0.4U/mL之间线性良好,R2>0.990。
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明,并不以任何方式对本公开造成限定。凡依照本公开内容所进行的任何本领域等同替换,均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为反应速率曲线
图2为中间精密度测试反应速率平均值与活性单位回归方程
图3为20mM、50mM与100mM Tris浓度测试结果对比
图4为150mM与200mM Tris浓度测试结果对比
图5为10种Ca2+浓度测试结果对比
图6为最适反应温度图。
图7为不同标准品浓度与斜率(生色底物生产速率)的线性关系
具体实施方式
实施例1 凝血因子Ⅹ激活剂活性标定
1、实施例所用试剂配制
(1)200mM Tris-HCl缓冲溶液(pH7.4)配制
精密称取24.2g Tris,加水800mL溶解,冷却至室温,用1mol/L HCl调节pH值至7.4,加水至1000mL,混匀备用。
(2)75mM CaCl2配制
称取0.366g CaCl2,加蒸馏水溶解,冷却至室温,加水至100ml,混匀备用。
(3)含0.1%人血清白蛋白200mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH7.4)配制
取20%的人血清白蛋白注射液100μl,加入200mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH7.4)至20ml,混匀,备用。
(4)25μg/ml凝血因子Ⅹ配制
在凝血因子Ⅹ试剂瓶(厂家:HYPHEN BioMed货号:PP008A规格:100μg/支)中加入1mL水复溶,混匀。得到100μg/ml凝血因子Ⅹ母液,分装备用。将100μg/ml的凝血因子Ⅹ用200mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH7.4)稀释至25μg/ml的凝血因子Ⅹ备用。
(5)生色底物溶液的配制
取生色底物一支(厂家:HYPHEN BioMed,货号:229011,规格:25mg/支),加5ml水溶解制成5mg/ml的储备液备用(禁止冷冻)。
将5mg/ml的生色底物储备液与75mmol/L CaCl2按体积比4:3混匀备用。2、待标样品稀释:
本次待测样品为本单位参照文献Hong-Sen Chen,Jin-Mei Chen,Chia-Wei Lin,etc.New insights into the functions and N-glycan structures of factor Xactivator from Russell’s viper venom.FEBS[J].275(2008)3944–3958进行制备。使用1ml水复溶后稀释70、140、280倍分别进行测试。
3、检测
酶标仪预热至37℃。在酶标板中加入30μl的25μg/ml凝血因子Ⅹ、23μl生色底物溶液和7μl的待标样品,马上放入温度为37℃的酶标仪中。在405nm下测定吸光度值,每隔1min检测一次,读取15min。(同一样品至少设置2个复孔)
4、计算
将复孔的OD(A405nm)平均值与反应时间(t/min)的平方做线性回归(取4~15min反应时段),得到整个反应曲线,R2应大于0.98。记录反应曲线对应斜率。
5、结果
本发明将反应曲线斜率在9.00±2.00×10-4之间,标定为0.1U/ml。乘以相应的稀释倍数,即得待标标准品的活性。具体可根据自己的实际需要定义任意活性单位的反应速率,本方法提供稳定的反应速率。
如图1所示,20140618批活性参考品稀释倍数为140倍时,反应速率在9.00±2.00×10-4之间,为8.7×10-4。因此,本批次活性参考品的活性应为14U/支。
实施例2 方法验证
采用“上述实施例1”的方法操作。得到如下验证结果:
1精密度
(1)板内精密度
将样品(参照文献Hong-Sen Chen,Jin-Mei Chen,Chia-Wei Lin,etc.Newinsights into the functions and N-glycan structures of factor X activatorfrom Russell’s viper venom.FEBS[J].275(2008)3944–3958进行制备)配制成低中高浓度样品(0.05、0.1、0.2U/ml),通过10次重复实验评价重复性。
表1 板内精密度考察结果
由表1结果可知,在低中高浓度时测试结果均有较好的板内精密度,板内精密度RSD<5%。
(2)中间精密度
表2 中间精密度考察结果
由表2结果可知,本方法中间精密度良好,以0.1U/ml为目标进行标定,RSD<10%。
(3)极值之比
测试值将围绕真值浮动,多次测量的平均值将无限接近真值。假设中间精密度实验9次测试统计样本足够大,则其平均值为真值。由上述中间精密度结果,由反应速率的平均值与活性单位做线性回归可得回归方程为y=69.44x+1.328,R2=0.996,见图2。
将0.1U/mL点斜率带入方程,得到活性计算值分别为:0.086;0.119;0.113;0.115;0.192;0.115;0.118;0.109;0.115。其中极值为0.119与0.086,两者之比为138%。
2.耐用性
(1)缓冲液浓度
将200mM Tris-HCl缓冲溶液(pH7.4)浓度分别配制成20mM、50mM、100mM、150mM与200mM,测试不同浓度样品反应后pH。
由图3与图4结果可知,缓冲液浓度较低时,反应后体系pH变化较大。当缓冲液浓度达到150mM后,pH变化可控制在0.1以内,当达到200mM后pH趋于稳定。结果显示本方法溶液缓冲能力对pH变化影响较大,应保证较强的缓冲能力,Tris-HCl应保证在200mM左右,并避免Tris-HCl浓度低于150mM。
由于pH值对酶活性的反映有显著的影响。同时,随着反应的进行反应体系的整体pH有降低趋势。因此,反应体系应有足够的缓冲容量,使pH保持稳定,从而体现稳定的反应速率。
(2)Ca2+浓度
将75mM CaCl2,分别配制成10,20,30,40,50,60,70,80,90,100mM 10种Ca2+浓度,测试对检测结果的影响。
由图5结果可知,Ca2+浓度高于30mM时反应速率趋于稳定,对测试结果不会产生较大影响。提示本方法Ca2+充足,在高于30mM时可保证不影响实验结果。
(3)人血清白蛋白浓度
将0.1%人血清白蛋白200mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH7.4),分别配制成0.09%、0.1%、0.11%3种人血清白蛋白浓度,测试对检测结果反应曲线斜率的影响。
表3 人血清白蛋白(人白)含量测试结果对比
表4 0.09%人血清白蛋白与0.1%人血清白蛋白测试结果对比
表5 0.1%人血清白蛋白(人白)与0.11%人血清白蛋白测试结果对比
由表3、表4与表5结果可知,在含人白的稀释液中人白浓度在0.09%-0.11%对测试结果不会产生较大影响(CV<3%,低于中间精密度)。
(4)生色底物浓度
将5mg/ml的生色底物储备液,分别配制成4.5mg/ml、5mg/ml与5.5mg/ml 3种浓度,测试对检测结果反应曲线斜率的影响。
表6 3种生色底物浓度测试结果对比
表7 4.5mg/ml与5mg/ml生色底物浓度测试结果对比
表8 5.5mg/ml与5mg/ml生色底物浓度测试结果对比
由表6、表7
表与表8结果可知,底物浓度控制在4.5mg/ml-5.5mg/ml时对测试结果不会产生较大影响(CV<9%,低于中间精密度)。
(5)凝血因子Ⅹ溶液浓度
将100μg/ml凝血因子Ⅹ溶液,分别配制成22.5μg/ml、25μg/ml与27.5μg/ml 3种浓度,测试对检测结果反应曲线斜率的影响。
表9 3种FⅩ浓度测试结果对比
表10 22.5ug/ml与25ug/ml FⅩ浓度测试结果对比
表11 27.5ug/ml与25ug/ml FⅩ浓度测试结果对比
由表9、表10与表11结果可知,凝血因子Ⅹ浓度控制在22.5μg/ml-27.5μg/ml时对测试结果不会产生较大影响(CV<8%,低于中间精密度)。
(6)缓冲液pH
将200 mM Tris-HCl缓冲溶液(pH7.4),分别配制成pH6.66、pH7.4与pH8.143种pH,测试对检测结果反应曲线斜率的影响。
表12 3种缓冲液pH测试结果对比
表13 缓冲液pH6.66与pH7.4测试结果对比
表14 缓冲液pH8.14与pH7.4测试结果对比
由表12、表13和表14结果可知,当pH为6.66时,样品测试值会较正常值偏低(CV>80%),但pH为8.14时对测试结果不会产生较大影响(CV<8%,低于中间精密度)。因此,缓冲液pH偏低会对本实验测试结果会产生较大影响,在配制缓冲液时应避免pH较低。pH值为7.4~8.14是适宜的。
(7)将反应温度控制在30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃,测试对检测结果反应曲线斜率的影响。由图6可知,温度在30-45℃之间反应速率变化不大,对标定影响较小。而目前使用的酶标仪控温精度一般能做到在设置温度±3℃范围内。因此,本方法收温度的影响较小,保证了每次标定的准确度。
实施例3、凝血因子Ⅹ激活剂活性检测方法
1、实施例所用试剂配制
本实施例所用试剂75mM CaCl2、0.1%人血清白蛋白200mmol/L Tris-HCl缓冲溶液(pH7.4)、25μg/ml凝血因子Ⅹ、生色底物溶液,具体配制同实施例1所用试剂及配制方法。
标准品制备:采用实施例1标定方法所得标准品,即取14U/支的标准品一支,用Tris-HCl缓冲溶液稀释成0.025、0.05、0.1、0.2、0.4U/mL5个浓度备用。
待测样品制备:参照文献Hong-Sen Chen,Jin-Mei Chen,Chia-Wei Lin,etc.Newinsights into the functions and N-glycan structures of factor X activatorfrom Russell’s viper venom.FEBS[J].275(2008)3944–3958进行制备,再将所得溶液稀释至蛋白浓度约1-10ng/ml,即得待测样品。
2、测定待测样品活性
酶标仪预热至37℃。在酶标板中加入30μl的25μg/ml凝血因子Ⅹ、23μl生色底物溶液和7μl的标准品或待测样品,马上放入温度为37℃的酶标仪中。在405nm下测定吸光度值,每隔1min检测一次,读取15min,标准品或待测样品至少设置2个复孔。
选择4-15min的反应时间段,将5个标准品的OD值与反应时间的平方进行线性回归作图,得每个浓度标准品的斜率值,再将标准品的浓度与斜率作图,得标准品与斜率的标准曲线y=0.00744x+0.00013,R2=0.99542,见图7。由图可知,样品浓度在0.025-0.4U/mL之间线性良好,R2>0.990。
选择4-15min的反应时间段,将待测样品的OD值与反应时间的平方作图,得待测样品的斜率值为0.00192,将待测样品的斜率值代入标准品的标准曲线中,得待测样品活性为0.24U/mL。
Claims (13)
1.一种凝血因子Ⅹ激活剂活性标定的方法,其特征在于,步骤如下:
(1)在酶标板中加入凝血因子Ⅹ、生色底物溶液和具有确定稀释倍数的待标样品,所述凝血因子X的浓度为22.5μg/ml~27.5μg/ml,凝血因子Ⅹ是经Tris-HCl缓冲溶液稀释的,Tris-HCl缓冲溶液浓度大于150mmol/L,Tris-HCl缓冲溶液pH值为7.4~8.14,所述生色底物溶液为4.5mg/ml~5.5mg/ml生色底物溶液与CaCl2溶液按4:3体积比混匀的溶液,所述凝血因子Ⅹ、生色底物溶液和待标样品体积比为30:23:7,同一样品至少设置2个复孔,其中所述生色底物为人工合成生色底物Suc-Ile-Gly(γPip)Gly-Arg-pNA,所述CaCl2溶液的浓度为30mmol/L~100mmol/L;
(2)将酶标板置于酶标仪中读取OD值;
(3)取4~15min反应时段的OD值,将复孔的OD平均值与反应时间的平方做线性回归,得到反应曲线;
(4)选择反应曲线斜率,定义活性单位,乘以待标样品的稀释倍数,得到待标样品的活性。
2.根据权利要求1所述的凝血因子Ⅹ激活剂活性标定的方法,其特征在于,所述步骤(1)中凝血因子Ⅹ、生色底物溶液和待标样品体积分别为30μl、23μl、7μl。
3.根据权利要求1所述的凝血因子Ⅹ激活剂活性标定的方法,其特征在于,所述步骤(4)中将反应曲线斜率在9.00±2.00×10-4之间,标定为0.1U/ml。
4.根据权利要求1所述的凝血因子Ⅹ激活剂活性标定的方法,其特征在于,所述步骤(1)中凝血因子Ⅹ浓度为25μg/ml,所述生色底物溶液为5mg/ml生色底物溶液与75mmol/LCaCl2溶液按4:3体积比混匀的溶液。
5.根据权利要求1所述的凝血因子Ⅹ激活剂活性标定的方法,其特征在于,所述步骤(1)中凝血因子Ⅹ是经Tris-HCl缓冲溶液稀释的,Tris-HCl缓冲溶液浓度为200mmol/L,Tris-HCl缓冲溶液pH值为7.4。
6.根据权利要求5所述的凝血因子Ⅹ激活剂活性标定的方法,其特征在于,Tris-HCl缓冲溶液中含人血清白蛋白,人血清白蛋白浓度为0.09%~0.11%。
7.根据权利要求5所述的凝血因子Ⅹ激活剂活性标定的方法,其特征在于,Tris-HCl缓冲溶液中含人血清白蛋白,人血清白蛋白浓度为0.1%。
8.权利要求1-7任一项所述的凝血因子Ⅹ激活剂活性标定的方法,其特征在于,所述步骤(2)中的测定条件为30~45℃、405nm。
9.权利要求1-7任一项所述的凝血因子Ⅹ激活剂活性标定的方法,其特征在于,所述步骤(2)中的测定条件为37℃,所述步骤(3)中反应曲线R2大于0.98。
10.一种凝血因子Ⅹ激活剂活性检测方法,其特征在于,所述检测方法的反应体系为权利要求1-9任一项所述的凝血因子Ⅹ激活剂活性标定方法中步骤(1)提供的反应体系。
11.根据权利要求10所述的凝血因子Ⅹ激活剂活性检测方法,其特征在于,步骤如下:
(1)在酶标板中加入凝血因子Ⅹ、生色底物溶液和梯度稀释的标准品或待测样品,所述凝血因子X的浓度为22.5μg/ml~27.5μg/ml,凝血因子Ⅹ是经Tris-HCl缓冲溶液稀释的,Tris-HCl缓冲溶液浓度大于150mmol/L,Tris-HCl缓冲溶液pH值为7.4~8.14,所述生色底物溶液为4.5mg/ml~5.5mg/ml生色底物溶液与CaCl2溶液按4:3体积比混匀的溶液,所述凝血因子Ⅹ、生色底物溶液和待标样品体积比为30:23:7;其中所述生色底物为人工合成生色底物Suc-Ile-Gly(γPip)Gly-Arg-pNA,所述CaCl2溶液的浓度为30mmol/L~100mmol/L;
(2)将酶标板置于酶标仪中读取OD值;
(3)取4~15min反应时段的OD值,将标准品的OD值与反应时间的平方进行线性回归作图,得每个浓度标准品的斜率值,再将标准品的浓度与斜率值作图,得标准品与斜率的标准曲线;
(4)将待测样品的OD值与反应时间的平方作图,得待测样品的斜率值,将待测样品的斜率值代入标准品的标准曲线中,得待测样品活性。
12.根据权利要求11所述的凝血因子Ⅹ激活剂活性检测方法,其特征在于,所述步骤(1)中凝血因子Ⅹ、生色底物溶液和待标样品体积分别为30μl、23μl、7μl。
13.根据权利要求11或12所述的凝血因子Ⅹ激活剂活性检测方法,其特征在于,所述步骤(1)中凝血因子Ⅹ浓度为25μg/ml,所述生色底物溶液为5mg/ml生色底物溶液与75mmol/LCaCl2溶液按4:3体积比混匀的溶液。
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