CN112921067B - 一种蛋白水解酶标准品溶液及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于酶活性检测领域，公开了一种用于蛋白水解酶检测的标准品溶液及其制备方法和应用。本发明蛋白水解酶检测标准品溶液是在蛋白水解酶标准品中添加白蛋白溶液，混匀后制得的溶液。本发明还公开了应用前述蛋白水解酶标准品溶液进行蛋白水解酶活性测定的方法。利用本发明公开的蛋白水解酶标准品溶液制作标准曲线，测定蛋白酶酶活性的方法，检测的线性范围扩大、检测上限得到提高，检测更加简便，利用本发明蛋白水解酶标准品溶液校准传统蛋白水解酶检测方法，可以使得结果更加准确、可靠，具备非常强的实际应用推广价值。

Description

一种蛋白水解酶标准品溶液及其制备方法和应用
技术领域
本发明具体涉及一种蛋白水解酶标准品溶液及其制备方法和应用，属于酶活性检测领域。
背景技术
蛋白水解酶(又称蛋白酶)是一类催化肽键水解反应的酶的总称。蛋白酶总类繁多，来源广泛，按活性中心和必需基因不同，分为丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶等。其中激肽释放酶(舒血管素，Kallikrein，ECU3.4.21.8，简称K)是一组具有特异性、局限性蛋白水解作用的丝氨酸蛋白酶，在生物体内以无活性的前体——前激肽释放酶(Prekallikrein)的形式存在，它们与激肽释放酶抑制剂(Kallikrein Inhibitor)及激肽酶(Kininase)共同组成激肽体系(Bradykinin System)。激肽释放酶能使底物——激肽原(Kininogen)释放出一种多肽——激肽(Kinin)。
发色底物法是常见的酶活性测试方法，其原理为发色底物在酶的催化作用下，裂解产生发色基团，发色基团的吸光度与酶的活性成正相关。发光底物S-2288检测蛋白水解酶活性通常采用连续监测法。
连续检测法是在酶活力的测定方法中，不停止酶反应，连续监测酶促反应过程中某一产物或底物的吸光度，根据吸光度随时间的变化求出待测物浓度或活性的方法。连续检测法常在全自动、半自动生化分析仪和全自动凝血仪上应用。由于仪器设备本身条件限制，往往无法完全按照仪器使用说明书来进行，从而导致测定结果准确性难预测，急需解决该问题。
目前，大多数临床实验室在测定血清酶活性时不用校准品，而是根据仪器系统的特性，用给定系数(K值)计算酶活性。U/L＝ΔA/min×K×F，ΔA/min为每分钟吸光度变化率；K为给定系数；F为稀释倍数。但是由于催化活性不仅取决于酶的含量，还受多种因素的影响，比如底物的性质和浓度，反应介质的pH、温度、离子强度、激活或抑制因子等，这些因素在不同程度上影响到用K值计算出来的酶活性结果的可信度。
而用S-2288作为发色底物通过标准曲线法检测蛋白水解酶的方法仍然存在线性范围较窄，有文献报道在3-30U/L之间。同时实际待检测样品的蛋白水解酶活性往往较高，待测样品稀释次数增多将带来加大的操作误差，导致检测结果准确性降低。
发明内容
为解决上述问题，本发明将白蛋白应用于蛋白水解酶标准品溶液中，以此提高酶活性检测的准确性。
进一步地，所述蛋白水解酶标准品溶液中白蛋白终浓度不高于5％(g/mL)，优选白蛋白终浓度2-4.5％(g/mL)。
更进一步地，所述白蛋白为人血白蛋白、重组人血白蛋白、牛血清白蛋白或重组牛血清白蛋白，优选人血白蛋白；所述蛋白水解酶标准品为丝氨酸蛋白水解酶标准品，优选激肽释放酶标准品。
本发明还提供了一种蛋白水解酶标准品溶液，它是含有白蛋白终浓度不高于5％(g/mL)的蛋白水解酶标准品溶液。
进一步地，所述白蛋白终浓度2-4.5％(g/mL)；和/或，所述白蛋白为人血白蛋白、重组人血白蛋白、牛血清白蛋白或重组牛血清白蛋白，优选人血白蛋白；和/或，所述蛋白水解酶标准品为丝氨酸蛋白水解酶标准品，优选激肽释放酶标准品。
更进一步地，所述人血白蛋白溶液的添加量为每160U蛋白水解酶标准品添加1.2-2.5mg人血白蛋白。
本发明还提供了一种蛋白水解酶标准品溶液的制备方法，它是将蛋白水解酶标准品溶于水，再添加人血白蛋白溶液，混匀后制得蛋白水解酶标准品溶液；优选人血白蛋白终浓度不高于5％
(g/mL)，更优选2-4.5％(g/mL)的蛋白水解酶标准品溶液。
进一步地，所述人血白蛋白溶液的添加量为每160U蛋白水解酶标准品添加1.2-2.5mg人血白蛋白。
更进一步地，所述蛋白水解酶标准品为丝氨酸蛋白水解酶标准品，优选激肽释放酶标准品。
本发明最后还提供了一种前述的溶液或者包含所述溶液的制剂在蛋白水解酶活性测定中的应用。
本发明公开的蛋白水解酶检测方法，白蛋白使用量显著降低。使用本发明公开的蛋白水解酶标准品溶液制作标准曲线时，稀释液简单，比如仅仅使用Tris缓冲液即可。对应地，待测样品稀释液的白蛋白使用量非常低，0.2％-0.004％(g/mL)浓度即可。
相对现有技术S-2288作为发色底物，蛋白酶活性测定尤其是Human Kallikrein蛋白水解酶活性测定在3-30U/L范围内具有线性，本发明通过将白蛋白应用于蛋白水解酶标准品溶液中，将检测的线性范围扩大至5-125U/L，尤其在5.39U/L-122.42U/L范围内线性良好，r＞0.999。对应地，本发明公开的检测方法的上限明显提高：现有技术的检测上限为30U/L，本发明公开的检测上限提高至122.42U/L，约是现有技术的4倍多。由于检测上限提高，高活性蛋白水解酶样品稀释倍数减少，从而降低稀释误差，提高检测的准确度。
本发明公开的蛋白水解酶检测方法在5-125U/L范围内，回收率高，因此检测准确度高；同时因为标准品、样品稀释液简单、白蛋白用量低，检测成本低，易于大批量样品检测。具体地，本发明公开的蛋白酶活性测定尤其是Human Kallikrein蛋白水解酶活性测定方法在5U/L-10U/L范围内回收率可达到70-130％，15U/L-120U/L时回收率可达到80-120％。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1线性回归曲线。
具体实施方式
如非特殊说明，本发明所用专有名词“专属性”系指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)存在下，采用的分析方法能正确测定被测物的能力。回收率通过先添加一定量的被测物，然后检测被测物含量，同时做样品空白得出。回收率＝[(加标试样测定值-试样测定值)/加标量]×100％。本发明实施例、试验例、对比试例回收率＝测定值/理论值*100％。
如非特殊说明，本发明所用专有名词“线性系”指在设计的范围内，测定响应值与试样中被测物浓度呈比例关系的程度。
如非特殊说明，本发明所用专有名词“范围”是样品中被测物的最高浓度和最低浓度之间的间隔(包括最高和最低浓度)，在此区间内，分析方法应有合适的精密度、准确度和线性。
如非特殊说明，本发明所用专有名词“准确度”系指采用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收率(％)表示。
本发明蛋白水解酶酶活力单位定义：在37℃、pH 8.4条件下，每分钟转化出1μmol底物的酶量定义为1个酶活力单位(U)。
本发明所述白蛋白可以任选人血白蛋白、重组人血白蛋白或牛血清白蛋白或重组牛血清白蛋白，优选人血白蛋白或牛血清白蛋白，更优选人血白蛋白。
本发明蛋白水解酶标准品溶解用水，任选超纯水、去离子水、反渗水、超纯水、注射用水或细菌内毒素检查用水，优选注射用水或细菌内毒素检查用水。
相对于酶底物反应产物的当次酶活力测试试验会受当时仪器、试剂、操作人员及实验室环境等多种因素的干扰，为了提高检测的准确度，本发明公开的蛋白水解酶活性检测方法通过设置校准品来校准样品检测结果，提高检测结果准确性。作为本发明的一种具体的实施方式，本发明实施例、试验例、对比试例采用的试剂、检测仪器及基本检测参数和操作步骤如下：
1、试剂：
1)20％(g/mL)人血白蛋白：四川远大蜀阳药业有限责任公司自制。
2)蛋白水解酶标准品：Human Kallikrein，活性为161.60U/瓶。
3)底物S-2288启动试剂：将25mg的S-2288溶解在7.2mL蒸馏水中，获得6mmol/L的底物S-2288启动试剂。
4)缓冲液：pH8.4的Tris缓冲液，用于试剂和样品的稀释和配制。
2、试验仪器：
ACL TOP 300 CTS全自动血凝仪。
3、基本参数：
温度37℃，测定波长405nm，反应方向为正，反应类型“0”级速率法，延迟时间10s。
4、操作步骤：
取标准品溶液或待测样本溶液50μl于37℃保温孵育2-
4min，再加入缓冲液50μl，继续37℃保温孵育2-4min，最后加入底物S-2288启动试剂50μl，连续监测时间为90s，自动计算ΔmAbs/min。
实施例1本发明蛋白水解酶标准品溶液
取1瓶蛋白水解酶标准品(161.60U/瓶)，加6ml细菌内毒素检查用水溶解后，与54ml 5％人血白蛋白混合，得人血白蛋白终浓度4.5％(g/mL)，酶活性2693.33U/L的蛋白水解酶标准品溶液。
蛋白水解酶标准品：Human Kallikrein，活性为161.60U/瓶。
5％人血白蛋白：四川远大蜀阳药业有限责任公司自制20％人血白蛋白，用pH8.4的Tris缓冲液稀释至5％(g/mL)得到。
实施例2本发明蛋白水解酶标准品溶液
取1瓶蛋白水解酶标准品(161.60U/瓶)，加10ml细菌内毒素检查用水溶解后，与50ml 5％人血白蛋白混合，得人血白蛋白终浓度4.17％(g/mL)，酶活性2693.33U/L的蛋白水解酶标准品溶液。
蛋白水解酶标准品：Human Kallikrein，活性为161.60U/瓶。
5％人血白蛋白：同实施例1。
实施例3本发明蛋白水解酶标准品溶液
取1瓶蛋白水解酶标准品(161.60U/瓶)，加50ml注射用水溶解后，与10ml 4％人血白蛋白混合，得人血白蛋白终浓度2％(g/mL)，酶活2693.33U/L的蛋白水解酶标准品溶液。
蛋白水解酶标准品：Human Kallikrein，活性为161.60U/瓶。
4％(g/mL)人血白蛋白：四川远大蜀阳药业有限责任公司自制20％人血白蛋白，使用时用pH8.4的Tris缓冲液稀释至4％(g/mL)得到。
实施例4本发明蛋白水解酶标准品溶液
取1瓶蛋白水解酶标准品(161.60U/瓶)，加24ml注射用水溶解后，与36ml 5％人血白蛋白混合，得人血白蛋白终浓度3％(g/mL)，酶活2693.33U/L的蛋白水解酶标准品溶液。
蛋白水解酶标准品：Human Kallikrein，活性为161.60U/瓶。
5％人血白蛋白：同实施例1。
实施例5本发明蛋白水解酶标准品溶液的校验品
取实施例1的蛋白水解酶标准品溶液，加pH8.4的Tris缓冲液倍比稀释至26.93U/L(校验品1)、13.47U/L(校验品2)，即得校验品。80μL分装、-80℃保存备用。
实施例6蛋白水解酶活性检测
1)系列浓度的标准品溶液制备：取实施例1蛋白水解酶标准品溶液，加pH8.4的Tris缓冲液稀释成蛋白水解酶活性5～125U/L的系列浓度溶液，用全自动血凝仪测定ΔmAbs/min，建立蛋白水解酶标准曲线；
2)待测样品溶液稀释、校验品准备：
将待测样品用含人血白蛋白0.2％-0.009％(g/mL)的pH8.4的Tris缓冲液稀释数倍，使稀释后的样品蛋白水解酶活性在5～125U/L线性范围内。
校验品准备：实施例6的浓度为26.93U/L、6.73U/L校验品室温融化，备用。
3)标准曲线制备：
取5～125U/L的标准品溶液系列浓度样品50μL于37℃保温孵育2-4min，再加入pH8.4的Tris缓冲液50μL，继续37℃保温孵育2-4min，最后加入底物S-2288启动试剂50μL，连续监测时间为90s，自动计算ΔmAbs/min。
回归曲线拟合(r＞0.999)。
4)待测样品、校验品活性检测
取稀释后的待测样品、校验品1、校验品2 50μL于37℃保温孵育2-4min，再加入pH8.4的Tris缓冲液50μL，继续37℃保温孵育2-4min，最后加入底物S-2288启动试剂50μL，连续监测时间为90s，自动计算ΔmAbs/min。
5)检测结果计算
将稀释后的待测样品、校验品ΔmAbs/min检测结果带入回归曲线，计算待测样品、校验品蛋白水解酶活性。
校验品回收率计算：(校验品检测结果/校验品理论结果)*100％，校验品1的回收率应在80-120％之间，校验品2的回收率应在70-130％之间。
稀释后的待测样品蛋白水解酶活性校正值＝标准曲线检测值/校验品1或校验品2回收率。
以下通过试验例、对比例的方式进一步说明本发明的有益效果。
试验例1本发明蛋白水解酶标准品溶液的线性检测
1、试验方法
将实施例1、2、3、4制备的蛋白水解酶标准品溶液用pH8.4的Tris缓冲液稀释至5.39U/L，10.77U/L，21.55U/L，53.87U/L，67.33U/L，89.78U/L，107.73U/L和122.42U/L酶活性浓度梯度，每个浓度平行测定3次，并计算酶活性浓度平均值。
范围是样品中被测物的最高浓度和最低浓度之间的间隔(包括最高和最低浓度)，在此区间内，已经证明分析方法有合适的精密度、准确度和线性。
标准：回归曲线符合y＝bx+a，相关系数≥0.99(5.39U/L-122.42U/L)，剩余标准偏差≤10％，a＝±5，斜率的RSD≦5％，剩余标准偏差RSD≦10％。
2、试验结果
实施例1制备的蛋白水解酶标准品溶液的线性检测结果如下：
线性和范围实验结果表明：在5.39U/L-122.42U/L线性相关系数r>0.99，斜率间RSD值为2.89％<5％，截距a值在0.04-2.33≦±5，剩余标准偏差RSD值为8.69<10％。
统计结果见图1，表1。
表1线性、范围结果统计
Figure BDA0002305170820000071
Figure BDA0002305170820000081
实施例2制备的蛋白水解酶标准品溶液的线性检测结果如下：
线性和范围实验结果表明：在5.39U/L-122.42U/L线性相关系数r>0.99，斜率间RSD值为0.72％<5％，截距a值在1.0679-1.5035≦±5，剩余标准偏差RSD值为4.07<10％。线性相关性在可接受范围内。
统计结果见表2。
表2线性、范围结果统计
Figure BDA0002305170820000082
实施例3制备的蛋白水解酶标准品溶液的线性检测结果如下：
线性和范围实验结果表明：在5.39U/L-122.42U/L线性相关系数r>0.99，斜率间RSD值为1.17％<5％，截距a值在0.9102-1.1973≦±5，剩余标准偏差RSD值为2.23<10％。线性相关性在可接受范围内。
统计结果见表3。
表3线性、范围结果统计
Figure BDA0002305170820000083
实施例4制备的蛋白水解酶标准品溶液的线性检测结果如下：线性和范围实验结果表明：在5.39U/L-122.42U/L线性相关系数r>0.99，斜率间RSD值为0.74％<5％，截距a值在1.3413-2.1389≦±5，剩余标准偏差RSD值为4.66<10％。线性相关性在可接受范围内。
统计结果见表4。
表4线性、范围结果统计
Figure BDA0002305170820000084
Figure BDA0002305170820000091
试验例2本发明蛋白水解酶标准品溶液的线性检测
1、试验方法
将实施例1制备的蛋白水解酶标准品溶液用pH8.4的Tris缓冲液稀释至122.42U/L的酶活性浓度，然后用0.20％(g/mL)人血白蛋白梯度稀释至107.73U/L、89.78U/L、67.33U/L、53.87U/L、21.55U/L、10.77U/L、5.39U/L酶活性浓度，每个浓度平行测定3次，并计算酶活性浓度平均值。
标准：回归曲线符合y＝bx+a，相关系数≥0.99(5.39U/L-122.42U/L)，剩余标准偏差≤10％，a＝±5，斜率的RSD≦5％，剩余标准偏差RSD≦10％。
2、试验结果
上述样品的蛋白水解酶标准品溶液的线性检测结果如下：
统计结果见表5。
表5线性、范围结果统计
Figure BDA0002305170820000092
上述实验结果表明，将人血白蛋白终浓度为4.5％的蛋白水解酶标准品溶液稀释至人血白蛋白浓度一致(0.20％(g/mL)、)的122.42U/L、107.73U/L、89.78U/L、67.33U/L、53.87U/L、21.55U/L、10.77U/L、5.39U/L酶活性梯度样品时，线性相关系数r>0.999，线性相关性在可接受范围内。
试验例3本发明蛋白水解酶标准品溶液的线性检测
1、试验方法
将实施例3制备的蛋白水解酶标准品溶液用pH8.4的Tris缓冲液稀释稀释至122.42U/L，然后用0.09％(g/mL)人血白蛋白梯度稀释至107.73U/L、89.78U/L、67.33U/L、53.87U/L、21.55U/L、10.77U/L、5.39U/L酶活性浓度，每个浓度平行测定3次，并计算酶活性浓度平均值。
标准：回归曲线符合y＝bx+a，相关系数≥0.99(5.39U/L-122.42U/L)，剩余标准偏差≤10％，a＝±5，斜率的RSD≦5％，剩余标准偏差RSD≦10％。
2、试验结果
上述样品的线性检测结果如下：
统计结果见表6。
表6线性、范围结果统计
Figure BDA0002305170820000101
上述实验结果表明，将人血白蛋白终浓度为2％的蛋白水解酶标准品溶液稀释至人血白蛋白浓度一致(0.09％(g/mL)、)的122.42U/L、107.73U/L、89.78U/L、67.33U/L、53.87U/L、21.55U/L、10.77U/L、5.39U/L酶活性梯度样品时，线性相关系数r>0.999，线性相关性在可接受范围内。
试验例4蛋白水解酶标准品溶液中的白蛋白终浓度对蛋白水解酶活性浓度回收率检测结果的影响
1、试验方法
取蛋白水解酶标准品，用10ml水溶解后加入50ml 5％人血白蛋白混合，得到的标准品溶液中蛋白水解酶活性浓度为2693.3U/L，白蛋白终浓度为4.17％。
按表7配置得到不同白蛋白终浓度的蛋白水解酶标准品溶液。
表7不同白蛋白终浓度的蛋白水解酶标准品溶液的配置表
Figure BDA0002305170820000102
Figure BDA0002305170820000111
备注：N/A表示未加入。
将白蛋白终浓度为2％的蛋白水解酶标准品溶液用pH8.4的Tris缓冲液稀释至129.18U/L，113.68U/L，94.74U/L，71.05U/L，56.84U/L，22.74U/L，11.37U/L和5.68U/L酶活性浓度梯度，每个浓度平行测定3次，并计算酶活性浓度平均值，以酶活性浓度在5U/L和10U/L时回收率应达到70-130％，15U/L-120U/L时回收率应达到80-120％为合格指标。
将白蛋白终浓度为3％的蛋白水解酶标准品溶液用pH8.4的Tris缓冲液稀释至129.18U/L，113.68U/L，94.74U/L，71.05U/L，56.84U/L，22.74U/L，11.37U/L和5.68U/L酶活性浓度梯度，每个浓度平行测定3次，并计算酶活性浓度平均值，以酶活性浓度在5U/L和10U/L时回收率应达到70-130％，15U/L-120U/L时回收率应达到80-120％为合格指标。
将白蛋白终浓度为4.17％的蛋白水解酶标准品溶液用pH8.4的Tris缓冲液稀释至5.39U/L，10.77U/L，21.55U/L，53.87U/L，67.33U/L，89.78U/L，107.73U/L和122.42U/L酶活性浓度梯度，每个浓度平行测定3次，并计算酶活性浓度平均值，以酶活性浓度在5U/L和10U/L时回收率应达到70-130％，15U/L-120U/L浓度时回收率应达到80-120％为合格指标。
将白蛋白终浓度为5％的蛋白水解酶标准品溶液稀释至128.33U/L，112.93U/L，94.12U/L，70.58U/L，56.47U/L，22.59U/L，11.29U/L和5.65U/L的酶活性浓度，每个浓度平行测定3次，并计算酶活性浓度平均值，以酶活性浓度在5U/L和10U/L时回收率应达到70-130％，15U/L-120U/L时回收率应达到80-120％为合格指标。
将白蛋白终浓度为6％的蛋白水解酶标准品溶液稀释至123.15U/L，108.37U/L，90.32U/L，67.73U/L，54.19U/L，21.67U/L，10.84U/L和5.42U/L的酶活性浓度，每个浓度平行测定3次，并计算酶活性浓度平均值，以酶活性浓度在5U/L和10U/L时回收率应达到70-130％，15U/L-120U/L时回收率应达到80-120％为合格指标。
将白蛋白终浓度为7％的蛋白水解酶标准品溶液稀释至126.01U/L，110.89U/L，92.42U/L，69.31U/L，55.44U/L，22.18U/L，11.09U/L和5.54U/L的酶活性浓度，每个浓度平行测定3次，并计算酶活性浓度平均值，以酶活性浓度在5U/L和10U/L时回收率应达到70-130％，15U/L-120U/L时回收率应达到80-120％为合格指标。
将白蛋白终浓度为8％的蛋白水解酶标准品溶液稀释至124.88U/L，109.89U/L，94.59U/L，68.68U/L，54.95U/L，21.98U/L，10.99U/L和5.49U/L的酶活性浓度，每个浓度平行测定3次，并计算酶活性浓度平均值，以酶活性浓度在5U/L和10U/L时回收率应达到70-130％，15U/L-120U/L时回收率应达到80-120％为合格指标。
2、不同白蛋白终浓度的蛋白水解酶活性浓度回收率检测结果
由表6至表11统计结果可得出：当蛋白水解酶标准品溶液中白蛋白终浓度在2％-4.17％范围时，蛋白水解酶活性浓度在5-125U/L范围内回收率符合要求，而当蛋白水解酶标准品溶液中白蛋白终浓度在5％-8％范围时，蛋白水解酶活性浓度5-125U/L范围内回收率不符合接受标准。统计结果见表8至表14。
表8白蛋白终浓度为2％时回收率结果统计
Figure BDA0002305170820000121
表9白蛋白终浓度为3％时回收率结果统计
Figure BDA0002305170820000131
表10白蛋白终浓度为4.17％时回收率结果统计
Figure BDA0002305170820000132
表11白蛋白终浓度为5％时回收率结果统计
Figure BDA0002305170820000133
表12白蛋白终浓度为6％时回收率结果统计
Figure BDA0002305170820000134
表13白蛋白终浓度为7％时回收率结果统计
Figure BDA0002305170820000135
Figure BDA0002305170820000141
表14白蛋白终浓度为8％时回收率结果统计
Figure BDA0002305170820000142
根据Research Methods公开的信息显示，用S-2288检测血浆或血浆来源的免疫球蛋白中间品蛋白水解酶的方法在3-30U/L或0.05-0.5μkat/L范围内线性良好。待测样品(或标准品)处理时需将待测血浆、血清或血浆来源的免疫球蛋白中间品用缓冲液(TrisBuffer，pH8.4，25℃)稀释至蛋白水解酶活性在3-30U/L或0.05-0.5μkat/L之间才能准确检测，而本发明能将检测范围扩大到5-125U/L。
对比例1不含白蛋白的Human Kallikrein蛋白水解酶标准品溶液在5-125U/L范围内的线性及回收率
不含白蛋白的Human Kallikrein蛋白水解酶标准品溶液：取1瓶HumanKallikrein蛋白水解酶标准品(161.60U/瓶)，加60ml细菌内毒素检查用水溶解后，混匀，制得酶活2693.33U/L的不含白蛋白的蛋白水解酶标准品溶液。
1、线性检测方法、回收率检测方法
同试验例1线性检测方法，试验例4的回收率检测方法。
2、准确性测定结果
1)线性、范围测定结果
表15线性、范围结果统计数据显示：在5.39U/L-122.42U/L范围内线性相关系数r＜0.99，在5.39U/L-58.37U/L范围内线性相关系数r＞0.99。不含白蛋白的HumanKallikrein蛋白水解酶标准品溶液在5-125U/L范围内无线性。
表15线性、范围结果统计
Figure BDA0002305170820000143
Figure BDA0002305170820000151
2)回收率测定结果
表16平均回收率结果统计数据显示：酶活性浓度为5.39U/L和10.77U/L时平均回收率分别是98.45％、97.8％，在70-130％可接受范围内；酶活性浓度在21.55U/L-122.42U/L范围内对应平均回收率在74.31％-100.73范围内，不在80-120％可接受范围内。
表16平均回收率结果统计
Figure BDA0002305170820000152
以上试验结果表明：不含白蛋白的Human Kallikrein蛋白水解酶标准品溶液在5-125U/L范围内线性相关系数r＜0.99，无线性；不含白蛋白的Human Kallikrein蛋白水解酶标准品溶液在5-125U/L范围内，对应回收率在74.31％-100.73范围内，不在80-120％可接受范围内。
综上，本发明蛋白水解酶活性测定方法将现有技术中的样品检测范围扩大到了5-125U/L，尤其在5.39U/L-122.42U/L范围内线性良好，r＞0.999。同时在5-125U/L范围内，回收率更高，具体地，本发明公开的蛋白酶活性测定尤其是Human Kallikrein蛋白水解酶活性测定方法在5U/L-10U/L时回收率可达到70-130％，15U/L-120U/L时回收率可达到80-120％。
当本发明蛋白水解酶活性测定方法用于测定临床血浆样品时，待测样品稀释简单，测定速度快，一次可同时测定若干个样品，操作简单而且有较好的重复性。

Claims (9)

1.人血白蛋白在制备蛋白水解酶标准品溶液中的用途，其特征在于：所述蛋白水解酶标准品溶液中白蛋白终浓度不高于5%,g/mL；所述蛋白水解酶标准品为激肽释放酶标准品。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述蛋白水解酶标准品溶液中白蛋白终浓度为2~4.17%，g/mL。
3.一种蛋白水解酶标准品溶液，其特征在于：它是含有人血白蛋白终浓度不高于5％，g/mL的蛋白水解酶标准品溶液；所述蛋白水解酶标准品为激肽释放酶标准品。
4.根据权利要求3所述的蛋白水解酶标准品溶液，其特征在于：它是含有人血白蛋白终浓度2-4.17％，g/mL的蛋白水解酶标准品溶液。
5.根据权利要求3所述的标准品溶液，其特征在于：所述人血白蛋白的添加量为每160U蛋白水解酶标准品添加1.2-2.5mg人血白蛋白。
6.一种蛋白水解酶标准品溶液的制备方法，其特征在于：它是将蛋白水解酶标准品溶于水，再添加人血白蛋白溶液，混匀后制得人血白蛋白终浓度不高于5％，g/mL的蛋白水解酶标准品溶液；所述蛋白水解酶标准品为激肽释放酶标准品。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述人血白蛋白终浓度为2-4.17％，g/mL。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述人血白蛋白溶液的添加量为每160U蛋白水解酶标准品添加1.2-2.5mg人血白蛋白。
9.权利要求3~5任一项所述的溶液或者包含所述溶液的制剂在蛋白水解酶活性测定中的应用。
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