CN116256321A - 一种肝素残留量测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种肝素残留量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)准备试剂；(2)制备标准曲线：在多个不同浓度的标准品溶液中：加入抗凝血酶III、孵育，该反应过程肝素和ATIII形成复合物；加入过量的凝血酶Ⅱa、孵育，该反应过程肝素‑ATIII复合物再和IIa形成复合物，该步骤会有凝血酶Ⅱa剩余；加入发色底物，开始读取吸光度，该步骤剩余的凝血酶Ⅱa与发色底物反应生成pNA，记录反应一段时间内的吸光度值，求出吸光度值的变化速率；以相应的吸光度值变化速率对其肝素标准品系列溶液效价单位IU/ml作直线回归；(3)根据标准曲线计算供试品溶液中肝素的残留量。本发明能够提高残留量检测的检测限，并且简便、准确、定量限低、重复性高。

Description

一种肝素残留量测定方法
技术领域
本发明属于生物学检测技术领域，涉及一种肝素残留量测定方法。
背景技术
肝素(Heparin)是一种糖胺聚糖，是被广泛应用的抗凝血药物。肝素的抗凝血功能主要是通过它与抗凝血酶的结合来实现的。肝素与抗凝血酶结合后引起抗凝血酶III发生分子构象变化，可加速ATⅢ-凝血酶复合物这一反应达千倍以上，从而增强抗凝血酶的抗凝血活性。
2015年版《中国药典》三部通则3424采用凝固法测定肝素活性，利用硫酸鱼精蛋白能中和肝素，从而影响反应体系中血浆凝固时间，通过凝固时间及中和的硫酸鱼精蛋白量来测定样品中的肝素含量。此凝固法操作繁琐，耗时费力，最终含量通过两个变量因素(硫酸鱼精蛋白和样品含量https://www.doc88.com/p-0941767769872.html)间接获得，精准性相对较差。
中国药典四部1208肝素生物测定法是化学药效价检测，利用手工试验步骤，终点判定、量反应平行线法的计算模型进行肝素的效价测定。但其针对的是高浓度的肝素活性检测，要求的肝素含量高，对准确度和精密度要求并不高，目前现有技术中缺少对量值较低的肝素残留量的检测手段。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够提高残留量检测的检测限，并且简便、准确、定量限低、重复性高的肝素残留量测定方法。本发明的肝素残留量测定方法测试原理为：抗凝血酶III(AT-Ⅲ)与凝血酶(IIa)结合生成AT-Ⅲ-IIa复合物，肝素(HEP)与抗凝血酶III(AT-Ⅲ)、过量的凝血酶(IIa)三者结合形成生成HEP-AT-Ⅲ-IIa复合物、以及剩余的凝血酶(IIa)；对剩余的凝血酶(IIa)利用发色底物(S-2238)反应，凝血酶将pNA催化解离，游离的pNA可通过分光光度计或酶标仪检测即可反推得到肝素的残留量。
如下反应所示：
抗凝血酶III(AT-Ⅲ)+凝血酶(IIa)→AT-Ⅲ-IIa复合物
↓
肝素(HEP)+抗凝血酶III(AT-Ⅲ)+过量的凝血酶(IIa)→HEP-AT-Ⅲ-IIa复合物+剩余的凝血酶(IIa)
↓
剩余的凝血酶(IIa)+发色底物(S-2238)→pNA(OD405检测)
更具体的，其中：
抗凝血酶III(AT-III)是一种人体内非常重要的抗凝性蛋白，AT-Ⅲ是凝血酶及因子Ⅻα、Ⅺα、Ⅸα、Ⅹα等含丝氨酸的蛋白酶的抑制剂。它与凝血酶通过精氨酸-丝氨酸肽键相结合形成ATⅢ-凝血酶复合物而使酶灭活。
肝素(Heparin)可加速ATⅢ-凝血酶复合物这一反应达千倍以上，肝素与ATⅢ所含的赖氨酸结合后引起ATⅢ构象改变，使ATⅢ所含的精氨酸残基更易与凝血酶的丝氨酸残基结合形成肝素-ATⅢ凝血酶复合物。
IIa，即凝血酶，由凝血酶原(Prothrombin，II因子)经蛋白水解活化而来。它在凝血过程中起着非常重要的作用，能够促使纤维蛋白凝块的产生。
S-2238是凝血酶的发色底物(chromogenic substrates)，为化学合成的小肽，其一端为发色基团(pNA)，凝血酶可将pNA催化解离下来。游离pNA可通过常用的专用设备仪器如分光光度计或酶标仪检测。pNA是在一定时间内按相同的速度逐渐生成，直至凝血酶(IIa)或者发色底物消耗完。检测pNA方式为：记录一定时间内吸光值的变化速率，这种动力学法重复性更好。
至此，形成本发明的测试原理。
为实现上述目的提供一种肝素残留量测定方法，本发明采用了如下的技术方案：
一种肝素残留量测定方法，包括如下步骤：
(1)试剂的制备
配制稀释液，pH控制在7.4-8.4；复溶抗凝血酶III；复溶凝血酶IIa；
复溶发色底物：取发色底物S-2238；
复溶标准品：取肝素标准品，用稀释液稀释至多个不同浓度；
样品：用稀释液进行预稀释后直接进样；
(2)制备标准曲线
a.分别加入多个不同浓度的标准品、孵育；
b.在各标准品溶液中：
加入抗凝血酶III、孵育，该反应过程肝素和ATIII形成复合物；
加入过量的凝血酶Ⅱa、孵育，该反应过程肝素-ATIII复合物再和IIa形成复合物，该步骤会有凝血酶Ⅱa剩余；
加入发色底物，该步骤剩余的凝血酶Ⅱa与发色底物反应生成pNA，在405nm波长处记录反应一段时间内(start time/end time)的吸光度值，然后求出吸光度值的变化速率；
b.数据处理，以相应的吸光度值变化速率Y对其肝素标准品系列溶液效价单位IU/ml作直线回归，求得直线回归方程；
(3)样品肝素残留量的测试
a.加入一定量的样品、孵育；
b.加入抗凝血酶III、孵育，该反应过程肝素和ATIII形成复合物；
加入过量的凝血酶Ⅱa、孵育，该反应过程肝素-ATIII复合物再和IIa形成复合物，该步骤会有凝血酶Ⅱa剩余；
加入发色底物，该步骤剩余的凝血酶Ⅱa与发色底物反应生成pNA，反应结束后读取吸光度，根据标准曲线计算供试品溶液中肝素的残留量。
优选的，配制稀释液：取三羟甲基氨基甲烷6.06g，氯化钠10.23g，EDTA2.8g，聚乙二醇6000 1.0g，加水800ml使溶解，用盐酸调节pH至8.4，用水稀释至10000ml。
优选的，复溶抗凝血酶：取抗凝血酶(AT-Ⅲ)加入适量超纯水剧烈振荡30分钟至全部溶解，用稀释液稀释至0.25IU/ml；
复溶凝血酶IIa：取凝血酶IIa，用稀释液稀释至24IU/ml，该浓度使空白管的吸光值在0.8～1.0左右；
复溶发色底物：取发色底物S-2238，加水调整浓度至1.25μmol/ml。
优选的，在步骤(2)制备标准曲线中：肝素、ATIII、IIa和发色底物控制摩尔浓度比为1：(1+X)：(1+Y1)：(Y2)；其中，X和Y1、Y2均大于0且小于1；Y2大于Y1。
优选的，对样品进行预稀释，控制样品和标准品的浓度在0.064IU/ml以下。
优选的，肝素标准品用稀释液稀释至五个不同浓度分别为：0.064、0.048、0.032、0.016、0.000IU/ml。
优选的，步骤(2)中：
a.利用全自动加样仪的机械加样臂分别加入多个不同浓度的标准品40μl，37℃孵育160秒；
b.在各标准品溶液中：
机械臂加样针加入抗凝血酶III 40μl，37℃孵育120秒，该反应过程肝素和ATIII形成复合物；
机械臂加样针加入过量的凝血酶Ⅱa 40μl，37℃孵育120秒，该反应过程肝素-ATIII复合物再和IIa形成复合物，该步骤会有凝血酶Ⅱa剩余；
机械臂加样针加入发色底物40μl。
优选的，步骤(3)中：
a.机械臂加样针加入样品40μl，37℃孵育160秒；
b.机械臂加样针加入抗凝血酶III 40μl，37℃孵育120秒；
机械臂加样针加入过量的凝血酶Ⅱa 40μl，37℃孵育120秒；
机械臂加样针加入发色底物40μl。
优选的，步骤(2)中：
加入发色底物，利用专用设备开始读取吸光度，该步骤剩余的凝血酶Ⅱa与发色底物反应生成pNA，在405nm波长处记录反应5～45秒吸光度值的变化速率，单位mAbs/min。通过该时间段的选取，能够保证所有标准曲线的浓度点都呈线性，利于精准检测。
优选的，所述的孵育是对标准品、抗凝血酶III、凝血酶Ⅱa、样品进行单孔单独计时孵育，保证孵育时间完全一致。
有益效果：
相较于传统的药典四部1208效价测定方法而言，准确度和精密度要求并不高，本发明是检测肝素的残留量，对准确度、精密度，尤其是对定量限的准确度和精密度要求很高，针对凝血因子产品的肝素检测需求提出创新的解决方案，具体的，基于肝素、凝血酶IIa与发色底物S-2238反应的测试原理，可以实现生物药残留检测，而且利用动力学法检测光度值、重复性更好；将量反应平行线法的计算模型改为标准曲线法，提高了残留量检测的检测限，并且简便、准确、定量限低达到了0.006IU/ml、重复性高。此外，本发明的试验步骤基于自设程序，可以实现全自动检测，提高检测效率。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1、2为本发明标准曲线测试的结果对照图。
图3、4为不同浓度下本发明实施例(动力学判定)与对照例(终点法判定)的吸光度对照图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例的描述进一步详细解释本发明，但以下包括实施例的描述仅用于使本发明所属技术领域的普通技术人员能够更加清楚地理解本发明的原理和精髓，不意味着对本发明进行任何形式的限制。
根据本发明的一种较佳的实施方式，为一种肝素残留量测定方法，包括如下步骤：
(1)试剂的制备
配制稀释液：取三羟甲基氨基甲烷6.06g，氯化钠10.23g，EDTA2.8g，聚乙二醇60001.0g，加水800ml使溶解，用盐酸调节pH至8.4，用水稀释至10000ml；
复溶抗凝血酶：取抗凝血酶(AT-Ⅲ)加入适量超纯水剧烈振荡30分钟至全部溶解，用稀释液稀释至0.25IU/ml；
复溶凝血酶IIa：取凝血酶IIa，用稀释液稀释至24IU/ml，该浓度使空白管的吸光值在0.8～1.0左右；
复溶发色底物：取发色底物S-2238，加水调整浓度至1.25μmol/ml；
复溶标准品：取肝素标准品，用稀释液稀释至多个不同浓度：0.064、0.048、0.032、0.016、0.000IU/ml；
样品：将样品稀释至标准曲线范围内。
(2)制备标准曲线
a.分别加入多个不同浓度的标准品40μl(Material/Sample volume，下同)，37℃孵育160秒(incubation range，下同)；
b.在各标准品溶液中：
加入抗凝血酶III 40μl，37℃孵育120秒，该反应过程肝素和ATIII形成复合物；
加入过量的凝血酶Ⅱa 40μl，37℃孵育120秒，该反应过程肝素-ATIII复合物再和IIa形成复合物，该步骤会有凝血酶Ⅱa剩余；
加入发色底物40μl，利用专用设备开始读取吸光度，该步骤剩余的凝血酶Ⅱa与发色底物反应生成pNA，在405nm波长处记录反应一段时间内(start time/end time)的吸光度值，然后求出吸光度值的变化速率(动力学测试)，单位mAbs/min(毫吸光度/分钟)；
c.数据处理，以相应的吸光度值变化速率Y(mAbs/min)对其肝素标准品系列溶液效价X(单位IU/ml)作直线回归，求得直线回归方程Y＝bX+A；
(3)样品肝素残留量的测试
a.加入一定量的样品40μl，37℃孵育160秒；
b.加入抗凝血酶III 40μl，37℃孵育120秒，该反应过程肝素和ATIII形成复合物；
加入过量的凝血酶Ⅱa 40μl，37℃孵育120秒，该反应过程肝素-ATIII复合物再和IIa形成复合物，该步骤会有凝血酶Ⅱa剩余；
加入发色底物40μl，该步骤剩余的凝血酶Ⅱa与发色底物反应生成pNA，反应结束后读取吸光度，根据标准曲线计算供试品溶液中肝素的残留量。
其中，进样参数要求为：
作为优选的，在步骤(2)制备标准曲线中：肝素、ATIII、IIa和发色底物控制摩尔浓度比为1：(1+X)：(1+Y1)：(Y2)，其中，X和Y1、Y2均大于0且小于1；使得ATIII将肝素能完全反应，凝血酶Ⅱa能够完全将肝素-ATIII复合物进行反应结合并留有Ⅱa残留；Y2大于Y1；使得发色底物的量能够与过量的凝血酶Ⅱa完全结合，基于此，肝素、ATIII、IIa和发色底物需要保持在一定的比例，剂量-反应才能呈线性关系，残留的IIa的量和肝素的量呈反相关，从而建立在肝素的量和吸光度的变化速率之间建立联系：呈负相关。
在ATIII、IIa和发色底物加量已经固定的情况下，进样前对样品进行预稀释，控制样品和标准品的浓度在0.064IU/ml以下。
作为优选的，肝素标准品用稀释液稀释至五个不同浓度分别为：0.064、0.048、0.032、0.016、0.000IU/ml。
基于上述参数，后续加入的试剂相对于前一个反应试剂进行适当过量，以此保证肝素被充分反应，最终的吸光度也是与肝素的量成反相关；进而保证整个体系中，肝素含量即使达到标准曲线最高浓度，也能全部与ATIII(过量)结合，并进而全部和IIa(过量)结合。
步骤(2)的制备标准曲线中：
a.利用全自动加样仪的机械臂加样针分别加入多个不同浓度的标准品40μl(Material/Sample volume，下同)，37℃孵育160秒(incubation range，下同)；
b.在各标准品溶液中：
机械臂加样针加入抗凝血酶III 40μl，37℃孵育120秒，该反应过程肝素和ATIII形成复合物；
机械臂加样针加入过量的凝血酶Ⅱa 40μl，37℃孵育120秒，该反应过程肝素-ATIII复合物再和IIa形成复合物，该步骤会有凝血酶Ⅱa剩余；
机械臂加样针加入发色底物40μl。
步骤(3)的样品肝素残留量的测试中：
a.机械臂加样针加入样品40μl，37℃孵育160秒；
b.机械臂加样针加入抗凝血酶III 40μl，37℃孵育120秒；
机械臂加样针加入过量的凝血酶Ⅱa 40μl，37℃孵育120秒；
机械臂加样针加入发色底物40μl。
需说明的是，上述制备步骤通过仪器设置相应参数、根据参数自动执行相应动作(对应上述涉及的英文名称的指令)，可实现自动检测，见如下具体实施例：
为了检测人凝血因子VIII和人凝血酶原复合物中的肝素残留量，希望该方法准确性高、重复性高、定量限低、标准曲线线性拟合度高、抗干扰能力强。
实施例1
按照如下步骤进行：
S1、创建试剂，自定义试剂名称和类型；
S2、试剂准备并放到试剂架相应的位置，并关联自定义的试剂名称(该部分均为手工操作)，具体的：
配制稀释液：取三羟甲基氨基甲烷6.06g，氯化钠10.23g，EDTA2.8g，聚乙二醇60001.0g，加水800ml使溶解，用盐酸调节pH至8.4，用水稀释至10000ml；
复溶抗凝血酶：取抗凝血酶(AT-Ⅲ)加入适量超纯水剧烈振荡30分钟至全部溶解，用稀释液稀释至0.25IU/ml；
复溶凝血酶IIa：取凝血酶IIa，用稀释液稀释至24IU/ml，该浓度使空白管的吸光值在0.8～1.0左右；
复溶发色底物：取发色底物(S-2238)，加水调整浓度至1.25μmol/ml；
复溶标准品：取肝素标准品，用稀释液稀释至多个不同浓度：0.064、0.048、0.032、0.016、0.000IU/ml；
样品：将样品稀释至标准曲线范围内。
S3、制备标准曲线
首先，需注意的是，肝素、ATIII、IIa和底物需要保持一定的比例[提供具体的比例范围关系，尽量不要提供单个数值的比例，提供范围值更合适，参照权要3-5的批注]，剂量-反应才能呈线性关系，在ATIII、IIa和底物加量已经固定的情况下，样品和标准品的浓度应在0.064IU/ml以下，此步骤开始在反应杯中进行；
a.按上述创建系列标准品并放置到试剂架上，在仪器Calibration里设置系列标准品的浓度(IU/ml)，具体的，放入标准品并输入值(Calibrator target value)1.6IU/ml，然后仪器根据输入值自动系列稀释至我们的标曲范围浓度(Target value)，分别是0.064、0.048、0.032、0.016、0.000；
b.机械臂加样针分别加入多个不同浓度的标准品40μl(设置Material/Samplevolume，下同)，37℃孵育160秒(设置incubation range，下同)；
c.在各标准品溶液中：
利用全自动加样仪的机械臂加样针加入抗凝血酶III 40μl，37℃孵育120秒，该反应过程肝素和ATIII形成复合物；
机械臂加样针加入过量的凝血酶Ⅱa 40μl，37℃孵育120秒，该反应过程肝素-ATIII复合物再和IIa形成复合物，该步骤会有凝血酶Ⅱa剩余；
机械臂加样针加入发色底物40μl，开始读取吸光度，该步骤剩余的凝血酶Ⅱa与发色底物反应生成pNA，在405nm波长处记录反应5～45秒(设置Start time-end time)吸光度值的变化速率，单位mAbs/min(毫吸光度/分钟)；
d.数据处理，以相应的吸光度值变化速率Y(动力学法)对其肝素标准品系列溶液效价X(IU/ml)作直线回归(点击math model:linear regression)，求得直线回归方程；
S6、样品肝素残留量的测试
a.机械臂加样针加入一定量的样品40μl，37℃孵育160秒；
b.机械臂加样针加入抗凝血酶III 40μl，37℃孵育120秒，该反应过程肝素和ATIII形成复合物；
机械臂加样针加入过量的凝血酶Ⅱa 40μl，37℃孵育120秒，该反应过程肝素-ATIII复合物再和IIa形成复合物，该步骤会有凝血酶Ⅱa剩余；
机械臂加样针加入发色底物40μl，该步骤剩余的凝血酶Ⅱa与发色底物反应生成pNA，反应结束后读取吸光度，根据标准曲线计算供试品溶液中肝素的残留量。
实施例2
经上述试验，获得相应的标准曲线，对标准曲线进行线性试验。该试验指在设计的范围内，线性试验结果与试样中被测物浓度直接呈比例关系的能力，至少制备5个不同浓度水平，以测定的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，以直线回归相关系数(r)表示，基于化学原理的残留量检测方法一般要求直线回归相关系数r应不低于0.99；基于生物学原理的检测方法一般要求直线回归相关系数应不低于0.98；本例基于0.064、0.048、0.032、0.016、0.000IU/ml的系列浓度，重复6次进行线性试验，测试结果如下表所示，表明所建的方法标准曲线的相关系数都达到化学原理的残留量检测方法的要求，高于基于生物学原理的检测方法的要求。
表1标准曲线的相关系数r的结果汇总
Figure BDA0004003278250000101
备注：上述6次标准曲线测试的结果对应图1、2所示。
实施例3
准确度：指采用该方法测定的结果与真实值接近的程度，一般用回收率(％)表示。通过设计3种不同浓度，每种浓度分别制备6份供试品溶液进行测定。
精密度：指在规定的测定条件下，同一份均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度，一般用相对标准偏差RSD(％)，其中在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性。
根据《中国药典》2020版肝素钠检查项下规定：每1mg抗IIa因子的效价不得少于180IU，1IU/ml相当于5.6μg/ml，如下表2-3所示的单位换算对照。
表2单位换算对照表
Figure BDA0004003278250000111
表3质量体积浓度和百分比换算
浓度 百分比
1g/ml 100％
1mg/ml 0.1％
1μg/ml 0.0001％ ppm
1ng/ml 0.0000001％ ppb
按照《中国药典》2020版三部9101分析方法验证指导原则中对回收率和重复性的要求，0.064IU/ml和0.032IU/ml执行1ppm的要求(该浓度下回收率限度标准为75％～120％)；0.006IU/ml执行10ppb的要求(该浓度下回收率限度标准为70％～125％)。
本发明选取标准曲线的最高浓度0.064IU/ml、中间浓度0.032IU/ml和定量限浓度0.006IU/ml考察该方法的准确度和重复性(对应0.064IU/ml、0.032IU/ml、0.006IU/ml每种浓度分别制备6份、对应编号1-6的供试品溶液)。具体的，测试结果如表4-5所示，结果表明，高中低三种肝素浓度的回收率均在95％～102％之间，远高于标准要求的75％～120％，甚至达到10％成分含量(100000ppm)所要求的回收率限度95％～102％。重复性均符合标准要求，随着肝素浓度标高，相对标准偏差RSD也越来越低。
表4准确度的结果汇总(单位:IU/ml)
Figure BDA0004003278250000121
表5重复性的结果汇总(单位:IU/ml)
Figure BDA0004003278250000122
表明，本发明测试方法的准确度和重复性高，对于较低肝素残留量的检测具有较高的检测精确度。
其中，定量限又称作灵敏度、最低检测浓度(Limit of quantification LOQ),指能检出待测物在样品中的最低含量。其测定结果应符合准确度(回收率，％)和精密度(相对标准偏差RSD，％)要求。通过采用直观法，即用已知浓度的肝素样品，试验出能被可靠地定量测定的最低浓度为0.006IU/ml，相当于33ppb。参见表6所示，该浓度的回收率和重复性均符合标准要求。由于定量限极低，检测肝素残留更精准。
表6定量限的结果汇总(单位:IU/ml)
Figure BDA0004003278250000123
实施例4干扰试验
人凝血因子VIII和人凝血酶原复合物一般会加入氨基酸或者糖作为保护剂，为考察这些保护剂是否对检测有影响，根据EP-07A2临床化学中的干扰实验推荐的方法，用样品中添加干扰物质和对照同时测定评估的方法，以系列浓度调查干扰物的影响程度，影响程度一般用偏离(％)来表示，计算公式：偏离(％)＝(检测值-理论值)/理论值×100％；我们分别以甘氨酸和麦芽糖，按照常用的添加浓度配制系列浓度溶液与已知浓度的肝素对照品混合，进行检测，检测结果如表7、表8所示，表明偏离值最高不超过8.0％，说明甘氨酸和麦芽糖对肝素的检测没有影响。
表7甘氨酸对检测结果的影响(单位:IU/ml)
编号 1 2 3 4 5
甘氨酸加入量(mg/ml) 5 7.5 10 12.5 15
肝素加入量(IU/ml) 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
结果 0.052 0.051 0.052 0.054 0.053
偏离(％) 4.0％ 2.0％ 4.0％ 8.0％ 6.0％
表8麦芽糖对检测结果的影响(单位:IU/ml)
编号 1 2 3 4 5
麦芽糖加入量(mg/ml) 5 7.5 10 12.5 15
肝素加入量(IU/ml) 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
结果 0.052 0.052 0.051 0.049 0.052
偏离(％) 4.0％ 4.0％ 2.0％ -2.0％ 4.0％
实施例5耐用性试验
指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为所建立的方法用于常规检验提供依据。测定条件小的变动应能满足系统适用性试验要求，以确保方法的可靠性。本发明在实施例的基础上，设计了稀释剂的三种pH(仅按照下表调整PH值，其余处理条件不做调整)，考察其对定量限的影响。测试结果如表9所示，表明，代表中性的pH7.4和偏碱pH的8.4对定量限没有影响，而代表偏酸pH的6.4对定量限影响很大，无法检出。
表9pH对定量限的影响(单位:IU/ml)
Figure BDA0004003278250000131
对照例
以实施例1为例，将步骤S5中“机械臂加样针加入发色底物40μl，开始读取吸光度，该步骤剩余的凝血酶Ⅱa与发色底物反应生成pNA，在405nm波长处记录反应5～45秒(设置Start time-end time)吸光度值的变化速率，单位mAbs/min(毫吸光度/分钟)”替换为“机械臂加样针加入发色底物40μl，开始读取吸光度，该步骤剩余的凝血酶Ⅱa与发色底物反应生成pNA，待发色底物或凝血酶IIa反应完成后，加入醋酸中止反应，然后检测吸光度值，单位mAbs/min(毫吸光度/分钟)”，其余步骤均与实施例1相同。
结果显示，0.016IU/ml的肝素标准品加入终止试剂后(比如50％醋酸)，并不是一条直线，即使一分钟后仍不能维持直线。即使高浓度的0.64IU/ml加入终止试剂后虽然能迅速稳定，但还是有波动，这就影响读数的稳定，并影响检测的准确度和重复性。而采取本申请的动力学读取吸光度变化：0.016IU/ml吸光度的变化几乎是一条直线，而高浓度的0.64IU/ml肝素标准品的吸光度变化完全就是一条直线。参加对照图3-4所示(横坐标单位为s，纵坐标单位为mAbs/min)，其它浓度0.048、0.032、0.000IU/ml下的测试数据也如此。
上述依据发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims (10)

1.一种肝素残留量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)试剂的制备
配制稀释液，pH控制在7.4-8.4；复溶抗凝血酶III；复溶凝血酶IIa；
复溶发色底物：发色底物采用S-2238；
复溶标准品：取肝素标准品，用稀释液稀释至多个不同浓度；
样品：用稀释液进行预稀释后直接进样；
(2)制备标准曲线
a.分别加入多个不同浓度的标准品、孵育；
b.在各标准品溶液中：
加入抗凝血酶III、孵育，该反应过程肝素和ATIII形成复合物；
加入过量的凝血酶Ⅱa、孵育，该反应过程肝素-ATIII复合物再和IIa形成复合物，该步骤会有凝血酶Ⅱa剩余；
加入发色底物，该步骤剩余的凝血酶Ⅱa与发色底物反应生成pNA，在405nm波长处记录反应一段时间内的吸光度值，然后求出吸光度值的变化速率；
b.数据处理，以相应的吸光度值变化速率Y对其肝素标准品系列溶液效价单位IU/ml作直线回归，求得直线回归方程；
(3)样品肝素残留量的测试
a.加入待测试样品、孵育；
b.加入抗凝血酶III、孵育，该反应过程肝素和ATIII形成复合物；
加入过量的凝血酶Ⅱa、孵育，该反应过程肝素-ATIII复合物再和IIa形成复合物，该步骤会有凝血酶Ⅱa剩余；
加入发色底物，该步骤剩余的凝血酶Ⅱa与发色底物反应生成pNA，反应结束后读取吸光度，根据标准曲线计算供试品溶液中肝素的残留量。
2.根据权利要求1所述的肝素残留量测定方法，其特征在于，试剂的制备中：
配制稀释液：取三羟甲基氨基甲烷6.06g，氯化钠10.23g，EDTA2.8g，聚乙二醇60001.0g，加水800ml使溶解，用盐酸调节pH至8.4，用水稀释至10000ml。
3.根据权利要求1所述的肝素残留量测定方法，其特征在于，试剂的制备中：
复溶抗凝血酶：取抗凝血酶AT-Ⅲ加入适量超纯水剧烈振荡30分钟至全部溶解，用稀释液稀释至0.25IU/ml；
复溶凝血酶IIa：取凝血酶IIa，用稀释液稀释至24IU/ml，该浓度使空白管的吸光值在0.8～1.0左右；
复溶发色底物：取发色底物S-2238，加水调整浓度至1.25μmol/ml。
4.根据权利要求1所述的肝素残留量测定方法，其特征在于：在步骤(2)制备标准曲线中：
肝素、ATIII、IIa和发色底物控制摩尔浓度比为1：(1+X)：(1+Y1)：(Y2)；
其中，X和Y1、Y2均大于0且小于1；Y2大于Y1。
5.根据权利要求1所述的肝素残留量测定方法，其特征在于：
对样品进行预稀释，控制样品和标准品的浓度在0.064IU/ml以下。
6.根据权利要求1所述的肝素残留量测定方法，其特征在于：
肝素标准品用稀释液稀释至五个不同浓度分别为：0.064、0.048、0.032、0.016、0.000IU/ml。
7.根据权利要求1所述的肝素残留量测定方法，其特征在于，步骤(2)中：
a.分别加入多个不同浓度的标准品40μl，37℃孵育160秒；
b.在各标准品溶液中：
加入抗凝血酶III 40μl，37℃孵育120秒，该反应过程肝素和ATIII形成复合物；
加入过量的凝血酶Ⅱa 40μl，37℃孵育120秒，该反应过程肝素-ATIII复合物再和IIa形成复合物，该步骤会有凝血酶Ⅱa剩余；
加入发色底物40μl。
8.根据权利要求1所述的肝素残留量测定方法，其特征在于，步骤(3)中：
a.加入样品40μl，37℃孵育160秒；
b.加入抗凝血酶III 40μl，37℃孵育120秒；
加入过量的凝血酶Ⅱa 40μl，37℃孵育120秒；
加入发色底物40μl。
9.根据权利要求1所述的肝素残留量测定方法，其特征在于，步骤(2)中：
加入发色底物，该步骤剩余的凝血酶Ⅱa与发色底物反应生成pNA，在405nm波长处记录反应5～45秒吸光度值的变化速率，单位mAbs/min。
10.根据权利要求1所述的肝素残留量测定方法，其特征在于，所述的孵育是对标准品、抗凝血酶III、凝血酶Ⅱa、样品进行单孔单独计时孵育。
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