JPH01503599A

JPH01503599A - タンパク質加水分解で活性な成分の測定

Info

Publication number: JPH01503599A
Application number: JP63505266A
Authority: JP
Inventors: アウレル，レイフ; フリベルガー，ペッター
Original assignee: クロモジェニックス　アクチーボラグ
Priority date: 1987-06-18
Filing date: 1988-06-15
Publication date: 1989-12-07
Anticipated expiration: 2011-10-30
Also published as: DE3879406D1; NO890399L; EP0318571A1; ATE87037T1; AU620812B2; SE8702556D0; DK75089D0; JP2548349B2; DK75089A; AU1958788A; WO1988010312A1; FI890698A0; FI890698A; DE3879406T2; EP0318571B1; NO890399D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク質加水分解で活性な成分の測定本発明は臨床診断で使用するのに好適な凍結乾燥組合せ試薬に関し、この組合せ試薬はタンパク質加水分解において活性な成分、たとえばプロテアーゼ、および特にプロテアーゼに対するプロ酵素、阻害物質、補因子および活性化物質、を簡単に、しかも迅速に測定することを可能にする。本発明はまた、このような組合せ試薬を調製するための新規な方法およびこの組合せ試薬の凝析および淑維素溶解の分野における使用に関する。

タンパク質分解酵素、いわゆるプロテアーゼ、は体内で多くの１喪な機能を有する。プロテアーゼの例としては、下記のプロテアーゼをあげることができる：パンフレアーゼから分泌され、消化プロセスに関与するトリプシンおよびキモトリジシン：ａ！々のタイプのカテプシン、カリクレインおよびエラスターゼ、ならびに炎症状態およびアレルギー状態によって引き起される反応に関与する相補系の酵素；血液凝塊の形成を導く、一連の反応に関与するプロテアーゼよりなる因子■”ｓ　ＸａＳ′ＡａおよびｘＩｌａおよびトロンビン；および血液凝塊の溶ｍｋもたらすプロテアーゼである外生ウロキナーゼおよびプラスミン。

従って、インビトロで、プロテアーゼ活性を測定する診断方法は多くの臨床分野で極めて重要な方法である。この方法では、活性プロテアーゼの量ばかりでなく、また中でも、活性プロテアーゼに変換できるプロ酵素の量およびまた、タンパク負加水分解に関与する阻害物質および活性化物質の量が測定される。このような測定が病理学的症状の検査において極めて重要であることは勿論のことである。手術および（または）医療のような成る処置において、かなりの場合に、成る種のこれらの物質の定量がまた、先ず初めに行なわれる。

タンパク負加水分解において活性な成分、たとえばプロテアーゼおよび関連因子、たとえばプロ酵素、阻害物質および活性化物質を測定するための慣用の方法は、いわゆるバイオアッセイ、インビトロの免役学的反応または対応するプロテアーゼのための天然の基質をそれ自体、必要としない生物学的タンパク質の利用にもとすいている。

上記方法の欠点は、これらの方法が実施および判定の両方で時間がかかりそして労力重要すること、感度が制限されていること、および（または）特異性が欠落しており、そしてまた標準化が困曖であることにある。

過去数年の間に、アミノ酸または短釦ペプチドを基材とし、そしてプロテアーゼにより容易に分離される通常の測光により容易に測定できるマーカーを付与した、合成低分子量基質が開発された。これらの基質は前記の欠点のいくつかがこの基質によって排除されたことから、プロテアーゼ定量方法を大きく促進させた（：　Ｈｅｍｋｅｒ　Ｈ，Ｃ，によるＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ、　１９８３年、Ｍａｒｔｉｎｕｓ　Ｎ１ｊｈｏｆｆ出版社、Ｂｏｓｔｏｎ　）。

これらの基質、特に測光により測定できるマーカーを付けた基質、通称色原性基質は改善された特異性および再現性を有する方法の開発を可能にした。さらに、これらの方法によれば、他方で、たとえば免疫学的方・法の場合のような量の代りに活性度が測定され、測定結果に対する被験パラメーターの融状比が、いわゆるバイオアッセイでほとんどの場合に得られるｌｏｇ−１ｅｇ比および１ｉｎ− １ｅｇ比とは異なるものとして、得られる。

上記の利点にもかかわらず、このような、通常の色原性基質の分離にもとづく測定方法はその有用性を制限するいくりかの欠点により依然として有用性が減じられている。

一般に、これらの、いわゆる基質法は二段階反応よりなり、一方で、単なる生化学的反応を、そして他方で、プロテアーゼと適当な基質との反応を包含する。

測定しようとする活性成分に応じて、この反応プロセスは下記のとおりに示すことができる。

Ａ、阻害物質の測定Ｅ６＋工→に１−工＋　Ｅｏ−１（Ｅ６＞Ｅｌ）Ｓ−Ｍ−３ｅ−１→Ｓ十ＭＢ、補因子の測定Ｋ　十ＲｅＥ　−Ｒ＋　Ｅ、。

ｅ　Ｃ８−Ｍ−”ｅ−Ｃ−〉Ｓ　十ＭＣ０活性化物質の測定Ｐ−〉ｐ＋ＫＡ　（過剰のＰ）Ｓ−Ｍ−ＵＡ→Ｓ＋ＭＤ、プロ酵素の測定Ｐ−！Ｌｐ　＋　Ｅｐ　（過剰のＡ）Ｓ−Ｍ−Ｕｐ→Ｓ十Ｍすなわち、第二の反応段階は相当する酵素の影響によるマーカーを有する基質の分離を意味し、分解に利用される酵素の量は第一の反応により形成された後に残留する、あるいは第一の反応により形成される活性酵素の量よりなる。

従って、全ての場合に、放出されたマーカーＭの量はアナライト（分析対象物）工、Ｃ！、　ＡおよびＰにそれぞれ比例する。上記で使用した略語は次の意味を有し、濃度は付記により示されている：Ｅ−酵素ニー阻害物質Ｓ−Ｍ−マーカーを付けた基質Ｍ請マーカーＳ−マーカーを分離した後に残る基質残留物Ｒ−補因子の影響により酵素と反応する反応剤。

Ｃ＝補因子Ａ−活性化物質Ｐ＝態別様活性化することのできる酵素化合物またはプロ酵素ｐ＝プロ酵素／酵素化合物の活性化からの残留物一般に、これらの二段階法は時間がかかりそして労力を要する。さらにまた、この分析を行なう場合には、多くのピペット操作工程が含まれ、また各段階の反応時間が引き続いていることが必須であることから、極めて注意深い熟練を要する。さらにまた、このような二段階法は一回のそして同一系で手により行なうことができる試駄の数を制限する。

さらにまた、この方法の有用性は、一般にその再構成された生物学的試薬が有する、比較的短い有効寿命（１ケ月またはそれ以下）により減じられる。現在、この分析に利用できる市販の試薬は通常、２０〜２００の分析に充分であるように包装されている。従って、使用者は経済上の理由で、再構成した試薬が安定である時間以内に相当する数の分析を行なう必要がある。

これまで、何とかして個別に包装されねばならない試薬を分離した包装物中にあるいは充填容器内の分離した室内（隔室化されている）に収納するようにして、含有しているような分離した試験用の周率な包装物を形成することは技術的におよび価格的に、可能ではなかった。

現在、−回の試験用の試薬を１個の同一のプラスチック容器内で物理的に分離する包装形態が一つだけ市雑なデデインを有するこの容器は、試薬隔室間の仕切りを自動的に破り、次りで所定の時間の後に試料および追加の試薬を加える、この目的に対して特別に作られた装置でだけ有用である。

また、二段階プロセスを一段階プロセスに変えられるように、反応条件および試薬を適合させることにより、慣用の包装された試薬の取り扱いを成る程度まで簡単にすることはできる。この場合に、二種の反応は平行して進行し、この方法では、アナライトは測光計の読みに依然として直接的に比例する。この方法は数種の試薬を、数種の試薬が相互に引続いて直ちに添加されるような方法で（この場合には、ピペット操作工程の数は減少しない）、あるいは成る種の試薬（たとえば、基質と生化学的試薬）が前もって混合されるような方法で行なわれる。この場合に、ピペット操作は容易であるが、依然として非常に不安定な試薬（有効寿命は通常１日にすぎない）が得られる。特に、最後に記載した方法は自動式方法（下記参照）で使用されている。

基質法の利点の一つは、臨床用の自動分析機におけるそれらの利用可能性にあり、これは測定方法を一段階法に変えることを容易にする（　ｎｅｒｇａｔｒｉ：ｉｍ　Ｋ、およびＬａｈｎｂｏｒｇ、　ｅ、によるＴｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、　１９７５年、６巻、２２３〜２３３頁；　Ｋａｐｋｅ　Ｇ、Ｆ、等によるＣ１１ｎ。

ｃｈｅｍ、　１９６２年、２８巻、１５２１〜１５２４頁〕。

この方法で、基質方法の欠点のかなりが除かれる。しかしながら、自動分析機による検査は長い一連の試験を必要としおよび集中装置で有効な濃度を要する。このことは、しかしながら、試料採取から分析結果が得られるまでの期間が許容しがたいほど長くなることがあることを意味する。

一段階法を達成するための比較的複雑な方法がｘｐ−Ａ２−０１６８７３８に記載されており、この方法では、必要な一ベット操作工程および正確なタイミングが回避される。しかしながら、この特許出願に記載されている方法は必要な生化学的試薬と基質とを、反応を防止する異なる溶媒を用いて分離した方法で、または隔室化することにより、固定担体マ）　ＩＪラックス適用するという技術的に複雑な方法に実質的に制限される。さらにまた、生成する色を読み取るために、この目的に対して特別に設計された装置が必要である。

従って、本発明の目的は基質法を使用して、しかも上記の欠点を排除して、タンパク質加水分解で活性な成分の測定を一段階で容易に行なうことができる組合せ試薬を提供することにある。

この目的が本発明に従い、請求の範囲１に記載の凍結乾燥組合せ試薬により達成される。

従って、本発明は容器内に収納されており、そして組合せ試薬中に含まれており、プロテアーゼにより分解して、検出できる応答を生じることができる基質の分解によって、タンパク質加水分解で活性な成分を直接的に、または間接的に測定するための凍結乾燥した組合せ試薬に関し、この組合せ試薬は、それぞれ実質的に未反応の形態の、測定に必要な試薬の全部および任意のそれ自体既知の一種または二種以上の添加剤よりなり、この組合せ試薬はそれぞれ実質的に未反応の形態で凍結乾燥した組合せ試薬中に含まれる成分の全部を含有する溶液をそれ自体既知の方法により凍結乾燥させることにより調製されるものであり、そしてこの凍結乾燥した組合せ試薬は、たとえば緩衝溶液中における、その再構成時点でその元の活性を実質的に有することを特徴とするものである。

本発明の組合せ試薬は好ましくは、タンパク質加水分解で活性な成分、たとえばプロ酵素、プロテアーゼ活性化物質、補因子またはプロテアーゼ阻害物質あるいはそれらの活性化物質を測定するための一回の分離した一段階基質法を行なうのに充分の量で容器内に収納されている。

従って、本発明の組合せ試薬はプロテアーゼにより分解されて、検出できる応答を生じる基質を含有する。

検出しようとするタンパク質加水分解で活性な成分に応じて、組合せ試薬はまた、通常、次の成分から選ばれる他の試薬を含有する：ゾロ酵素、プロテアーゼ活性化物質、プロテアーゼ阻害物質、この阻害物質の活性化物質およびタンパク質加水分解に対する補因子。

組合せ試薬はまた、好ましくは添加剤、たとえば以下にさらに詳細に説明するような安定化添加剤を含有する。

有用な基質はプロテアーゼにより分解して、検出できる応答を生じることのできる基質の全部である。特に適当な基質は測光により測定できる応答を示す、いわゆる色原性基質である。前記した合成基質、はまた、好ましく使用される。このような基質は、たとえばＫａｂｉ　Ｖｉｔｒｕｍ　ＡＢ　Ｄｉａｇｎｏａｔｉｋａ、Ｍ６１ｎａａ１．Ｓｗｅｄｅｎから、たとえば商品登録名Ｓ　−２２５１（！１−Ｄ−Ｖａｎ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ・２ａｃ１）、Ｓ−２３３７（ｎα −ベンゾイルーエ１ｅ−Ｇｌｕ（ｒ−ピペリジド）　−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ −ＨＯＩ　）、８−２５６６　（＜　Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−ＨＯｌ）、Ｓ−２５９０（Ｈ−Ｄ−Ｖａｎ−Ｐｈｅ−Ｌｙａ−ｐＮＡ−２ＨＣ１）およびＳ−２７３２（Ｎα−スクシノイルーエ１ｅ−Ｇｌｕ−（ｒ−ピペリジド）− Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−ＨＣｌ）として、市販されている。下記の実施例に記載されているこれらの基質に加えて、本発明に有用である別の基質の例を表１に示す。しかしながら、これらの基質は例示されているだけであり、本発明を制限するものではなｈ０特表千１−５０３５９９　（５）本発明は凍結乾燥条件の下で、タンパク質加水分解で活性な成分がそれらの活性を損なわず、たとえば相互に反応せず、しかも再構成後に、それらの元の活性を実質的に回復するような凍結乾燥条件が試薬溶液について確立できるかぎり、基質測定法の基本原則に従い、タンパク質加水分解で活性な成分の検出に一般的に、適用することができる。

従来、α１−アンチトリプシンおよびＦ■の測定用の組合せ試薬を除けば、対象、特に凝血および繊維素溶解の分野における対象の全ての組合せ試薬のための適当な条件を確立することが可能であった。しかしながら、このような条件は追加の実験の後に、これらの組合せに対して確立することができるものである。

本発明は基質測定法に関する前記したタンパク質加水分解で活性な成分の測定に良好に適している。従って、タンパク質加水分解で活性な成分がａ）阻害物質、ｂ）補因子、ｃ）活性化物質またはｄ）プロ酵素よりなる場合に、適当な組合せ試薬は組合せ中のプロテアーゼにより分解させることができる色原性基質とそれぞれ、ａ）プロテアーゼ、ｂ）プロテアーゼおよび測定しようとする補因子の影響の下でプロテアーゼと反応できる反応剤、Ｃ）プロ酵素または他の活性化できる酵素化合物、およびｄ）プロ酵素に対する活性化物質とよりなる。現在、好ましい本発明の詳細な説明用の例から明らかである。

本発明はまた、凍結乾燥組合せ試薬の調製方法に関し、この方法は請求の範囲５に記載されている。

さらに詳細に言えば、本発明は凍結乾燥組合せ試薬の調製方法であって、測定に必要な試薬の全部および任意の一洩または二種以上のそれ自体既知の添加剤を含有する溶液を水のような溶剤中で、試薬が生成する溶液中でおよびまた、引続く溶液の凍結乾燥中に、実質的に未反応のまま残されるような方法で制御した条件の下に生成し、次いでこの溶液をそれ自体既知の方法で、容器内で凍結乾燥させ、その中に試薬が実質的に未反応の形態で含まれており、しかもその中の試薬が、たとえば緩衝溶液中における組合せ試薬の再構成後に元の活性を実質的に有する凍結乾燥組合せ試薬を得ることを特徴とする方法に関する。

凍結乾燥した組合せ試薬中に含まれる試薬の全部を少なくとも一回の凍結乾燥処理に対する、同一溶液中に溶解することは本発明において必須である。この方法は原溶液を先ず、関連試薬の全部を本発明に従う制御された条件の下で調製した場合に、特に藺単に行なうことができ、この場合に、使用できる添加剤をまた含有するこの原溶液を容器内に装入し、次いでこれらの容器内で凍結乾燥させる。

しかしながら、一種または数種の関連試薬および使用できる添加剤を含有する数個の原溶液を調設し、その後、これらの溶液七−緒にして、一つの溶液として、各容器内で同時的に凍結乾燥させることができることは勿論のことである。水は適当な溶剤であり、他の溶剤、たとえば酢酸、メタノールおよびジメチルスルホキシドを添加して使用することもできる。

本発明の適当な態様において、各容器中に導入する溶液（一種または二極以上）の量は一回の試験に対するような量である。微滴定用板などのくぼみまたは凹部は容器として好ましく使用でき、ここに試料を添加し、その後、この容器を臨床分析用の標準装置、たとえば測光計に直接に移すことができる。

本発明において、全ての試薬の溶液の調製または試薬の数種の溶液の組合せの調製における条件を、たとえることによって調整すること、そして（あるいは）通常相互に反応性である成分の混合物を、望ましくないがこの調製において生じることがそれ自体予想される反応を伴なうことなく、凍結乾燥試薬組合せの調製において溶解させることができるような一範囲に、好ましくは緩衝塩を用いて＠整することは必須である。

この条件を如何にして調整するかは試桑組合せ中に含まれる試薬に依存し、下記にさらに詳細に説明する。

このような制御された条件を確立することによって、全ての試薬を一つの溶液中で、本発明に従い同時に凍結乾燥させることができる。最終形態の生成物中の試薬混合物は混合物中に含まれる成分のいずれの特別の隔離を伴なうことなく、凍結乾燥状態で存在し、この混合物は良好な溶解性を有し、この試薬混合物中に含まれている成分の全部の即時的溶解はこの凍結乾燥試薬組合せ用の緩衝液中に溶解した試料をそこに添加することにより達成される。

従って、本発明により、基質測定法の利点の全部を利用することができる生成物が提供され、この生成物によってさらに追加の利点が得られる。たとえば、試料の取り扱すに１回だけのピペット操作ｔ−要するだけであって、数回のピペット操作工程が省かれる。また、正確なインキュベーション時間および反応期間の維持に要するＮ確度に対する叢求が除かれる。さらにまた、実施者の技術的熟練に対する要求が低くなり、また分析の行なうために、この組合せ試薬のための特別の装＆を作る必要もない。

本発明による生成物のもう一つの利点は相当する再＃を成した試薬よりも格別に長す有効寿命を有し、かつまたこの生成物は製造者によう蘭単に標準−化でき、従って通常、標準曲線の作成が必要である同一タイプの従来既知の方法に比較して、試験結果の計算に関して格別に単純な方法が提供される。

本発明の凍結乾燥組合せ試薬は検査用の自動分析機を持っていない、そして（または）検査に適任な人がいない小規模のおよび（または）大規模な診療所において、−回の試験を行なうための現在利用できる装置で通例のとおりに使用するのに極めてよく適している。

さらにまた、本発明による生成物は、測定を局所的な場所で（ベットの横で）行なうことができ、また試薬溶液の調製、標準曲線の作成あるいは対照実験のような予備操作が不必要であるので、緊急の状況下に迅速な答えを得ることを可能にする。

さらにまた、本発明による生成物を使用するこは、現在市販されており、少量の試料の測定には適合しない、または−回の分析を行なうようにデデインされている場合にはその実施に特別の用具を必要とする、「キット」のような製品と比較して、原料および材料を格別に節約するという意味をしばしば有する。

前記で指摘したように、本発明の試薬組合せはプロテアーゼにより分解することができる基質および測定しようとするタンパク質加水分解で活性の成分に応じて追加の他の試薬を含有する。従って、この生成物の調製は、組合せ試薬中に含有させようとする試薬に関して、すなわち測定しようとする活性成分に応じて、制御されている条件の下で行なわなければならない。

このための方法を、現在重要である態様、すなわち阻害物質、補因子、活性化物質およびプロ酵素に関して、以下にさらに詳細に説明する。

■、阻害物質測定用の生成物の論灸方法試料中のプロテアーゼ阻害物質の、量の測定は、当該阻害物質と１＝１−複合体を形成することによって阻害される酵素を既知で、明確に定められた量で試料に加え、次いで過剰の酵素を既知で、明確に定められた量の適当な基質の添加により測定することにもとづいている。

本発明により、酵素および基質を含有する溶液が、溶液中であるいは凍結乾燥工程中に酵素も基質も分解されないように制御されている条件の下で、大規模に製造するのに適した条件の下で調製することができることが見い出された。試薬組合せの胸裏中に酵素が基質と反応せず、しかもこの酵素と基質とのほとんど完全な活性が、凍結乾燥した組合せを、たとえば適当な緩衝液の添加により再構成した後にも得られるということは極めて鴬〈べきことである。

プロテアーゼ阻害物質の測定において、本発明の方法は基質に対する酵素活性が無視できる範囲にあるが、酵素の変性もまたは基質のいずれの加水分解も生じない範−〇−範曲を見い出したことにもとづいている。

この範囲は、好ましくはｐＨ５〜５であり、最も好ましい−は４．２である。この範白内の最適数値はこの方法に使用する酵素および基質に幾分、依存して変わる。

さらにまた、最適−〇調整には、基質−酵素反応におよびまた＃素−阻害物質反応に最適の反応条件、すなわちｐＨ６，５〜９．５を得ることができるように、６．５〜９．５の−を有する慣用の緩衝剤を使用すると有利であり、この緩衝剤の塩は凍結乾燥時に分離させるか１、・′ｐ ″あるｂは分析前に試料ｔｈ製できるようにするために、少量で凍結乾燥後も存在させる。本発明の試薬調製方法に適する緩衝剤はギ酸塩または酢酸塩とそれぞれ混合したギ酸または酢酸のような弱有機酸である。クエン酸、アスコルビン酸などのような同一範囲のｐＫａ値を有する他の醗もまた使用することができるが、これらは格別に安定性に貧しいＰＨが得られることから、一般に低い濃度にする必要がある。

凍結乾燥工程中および引続く試薬混合物の貯蔵期間中における分解を回避するために、そしてまた試料に加えた場合の試薬混合物の迅速な溶解を促進し、試料容器での試料吸収を最少にするために、無機塩、不活性タンパク質、たとえばアルブミン、ａｉ（たとえばマンニトール）および（または）表面活性剤〔たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ、　Ｕｎｉｏｎ　（２ａｒｂｉｄｓ、米国から入手できるＣａｒｂＯＷａｘ■８０００）およびＴｒｉｔＯｎ■Ｘ　−ｉ　Ｑ　Ｑ　（Ｒｏｈｍ　＆　Ｂａ５ｓ、米国）〕のような添加剤を使用すると好ましい。

法例に示されてｂるように、本発明による組合せ試薬を使用することにより得られる優れた結果は、両方の反応、すなわち阻害物質の測定における基質−酵素反応および阻害物質−酵素反応に対して適当である、分析用の反応条件、たとえば −、イオン強度および緩衝塩を見い出すことができることによるものである。

本発明を使用する場合に、基質の選択はまた、極めて重要である。前記で指摘したように、基質はプロテアーゼにより分解され、検出できる応答を生じなければならないことに加え、基質は成る反応毎に、妥当な測定条件、好ましくは１０分より短い反応時間が達成される程度に充分に効果的に酵素と反応するが、醪累分子を阻害物質との反応から防護するのに充分に有効であってはならないと−う観点で選択する。この条件は部分的に、酵素に対する基質の結合能力、癲、で表わすことができ、勉は好ましくは２〜８　Ｘ　１０−’モＭであるべきである。

市販の合成基質、たとえば表１にあげたものおよび実施例に記載のものが通常、使用される。適当な基質濃度は１〜２０　Ｘ　１０−’モル／ｌである。この濃度は酵素濃度とマーカー濃度との間が線状関係にあるように高くあるべきである。一般に、好適な基質濃度は５　Ｘ　１０−’モル／ｌである。

しかしながら、最適基質濃度および基質の親和性は反応混合物中の添加剤によって影響されるので、明確な一般的選択基準は規定できないことを指摘しておかねばならない。

酵素の選択が測定しようとする阻害物質に依存することは勿論のことである。臨床上の対象である多種の阻害物質、たとえばアンチトロンビン（これはヘパリンの存在下にトロンビンまたは因子Ｘａとの反応により測定できる）、アンチプ２スミ／（これはプラスミンを介して測定することができる）、およびカリクレイン阻害物質のような血漿中に生じる数種の重要なプロテアーゼ阻害物質に対する酵素は市販されており、従って、本発明に従い、これらの測定を行なうための凍結乾燥組合せ試薬を調製することができる。

■、補因子測定用生成物の鉤裂方法補因子は酵素反応を生じさせて、かなりの異なるタイプの物質を包含する。ここでは、因子の例として先ず第一に、阻害物質アンチトロンビン、すなわちヘパリンと一緒になって、成る種のセリンプロテアーゼの阻害を開始させる因子、主としてＦＸａおよびトロンビンを取り上げる。ヘパリンおよび類似物質の測定方法は、阻害物質、この場合にはアンチトロンビン、を過剰に加えなければならない点を除いて、前記した阻害物質測定法と同様である。

このために、酵素量は正しい反応条件を得ることができる程度に、相当に増加しなければならない。その他の点では、この方法はアンチトロンビンおよヒ因子Ｘａ　ｆ例として前記した阻害物質測定法と同一原則にもとづいている。従って、方法■に従う阻害物質測定用の組合せ試薬のｈａ方法と同一の条件が適用される。

測定することができるもう一種の補因子はフィブリンモノマーである。これは凝析性酵素により変換される血漿タンパク質であり、酵素ｔ−ＦＡ（７°ラスミノーデンアクテベーター）を介してプロ酵素プラスミノーゲンを活性化する補因子であり、この場合のｔ−ＰＡは活性化物質として作用する。この酵素、すなわち活性化物質をその基質であるプラスミノーゲンおよび活性化生成物、すなわち酵素プラスミンに適する色原性基質とともに凍結乾燥させる。この組合せ試薬の調製方法は前記の阻害物質測定用試薬組合せの調製方法に相当するが、凍結乾燥時に１中性−よりなる−範曲を使用できる点で異なっており、この場合の−は適当には、３〜８．５、好ましくは５〜７である。

■、活性化物質測定用の組合せ試薬のＭＷ方法活性化物質の測定方法は、適当なプロ酵素を活性化されたプロ酵素に適する基質と一緒に、安定性および溶解性を促進する添加剤の存在の下で、前記と同様にして凍結乾燥させる原則にもとづく。さらにまた、成る種の測定方法では反応促進性反応剤の存在が必要であることがある。従って、本発明によれば、たとえばｔ−ＰＡの測定に要求される反応剤、すなわちプラスミノーゲン、プラスミン基質およびフィブリンまたはポリリジンタイプの賦活物質の全部を同時的に凍結乾燥させることができ、しかもそれらの活性を維持することができる。この場合に、上記方法…と同様に、中性ｐＨ’ ！ｒ含む前記条件を使用する。従って、適当な一範囲は６〜８．５、好ましくは６〜７である。

■、プロ酵酵素測定用台せ試薬の調製方法プロティンＣ１プラスミノーデンおよび因子Ｘのようなプロ酵素は、反応剤として使用される活性化物質が相応する活性化されたプロ酵素用の基質の存在の下で迅速に作用するかぎり、一段階態様における基質技法を用いて測定するのによく適している。すなわち、本発明のこの態様に従う方法は試料中に存在するプロ酵素の大部分を数分以内に活性化する活性化物質とともに、基質を凍結乾燥させることを包含する。生成する組合せ試薬はプロ酵素測定用のものであり、この場合に、試料は、この試料中に元から存在していた活性化されたｆｒ：Ｉ酵素の阻害物質が活性化されたプロ酵素とその基質との間の反応に関与しないような低濃度で存在するように稀釈する。

本発明に従い、凍結乾燥は常法で、たとえば０．０８〜０．１５ミリバール（ｍｂａｒ）において、−４５°〜−４０℃、好ましくは一４２°Ｃの温度で、１〜５時間、好ましくは１時間、凍結させ、引続いて、１２〜２４℃、好ましくは２２°Ｃの温度で１２〜２０時間、好ましくは１５時間、乾燥させることによって行なう。

本発明はまた、一段階法における試料、特に全血、血液血漿、崩液血清、脳背髄液、膵液または尿のような生物学的試料中の凝析因子および繊維素溶解因子の定量、牛定量または定性分析において、容器内、好ましくはキュベツト中に収容されている本発明の凍結乾燥組合せ試薬を試料に添加し、次いで受け取られる応答をそれ自体既知の方法で読み取ることによって、この凍結乾燥試薬混合物を使用することに関する。

本発明による方法を、添付図面を引用して、下記の例によりさらに詳細に説明する。これらの例はそれ自体制限するものではない。Ｆｉｇ　１〜９はタンパク質加水分解で活性な、多くの異なる成分に係る標準曲憩を示すものであり、これらの曲線は本発明による適当な凍結乾燥組合せ試薬を用いて、４０５ｎｍの波長で作成したものである。

例　１この例では、プロテアーゼ阻害物質、アンチ因子Ｘ＆の測定用の凍結乾燥組合せ試薬の調製方法およびその使用を説明する。

ａ）水中の０．２Ｍ酢酸と０．２Ｍ酢酸ナトリウムとの混合物５００ゴを蒸留水の添加により１０１００Ｏに稀釈することにより酢酸塩緩衝液１ｏ　ｏ　０ｍ１ｔ−Ｔｈｅする。

０．２Ｍ酢酸３６８ｄおよび０．２Ｍ酢酸ナトリウム１３２ゴを用いることにより４．２の所望のめ値が得られる。

ｂ）組合せ試薬の改善された安定性および増大された溶解性を得るために、アルブミンおよびマンニトールを下記の量で緩衝溶液ａ）に加える。

Ｃ）凍結乾燥用論展物：基質８−２７３２　６５０■／／（０，８ミリそル／ｌ）および因子Ｘａｌ　００Ｑｎｋａｔ（１０００ｎｋａｔ／Ｊ　）を緩衝溶液ａ）に加える。この緩衝溶液ａ）にはＢＳＡ５ｇ＃（０，５％）およびマンニトール１０９／１（１％）が加えられている。

ｄ）アンチ因子Ｘａの測定用の凍結乾燥組合せ試薬の調製：溶液Ｃ）各２００μｌをプラスチック製のマイクロキュベツト（Ｋａｒｔｅｌｌ　Ａｒｔ、　／１６１９３８　）にそれぞれ移す。これらのキュベラ）！−４２ ℃の凍結乾燥機内に１時間入れ、次いで＋２２℃および０．０８〜０．１５ミリバールの圧力で１５時間乾燥させる。

ｅ）アンチ因子Ｘａ測定用のキュベラ）　ｄ）の使用：ＥＤＴＡ　（７，５ミリそル／ｌ）を含有する０、０５モル／ｌＴｒｉｍ　（ｐＨ８，４、ニー　０．２　）中の血漿（１：５００に稀釈）６００μ１１ヘパリン（３工Ｕ　／ｍｌ　）およびＰＥＧ１％を、Ｓ−２７３２（０，１３１Ｖ）　ＦＸａ　（０，２ｎｋａｔ）およびＢＳＡおよびマンニトールよりなる凍結乾燥組合せ試薬を含有するキュベラ）　ｄ）に加える。

添加後の被験溶液の−は８．２である。室温（２５°Ｃ）で、または３７℃で反応を生起させ、８分後に、５％ＡＣＯＨ３００μｌの添加により止める。

次いで、４０５ｎｍにおける溶液の吸光度を測光計で読み取り、この結果を既知量のアンチ因子Ｘａ　ｆ含有する試料と、Ｆｉｇ　ｊａに示されている標準白ｉ！ｊを用いて比較する。このＦｉｇ　Ｉａは組合せ試薬の製造者が予め作成しておいたものである。この曲線は施用量と応答との間の関係を示すものであり、製造者によって計算され、対象アナライトの計算用に使用者により使用されるファクターにもとづいている。

Ｆｉｇ　ｉａから明らかなように、反応は低温依存性であることが見い出された。

アンチトロンビンの測定用の一般に使用され、市販されている「キットＪ　（ｃｏａｔａｓｔＩ３１Ａｎｔｉｚｈｒｏｍｂｉｎ　。

ＫａｂｉＶｉｔｒｕｍ　ＡＢ、　Ｓｗｅｄｅｎ　）に対する相関関係ｔ　Ｆｉｇ　１ｂこの例では、アンチトロンビン測定用の組合せ試薬の調製方法およびその使用を説明する。

ａ）例１と同様にして、アンチトロンビン測定用の、Ｓ　−２！ｌ　６６　（０，１ｍ９）、トロンビン（Ｑ、７　ｎｋａｔ　）およびＢＳＡおよびマンニトールを含有する凍結乾燥組合せ試薬をキュベツト中で調製する。

ｂ）アンチトロンビン測定における組合せ試薬の使用。

例１ｅ）に記載のものと同一の緩衝液中の血漿（１：８０に稀釈）３００μＪｔ −１その内容物が凍結乾燥されているａ）からのキュベツトに加える。反応は３７℃で生じさせ、８分後に、５％酢［３００μ）の添加により止める。測定は例１　ｅ）と同様に行なう。

１１ｇ２に示されている標準曲線が得られる。

の９４ｍ方法およびその使用を説明する。

ａ）例１と同様にして、アンチプラスミン測定用の、５−２２５１　（０，３ｑ）、プラスミ７　（０，３ｎｋａｔ　）およびＢＳＡおよびマンニトールを含有する凍結乾燥組合せ試薬を含有するキュベツトｔｈ製する。

ｂ）この組合せ試薬のアンチプラスミン測定における使用。

メチルアミン０．１５モル／Ｉｆ：含有する０、０５モル／ｌ！Ｔｒｉｏ　（ｐＨ−８−３）中の血漿（１：３０に稀釈）３００μｌをａ）からのキュベツトに加える。キュベツトの内容物は凍結乾燥されている。反応は３７℃で生じさせ、８分後に、５％ＡＣｏａ　３　Ｄ　Ｏμｌの添加により止める。測定は例ｉ　ｅ）と同様にして行なう。７１ｇ３に示されている標準白−が得られる。

上記例はプロテアーゼ阻害物質の測定用の組合せ試薬を説明するものである。次の２例は補因子の測定用の組合せ試薬を例示するものである。

例　４この例では、ヘパリン測定用の組合せ試薬のｐｊＩ４製方法およびその使用を説明する。

ａ）ヘパリン測定用の、ｓ−２７３２（０−２Ｗ）、ＰＸａ　（Ｑ、５　ｎｋａｔ　）およびＢＳＡおよび？　７　二）　−ｈ　ｆ含有する組合せ試薬を含有するキュベラ）１例１と同様にしてｖＩ４裂する。

ｂ）　この組合せ試薬のヘパリン測定における使用。

ＥＤＴＡ　（７，５ミリモル／ｌ）およびＰＥＧ　（ｉ％）を含有する０、０５モル／　ｌ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ＝　８．４、工＝　０．２　）中の血漿（１：１５に稀釈）３００μｌ　ｔ　ａ）からのキュベツトに加える。このキュベツトの内容物は凍結乾燥されている。反応は室温で行なわせ、６分後に、５％酢酸３００μｌの添加により止める。測定は例１８）と同様して行なう。Ｆｉｇ４に示されている標準曲線が得られる。

例　５この例では、フィブリンモノマー測定用の組合せ試薬のｈｈ方法およびその使用を説明する。

ａ）ｓ　２．１５９０（１２Ｉｎ９）およびマンニトール（１９７＃）’ｔ−１０，０１％ＴｗｅｅｎＲ８０ｋ含有する０、０３モル／ｌの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝４．９）７．０Ｍに溶解し、次いで殺菌水Ｑ、１３ｍ１に溶解したヒトＧｌｕ−プラスミノ−ｒ７２．５ｍ９と混合する。生成した溶液に、水Ｑ、５ｍｌに溶解したＢＳＡ　１００１ｎ９および酢酸ナトリウム緩衝液０．１３ｍ１に溶解したｔ−ＦＡ３．（５μｇを加え、その後、追加の緩衝液を加えて、総量を２０ｍ１にする。この最終溶液２００μ）づつをマイクロキュベツトに分配し、例１ｄ）に従い凍結乾燥させる。

ｂ）この組合せ試薬のフィブリンモノマー測定における使用。

０．０１％Ｔｗｅｅｎ”　８０　ｋ含有する０、０６３モル／１Ｔｒｉｅ　（ｐ）Ｉ　−８，５）中の血漿（１：４１に稀釈）３００μｌをａ〕からのキュベツトに加える。このキュベツトの内容物は凍結乾燥されており、５−２３９０（０，１２■）、プラスミノーダン（２５μｇ）およびｔ−ＦＡ　（０，０３６μｇ）および？　７　＝　）　−ル、７ｗｅｅｎ■８０およびＢＳＡ　’ｊＨ含有している。反応は室温で生じさせ、２０分後に、２０％酢酸６００μｌの添加により止める。例ｉ　ｅ）と同様にして測定する。Ｆｉｇ５に示されている標準曲線が得られる。

下記の例は酵素反応の活性化物質を測定するための態様を説明するものである。

例　６ｔ−ＦＡ測定用の組合せ試薬の調製方法およびその使用をこの例で説明する。

ａ）蒸留水１３．５ｍＡに溶解したＳ−２５−２２５１Ｃ９を、プラスミノーダン（１８，７５ＣＵ）おヨヒマンニトール（１５■）を含有する水溶液り、７５ｍＪと混合する。生成する溶液を冷却させ、次いでＣＮＢｒ−消化フィブリン（フィブリノ−ｒン）　（３，７５■）およびマンニトール（１５ｒｎｇ）を含有する水溶液０．７５ｍ１と混合する。この最終溶液２００μｌづつをマイクロキュベツトに分配し、次いで例１　ｃＬ）に従い凍結乾燥させる。

ｂ〕　この組合せ試薬のｔ−ＦＡ測測定おける使用。

０．０１％Ｔｗｅｅｎ■８０＝を含有する０、０５モル／ｌＴｒｉｍ　（ｐＨ＝　８．３　）中の前処理した血漿（１：１２５に稀釈）３００μｌをａ）からのキュベツトに加える。

キュベツトの内容物は凍結乾燥されており、Ｓ−２２５１（１２０μｇ）、プラスミノーダン（０，２５ＣＵ　）およびＣ！ＮＢｒ−消化フィブリン（フィブリノ−ｒン）（５０μｇ）およびマンニトールよりなる。反応は３７℃で生じさせ、２時間４５分後に、２０％Ａｃ　０Ｈ３００μｌの添加により止める。

例１θ）と同様にして測定し、Ｆｉｇ６に示されている標準曲線を得る。

次側では、プロ酵素測定用の態様を説明する。

例　７この例では、因子Ｘの測定用の組合せ試薬の調製方法およびその使用を説明する。

ａ）蒸留水６．５コ中に溶解した５−２３３７（２４１ｎ９）およびマンニトール（１２０ｑ）ｔ、Ｒｕ５ｓｅｌ’ｓ　ＶｉｐｓｒＶｅｎｏｍ　（ＲＶＶ、　Ｍｉａｍｉ　Ｓｅｒｐｅｎｔａｒｉｕｍ　Ｌａｂｓ、米国）（０，９ダ）およびＮａｃｌ（６０ダ）を含有する水溶液３．５ｍｌと混合する。生成する溶液にＯａｋ！１２の溶液（０，１モル／１１）を、全量が２０ゴになるまで加える。

この最終溶液２００μｊづつ七マイクロキュベツトに分配し、次いで例１　ｄ）に従い凍結乾燥させる。

ｂ）この組合せ試薬の因子Ｘの測定における使用。

Ｐｏ１ｙｂｒｅｎｅ■（２０ｍｙ／　ｌ　ｚ　Ａｌｄｒｉｃｈ　％米国）を含有する０、０５モル／ｉ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ＝　７．８　）中の血漿（１：６０に稀釈）６００μｌ　’ｋ　ａ）からのキュベツトに加える。このキュベツトの内容物は凍結乾燥されており、５−２３３７（０，２４ｍ９）およびＲＶＶ　（９ｐ９　）ナラＵ　Ｋマンニトール、ＣａＣｌ２およびＮａＣ１よりなる。

反応は３７℃で生じさせ、３分後に、２０％Ａｃｏｎ２００μｌの添加により止める。例ｉ　ｅ）と同様に測定し、Ｆｉｇ７に示されている標準曲線を得る。

例　８この例では、プラスミノーデン測定用の組合せ試薬の調製方法およびその使用を説明する。

ａ）ｓ−２２５１（５０ｒｎｇ）を蒸留水１６ｍ１ＶＣ溶屑し、次いでストレプトキナーゼ（８００００１Ｕ）およびアルブミン（２０％）１２ｍ９に含有する溶液４ゴと混合する。生成する最終溶液２００μｌづつをマイクロキュベツトに分配し、次いで例１　ａ）に従い凍結乾燥させる。

ｂ）この試薬のプラスミノーデン測定における使用。

０．０５−Ｆ−ル／　ｌ　Ｔｒｉｓ　（ｐＨ−７，４およびニー０．０５）中の血漿（１：２０に稀釈）３００μｌをａ）からのキュベツトに加える。このキュベツトの内容物は凍結乾燥されており、５−２２５１（０，３ｍｇ）およびストレプトキナーゼ（８００ＸＵ　）ならびにアルブミンよりなる。反応は３７℃で生じさせ、３分後に、５％Ａｃ０Ｈ３００μｌの添加により止める。例１θ）と同様に測定し、Ｆｉｇ１３に示されている標準曲線を得る。

この例では、プロティンＣ測定用の組合せ試薬の調製方法およびその使用を説明する。

ａ）Ｂ−２３６６（１２Ｔｎ９）を蒸留水１９．５５ｍ１に溶解し、次いでＰｒ０ｔａｃ”　ｃ−溶液（１０Ｕ／１ｉＺ）、Ｐｅｎｔａｐｈａｒｍ、　５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ　）　Ｑ、４５　ｍｌを加える。生成する溶液２００μ！づつをマイクロキュベツトに分配し、次いで例１　ａ）に従い凍結乾燥させる。

ｂ）この組合せ試薬のプロティンＣ測定における使用。

０．１％ＰＥＧを含有する０、０２５モル／　１Ｔｒｉ８（ｐＨ−８，４）中の血漿（１：１１に稀釈）３００μｊｔａ）からのキュベツトに加える。このキュベツトの内容物は凍結乾燥されており、ｓ　−２３６６（０，１２１ｖ）およびｐｒｏｔａｃ■ｃ　（０，０４５Ｕ　）よりなる。反応は３７℃で生じさせ、７分後に、２０％ＡＣＯＨ３００μｌの添加により止める。例１ｅ）と同様に測定し、７１ｇ９に示されている標準曲線を得る。

これらの例において、使用されてｂる略語は下記の意味を有するＢＳＡ　ウシ血清アルブミンＴｒｉｓ　）リス（ヒＶロキシメチル）−アミノメタンＥＤＴＡ　エチレンジアミンテトラ酢酸ＰＥＧ　ポリエチレングリコールＡｃＯＨ酢酸Ｔｗｅａｎ”　８０　ポリオキシエチレンノルピタンモノオレエ　−　）　（Ａｔ１ａｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　工ｎｄｕｓｔｒｉｅｓ。

ＵＳＡ　）Ｇｌｕ　グルタミン酸ｔ−ＰＡ　プラスミノーデン活性化物質Ｓ−２２５１１ｉ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ −Ｌｙｅ−ｐＮＡ・２ＨＣＩ８２３３７　Ｎａ−ペンゾイルーエ１ｅ−Ｇｌｕ　（ｒ−ピペリジド）　−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−ＨＣＩｓ−２５６６＜Ｇｌｕ −Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−ＨＣＩＳ−２３９０Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ−２ＨＣＩ５２７３２　Ｎａ−スクシノイルーエｍ５−Ｇｌｕ　（ｒ −ピペリジド）　−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−Ｈｃｌ−ｐＮＡ　ｐ−ニトロアニリドＡ４ｏ５４　Ｑ　５　ｎｍにおける吸光度’ｎｋａｔ　ノナケタル（１ケタル！特定の条件下における、１秒当りで基質１モルを分解する酵素活性の量）性化するＰｒ０ｔａｃ■の量図面に示されている標準白線は、好ましくは組合せ試薬の製造者により、相当する実施例で行なわれた測定と同様に、各標準曲線を使用して、被測定成分を種種の既知量で含有する試料についてＡ４゜５の測定により得られたものである。

辷滋楠司ｒｒ　ｒｓ　０００Ａ４０５Ａ！４０５４０ＳＬＯ５国際調査報告＋ｍ−−−＋−＠ｍａｅ−−１−−ｈｌＰＣＴ／ＳＥ８８１００３２６

Claims

【特許請求の範囲】

１．容器内に収納された凍結乾燥組合せ試薬であつて、そしてプロテアーゼにより分解されて検出できる応答を生じる、該組合せ試薬中に含まれている基質の分解よつて、タンパク質加水分解で活性な成分を直接にまたは間接的に測定するための凍結乾燥組合せ試薬であつて、この組合せ試薬は検出に必要な試薬の全部および任意のそれ自体既知の一種以上の添加剤を、実質的に未反応の形態で含有しており、そして該凍結乾燥組合せ試薬中に含まれる全部の成分を実質的に未反応の形態で含有する溶液をそれ自体既知の方法で凍結乾燥させることによつて調製されたものであり、そしてこの凍結乾燥された組合せ試薬は緩衝溶液中で再構成された時点で実質的にその元の活性を有することを特徴とする凍結乾燥組合せ試薬。
２．一回の測定用の量の上記組合せ試薬がその内部容積が分割されていない容器内に収納されており、この容器は好ましくは応答検出用の測定装置で直接に使用できるものであることを特徴とする、請求項１に記載の組合せ試薬。
３．ａ）阻害物質、ｂ）補因子、ｃ）活性化物質またはｄ）プロ酵素よりなる、タンパク質加水分解で活性な成分の測定用の組合せ試薬であつて、プロテアーゼにより分解させることができ、好ましくは色原性基質である基質および使用できる添加剤に加えて、ａ）プロテアーゼ、ｂ）プロテアーゼおよび該プロテアーゼと被測定補因子の影響の下で反応することができる反応剤、ｃ）プロ酵素または活性化できる酵素化合物、またはｄ）プロ酵素のための活性化物質を含有することを特徴とする、請求項１または２に記載の組合せ試薬。
４．１）アンチ因子Ｘａ、２）ヘパリン、３）フィブリンモノマーまたは４）プロテインＣ測定用の組合せ試薬であつて、１）因子Ｘａ、Ｎα−スクシノイル− ｌｅ−Ｇｌｕ（γ−ピペリジド）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−基質、ウシ血清アルブミンおよびマンニトール；２）因子Ｘａ、Ｎα−スクシノイル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（γ−ピペリジド）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−基質、ウシ血清アルブミンおよびマンニトール、３）プラスミノーゲン、Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ −ｐＮＡ−基質、ｔ−ＰＡ、マンニトール、表面活性剤およびウシ血清アルブミン、または４）プロテインＣ−活性化物質および＜Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ−基質よりなることを特徴とする、請求項３に記載の組合せ試薬。
５．組合せ試薬中に含まれており、プロテアーゼにより分解させて、検出できる応答を生じることができる基質の分解により、直接または間接にタンパク質加水分解で活性な成分を測定するための請求項１に記載の凍結乾燥組合せ試薬の調製方法であつて、該測定に必要な試薬の全部および任意のそれ自体既知の一種以上の添加剤を含有する溶液を容器内で水のような溶剤中において、該試薬が生成する溶液中で実質的に非反応性であるような様相に制御されている条件の下で調製し、引続いて、この溶液を凍結乾燥させることよりなり、該溶液は容器内でそれ自体既知の方法で凍結乾燥させ、その中に存在する試薬が実質的に未反応の形態で含まれており、かつまた、その中に存在する試薬が該組合せ試薬を緩衝溶液などの中で再構成した後に、実質的に元の活性を有する凍結乾燥組合せ試薬を得ることを特徴とする調製方法。
６．凍結乾燥工程において、容器が一回の測定に適する量の溶液を含有しており、該容器はその内部容積が分割されていないものであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
７．条件を、好ましくは緩衝剤により、補因子または活性物質測定用の組合せ試薬を調製する場合には、３〜８．５のｐＨ値に制御し、そして阻害物質またはプロ酵素測定用の組合せ試薬を調製する場合には、３〜５のｐＨ値に制御することを特徴とする、請求項５または６に記載の方法。
８．凍結乾燥を、０．０８〜０．１５ミリバール（ｍｂａｒ）において、−４５ °〜−４０℃、好ましくは−４２℃の温度で１〜５時間、好ましくは１時間凍結させ、引続いて、１２〜２４℃、好ましくは２２℃の温度で１２〜２０時間、好ましくは１５時間、乾燥させることにより行なうことを特徴とする、請求項５、６または７に記載の方法。
９．上記溶液が不活性タンパク質、たとえばアルブミン；糖、たとえばマンニトール；および（または）表面活性剤、たとえばポリエチレングリコールなどの添加剤を含有することを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の方法。
１０．組合せ試薬を、ａ）阻害物質、ｂ）補因子、ｃ）活性化物質またはｄ）プロ酵素よりなる、タンパク質加水分解で活性な成分を測定するために調製し、そして該組合せ試薬の凍結乾燥させる溶液がプロテアーゼにより分解させることができる基質および使用できる添加剤に加えて、ａ）プロテアーゼ、ｂ）プロテアーゼおよび被測定補因子の影響の下でプロテアーゼと反応することができる反応剤、ｃ）プロ酵素または活性化できる酵素化合物、またはｄ）プロ酵素のための活性化物質、を含有することを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の方法。
１１．請求項１に記載の凍結乾燥組合せ試薬の、試料、特に全血、血液血漿、血液血清、脳背髄液、肺液または尿のような生物学的試料中に存在する凝析因子および繊維素溶解因子を一段階法で、該試料を、容器内、好ましくはキユベツト内に収納されている該凍結乾燥組合せ試薬に添加し、次いで生じる応答をそれ自体既知の方法で読み取ることによる定量、半定量または定性分析における使用。