JP2548349B2 - タンパク質加水分解で活性な成分の測定 - Google Patents
タンパク質加水分解で活性な成分の測定Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は臨床診断で使用するのに好適な凍結乾燥組合
せ試薬に関し、この組合せ試薬はタンパク質加水分解に
おいて活性な成分、たとえばプロテアーゼ、および特に
プロテアーゼに対するプロ酵素、阻害物質、補因子およ
び活性化物質、を簡単に、しかも迅速に測定することを
可能にする。本発明はまた、このような組合せ試薬を調
製するための新規な方法およびこの組合せ試薬の凝析お
よび繊維素溶解の分野における使用に関する。
せ試薬に関し、この組合せ試薬はタンパク質加水分解に
おいて活性な成分、たとえばプロテアーゼ、および特に
プロテアーゼに対するプロ酵素、阻害物質、補因子およ
び活性化物質、を簡単に、しかも迅速に測定することを
可能にする。本発明はまた、このような組合せ試薬を調
製するための新規な方法およびこの組合せ試薬の凝析お
よび繊維素溶解の分野における使用に関する。
タンパク質分解酵素、いわゆるプロテアーゼ、は体内
で多くの重要な機能を有する。プロテアーゼの例として
は、下記のプロテアーゼをあげることができる：パンク
レアーゼから分泌さえ、消化プロセスに関与するトリプ
シンおよびキモトリプシン；種々のタイプのカテプシ
ン、カリクレインおよびエラスターゼ、ならびに炎症状
態およびアレルギー状態によつて引き起される反応に関
与する補体系の酵素：血液凝塊の形成を導く、一連の反
応に関与するプロテアーゼよりなる因子VII a、X a、XI
aよびXII aおよびトロンビン；および血液凝塊の溶解
をもたらすプロテアーゼである外生ウロキサーゼおよび
プラスミン。
で多くの重要な機能を有する。プロテアーゼの例として
は、下記のプロテアーゼをあげることができる：パンク
レアーゼから分泌さえ、消化プロセスに関与するトリプ
シンおよびキモトリプシン；種々のタイプのカテプシ
ン、カリクレインおよびエラスターゼ、ならびに炎症状
態およびアレルギー状態によつて引き起される反応に関
与する補体系の酵素：血液凝塊の形成を導く、一連の反
応に関与するプロテアーゼよりなる因子VII a、X a、XI
aよびXII aおよびトロンビン；および血液凝塊の溶解
をもたらすプロテアーゼである外生ウロキサーゼおよび
プラスミン。
従つて、インビトロで、プロテアーゼ活性を測定する
診断方法は多くの臨床分野で極めて重要な方法である。
この方法では、活性プロテアーゼの量ばかりでなく、ま
た中でも、活性プロテアーゼに変換できるプロ酵素の量
およびまた、タンパク質加水分解に関与する阻害物質お
よび活性化物質の量が測定される。このような測定が病
理学的症状の検査において極めて重要であることは勿論
のことである。手術および（または）医療のような或る
処置において、かなりの場合に、或る種のこれらの物質
の定量がまた、先ず初めに行なわれる。
診断方法は多くの臨床分野で極めて重要な方法である。
この方法では、活性プロテアーゼの量ばかりでなく、ま
た中でも、活性プロテアーゼに変換できるプロ酵素の量
およびまた、タンパク質加水分解に関与する阻害物質お
よび活性化物質の量が測定される。このような測定が病
理学的症状の検査において極めて重要であることは勿論
のことである。手術および（または）医療のような或る
処置において、かなりの場合に、或る種のこれらの物質
の定量がまた、先ず初めに行なわれる。
タンパク質加水分解において活性な成分、たとえばプ
ロテアーゼおよび関連因子、たとえばプロ酵素、阻害物
質および活性化物質を測定するための慣用の方法は、い
わゆるバイオアツセイ、インビトロの免疫学的反応また
は対応するプロテアーゼのための天然の基質をそれ自
体、必要としない生物学的タンパク質の利用にもとずい
ている。
ロテアーゼおよび関連因子、たとえばプロ酵素、阻害物
質および活性化物質を測定するための慣用の方法は、い
わゆるバイオアツセイ、インビトロの免疫学的反応また
は対応するプロテアーゼのための天然の基質をそれ自
体、必要としない生物学的タンパク質の利用にもとずい
ている。
上記方法の欠点は、これらの方法が実施および判定の
両方で時間がかかりそして労力を要すること、感度が制
御されていること、および（または）特異性が欠落して
おり、そしてまた標準化が困難であることにある。
両方で時間がかかりそして労力を要すること、感度が制
御されていること、および（または）特異性が欠落して
おり、そしてまた標準化が困難であることにある。
過去数年の間に、アミノ酸または短鎖ペプチドを基材
とし、そしてプロテアーゼにより容易に分離される通常
の測光により容易に測定できるマーカーを付与した、合
成低分子基質が開発された。これらの基質は前記の欠点
のいくつかがこの基質によつて排除されたことから、プ
ロテアーゼ定量方法を大きく促進させた〔Hemker H.C.
によりHandbook of synthetic substrates,1983年、Mar
tinus Nijhoff出版社、Boston〕。
とし、そしてプロテアーゼにより容易に分離される通常
の測光により容易に測定できるマーカーを付与した、合
成低分子基質が開発された。これらの基質は前記の欠点
のいくつかがこの基質によつて排除されたことから、プ
ロテアーゼ定量方法を大きく促進させた〔Hemker H.C.
によりHandbook of synthetic substrates,1983年、Mar
tinus Nijhoff出版社、Boston〕。
これらの基質、特に測光により測定できるマーカーを
付けた基質、通称色原性基質は改善された特異性および
再現性を有する方法の開発を可能にした。さらに、これ
らの方法によれば、他方で、たとえば免疫学的方法の場
合のような量の代りに活性度が測定され、測定結果に対
する被験パラメーターの線状比が、いわゆるバイオアツ
セイでほとんどの場合に得られるlog−log比およびlin
−log比とは異なるものとして、得られる。
付けた基質、通称色原性基質は改善された特異性および
再現性を有する方法の開発を可能にした。さらに、これ
らの方法によれば、他方で、たとえば免疫学的方法の場
合のような量の代りに活性度が測定され、測定結果に対
する被験パラメーターの線状比が、いわゆるバイオアツ
セイでほとんどの場合に得られるlog−log比およびlin
−log比とは異なるものとして、得られる。
上記の利点にもかかわらず、このような、通常の色原
性基質の分離にもとづく測定方法はその有用性を制限す
るいくつかの欠点により依然として有用性が減じられて
いる。
性基質の分離にもとづく測定方法はその有用性を制限す
るいくつかの欠点により依然として有用性が減じられて
いる。
一般に、これらの、いわゆる基質法は二段階反応より
なり、一方で、単なる生化学的反応を、そして他方で、
プロテアーゼと適当な基質との反応を包含する。測定し
ようとする活性成分に応じて、この反応プロセスは下記
のとおりに示すことができる。
なり、一方で、単なる生化学的反応を、そして他方で、
プロテアーゼと適当な基質との反応を包含する。測定し
ようとする活性成分に応じて、この反応プロセスは下記
のとおりに示すことができる。
すなわち、第二の反応段階は相当する酵素の影響によ
るマーカーを有する基質の分離を意味し、分解に利用さ
れる酵素の量は第一の反応により形成された後に残留す
る、あるいは第一の反応により形成される活性酵素の量
よりなる。
るマーカーを有する基質の分離を意味し、分解に利用さ
れる酵素の量は第一の反応により形成された後に残留す
る、あるいは第一の反応により形成される活性酵素の量
よりなる。
従つて、全ての場合に、放出されたマーカーＭの量は
アナライト（分析対象物）Ｉ、Ｃ、ＡおよびＰにそれぞ
れ比例する。上記で使用した略語は次の意味を有し、濃
度は付記により示されている： Ｅ＝酵素 Ｉ＝阻害物質 Ｓ−Ｍ＝マーカーを付けた基質 Ｍ＝マーカー Ｓ＝マーカーを分離した後に残る基質残留物 Ｒ＝補因子の影響により酵素と反応する反応剤。
アナライト（分析対象物）Ｉ、Ｃ、ＡおよびＰにそれぞ
れ比例する。上記で使用した略語は次の意味を有し、濃
度は付記により示されている： Ｅ＝酵素 Ｉ＝阻害物質 Ｓ−Ｍ＝マーカーを付けた基質 Ｍ＝マーカー Ｓ＝マーカーを分離した後に残る基質残留物 Ｒ＝補因子の影響により酵素と反応する反応剤。
Ｃ＝補因子 Ａ＝活性化物質 Ｐ＝別様に活性化することのできる酵素化合物またはプ
ロ酵素 Ｐ＝プロ酵素／酸素化合物の活性化からの残留物 一般に、これらの二段階法は時間がかかりそして労力
を要する。さらにまた、この分析を行なう場合には、多
くのピペット操作工程が含まれ、また各段階の反応時間
が引き続いていることが必須であることから、極めて注
意深い熟練を要する。さらにまた、このような二段階法
は一回のそして同一系で手により行なうことができる試
験の数を制限する。
ロ酵素 Ｐ＝プロ酵素／酸素化合物の活性化からの残留物 一般に、これらの二段階法は時間がかかりそして労力
を要する。さらにまた、この分析を行なう場合には、多
くのピペット操作工程が含まれ、また各段階の反応時間
が引き続いていることが必須であることから、極めて注
意深い熟練を要する。さらにまた、このような二段階法
は一回のそして同一系で手により行なうことができる試
験の数を制限する。
さらにまた、この方法の有用性は、一般にその再構成
された生物学的試薬が有する、比較的短い有効寿命（１
ケ月またはそれ以下）により減じられる。現在、この分
析に利用できる市販の試薬は通常、20〜200の分析に充
分であるように包装されている。従つて、使用者は経済
上の理由で、再構成した試薬が安定である時間以内に相
当する数の分析を行なう必要がある。これまで、何とか
して個別に包装されねばならない試薬を分離した包装物
中にあるいは充填容器内の分離した室内（隔室化されて
いる）の収納するようにして、含有しているような分離
した試薬用の簡単な包装物を形成することは技術的にお
よび価格的に、可能ではなかつた。
された生物学的試薬が有する、比較的短い有効寿命（１
ケ月またはそれ以下）により減じられる。現在、この分
析に利用できる市販の試薬は通常、20〜200の分析に充
分であるように包装されている。従つて、使用者は経済
上の理由で、再構成した試薬が安定である時間以内に相
当する数の分析を行なう必要がある。これまで、何とか
して個別に包装されねばならない試薬を分離した包装物
中にあるいは充填容器内の分離した室内（隔室化されて
いる）の収納するようにして、含有しているような分離
した試薬用の簡単な包装物を形成することは技術的にお
よび価格的に、可能ではなかつた。
現在、一回の試験用の試薬を１個の同一のプラスチツ
ク容器内で物理的に分離する包装形態が一つだけ市販さ
れている（ACA 、DuPont、米国）。技術的に複雑なデ
ザインを有するこの容器は、試薬隔室間の仕切りを自動
的に破り、次いで所定の時間の後に試料および追加の試
薬を加える、この目的に対して特別に作られた装置でだ
け有用である。
ク容器内で物理的に分離する包装形態が一つだけ市販さ
れている（ACA 、DuPont、米国）。技術的に複雑なデ
ザインを有するこの容器は、試薬隔室間の仕切りを自動
的に破り、次いで所定の時間の後に試料および追加の試
薬を加える、この目的に対して特別に作られた装置でだ
け有用である。
また、二段階プロセスを一段階プロセスに変えられる
ように、反応条件および試薬を適合させることにより、
慣用の包装された試薬の取り扱いを或る程度まで簡単に
することはできる。この場合に、二種の反応は平行して
進行し、この方法では、アナライトは測光計の読みに依
然として直接的に比例する。この方法は数種の試薬を、
数種の試薬が相互に引続いて直ちに添加されるような方
法で（この場合には、ピペツト操作工程の数は減少しな
い）、あるいは或る種の試薬（たとえば、基質と生化学
的試薬）が前もつて混合されるような方法で行なわれ
る。この場合に、ピペツト操作は容易であるが、依然と
して非常に不安定な試薬（有効寿命は１日にすぎない）
が得られる。特に、最後に記載した方法は自動式方法
（下記参照）で使用されている。
ように、反応条件および試薬を適合させることにより、
慣用の包装された試薬の取り扱いを或る程度まで簡単に
することはできる。この場合に、二種の反応は平行して
進行し、この方法では、アナライトは測光計の読みに依
然として直接的に比例する。この方法は数種の試薬を、
数種の試薬が相互に引続いて直ちに添加されるような方
法で（この場合には、ピペツト操作工程の数は減少しな
い）、あるいは或る種の試薬（たとえば、基質と生化学
的試薬）が前もつて混合されるような方法で行なわれ
る。この場合に、ピペツト操作は容易であるが、依然と
して非常に不安定な試薬（有効寿命は１日にすぎない）
が得られる。特に、最後に記載した方法は自動式方法
（下記参照）で使用されている。
基質法の利点の一つは、臨床用の自動分析機における
それらの利用可能性にあり、これは測定方法を一段階に
変えることを容易にする〔Bergstrm K.およびLahnbor
g,G.によるTromb,Res.1975年、６巻、223〜233頁;Kapke
G.F.等によるClin.Chem.1962年、28巻、1521〜1524
頁〕。この方法で、基質方法の欠点のかなりが除かれ
る。しかしながら、自動分析機による検査は長い一連の
試験を必要としおよび集中装置で有効な濃度を要する。
このことは、しかしながら、試料採取から分析結果が得
られるまでの期間の許容しがたいほど長くなることがあ
ることを意味する。
それらの利用可能性にあり、これは測定方法を一段階に
変えることを容易にする〔Bergstrm K.およびLahnbor
g,G.によるTromb,Res.1975年、６巻、223〜233頁;Kapke
G.F.等によるClin.Chem.1962年、28巻、1521〜1524
頁〕。この方法で、基質方法の欠点のかなりが除かれ
る。しかしながら、自動分析機による検査は長い一連の
試験を必要としおよび集中装置で有効な濃度を要する。
このことは、しかしながら、試料採取から分析結果が得
られるまでの期間の許容しがたいほど長くなることがあ
ることを意味する。
一段階法を達成するための比較的複雑な方法がEP−A2
−0168738に記載されており、この方法では、必要なピ
ペット操作工程および正確なタイミングが回避される。
しかしながら、この特許出願に記載されている方法は必
要な生化学的試薬と基質とを、反応を防止する異なる溶
媒に用いて分離した方法で、または隔室化することによ
り、固定担体マトリックスに適用するという技術的に複
雑な方法に実質的に制限される。さらにまた、生成する
色を読み取るために、この目的に対して特別に設計され
た装置が必要である。
−0168738に記載されており、この方法では、必要なピ
ペット操作工程および正確なタイミングが回避される。
しかしながら、この特許出願に記載されている方法は必
要な生化学的試薬と基質とを、反応を防止する異なる溶
媒に用いて分離した方法で、または隔室化することによ
り、固定担体マトリックスに適用するという技術的に複
雑な方法に実質的に制限される。さらにまた、生成する
色を読み取るために、この目的に対して特別に設計され
た装置が必要である。
従つて、本発明の目的は基質法を使用して、しかも上
記の欠点を排除して、タンパク質加水分解で活性な成分
の測定を一段階で容易に行なうことができる組合せ試薬
を提供することにある。
記の欠点を排除して、タンパク質加水分解で活性な成分
の測定を一段階で容易に行なうことができる組合せ試薬
を提供することにある。
この目的が本発明に従い、請求の範囲１に記載の凍結
乾燥組合せ試薬により達成される。
乾燥組合せ試薬により達成される。
従つて、本発明は容器内に収納されており、そして組
合せ試薬中に含まれており、プロテアーゼにより分解し
て、検出できる応答を生じることができる基質の分解に
よつて、タンパク質加水分解で活性な成分を直接的に、
または間接的に測定するための凍結乾燥した組合せ試薬
に関し、この組合せ試薬は、それぞれ実質的に未反応の
形態の、測定に必要な試薬の全部および任意のそれ自体
既知の一種または二種以上の添加剤よりなり、この組合
せ試薬はそれぞれ実質的に未反応の形態で凍結乾燥した
組合せ試薬中に含まれる成分の全部を含有する溶液をそ
れ自体既知の方法により凍結乾燥させることにより調製
されるものであり、そしてこの凍結乾燥した組合せ試薬
は、たとえば緩衝溶液中における、その再構成時点でそ
の元の活性を実質的に有することを特徴とするものであ
る。
合せ試薬中に含まれており、プロテアーゼにより分解し
て、検出できる応答を生じることができる基質の分解に
よつて、タンパク質加水分解で活性な成分を直接的に、
または間接的に測定するための凍結乾燥した組合せ試薬
に関し、この組合せ試薬は、それぞれ実質的に未反応の
形態の、測定に必要な試薬の全部および任意のそれ自体
既知の一種または二種以上の添加剤よりなり、この組合
せ試薬はそれぞれ実質的に未反応の形態で凍結乾燥した
組合せ試薬中に含まれる成分の全部を含有する溶液をそ
れ自体既知の方法により凍結乾燥させることにより調製
されるものであり、そしてこの凍結乾燥した組合せ試薬
は、たとえば緩衝溶液中における、その再構成時点でそ
の元の活性を実質的に有することを特徴とするものであ
る。
本発明の組合せは好ましくは、タンパク質加水分解で
活性な成分、たとえばプロ酵素、プロテアーゼ活性化物
質、補因子またはプロテアーゼ阻害物質あるいはそれら
の活性化物質を測定するための一回の分離した一段階基
質法を行なうのに充分の量で容器内に収納されている。
活性な成分、たとえばプロ酵素、プロテアーゼ活性化物
質、補因子またはプロテアーゼ阻害物質あるいはそれら
の活性化物質を測定するための一回の分離した一段階基
質法を行なうのに充分の量で容器内に収納されている。
従つて、本発明の組合せ試薬はプロテアーゼにより分
解されて、検出できる応答を生じる基質を含有する。検
出しようとするタンパク質加水分解で活性な成分に応じ
て、組合せ試薬はまた、通常、次の成分から選ばれる他
の試薬を含有する：プロ酸素、プロテアーゼ活性化物
質、プロテアーゼ阻害物質、この阻害物質の活性化物質
およびタンパク質加水分解に対する補因子。組合せ試薬
はまた、好ましくは添加剤、たとえば以下にさらに詳細
に説明するような安定化添加剤を含有する。
解されて、検出できる応答を生じる基質を含有する。検
出しようとするタンパク質加水分解で活性な成分に応じ
て、組合せ試薬はまた、通常、次の成分から選ばれる他
の試薬を含有する：プロ酸素、プロテアーゼ活性化物
質、プロテアーゼ阻害物質、この阻害物質の活性化物質
およびタンパク質加水分解に対する補因子。組合せ試薬
はまた、好ましくは添加剤、たとえば以下にさらに詳細
に説明するような安定化添加剤を含有する。
有用な基質はプロテアーゼにより分解して、検出でき
る応答を生じることのできる基質の全部である。特に適
当な基質は測光により測定できる応答を示す、いわゆる
色原性基質である。前記した合成基質はまた、好ましく
使用される。このような基質は、たとえばKabi Vitrum
AB Diagnostika,Mlndal.Swedenから、たとえば商品登
録名Ｓ−2251（Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Lys−pNA・2HCl）、
Ｓ−2337（Ｎα−ベンゾイル−Ile−Glu（γ−ピペリジ
ド）−Gly−Arg−pNA・HCl）、Ｓ−2366（＜Glu−Pro−
Arg−pNA・HCl）、Ｓ−2390（Ｈ−Ｄ−Val−Phe−Lys−
pNA・2HCl）およびＳ−2732（Ｎα−スクシノイル−Ile
−Glu−（γ−ピペリジド）−Gly−Arg−pNA・HCl）と
して、市販されている。下記の実施例に記載されている
これらの基質に加えて、本発明に有用である別の基質の
例を表Ｉに示す。しかしながら、これらの基質は例示さ
れているだけであり、本発明を制限するものではない。
る応答を生じることのできる基質の全部である。特に適
当な基質は測光により測定できる応答を示す、いわゆる
色原性基質である。前記した合成基質はまた、好ましく
使用される。このような基質は、たとえばKabi Vitrum
AB Diagnostika,Mlndal.Swedenから、たとえば商品登
録名Ｓ−2251（Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Lys−pNA・2HCl）、
Ｓ−2337（Ｎα−ベンゾイル−Ile−Glu（γ−ピペリジ
ド）−Gly−Arg−pNA・HCl）、Ｓ−2366（＜Glu−Pro−
Arg−pNA・HCl）、Ｓ−2390（Ｈ−Ｄ−Val−Phe−Lys−
pNA・2HCl）およびＳ−2732（Ｎα−スクシノイル−Ile
−Glu−（γ−ピペリジド）−Gly−Arg−pNA・HCl）と
して、市販されている。下記の実施例に記載されている
これらの基質に加えて、本発明に有用である別の基質の
例を表Ｉに示す。しかしながら、これらの基質は例示さ
れているだけであり、本発明を制限するものではない。
本発明は凍結乾燥条件の下で、タンパク質加水分解で
活性な成分がそれらの活性を損なわず、たとえば相互に
反応せず、しかも再構成後に、それらの元の活性を実質
的に回復するような凍結乾燥条件が試薬溶液について確
立できるかぎり、基質測定法の基本原則に従い、タンパ
ク質加水分解で活性な成分の検出に一般的に、適用する
ことができる。
活性な成分がそれらの活性を損なわず、たとえば相互に
反応せず、しかも再構成後に、それらの元の活性を実質
的に回復するような凍結乾燥条件が試薬溶液について確
立できるかぎり、基質測定法の基本原則に従い、タンパ
ク質加水分解で活性な成分の検出に一般的に、適用する
ことができる。
従来、α１−アンチトリプシンおよびF VIIIの測定用
の組合せ試薬を除けば、対象、特に凝血および繊維素溶
解の分野における対象の全ての組合せ試薬のための適当
な条件を確立することが可能であつた。しかしながら、
このような条件は追加の実験の後に、これらの組合せに
対して確立することができるものである。
の組合せ試薬を除けば、対象、特に凝血および繊維素溶
解の分野における対象の全ての組合せ試薬のための適当
な条件を確立することが可能であつた。しかしながら、
このような条件は追加の実験の後に、これらの組合せに
対して確立することができるものである。
本発明は基質測定法に関する前記したタンパク質加水
分解で活性な成分の測定に良好に適している。従つて、
タンパク質加水分解で活性な成分がａ）阻害物質、ｂ）
補因子、ｃ）活性化物質またはｄ）プロ酵素よりなる場
合に、適当な組合せ試薬は組合せ中のプロテアーゼによ
り分解されることができる色原性基質とそれぞれ、ａ）
プロテアーゼ、ｂ）プロテアーゼおよび測定しようとす
る補因子の影響の下でプロテアーゼと反応できる反応
材、ｃ）プロ酵素または他の活性化できる酵素化合物、
およびｄ）プロ酵素に対する活性化物質とよりなる。現
在、好ましい本発明の態様は説明用の例から明らかであ
る。
分解で活性な成分の測定に良好に適している。従つて、
タンパク質加水分解で活性な成分がａ）阻害物質、ｂ）
補因子、ｃ）活性化物質またはｄ）プロ酵素よりなる場
合に、適当な組合せ試薬は組合せ中のプロテアーゼによ
り分解されることができる色原性基質とそれぞれ、ａ）
プロテアーゼ、ｂ）プロテアーゼおよび測定しようとす
る補因子の影響の下でプロテアーゼと反応できる反応
材、ｃ）プロ酵素または他の活性化できる酵素化合物、
およびｄ）プロ酵素に対する活性化物質とよりなる。現
在、好ましい本発明の態様は説明用の例から明らかであ
る。
本発明はまた、凍結乾燥組合せ試薬の調製方法に関
し、この方法は請求の範囲５に記載されている。
し、この方法は請求の範囲５に記載されている。
さらに詳細に言えば、本発明は凍結乾燥組合せ試薬の
調製方法であつて、測定に必要な試薬の全部および任意
の一種または二種以上のそれ自体既知の添加剤を含有す
る溶液を水のような浴剤中で、試薬が生成する溶液中で
およびまた、引続く溶液の凍結乾燥中に、実質的に未反
応のまま残されるような方法で制御した条件の下に生成
し、次いでこの溶液をそれ自体既知の方法で、容器内で
凍結乾燥させ、その中に試薬が実質的に未反応の形態で
含まれており、しかもその中の試薬が、たとえば緩衝溶
液中における組合せ試薬の再構成後に元の活性を実質的
に有する凍結乾燥組合せ試薬を得ることを特徴とする方
法に関する。
調製方法であつて、測定に必要な試薬の全部および任意
の一種または二種以上のそれ自体既知の添加剤を含有す
る溶液を水のような浴剤中で、試薬が生成する溶液中で
およびまた、引続く溶液の凍結乾燥中に、実質的に未反
応のまま残されるような方法で制御した条件の下に生成
し、次いでこの溶液をそれ自体既知の方法で、容器内で
凍結乾燥させ、その中に試薬が実質的に未反応の形態で
含まれており、しかもその中の試薬が、たとえば緩衝溶
液中における組合せ試薬の再構成後に元の活性を実質的
に有する凍結乾燥組合せ試薬を得ることを特徴とする方
法に関する。
凍結乾燥した組合せ試薬中に含まれる試薬の全部を少
なくとも一回の凍結乾燥処理に対する、同一溶液中に溶
解することは本発明において必須である。この方法は原
溶液を先ず、関連試薬の全部を本発明に従う制御された
条件の下で調製した場合に、特に簡単に行なうことがで
き、この場合に、使用できる添加剤をまた含有するこの
原溶液を容器内に装入し、次いでこれらの容器内で凍結
乾燥させる。しかしながら、一種または数種の関連試薬
および使用できる添加剤を含有する数個の原溶液を調製
し、その後、これらの溶液を一緒にして、一つの溶液と
して、各容器内で同時的に凍結乾燥させることができる
ことは勿論のことである。水は適当な溶剤であり、他の
溶剤、たとえば酢酸、メタノールおよびジメチルスルホ
キシドを添加して使用することもできる。
なくとも一回の凍結乾燥処理に対する、同一溶液中に溶
解することは本発明において必須である。この方法は原
溶液を先ず、関連試薬の全部を本発明に従う制御された
条件の下で調製した場合に、特に簡単に行なうことがで
き、この場合に、使用できる添加剤をまた含有するこの
原溶液を容器内に装入し、次いでこれらの容器内で凍結
乾燥させる。しかしながら、一種または数種の関連試薬
および使用できる添加剤を含有する数個の原溶液を調製
し、その後、これらの溶液を一緒にして、一つの溶液と
して、各容器内で同時的に凍結乾燥させることができる
ことは勿論のことである。水は適当な溶剤であり、他の
溶剤、たとえば酢酸、メタノールおよびジメチルスルホ
キシドを添加して使用することもできる。
本発明の適当な態様において、各容器中に導入する溶
液（一種または二種以上）の量は一回の試験に対するよ
うな量である。微滴定用板などのくぼみまたは凹部は容
器として好ましく使用でき、ここに試料を添加し、その
後、この容器を臨床分析用の標準装置、たとえば測光計
に直接に移すことができる。
液（一種または二種以上）の量は一回の試験に対するよ
うな量である。微滴定用板などのくぼみまたは凹部は容
器として好ましく使用でき、ここに試料を添加し、その
後、この容器を臨床分析用の標準装置、たとえば測光計
に直接に移すことができる。
本発明において、全ての試薬の溶液の調製または試薬
の数種の溶液の組合せの調製における条件を、たとえば
溶剤に可溶性成分を安定化する適当な添加剤を加えるこ
とによつて調整すること、そして（あるいは）通常相互
に反応性である成分の混合物を、望ましくないがこの調
製において生じることがそれ自体予想される反応を伴な
うことなく、凍結乾燥試薬組合せの調製において溶解さ
せることができるようなpH範囲に、好ましくは緩衝塩を
用いて調整することは必須である。この条件を如何にし
て調整するかは試薬組合せ中に含まれる試薬に依存し、
下記にさらに詳細に説明する。
の数種の溶液の組合せの調製における条件を、たとえば
溶剤に可溶性成分を安定化する適当な添加剤を加えるこ
とによつて調整すること、そして（あるいは）通常相互
に反応性である成分の混合物を、望ましくないがこの調
製において生じることがそれ自体予想される反応を伴な
うことなく、凍結乾燥試薬組合せの調製において溶解さ
せることができるようなpH範囲に、好ましくは緩衝塩を
用いて調整することは必須である。この条件を如何にし
て調整するかは試薬組合せ中に含まれる試薬に依存し、
下記にさらに詳細に説明する。
このような制御された条件を確立することによつて、
全ての試薬を一つの溶液中で、本発明に従い同時に凍結
乾燥させることができる。最終形態の生成物中の試薬混
合物は混合物中に含まれる成分のいずれの特別の隔離を
伴なうことなく、凍結乾燥状態で存在し、この混合物は
良好な溶解性を有し、この試薬混合物中に含まれている
成分の全部の即時的溶解はこの凍結乾燥試薬組合せ用の
緩衝液中に溶解した試料をそこに添加することにより達
成される。
全ての試薬を一つの溶液中で、本発明に従い同時に凍結
乾燥させることができる。最終形態の生成物中の試薬混
合物は混合物中に含まれる成分のいずれの特別の隔離を
伴なうことなく、凍結乾燥状態で存在し、この混合物は
良好な溶解性を有し、この試薬混合物中に含まれている
成分の全部の即時的溶解はこの凍結乾燥試薬組合せ用の
緩衝液中に溶解した試料をそこに添加することにより達
成される。
従つて、本発明により、基質測定法の利点の全部を利
用することができる生成物が提供され、この生成物によ
つてさらに追加の利点が得られる。たとえば、試料の取
り扱いに１回だけのピペツト操作を要するだけであつ
て、数回のピペツト操作工程が省かれる。また、正確な
インキユベーシヨン時間および反応期間の維持に要する
精確度に対する要求が除かれる。さらにまた、実施者の
技術的熟練に対する要求が低くなり、また分析の行なう
ために、この組合せ試薬のための特別の装置を作る必要
もない。
用することができる生成物が提供され、この生成物によ
つてさらに追加の利点が得られる。たとえば、試料の取
り扱いに１回だけのピペツト操作を要するだけであつ
て、数回のピペツト操作工程が省かれる。また、正確な
インキユベーシヨン時間および反応期間の維持に要する
精確度に対する要求が除かれる。さらにまた、実施者の
技術的熟練に対する要求が低くなり、また分析の行なう
ために、この組合せ試薬のための特別の装置を作る必要
もない。
本発明による生成物のもう一つの利点は相当する再構
成した試薬よりも格別に長い有効寿命を有し、かつまた
この生成物は製造者により簡単に標準化でき、従つて通
常、標準曲線の作成が必要である同一タイプの従来既知
の方法に比較して、試験結果の計算に関して格別に単純
な方法が提供される。
成した試薬よりも格別に長い有効寿命を有し、かつまた
この生成物は製造者により簡単に標準化でき、従つて通
常、標準曲線の作成が必要である同一タイプの従来既知
の方法に比較して、試験結果の計算に関して格別に単純
な方法が提供される。
本発明の凍結乾燥組合せ試薬は検査用の自動分析機を
持つていない、そして（または）検査に適任な人がいな
い小規模のおよび（または）大規模な診療所において、
一回の試験を行なうための現在利用できる装置で通例の
とおりに使用するのに極めてよく適している。さらにま
た、本発明による生成物は、測定の局所的な場所で（ベ
ツトの横で）行なうことができ、また試薬溶液の調製、
標準曲線の作成あるいは対象実験のような予備操作が不
必要であるので、緊急の状況下に迅速な答えを得ること
を可能にする。
持つていない、そして（または）検査に適任な人がいな
い小規模のおよび（または）大規模な診療所において、
一回の試験を行なうための現在利用できる装置で通例の
とおりに使用するのに極めてよく適している。さらにま
た、本発明による生成物は、測定の局所的な場所で（ベ
ツトの横で）行なうことができ、また試薬溶液の調製、
標準曲線の作成あるいは対象実験のような予備操作が不
必要であるので、緊急の状況下に迅速な答えを得ること
を可能にする。
さらにまた、本発明による生成物を使用するこは、現
在市販されており、少量の試料の測定には適合しない、
または一回の分析を行なうようにデザインされている場
合にはその実施に特別の用具を必要とする、「キツト」
のような製品と比較して、原料および材料を格別に節約
するという意味をしばしば有する。
在市販されており、少量の試料の測定には適合しない、
または一回の分析を行なうようにデザインされている場
合にはその実施に特別の用具を必要とする、「キツト」
のような製品と比較して、原料および材料を格別に節約
するという意味をしばしば有する。
前記で指摘したように、本発明の試薬組合せはプロテ
アーゼにより分解することができる基質および測定しよ
うとするタンパク質加水分解で活性の成分に応じて追加
の他の試薬を含有する。従つて、この生成物の調製は、
組合せ試薬中に含有させようとする試薬に関して、すな
わち測定しようとする活性成分に応じて、制御されてい
る条件の下で行なわなければならない。このための方法
を、現在重要である態様、すなわち阻害物質、補因子、
活性化物質およびプロ酵素に関して、以下にさらに詳細
に説明する。
アーゼにより分解することができる基質および測定しよ
うとするタンパク質加水分解で活性の成分に応じて追加
の他の試薬を含有する。従つて、この生成物の調製は、
組合せ試薬中に含有させようとする試薬に関して、すな
わち測定しようとする活性成分に応じて、制御されてい
る条件の下で行なわなければならない。このための方法
を、現在重要である態様、すなわち阻害物質、補因子、
活性化物質およびプロ酵素に関して、以下にさらに詳細
に説明する。
I.阻害物質測定用の生成物の調製方法 試料中のプロテアーゼ阻害物質の量の測定は、当該阻
害物質と1:1−複合体を形成することによつて阻害され
る酵素を既知で、明確に定められた量で試料に加え、次
いで過剰の酵素を既知で、明確に定められた量の適当な
基質の添加により測定することにもとづいている。
害物質と1:1−複合体を形成することによつて阻害され
る酵素を既知で、明確に定められた量で試料に加え、次
いで過剰の酵素を既知で、明確に定められた量の適当な
基質の添加により測定することにもとづいている。
本発明により、酵素および基質を含有する溶液が、溶
液中であるいは凍結乾燥工程中に酵素も基質も分解され
ないように制御されている条件の下で、大規模に製造す
るのに適した条件の下で調製することができることが見
い出された。試薬組合せの調製中の酵素が基質と反応せ
ず、しかもこの酵素と基質とのほとんど完全な活性が、
凍結乾燥した組合せを、たとえば適当な緩衝液の添加に
より再構成した後にも得られるということは極めて驚く
べきことである。
液中であるいは凍結乾燥工程中に酵素も基質も分解され
ないように制御されている条件の下で、大規模に製造す
るのに適した条件の下で調製することができることが見
い出された。試薬組合せの調製中の酵素が基質と反応せ
ず、しかもこの酵素と基質とのほとんど完全な活性が、
凍結乾燥した組合せを、たとえば適当な緩衝液の添加に
より再構成した後にも得られるということは極めて驚く
べきことである。
プロテアーゼ阻害物質の測定において、本発明の方法
は基質に対する酵素活性が無視できる範囲にあるが、酵
素の変性もまたは基質のいずれの加水分解も生じない範
囲のpH範囲を見い出したことにもとづいている。この範
囲は、好ましくはpH3〜５であり、最も好ましいpHは4.2
である。この範囲内の最適数値はこの方法に使用する酵
素および基質に幾分、依存して変わる。
は基質に対する酵素活性が無視できる範囲にあるが、酵
素の変性もまたは基質のいずれの加水分解も生じない範
囲のpH範囲を見い出したことにもとづいている。この範
囲は、好ましくはpH3〜５であり、最も好ましいpHは4.2
である。この範囲内の最適数値はこの方法に使用する酵
素および基質に幾分、依存して変わる。
さらにまた、最適pHの調整には、基質−酵素反応にお
よびまた酵素−阻害物質反応に最適の反応条件、すなわ
ちpH6.5〜9.5を得ることができるように、6.5〜9.5のpH
を有する慣用の緩衝剤を使用すると有利であり、この緩
衝剤の塩は凍結乾燥時に分離させるか、あるいは分析前
に試料を調製できるようにするために、少量で凍結乾燥
後も存在させる。本発明の試薬調製方法に適する乾燥剤
はギ酸塩または酢酸塩とそれぞれ混合したギ酸または酢
酸のような弱有機酸である。クエン酸、アスコルビン酸
などのような同一範囲のpKa値を有する他の酸もまた使
用することができるが、これらは格別に安定性に貧しい
pHが得られることから、一般に低い濃度にする必要があ
る。
よびまた酵素−阻害物質反応に最適の反応条件、すなわ
ちpH6.5〜9.5を得ることができるように、6.5〜9.5のpH
を有する慣用の緩衝剤を使用すると有利であり、この緩
衝剤の塩は凍結乾燥時に分離させるか、あるいは分析前
に試料を調製できるようにするために、少量で凍結乾燥
後も存在させる。本発明の試薬調製方法に適する乾燥剤
はギ酸塩または酢酸塩とそれぞれ混合したギ酸または酢
酸のような弱有機酸である。クエン酸、アスコルビン酸
などのような同一範囲のpKa値を有する他の酸もまた使
用することができるが、これらは格別に安定性に貧しい
pHが得られることから、一般に低い濃度にする必要があ
る。
凍結乾燥工程中および引続く試薬混合物の貯蔵期間中
における分解を回避するために、そしてまた試料に加え
た場合の試薬混合物の迅速な溶解を促進し、試料容器で
の試料吸収を最小にするために、無機塩、不活性タンパ
ク質、たとえばアルブミン、糖（たとえばマンニトー
ル）および（または）表面活性剤〔たとえばポリエチレ
ングリコール（PEG.Union Carbide.米国から入手できる
Carbowax 8000）およびTriton ｘ−100（Rohm＆Has
s、米国）〕のような添加剤を使用すると好ましい。
における分解を回避するために、そしてまた試料に加え
た場合の試薬混合物の迅速な溶解を促進し、試料容器で
の試料吸収を最小にするために、無機塩、不活性タンパ
ク質、たとえばアルブミン、糖（たとえばマンニトー
ル）および（または）表面活性剤〔たとえばポリエチレ
ングリコール（PEG.Union Carbide.米国から入手できる
Carbowax 8000）およびTriton ｘ−100（Rohm＆Has
s、米国）〕のような添加剤を使用すると好ましい。
次例に示されているように、本発明による組合せ試薬
を使用することにより得られる優れた結果は、両方の反
応、すなわち阻害物質の測定における基質−酵素反応お
よび阻害物質−酵素反応に対して適当である、分析用の
反応条件、たとえばpH、イオン強度および緩衝塩を見い
出すことができることによるものである。
を使用することにより得られる優れた結果は、両方の反
応、すなわち阻害物質の測定における基質−酵素反応お
よび阻害物質−酵素反応に対して適当である、分析用の
反応条件、たとえばpH、イオン強度および緩衝塩を見い
出すことができることによるものである。
本発明を使用する場合に、基質の選択はまた、極めて
重要である。前記で指摘したように、基質はプロテアー
ゼにより分解され、検出できる応答を生じなければなら
ないことに加え、基質は或る反応毎に、妥当な測定条
件、好ましくは10分より短い反応時間が達成される程度
に充分に効果的に酵素と反応するが、酵素分子を阻害物
質との反応から防護するのに充分に有効であつてはなら
ないという観点で選択する。この条件は部分的に、酵素
に対する基質の結合能力、km、で表わすことができ、km
は好ましくは２〜８×10-4モル／であるべきである。
重要である。前記で指摘したように、基質はプロテアー
ゼにより分解され、検出できる応答を生じなければなら
ないことに加え、基質は或る反応毎に、妥当な測定条
件、好ましくは10分より短い反応時間が達成される程度
に充分に効果的に酵素と反応するが、酵素分子を阻害物
質との反応から防護するのに充分に有効であつてはなら
ないという観点で選択する。この条件は部分的に、酵素
に対する基質の結合能力、km、で表わすことができ、km
は好ましくは２〜８×10-4モル／であるべきである。
市販の合成基質、たとえば表Ｉにあげたものおよび実
施例に記載のものが通常、使用される。適当な基質濃度
１〜20×10-4モル／である。この濃度は酵素濃度とマ
ーカー濃度との間が線状関係にあるように高くあるべき
である。一般に、公的な基質濃度は５×10-4モル／で
ある。
施例に記載のものが通常、使用される。適当な基質濃度
１〜20×10-4モル／である。この濃度は酵素濃度とマ
ーカー濃度との間が線状関係にあるように高くあるべき
である。一般に、公的な基質濃度は５×10-4モル／で
ある。
しかしながら、最適基質濃度および基質の親和性は反
応混合物中の添加剤によつて影響されるので、明確な一
般的選択基準は規定できないことを指摘しておかねばな
らない。
応混合物中の添加剤によつて影響されるので、明確な一
般的選択基準は規定できないことを指摘しておかねばな
らない。
酵素の選択が測定しようとする阻害物質に依存するこ
とは勿論のことである。臨床上の対象である多種の阻害
物質、たとえばアンチトロンビン（これはヘパリンの存
在下にトロンビンまたは因子X aとの反応により測定で
きる）、アンチプラスミン（これはプラスミンを介して
測定することができる）、およびカリクレイン阻害物質
のような血漿中に生じる数種の重要なプロテアーゼ阻害
物質に対する酵素は市販されており、従つて、本発明に
従い、これらの測定を行なうための凍結乾燥組合せ試薬
を調製することができる。
とは勿論のことである。臨床上の対象である多種の阻害
物質、たとえばアンチトロンビン（これはヘパリンの存
在下にトロンビンまたは因子X aとの反応により測定で
きる）、アンチプラスミン（これはプラスミンを介して
測定することができる）、およびカリクレイン阻害物質
のような血漿中に生じる数種の重要なプロテアーゼ阻害
物質に対する酵素は市販されており、従つて、本発明に
従い、これらの測定を行なうための凍結乾燥組合せ試薬
を調製することができる。
II.補因子測定用生成物の調製方法 補因子は酵素反応を生じさせて、かなりの異なるタイ
プの物質を含有する。ここでは、因子の例として先ず第
一に、阻害物質アンチトロンビン、すなわちパリンと一
緒になつて、或る種のセリンプロテアーゼの阻害を開始
させる因子、主としてF X aおよびトロンビンを取り上
げる。ヘパリンおよび類似物質の測定方法は、阻害物
質、この場合にはアンチトロンビン、を過剰に加えなけ
ればならない点を除いて、前記した阻害物質測定法と同
様である。
プの物質を含有する。ここでは、因子の例として先ず第
一に、阻害物質アンチトロンビン、すなわちパリンと一
緒になつて、或る種のセリンプロテアーゼの阻害を開始
させる因子、主としてF X aおよびトロンビンを取り上
げる。ヘパリンおよび類似物質の測定方法は、阻害物
質、この場合にはアンチトロンビン、を過剰に加えなけ
ればならない点を除いて、前記した阻害物質測定法と同
様である。
このために、酵素量は正しい反応条件を得ることがで
きる程度に、相当に増加しなければならない。その他の
点では、この方法はアンチトロンビンおよび因子X aを
例として前記した阻害物質測定法と同一原則にもとづい
ている。従つて、方法Ｉに従う阻害物質測定用の組合せ
の試薬の調製方法と同一の条件が適用される。
きる程度に、相当に増加しなければならない。その他の
点では、この方法はアンチトロンビンおよび因子X aを
例として前記した阻害物質測定法と同一原則にもとづい
ている。従つて、方法Ｉに従う阻害物質測定用の組合せ
の試薬の調製方法と同一の条件が適用される。
測定することができるもう一種の補因子はフイブリン
モノマーである。これは凝析性酵素により変換される血
漿タンパク質であり、酵素ｔ−PA（プラスミノーゲンア
クチベーター）を介してプロ酵素プラスミノーゲンを活
性化する補因子であり、この場合のｔ−PAは活性化物質
として作用する。この酵素、すなわち活性化物質をその
基質であるプラスミノーゲンおよび活性化生成物、すな
わち酵素プラスミンに適する色原性基質とともに凍結乾
燥させる。この組合せ試薬の調製方法は前記の阻害物質
測定用試薬組合せの調製方法に相当するが、凍結乾燥時
に、中性pHよりなるpH範囲を使用できる点で異なつてお
り、この場合のpHは適当には、３〜8.5、好ましくは５
〜７である。
モノマーである。これは凝析性酵素により変換される血
漿タンパク質であり、酵素ｔ−PA（プラスミノーゲンア
クチベーター）を介してプロ酵素プラスミノーゲンを活
性化する補因子であり、この場合のｔ−PAは活性化物質
として作用する。この酵素、すなわち活性化物質をその
基質であるプラスミノーゲンおよび活性化生成物、すな
わち酵素プラスミンに適する色原性基質とともに凍結乾
燥させる。この組合せ試薬の調製方法は前記の阻害物質
測定用試薬組合せの調製方法に相当するが、凍結乾燥時
に、中性pHよりなるpH範囲を使用できる点で異なつてお
り、この場合のpHは適当には、３〜8.5、好ましくは５
〜７である。
III.活性化物質測定用の組合せ試薬の調製方法 活性化物質の測定方法は、適当なプロ酵素を活性化さ
れたプロ酵素に適する基質と一緒に、安定性および溶解
性を促進する添加剤の存在の下で、前記と同様にして凍
結乾燥させる原則にもとづく。さらにまた、或る種の測
定方法では反応促進反応剤の存在が必要であることがあ
る。従つて、本発明によれば、たとえばｔ−PAの測定に
要求された反応剤、すなわちプラスミノーゲン、プラス
ミン基質およびフイブリンまたはポリリジンタイプの賦
活物質の全部を同時的に凍結乾燥させることができ、し
かもそれらの活性を維持することができる。この場合
に、上記方法IIと同様に、中性pHを含む前記条件を使用
する。従つて、適当なpH範囲は３〜8.5、好ましくは６
〜７である。
れたプロ酵素に適する基質と一緒に、安定性および溶解
性を促進する添加剤の存在の下で、前記と同様にして凍
結乾燥させる原則にもとづく。さらにまた、或る種の測
定方法では反応促進反応剤の存在が必要であることがあ
る。従つて、本発明によれば、たとえばｔ−PAの測定に
要求された反応剤、すなわちプラスミノーゲン、プラス
ミン基質およびフイブリンまたはポリリジンタイプの賦
活物質の全部を同時的に凍結乾燥させることができ、し
かもそれらの活性を維持することができる。この場合
に、上記方法IIと同様に、中性pHを含む前記条件を使用
する。従つて、適当なpH範囲は３〜8.5、好ましくは６
〜７である。
IV.プロ酵素測定用組合せ試薬の調製方法 プロテインＣ、プラスミノーゲンおよび因子Ｘのよう
なプロ酵素は、反応剤として使用される活性化物質が相
応する活性化されたプロ酵素用の基質の存在の下で迅速
に作用するかぎり、一段階態様における基質技法を用い
て測定するのによく適している。すなわち、本発明のこ
の態様に従う方法は試料中に存在するプロ酵素の大部分
の数分以内に活性化する活性化物質とともに、基質を凍
結乾燥させることを包含する。生成する組合せ試薬はプ
ロ酵素測定用のものであり、この場合に、試料は、この
試料中に元から存在していた活性化されたプロ酵素の阻
害物質が活性化されたプロ酵素とそと基質との間の反応
に関与しないような低濃度で存在するように稀釈する。
なプロ酵素は、反応剤として使用される活性化物質が相
応する活性化されたプロ酵素用の基質の存在の下で迅速
に作用するかぎり、一段階態様における基質技法を用い
て測定するのによく適している。すなわち、本発明のこ
の態様に従う方法は試料中に存在するプロ酵素の大部分
の数分以内に活性化する活性化物質とともに、基質を凍
結乾燥させることを包含する。生成する組合せ試薬はプ
ロ酵素測定用のものであり、この場合に、試料は、この
試料中に元から存在していた活性化されたプロ酵素の阻
害物質が活性化されたプロ酵素とそと基質との間の反応
に関与しないような低濃度で存在するように稀釈する。
本発明に従い、凍結乾燥は常法で、たとえば0.08〜0.
15ミリバール（mbar）において、−45゜〜−40℃、好ま
しくは、−42℃の温度で、１〜５時間、好ましくは１時
間、凍結させ、引続いて、12〜24℃、好ましくは22℃の
温度で12〜20時間、好ましくは15時間、乾燥させること
によつて行なう。
15ミリバール（mbar）において、−45゜〜−40℃、好ま
しくは、−42℃の温度で、１〜５時間、好ましくは１時
間、凍結させ、引続いて、12〜24℃、好ましくは22℃の
温度で12〜20時間、好ましくは15時間、乾燥させること
によつて行なう。
本発明はまた、一段階法における試料、特に全血、血
液血漿、血液血清、脳背髄液、肺液または尿のような生
物学的試料中の凝析因子および繊維素溶解因子の定量、
半定量または定性分析において、容器内、好ましくはキ
ユベツト中に収容されている本発明の凍結乾燥組合せ試
薬を試料に添加し、次いで受け取られる応答をそれ自体
既知の方法で読み取ることによつて、この凍結乾燥試薬
混合物を使用することに関する。
液血漿、血液血清、脳背髄液、肺液または尿のような生
物学的試料中の凝析因子および繊維素溶解因子の定量、
半定量または定性分析において、容器内、好ましくはキ
ユベツト中に収容されている本発明の凍結乾燥組合せ試
薬を試料に添加し、次いで受け取られる応答をそれ自体
既知の方法で読み取ることによつて、この凍結乾燥試薬
混合物を使用することに関する。
本発明による方法を、添付図面を引用して、下記の例
によりさらに詳細に説明する。これらの例はそれ自体制
限するものではない。Fig1〜９はタンパク質加水分解で
活性な、多くの異なる成分に係る標準曲線を示すもので
あり、これらの曲線は本発明による適当な凍結乾燥組合
せ試薬を用いて、405nmの波長で作成したものである。
によりさらに詳細に説明する。これらの例はそれ自体制
限するものではない。Fig1〜９はタンパク質加水分解で
活性な、多くの異なる成分に係る標準曲線を示すもので
あり、これらの曲線は本発明による適当な凍結乾燥組合
せ試薬を用いて、405nmの波長で作成したものである。
例 １ この例では、プロテアーゼ阻害物質、アンチ因子X a
の測定用の凍結乾燥組合せ試薬の調製方法およびその使
用を説明する。
の測定用の凍結乾燥組合せ試薬の調製方法およびその使
用を説明する。
ａ） 水中の0.2M酢酸と0.2M酢酸ナトリウムとの混合物
500mlを蒸留水の添加により1000mlに稀釈することによ
り酢酸塩緩衝液1000mlを調製する。0.2M酢酸368mlおよ
び0.2M酢酸ナトリウム132mlを用いることにより4.2の所
望のpH値が得られる。
500mlを蒸留水の添加により1000mlに稀釈することによ
り酢酸塩緩衝液1000mlを調製する。0.2M酢酸368mlおよ
び0.2M酢酸ナトリウム132mlを用いることにより4.2の所
望のpH値が得られる。
ｂ） 組合せ試薬の改善された安定性および増大された
溶解性を得るために、アルブミンおよびマンニトールを
下記の量で緩衝溶液ａ）に加える。
溶解性を得るために、アルブミンおよびマンニトールを
下記の量で緩衝溶液ａ）に加える。
ｃ） 凍結乾燥用調製物： 基質Ｓ−2732 650mg/（0.8ミリモル／）および
因子X a1000nKat（1000nKat/）を緩衝溶液ａ）に加え
る。この緩衝溶液ａ）にはBSA5g/（0.5％）およびマ
ンニトール10g/（１％）が加えられている。
因子X a1000nKat（1000nKat/）を緩衝溶液ａ）に加え
る。この緩衝溶液ａ）にはBSA5g/（0.5％）およびマ
ンニトール10g/（１％）が加えられている。
ｄ） アンチ因子X aの測定用の凍結乾燥組合せ試薬の
調製： 溶液ｃ）各200μをプラスチック製のマイクロキユ
ベツト（Kartell Art.No.1938）にそれぞれ移す。これ
らのキユベツトを−42℃の凍結乾燥機内に１時間入れ、
次いで＋22℃および0.08〜0.15ミリバールの圧力で15時
間乾燥させる。
調製： 溶液ｃ）各200μをプラスチック製のマイクロキユ
ベツト（Kartell Art.No.1938）にそれぞれ移す。これ
らのキユベツトを−42℃の凍結乾燥機内に１時間入れ、
次いで＋22℃および0.08〜0.15ミリバールの圧力で15時
間乾燥させる。
ｅ） アンチ因子X a測定用のキユベツトｄ）の使用： EDTA（7.5ミリモル／）を含有する0.05モル／Tri
s（pH8.4、Ｉ＝0.2）中の血漿（1:500に稀釈）300μ
、ヘパリン（3IU/ml）およびPEG1％を、Ｓ−2732（0.
13mg）F X a（0.2nkat）およびBSAおよびマンニトール
よりなる凍結乾燥組合せ試薬を含有するキユベツトｄ）
に加える。
s（pH8.4、Ｉ＝0.2）中の血漿（1:500に稀釈）300μ
、ヘパリン（3IU/ml）およびPEG1％を、Ｓ−2732（0.
13mg）F X a（0.2nkat）およびBSAおよびマンニトール
よりなる凍結乾燥組合せ試薬を含有するキユベツトｄ）
に加える。
添加後の被験溶液のpHは8.2である。室温（25℃）
で、または37℃で反応を生起させ、８分後に、５％AcOH
300μの添加により止める。
で、または37℃で反応を生起させ、８分後に、５％AcOH
300μの添加により止める。
次いで、405nmにおける溶液の吸光度を側光計で読み
取り、この結果を既知量のアンチ因子X aを含有する試
料と、Fig1aに示されている標準曲線を用いて比較す
る。このFig1aは組合せ試薬の製造者が予め作成してお
いたものである。この曲線は施用量と応答との間の関係
を示すものであり、製造者によつて計算され、対象アナ
ライトの計算用の使用者により使用されるフアクターに
もとづいている。
取り、この結果を既知量のアンチ因子X aを含有する試
料と、Fig1aに示されている標準曲線を用いて比較す
る。このFig1aは組合せ試薬の製造者が予め作成してお
いたものである。この曲線は施用量と応答との間の関係
を示すものであり、製造者によつて計算され、対象アナ
ライトの計算用の使用者により使用されるフアクターに
もとづいている。
Fig1aから明らかなように、反応は低温依存性である
ことが見い出された。
ことが見い出された。
アンチトロンビンの測定用の一般に使用され、市販さ
れている「キット」（Coatest Antithrombin、KabiVit
rum AB.Sweden）に対する相関関係をFig1bに示す。
れている「キット」（Coatest Antithrombin、KabiVit
rum AB.Sweden）に対する相関関係をFig1bに示す。
例 ２ この例では、アンチトロンビン測定用の組合せ試薬の
調製方法およびその使用を説明する。
調製方法およびその使用を説明する。
ａ） 例１と同様にして、アンチトロンビン測定用の、
Ｓ−2366（0.1mg）、トロンビン（0.7nkat）およびBSA
およびマンニトールを含有する凍結乾燥組合せ試薬をキ
ユベツト中で調製する。
Ｓ−2366（0.1mg）、トロンビン（0.7nkat）およびBSA
およびマンニトールを含有する凍結乾燥組合せ試薬をキ
ユベツト中で調製する。
ｂ） アンチトロンビン測定における組合せ試薬の使
用。
用。
例1e）に記載のものと同一の緩衝液中の血漿（1:80に
稀釈）300μを、その内容物が凍結乾燥されている
ａ）からのキユベツトに加える。反応は37℃で生じさ
せ、８分後に、５％酢酸300μの添加により止める。
測定は例1e）と同様に行なう。Fig2に示されている標準
曲線が得られる。
稀釈）300μを、その内容物が凍結乾燥されている
ａ）からのキユベツトに加える。反応は37℃で生じさ
せ、８分後に、５％酢酸300μの添加により止める。
測定は例1e）と同様に行なう。Fig2に示されている標準
曲線が得られる。
例 ３ この例では、アンチプラスミン測定用の組合せ試薬の
調製方法およびその使用を説明する。
調製方法およびその使用を説明する。
ａ） 例１と同様にして、アンチプラスミン測定用の、
Ｓ−2251（0.3mg）、プラスミン（0.3nkat）およびBSA
およびマンニトールを含有する凍結乾燥組合せ試薬を含
有するキユベツトを調製する。
Ｓ−2251（0.3mg）、プラスミン（0.3nkat）およびBSA
およびマンニトールを含有する凍結乾燥組合せ試薬を含
有するキユベツトを調製する。
ｂ） この組合せ試薬のアンチプラスミン測定における
使用。
使用。
メチルアミン0.15モル／を含有する0.05モル／Tr
is（pH＝8.3）中の血漿（1:30に稀釈）300μをａ）か
らのキユベツトに加える。キユベツトの内容物は凍結乾
燥されている。反応は37℃で生じさせ、８分後に、５％
AcOH300μの添加により止める。測定は例1e）と同様
にして行なう。Fig3に示されている標準曲線が得られ
る。
is（pH＝8.3）中の血漿（1:30に稀釈）300μをａ）か
らのキユベツトに加える。キユベツトの内容物は凍結乾
燥されている。反応は37℃で生じさせ、８分後に、５％
AcOH300μの添加により止める。測定は例1e）と同様
にして行なう。Fig3に示されている標準曲線が得られ
る。
上記例はプロテアーゼ阻害物質の測定用の組合せ試薬
を説明するものである。次の２例は補因子の測定用の組
合せ試薬を例示するものである。
を説明するものである。次の２例は補因子の測定用の組
合せ試薬を例示するものである。
例 ４ この例では、ヘパリン測定用の組合せ試薬の調製方法
およびその使用を説明する。
およびその使用を説明する。
ａ） ヘパリン測定用の、Ｓ−2732（0.2mg）、F x a
（0.5nkat）およびBSAおよびマンニトールを含有する組
合せ試薬ろ含有するキユベツトを例１と同様にして調製
する。
（0.5nkat）およびBSAおよびマンニトールを含有する組
合せ試薬ろ含有するキユベツトを例１と同様にして調製
する。
ｂ） この組合せ試薬のヘパリン測定における使用。
EDTA（7.5ミリモル／）およびPEG（１％）を含有す
る0.05モル／ Tris（pH＝8.4、Ｉ＝0.2）中の血漿
（1:15に稀釈）300μをａ）からのキユベツトに加え
る。このキユベツトの内容物は凍結乾燥されている。反
応は室温で行なわせ、６分後に、５％酢酸300μの添
加により止める。測定は例1e）と同様して行なう。Fig4
に示されている標準曲線が得られる。
る0.05モル／ Tris（pH＝8.4、Ｉ＝0.2）中の血漿
（1:15に稀釈）300μをａ）からのキユベツトに加え
る。このキユベツトの内容物は凍結乾燥されている。反
応は室温で行なわせ、６分後に、５％酢酸300μの添
加により止める。測定は例1e）と同様して行なう。Fig4
に示されている標準曲線が得られる。
例 ５ この例では、フイブリンモノマー測定用の組合せ試薬
の調製方法およびその使用を説明する。
の調製方法およびその使用を説明する。
ａ） Ｓ−2390（12mg）およびマンニトール（19mg）
を、0.01％TweenR80を含有する0.03モル／の酢酸ナト
リウム緩衝液（pH＝4.9）7.0mlに溶解し、次いで殺菌水
0.8mlに溶解したヒトGlu−プラスミノーゲン2.5mgと混
合する。生成した溶液に、水0.5mlに溶解したBSA100mg
および酢酸ナトリウム緩衝液0.8mlに溶解したｔ−PA3.6
μｇを加え、その後、追加の緩衝液を加えて、総量を20
mlにする。この最終溶液200μづつをマイクロキユベ
ツトに分配し、例1d）に従い凍結乾燥させる。
を、0.01％TweenR80を含有する0.03モル／の酢酸ナト
リウム緩衝液（pH＝4.9）7.0mlに溶解し、次いで殺菌水
0.8mlに溶解したヒトGlu−プラスミノーゲン2.5mgと混
合する。生成した溶液に、水0.5mlに溶解したBSA100mg
および酢酸ナトリウム緩衝液0.8mlに溶解したｔ−PA3.6
μｇを加え、その後、追加の緩衝液を加えて、総量を20
mlにする。この最終溶液200μづつをマイクロキユベ
ツトに分配し、例1d）に従い凍結乾燥させる。
ｂ） この組合せ試薬をフイブリンモノマー測定におけ
る使用。
る使用。
0.01％Tween 80を含有する0.063モル／Tris（pH＝
8.5）中の血漿（1:41に稀釈）300μをａ）からのキユ
ベツトに加える。このキユベツトの内容物は凍結乾燥さ
れており、Ｓ−2390（0.12mg）、プラスミノーゲン（25
μｇ）およびｔ−PA（0.036μｇ）およびマンニトー
ル、Tween 80およびBSAを含有している。反応は室温で
生じさせ、20分後に、20％酢酸300μの添加により止
める。例1e）と同様にして測定する。Fig5に示されてい
る標準曲線が得られる。
8.5）中の血漿（1:41に稀釈）300μをａ）からのキユ
ベツトに加える。このキユベツトの内容物は凍結乾燥さ
れており、Ｓ−2390（0.12mg）、プラスミノーゲン（25
μｇ）およびｔ−PA（0.036μｇ）およびマンニトー
ル、Tween 80およびBSAを含有している。反応は室温で
生じさせ、20分後に、20％酢酸300μの添加により止
める。例1e）と同様にして測定する。Fig5に示されてい
る標準曲線が得られる。
下記の例は酵素反応の活性化物質を測定するための態
様を説明するものである。
様を説明するものである。
例 ６ ｔ−PA測定用の組合せ試薬の調製方法およびその使用
をこの例で説明する。
をこの例で説明する。
ａ） 蒸留水13.5mlに溶解したＳ−2251（9mg）を、プ
ラスミノーゲン（18.75CU）およびマンニトール（15m
g）を含有する水溶液0.75mlと混合する。生成する溶液
を冷却させ、次いでCNBr−消化フイブリン（フイブリノ
ーゲン）（3.75mg）およびマンニトール（15mg）を含有
する水溶液0.75mlと混合する。この最終溶液200μづ
つをマイクロキユベツトに分配し、次いで例1d）に従い
凍結乾燥させる。
ラスミノーゲン（18.75CU）およびマンニトール（15m
g）を含有する水溶液0.75mlと混合する。生成する溶液
を冷却させ、次いでCNBr−消化フイブリン（フイブリノ
ーゲン）（3.75mg）およびマンニトール（15mg）を含有
する水溶液0.75mlと混合する。この最終溶液200μづ
つをマイクロキユベツトに分配し、次いで例1d）に従い
凍結乾燥させる。
ｂ） この組合せ試薬のｔ−PA測定における使用。
0.01％Tween 80を含有する0.05モル／Tris（pH＝8.
3）中の前処理した血漿（1:125に稀釈）300μをａ）
からのキユベツトに加える。キユベツトの内容物は凍結
乾燥されており、Ｓ−2251（120μｇ）、プラスミノー
ゲン（0.25CU）およびCNBr−消化フイブリン（フイブノ
ーゲン）（50μｇ）およびマンニトールよりなる。反応
は37℃で生じさせ、２時間45分後に、20％AcOH300μ
の添加により止める。
3）中の前処理した血漿（1:125に稀釈）300μをａ）
からのキユベツトに加える。キユベツトの内容物は凍結
乾燥されており、Ｓ−2251（120μｇ）、プラスミノー
ゲン（0.25CU）およびCNBr−消化フイブリン（フイブノ
ーゲン）（50μｇ）およびマンニトールよりなる。反応
は37℃で生じさせ、２時間45分後に、20％AcOH300μ
の添加により止める。
例1e）と同様にして測定し、Fig6に示されている標準
曲線を得る。
曲線を得る。
次例では、プロ酵素測定用の態様を説明する。
例 ７ この例では、因子Ｘの測定用の組合せ試薬の調製方法
およびその使用を説明する。
およびその使用を説明する。
ａ） 蒸留水6.5ml中に溶解したＳ−2337（24mg）およ
びマンニトール（120mg）を、Russel′s ViperVenom（R
VV.Miami Sarpentarium Labs,米国）（0.9mg）およびNa
Cl（60mg）を含有する水溶液3.5mlと混合する。生成す
る溶液にCaCl2の溶液（0.1モル／）を、全量が20mlに
なるまで加える。この最終溶液200μづつをマイクロ
キユベツトに分配し、次いで例1d）に従い凍結乾燥させ
る。
びマンニトール（120mg）を、Russel′s ViperVenom（R
VV.Miami Sarpentarium Labs,米国）（0.9mg）およびNa
Cl（60mg）を含有する水溶液3.5mlと混合する。生成す
る溶液にCaCl2の溶液（0.1モル／）を、全量が20mlに
なるまで加える。この最終溶液200μづつをマイクロ
キユベツトに分配し、次いで例1d）に従い凍結乾燥させ
る。
ｂ） この組合せ試薬の因子Ｘの測定における使用。
Polybrene （20mg/、Aldrich、米国）を含有する0.0
5モル／ Tris（pH＝7.8）中の血漿（1:60に稀釈）600
μをａ）からのキユベツトに加えて、このキユベツト
の内容物は凍結乾燥されており、Ｓ−2337（0.24mg）お
よびRVV（９μｇ）ならびにマンニトール、CaCl2および
NaClよりなる。反応は37℃で生じさせ、３分後に、20％
AcOH200μの添加により止める。例1e）と同様に測定
し、Fig7に示されている標準曲線を得る。
5モル／ Tris（pH＝7.8）中の血漿（1:60に稀釈）600
μをａ）からのキユベツトに加えて、このキユベツト
の内容物は凍結乾燥されており、Ｓ−2337（0.24mg）お
よびRVV（９μｇ）ならびにマンニトール、CaCl2および
NaClよりなる。反応は37℃で生じさせ、３分後に、20％
AcOH200μの添加により止める。例1e）と同様に測定
し、Fig7に示されている標準曲線を得る。
例 ８ この例では、プラスミノーゲン測定用の組合せ試薬の
調製方法およびその使用を説明する。
調製方法およびその使用を説明する。
ａ） Ｓ−2251（30mg）を蒸溜水16mlに溶解し、次いで
ストレプトキナーゼ（80000IU）およびアルブミン（20
％）12mgを含有する溶液4mlと混合する。生成する最終
溶液200μづつをマイクロキユベツトに分配し、次い
で例1d）に従い凍結乾燥させる。
ストレプトキナーゼ（80000IU）およびアルブミン（20
％）12mgを含有する溶液4mlと混合する。生成する最終
溶液200μづつをマイクロキユベツトに分配し、次い
で例1d）に従い凍結乾燥させる。
ｂ） この試薬のプラスミノーゲン測定における使用。
0.05モル／Tris（pH＝7.4およびＩ＝0.05）中の血
漿（1:20に稀釈）300μをａ）からのキユベツトに加
える。このキユベツトの内容物は凍結乾燥されており、
Ｓ−2251（0.3mg）およびストレプトキナーゼ（800IU）
ならびにアルブミンよりなる。反応は77℃で生じさせ、
３分後に、５％AcOH300μの添加により止める。例1
e）と同様に測定し、Fig8に示されている標準曲線を得
る。
漿（1:20に稀釈）300μをａ）からのキユベツトに加
える。このキユベツトの内容物は凍結乾燥されており、
Ｓ−2251（0.3mg）およびストレプトキナーゼ（800IU）
ならびにアルブミンよりなる。反応は77℃で生じさせ、
３分後に、５％AcOH300μの添加により止める。例1
e）と同様に測定し、Fig8に示されている標準曲線を得
る。
例 ９ この例では、プロテインＣ測定用の組合せの試薬の調
製方法およびその使用を説明する。
製方法およびその使用を説明する。
ａ） Ｓ−2366（12mg）を蒸留水19.55mlに溶解し、次
いでProtac Ｃ−溶液（10U/ml）、Pentapharm.Switzer
land）0.45mlを加える。生成する溶液200μづつをマ
イクロキユベツトに分配し、次いで例1d）に従い凍結乾
燥させる。
いでProtac Ｃ−溶液（10U/ml）、Pentapharm.Switzer
land）0.45mlを加える。生成する溶液200μづつをマ
イクロキユベツトに分配し、次いで例1d）に従い凍結乾
燥させる。
ｂ） この組合せ試薬のプロテインＣ測定における使
用。
用。
0.1％PEGを含有する0.025モル／Tris（pH＝8.4）中
に血漿（1:11に稀釈）300μをａ）からのキユベツト
に加える。このキユベツトの内容物は凍結乾燥されてお
り、Ｓ−2366（0.12mg）およびProtac Ｃ（0.045U）よ
りなる。反応は37℃で生じさせ、７分後に、20％AcOH30
0μの添加により止める。例1e）と同様に測定し、Fig
9に示されている標準曲線を得る。
に血漿（1:11に稀釈）300μをａ）からのキユベツト
に加える。このキユベツトの内容物は凍結乾燥されてお
り、Ｓ−2366（0.12mg）およびProtac Ｃ（0.045U）よ
りなる。反応は37℃で生じさせ、７分後に、20％AcOH30
0μの添加により止める。例1e）と同様に測定し、Fig
9に示されている標準曲線を得る。
これらの例において、使用されている略語は下記の意
味を有する BSA ウシ血清アルブミン Tris トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン EDTA エチレンジアミンテトラ酢酸 PEG ポリエチレングリコール AcOH 酢酸 Tween 80 ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエ
ート（Atlas Chemical Industries,USA） Glu グルタミン酸 ｔ−PA プラスミノーゲン活性化物質 Ｓ−2251 Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Lys−pNA・2HCl Ｓ−2337 Ｈα−ベンゾイル−Ile−Glu（γ−ピペリジ
ド）−Gly−Arg−pNA・HCl Ｓ−2366 ＜Glu−Pro−Arg−pNA・HCl Ｓ−2390 Ｈ−Ｄ−Val−Phe−Lys−pNA・2HCl S2732 Ｎα−スクシノイル−Ile−Glu（γ−ピペリジ
ド）−Gly−Arg−pNA・HCl −pNA ｐ−ニトロアニリド A405 405nmにおける吸光度 nkat ノナケタル（１ケタル＝特定の条件下における、
１秒当りで基質１モルを分解する酵素活性の量） 1U（ヘパリン） 国際単位に相当する単位 1U（ストレプトキナーゼ） 国際標準に相当する単位 CU（プラスミノーゲン） カゼイン単位 Ｕ（Protac ） 1U＝正常なヒトのクエン酸塩処理した
血漿1ml中に含まれるプロテインＣを活性化するProtac
の量 図面に示されている標準曲線は、好ましくは組合せ試
薬の製造者により、相当する実施例で行なわれた測定と
同様に、各標準曲線を使用して、被測定成分を種種の既
知量で含有する試料についてA405の測定により得られた
ものである。
味を有する BSA ウシ血清アルブミン Tris トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン EDTA エチレンジアミンテトラ酢酸 PEG ポリエチレングリコール AcOH 酢酸 Tween 80 ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエ
ート（Atlas Chemical Industries,USA） Glu グルタミン酸 ｔ−PA プラスミノーゲン活性化物質 Ｓ−2251 Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Lys−pNA・2HCl Ｓ−2337 Ｈα−ベンゾイル−Ile−Glu（γ−ピペリジ
ド）−Gly−Arg−pNA・HCl Ｓ−2366 ＜Glu−Pro−Arg−pNA・HCl Ｓ−2390 Ｈ−Ｄ−Val−Phe−Lys−pNA・2HCl S2732 Ｎα−スクシノイル−Ile−Glu（γ−ピペリジ
ド）−Gly−Arg−pNA・HCl −pNA ｐ−ニトロアニリド A405 405nmにおける吸光度 nkat ノナケタル（１ケタル＝特定の条件下における、
１秒当りで基質１モルを分解する酵素活性の量） 1U（ヘパリン） 国際単位に相当する単位 1U（ストレプトキナーゼ） 国際標準に相当する単位 CU（プラスミノーゲン） カゼイン単位 Ｕ（Protac ） 1U＝正常なヒトのクエン酸塩処理した
血漿1ml中に含まれるプロテインＣを活性化するProtac
の量 図面に示されている標準曲線は、好ましくは組合せ試
薬の製造者により、相当する実施例で行なわれた測定と
同様に、各標準曲線を使用して、被測定成分を種種の既
知量で含有する試料についてA405の測定により得られた
ものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭58−209999（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−230066（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−120863（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−187800（ＪＰ，Ａ) 実開 昭61−37100（ＪＰ，Ｕ) 実開 昭56−134999（ＪＰ，Ｕ)
Claims (10)
- 【請求項１】容器内に収納された凍結乾燥組合せ試薬で
あって、該組合せ試薬中に含まれている基質の分解によ
って、直接または間接にタンパク質加水分解において活
性な成分を測定することを目的とし、そしてプロテアー
ゼにより分解されて検出できる応答を生じる、凍結乾燥
組合せ試薬において、この組合せ試薬は検出に必要な試
薬の全部、該試薬は色原体基質およびこの基質に対して
酸素活性を有する成分からなり、および任意のそれ自体
既知の一種以上の添加剤を、実質的に未反応の形態で含
有しており、そして該凍結乾燥組合せ試薬中に含まれる
全部の成分を実質的に未反応の形態で含有する溶液をそ
れ自体既知の方法で凍結乾燥させることによって調製さ
れたものであり、そしてこの凍結乾燥された組合せ試薬
は緩衝溶液中におけるごとく再構成された場合に実質的
にその元の活性を有することを特徴とする凍結乾燥組合
せ試薬。 - 【請求項２】一回の測定用の量の上記組合せ試薬がその
内部容積が分割されていない容器内に収納されており、
この容器は好ましくは反応検出用の測定装置で直接に使
用できるものであることを特徴とする、請求項１に記載
の組合せ試薬。 - 【請求項３】ａ）阻害物質、ｂ）補因子、ｃ）活性化物
質またはｄ）プロ酸素よりなる、タンパク質加水分解で
活性な成分の測定用の組合せ試薬であって、プロテアー
ゼにより分解させることができ、好ましくは色原性基質
である基質および可能な添加剤に加えて、ａ）プロテア
ーゼ、ｂ）プロテアーゼおよび該プロテアーゼと被測定
補因子の影響の下で反応することができる反応剤、ｃ）
プロ酵素または活性化できる酸素化合物、またはｄ）プ
ロ酵素のための活性化物質を含有することを特徴とす
る、請求項１または２のいずれか一つに記載の組合せ試
薬。 - 【請求項４】１）アンチ因子X a、２）ヘパリン、３）
フイブリンモノマーまたは４）プロテインｃ測定を目的
とし、１）因子X a、Ｎα−スクシノイル−11e−Glu
（γ−ピペリジド）−Gly−Arg−pNA−基質、ウチ血清
アルブミンおよびマンニトール;2）因子X a、Ｎα−ス
クシノイル−IIe−Glu（γ−ピペリジド）−Gly−Arg−
pNA−基質、ウシ血清アルブミンおよびマンニトール、
３）プラスミノーゲン、Ｈ−Ｄ−Val−Phe−Lys−pNA−
基質、ｔ−PA、マンニトール、界面活性剤およびウシ血
清アルブミン、または４）プロテインＣ−活性化物質お
よび＜Glu−Pro−Arg−pNA−基質よりなることを特徴と
する、請求項３に記載の組合せ試薬。 - 【請求項５】組合せ試薬中に含まれており、かつプロテ
アーゼより分解されて、検出できる応答を生じることが
できる基質の分解によって、直接または間接にタンパク
質加水分解において活性な成分を測定することを目的と
する請求項１に記載の凍結乾燥組合せ試薬の調製方法で
あって、該測定に必要な試薬の全部、該試薬は色原体基
質およびこの基質に対して酵素活性を有する成分からな
り、および任意のそれ自体既知の一種以上の添加剤を含
有する溶液を、容器内で水などの溶媒中で、該試薬が生
成する溶液中で実質的に非反応性であるように制御され
ている条件の下で調製し、引続いて、この溶液を凍結乾
燥させることよりなり、該溶液は容器内でそれ自体既知
の方法で凍結乾燥させ、その中に存在する試薬が実質的
に未反応の形態で含まれており、かつまた、その中に存
在する試薬が該組合せ試薬を緩衝溶液などの中における
ごとく再構成した後に、実質的にその元の活性を有する
凍結乾燥組合せ試薬を得ることを特徴とする調製方法。 - 【請求項６】凍結乾燥工程において、容器が一回の測定
に適する量の溶液を含有しており、該容器はその内部容
積が分割されていないものであることを特徴とする、請
求項５に記載の方法。 - 【請求項７】条件を、好ましくは緩衝剤により、補因子
または活性物質測定用の組合せ試薬を調製する場合に
は、３〜8.5のpH値に制御し、そして阻害物質またはプ
ロ酵素測定用の組合せ試薬を調製する場合には、３〜５
のpH値に制御することを特徴とする、請求項５または６
のいずれか一つに記載の方法。 - 【請求項８】凍結乾燥を、0.08〜0.15ミリバール（mba
r）において、−45゜〜−40℃、好ましくは−42℃の温
度で１〜５時間、好ましくは１時間凍結させ、引続い
て、12〜24℃、好ましくは22℃の温度で12〜20時間、好
ましくは15時間、乾燥させることにより行なうことを特
徴とする、請求項５、６または７のいずれか一つに記載
の方法。 - 【請求項９】上記溶液が不活性タンパク質、たとえばア
ルブミン；糖、たとえばマンニトール；および（また
は）界面活性剤、たとえばポリエチレングリコールなど
の添加剤を含有することを特徴とする請求項５〜８のい
ずれか一つに記載の方法。 - 【請求項１０】ａ）阻害物質、ｂ）補因子、ｃ）活性化
物質またはｄ）プロ酵素よりなり、タンパク質加水分解
で活性な成分を測定するための組合せ試薬を調製し、そ
して凍結乾燥させる該組合せ試薬の溶液がプロテアーゼ
により分解させることができる基質および可能な添加剤
に加えて、ａ）プロテアーゼ、ｂ）プロテアーゼおよび
測定されるべき補因子の影響の下でプロテアーゼと反応
することができる反応剤、ｃ）プロ酵素または活性化で
きる酸素化合物、またはｄ）プロ酵素の活性化物質、を
含有することを特徴とする請求項５〜９のいずれか一つ
に記載の方法。
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|---|---|
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| US4657855A (en) * | 1984-04-06 | 1987-04-14 | Miles Laboratories, Inc. | Composition and test device for determining the presence of leukocytes, esterase and protease in a test sample |
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