JPS596898A - アミノペプチダ−ゼ活性測定法およびそれに用いる合成基質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、下記一般式　〔Ｉ〕 ４ （ただし式中、Ｒはヒドロキンル基または−Ｎ＜恥で表
わされる基、Ｒ１はＬ−ロイシル基、Ｒ２または島は水
素原子または低級アルキル基、Ｒ４は水素原子、低級ア
ルキル基またはカルボキシル基を示す）で表わされるア
ミド化合物またはその塩を基質とする被検液中のアミノ
ペプチダーゼの新規な活性測定法に関し、またアミノペ
プチダーゼ活性測定に有用な新規な下記式　〔■〕（た
だし式中、ＲＩは前記と同じ意味を有する）で表わされ
るＬ−ロイシル−４−アミノアニリドまたはその塩に関
する。

本発明の一般式〔Ｉ〕で表わされるアミド化合物および
それに包含される式ＣＩ［］で表わされる新規化合物で
あるＬ−ロイシル−４−アミノアニリドは、ロイシンア
ミノペプチダーゼＣＴｒｕｅ　Ｌ　Ａ　Ｐともいう〕ア
リルアミダーゼ（０１ｉｎｉｏａｌ　ＬＡＰともいう、
以下時としてＡＡと称する）などのアミ　、ノペブチダ
ーゼ（以下、Ｔｒｕｅ　Ｌ　Ａ　Ｐと０１ｎｉｏａｌ３
− ＬＡＰを併せて単に、ＬＡＰと称する）の活性測定用基
質として有用な化合物である。

ＬＡＰは生体内のあらゆる組織に広く分布し、血清中に
も存在するもので、病的条件によって増加することが知
られており、臨床検査の対象となっている。その臨床化
学的分析値としてＧ−Ｒ単位（ＧｏｌｄｂａｒｇＲｕｔ
ｓｎｂｕｒｇ）を使用し、Ｇ−Ｒ単位＝２．７２　Ｘｌ
、ＡＰ国際単位（ｍＵ／ｄ）としている［　０ａｎｃｅ
ｒ、　１１．２８３　（１９５８）　］。

ＬＡＰ活性の測定法としては種々知られているが、いず
れも一長一短があり、現在一般に用いられている測定法
としては、Ｌ−ロイシンとアミン化合物よりなる合成基
質を用いてＬＡＰの酵素作用により生成されるアミン化
合物の比色定量法が知られている。この比色定量法にお
いては一般に、合成基質としてＬ−ロイシル−ｐ−ニト
ロアニリドを用い、ＬＡＰの酵素作用により生成するｐ
ｒ−二トロアニリンの黄色を比色して測定されている。

しかしながら、この場合、合成基質の吸収波長とｐ−ニ
トロアニリンの測定波長がオーバーラツプするため測定
値が正確でないという欠点があり、また血清成分、特に
ビリルビン系色素による測定への影響も免れることがで
きない欠点があった。

また、Ｌ−口イシル−β−す７チルアミドを基質として
用いる場合には、生成するβ−ナフチルアミンに、５−
ニトロ−２−アミノメトキシベンゼンジアゾテートなど
をカップリングさせて色素を形成させるか、または生成
するβ−ナフチルアミンを亜硝酸ナトリウムでジアゾ化
し、Ｎ−（１−ナフチル）−エチレンジアミンにカップ
リングさせるか、もしくはｐ−ジメチルアミノベンズア
ルデヒドまたはｐ−ジメチルアミノケイ皮アルデヒドを
縮合させて色素を形成せしめるかして、これら生成物を
比色定量して測定する方法が知られて゛いる。しかしこ
れらの比色定量法は、反応過程が複雑で、かつ厳密な操
作を必要とするために、検査法としてはなお不便なもの
であった。また標準物質のβ−ナフチルアミンは、毒性
が著しく、膀胱の腫瘍および癌を発生することが近年明
らかとなったり、発癌物質であるため、この使用に特に
　４− 厳密な注意を要するものであった。その他、酵素を用い
るＬＡＰ活性の測定法としては、その基質としてＬ−ロ
イシンアミド（Ｌ　−Ｌｅｕｏｉｎａｍｉｄｅ　）を用
い、ＬＡＰにより生成したアンモニアを、α−ケトグル
タール酸、グルタミン酸脱水素酵素および還元型ニコチ
ンアデニンジヌクレオチドＣＮＡ　Ｄ　Ｈｇ）と反応せ
しめてグルタミン酸に変化せしめ、この際に反応系のＮ
ＡＤＨ２の減少を分光学的に追跡する方法が知られてい
る。またＬ−ロイシル−Ｌ−アラニンを基質として用い
た場合には、ＬＡＰの作用により生じたＬ−アラニンを
、α−ケトゲルタール酸、グルタミン酸−ピルビン酸を
生成させ、さらにこのピルビン酸を乳酸脱水素酵素を用
いて乳酸に変化せしめ、その際に消費されるＮＡＤＨ２
を分光学的に追跡する方法も知られている。さらにＬ−
ロイシン脱水素酵素を用いる測定法も知られている。即
ち、Ｌ−ロイクルーグリシンなどの基質を用いて、ＬＡ
Ｐにより生成したＬ−ロイシンにＬ−ロイシン脱水素酵
素を反応させ、その際に変化するＮＡＤＨｇを分光学的
に測定する方法である。（特開昭５４−１１９２９０号
）。

壕だ、Ｌ−ロイシンアミドを基質として用い、生成する
Ｌ−ロイシンをＬ−アミノ酸酸化酵素を用いて反応させ
、反応系に生ずる過酸化水素を比色定量する測定法も知
られている「ファルマシア、１４．８７２（１９７８）
］。

しかしながら、これらの酵素を用いる公知の測定法は、
反応系が複雑であり、また比色測定法であるために、血
清中のビリルビン系色素などや乳濁血清などの白濁の影
響も大きく、そのために必ずブランクを取らねばならな
い。特にＬ−アミノ酸酸化酵素を用いる測定法において
は、ＬＡＰによって生成するＬ−ロイシンの１に比べて
相当量のＬ−アミノ酸が血清中に存在しており、かつこ
の血清中のＬ−アミノ酸含量も栄養剤や食事等の摂取に
より著しく変化するために、ＬＡＰにより生成するＬ−
ロイシンの定量には血清中の多量のＬ−アミノ酸の影響
が着しく強く現われ、Ｌ−ロイシンの定量が困難である
、等の欠点があった。

本発明者らの一部は、先に従来のＬＡＰ活性測定法を改
善すべく研究した結果、Ｌ−ロイシンを種々の置換メチ
ルアミン化合物またはＤ−アミノ酸化合物との結合化合
物であるアミド化合物を得、これをＬＡＰ活性測定用の
合成基質として用い、この合成基質にＬＡＰ活性測定用
被検液を作用せしめ、次いで反応によって生成、遊離し
た置換メチルアミン化合物またはＤ−アミノ酸化合物に
対応する酸化酵素であるアミンオキシダーゼまたはＤ−
アミノ酸オキシダーゼを作用せしめ、次いでこの酸化酵
素によって消費された酸素の量または生成された過酸化
水素の量またはアンモニアの量を定量することによるＬ
ＡＰ活性測定法を完成した（％開昭５６−１４４０９７
号公Ｎ）さらに本発明者らは、ＬＡＰ活性測定法に関し
て鋭意研究した結果、全く意外にも、血清中に存在しな
い樵々のフェニレンジアミン化合物、Ｐ−ヒドロキシア
ニリンや３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリンなど
のアニリン系化合物をＬ−ロイシンに結合せしめて得ら
れた一般式［１）で表わされるアミド化合物がＬ　Ａ　
Ｐにより着しく良好に　７− フニレンジアミン化合物、ｐ−ヒドロキシアニリンや３
−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリンなどのアニリン
系化合物を遊離、生成する良好な合成基質であることを
知った。さらにこの合成基質にＩ、ＡＰを作用せしめて
生成するこのフェニレンジアミン化合物、ｐ−ヒドロキ
シアニリンや３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリン
などのアニリン系化合物に、アスコルビン酸オキシダー
ゼまたはラッカーゼなどの酵素を作用させると酸素を消
費し、色素を生成することを知り、この消費された酸素
の量または生成された色素の量を定量することによりＬ
ＡＰの活性測定法を簡便になし得る新規な測定法を見い
出した。また、特にＬＡＰを含有する被検液とその酸化
酵素とを同時に用いて反応せしめてなる一段反応にてき
わめて簡便に測定し得ることを知った。また、この合成
基質にＬＡＰを作用せしめ、さらにこれにナトリウムペ
／タシアノアコ７エリアー）　Ｎａｇ　（Ｆｅ　（ＯＮ
）５　・ＨｇＯ］を作用せしめて発色生成物を形成せし
め、この発色生成物の量を定量することによりＬＡＰの
活性一台− 測定が行なえることを見い出した。

本発明は、上記の知見に基いて完成されたもので、下記
一般式　［１〕 ４ （ただし式中、ａ　Ｘ　Ｒ１％　Ｒ４は前記と同じ意味
を有する）で表わされるアミド化合物またはその塩を基
質とし、これにアミノペプチダーゼ活性測定用被検液を
作用させた後反応生成物たるアニリン系化合物に作用し
て少なくとも酸素を消費して色素を生成する酸化酵素を
作用せしめ、次いで反応によって消費された酸素の量ま
たは生成した色素の量を定量することを特徴とするアミ
ノペプチダーゼ活性測定法、および下記式　［Ｉ［］（
ただし式中、Ｒ１は前記と同じ意味を有する）で表わさ
れるＬ−ロイシル−４−アミノアニリドまたはその塩で
あり、ＬＡＰの新規な活性測定法および有用な新規な合
成基質を提供するものである。

まず本発明に用いられる下記一般式〔Ｉ〕■４ （ただし式中、ＲＸＲ＋およびＲ４は前記と同じ意味を
有するうで表わされるアミド化合物（以下アミド化合物
［１］と称す）は、Ｌ−ロイシン（（ただし式中、Ｒお
よびＲ４は前記と同じ意味を有する）で表わされるアニ
リン系化合物（以下、アニリン系化合物〔■〕と称す）
を結合せしめて得られるものである。

このアミド化合物〔Ｉ〕を製造するに当っては、ペプチ
ド合成のための常法手段に従って、Ｌ−ロイシンとアニ
リン系化合物［■〕との結合反応により行なわれる。

反応に際しては、必要に応じて官能基が保護される。保
護基としては、ペプチド合成反応において汎用される通
常の保護基が挙られる。例えばＬロイシンのα−アミン
基は通常の保護基例えばｔ−ブトキシ力ルボニル、ｔ−
アミルオキシカルボニル、アダマンタチルオキシカルボ
ニル、ベンジルオキ７カルボニル、０−ニトロフェニル
チオ、ニトロ置換ベンジルオキシカルボニル基などにて
保護すればよい。カルボキシル基は、例えば酸アジド、
酸無水物、酸ハｐゲナイドー酸、酸イミダゾリドまたは
活性エステル、例えばシアンメチルエステル、ｐ−ニト
ロフェニルエステル、２．４−ジニトロフェニルエステ
ル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒド
ロキン７タル酸イミドエステルなどに変換することによ
って、あるいはカルボジイミド、Ｎ、Ｎ’−カルボニル
−ジイミダゾールまたはイソオキサゾリウム塩、例えば
ウッドソード反応剤などにより活性化せしめる。

　１１　− さらにこの活性化した化合物とアニリン系化合物［ＩＩ
Ｄとを反応せしめる。

好ましい縮合反応手段としては、上述したようにカルボ
ジイミド法、アジド法、酸ハロゲナイド法、活性エステ
ル法や酸無水物法である。また反応に当っては不活性溶
媒、例えばジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミ
ド、ジメチルスルホキサイド、テトラヒドロフランなど
の溶媒中にＬ−ロイシンとアニリン系化合物［１１１］
の両者はぼ等モル１を溶解し、約−３０℃〜室温中にて
攪拌すればよい。一般に反応は３０分〜５０時間で完了
する、反応後、α−アミノ基の保護基を脱離せしめる。

脱離反応は好ましくはｔ−ブトキシカルボニル基の場合
では２Ｎ−ＨＯＩの酢酸溶液やトリフルオロ酢酸を用い
て、またはベンジルオキシカルボニル基の場合ではパラ
ジウム−炭素を用いる接触還元手段またはＨＢｒの酢酸
溶液を用いて行われる。目的物は分離手段、例えば抽出
、洗浄、クロマト操作、結晶化など操作により得ること
ができる。さらに目的物は、塩形成に適する酸、例え　
１２− ば塩酸、臭化水素酸、リン酸などの無機酸、ギ酸、酢酸
、プロピオン酸、シュウ酸などの有機酸と反応させるこ
とによって相当する塩を形成することができる。

また本発明のアミド化合物〔■〕を得るに当って用いら
れるアニリン系化合物［１１１）としては、フエ＝ｖ：
、ｙ、）アミン化合物＋ｐ−ヒドロキシアニリン＼３−
カルボキシ−４−ヒドロキシアニリンがあげられる。例
えばｐ−７エニレンジアミン、Ｎ−Ｎ−ジメチルーｐ−
７エニレンジアミン、ＮｌＮ−ジエチル−ｐ−フェニレ
ンジアミン（ｐ−ジエチルアミノアニリン）、２−メチ
ル−４−Ｎ−Ｎ−ジエチルアミノアニリン、Ｎ−Ｎ−ジ
−ｎ−プロピル−ｐ−フェニレンジアミンやｐ−ヒドロ
キシアニリン、３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリ
／などがあげられる。

さらに上記のアミド化合物〔Ｉ〕がらＬＡＰの作用によ
り生成されるアニリン系化合物に作用して酸素を消費し
て色素を生成する酸化酵素としては、このアニリン系化
合物に作用して反応において少なくとも酸素を消費して
色素を生成する酸化酵素であればよく、例えばアスコル
ビン酸オキシダーゼまたはラッカーゼなどがあげられる
。

またこれらの酵素は限定されるものではないが、例えば
アスコルビン酸オキシダーゼとしてはカポチャ、キュー
リやハヤトウリ（特開昭５６−８８７９３号公報）など
から得られた酵素があげられ、またラッカーゼとしては
例えばウルシや担子菌コリオラス・ベルンカラー、リゾ
ンプス属に属する生産菌やポリポラス・ベルシカラー［
Ｊ、　Ｂｉｏａｈｅｍ。

５０．２６４．（１９６１）、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｌｏ
ｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、７３．　２０４　（１９３６）　
〕にょる酵累があげられる。

さらにこれらの酵素は固定化酵素として使用してもよい
。この場合には、自動分析装置へ組み込んで測定を行な
うことが可能となり、酸素電極にて電気化学的変化とし
て測定を行なうことにより、高価な酵素の使用を著しく
少量ならしめる。さらに酵素電極たる固定化酵素と上記
電極とを組み合わせた七／サーとして用いることにより
、迅速に、しかも種々の試薬も必要とせず、さらに繰り
返し測定に利用でき、さらにまた有色物質を含むＬＡＰ
活性測定用試料にも適用できる。固定化酵素とするには
、公知の種々の固定化手段が使用できる。

好壕しくけ、アクリルアミドで包括固定化する方法、ア
ルブミンなどの蛋白質と共に混合した彼、蛋白質同士を
架橋して固定化する方法、ロラーゲンやフィブロインな
どに包括するか、またはこれを共有結合せしめて固定化
する方法、多孔性有機高分子樹脂に吸着または共有結合
にて固定化する方法、光硬化性樹脂を用いて包括固定化
する方法などの種々の包括、吸着、結合等の手段が用い
られ、その固定化酵素の形状としては、酵素電極用の形
として使用に好ましい膜状繊維状物、粒状またはチュー
ブ状として加工使用される。

次にＬＡＰ活性測定の例をあげる。まず合成基質として
のアミド化合物［１）の一定濃度溶液を調整し、これに
、ＬＡＰ活性測定用試料、例えば血清、および緩衝液を
加えて反応せしめる。反応は通常３７℃近辺にて行なえ
ばよく、反応時間とし−？５− てはＬＡＰにより合成基質からアニリン系化合物が生成
される時間であれば特に限定されるものではなく、通常
１分以上であればよい。反応後、ＬＡＰＫより生じたア
ニリン系化合物に作用して酸素を消費し、色素を生成す
る、例えばアスコルビン酸オキシダーゼなどを加えて酸
化せしめる。その際、酵素反応によって酸素が消費され
色素が生成されればよいのであって、通常は酵素の溶液
を添加して反応せしめるか、または固定化酵素に接触せ
しめて反応を進行せしめればよい。この反応も通常３７
℃近辺にて行なわれる。反応により消費される酸素の量
の定量は、好ましくは酸素電極により測定されるが、上
記固定化酵素と電極とを組み合せてなる酵素電極として
使用することによってより簡便に行なわれる。さらにこ
れらの電極によって測定された値は電気化学的変化とし
て、必要に応じて記録するか表示し、ＬＡＰ活性値とし
て換算すればよい。

また生成された色素の定量に当っては、その色素の特異
的吸収波長による吸光度測定である比色１８一 定量法に基くことが簡便である。またその特異的吸収波
長としては、形成される色素の吸収波長を公知の手段に
より測定した後決定すればよく、例えば３５０〜３８０
ｎｍの範囲や５００ｎｍ〜６００ｎｍの範囲の特異的吸
収波長をもって行なう。

次に、ＬＡＰ活性測定のための系の一例を述べる。この
測定系は、反応槽−検出槽からなるものであって、ＬＡ
Ｐ活性測定用試料、合成基質溶液、反応媒体たる緩衝液
を注出口よりＬＡＰ反応檜（合成基質よりアニリン系化
合物を生成せしめるためのもの）に導き、さらに反応に
よって生成したアニリン系化合物を酸化せしめるための
酸化酵素を作用せしめ、酸素の量を検出することにより
測定がなされる。この反応−検出槽において、好ましく
は対応する酸化酵素の固定化酵素カラム部と検出のため
の電極部とを分離してもよい。あるいは、電極部の検知
部に固定化酵素をつけた酵素電極部として一体化したも
のであってもよい。さらに、ＬＡＰ反応槽と反応−検出
槽とは一対の系に限定されるものではなく、例えば複数
のＬＡＰ反応槽よりサンプリング装置にて順次反応−検
出槽に測定サンプルを注入し、順次検出、洗浄を繰り返
すことによりなる２以上のＬＡＰ反応槽と反応−検出槽
を有する測定系であってもよい。

以上詳述したように、本発明方法は、各反応工程が温和
な酵素反応であり、一段反応にて簡便にＬＡＰ活性測定
がなし得るものである上に、測定の自動化が容易になし
得るものであって、従来の化学的発色法の二段反応では
不可能であったレイトアッセイを可能にしたものである
。

次いで本発明の実施例をあげて具体的に述べるが、本発
明はこれらによって何んら限定されるものではない。

なお、本明細書中の記載の略記号は、次の意味を有する
ものである。

Ｂｏａ　：　ｔ−ブトキシカルボニル Ｌθｕ：Ｌ−ロイシン ＨＯ８ｕ　：　Ｎ−ヒドロキ、シスクシンイミド：［（
ｏＢｔ　：　１−ヒドロキシベンゾトリアゾール０８ｕ
　：　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルＤＯＯ：
Ｎ、　　Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド’Ｉ’
ＨＦ　：テトラヒドロフラン ＤＯＵ　：　Ｎ、　Ｎ’−ジシクロへキシルウレアｎ　
−ＢｕＯＨ：　ｎ−ブチルアルコールＦｌｔＯＨ：エチ
ルアルコール ＡｃＯＨ：酢酸 ＤＭＦ　＋ジメチルホルムアミド 隅侃；Ｎ−メチルモルホリン ２：ペンジルオキシカルボニル基 実施例１ （１）Ｂｏａ−ロイシル−４−ｔ−ブトキシカルボニル
−アミノアニリドの合成 りｏａ　−Ｌｅｕ−ＯＨ（ｌｓ、０９　ｔ、　２２ｍＭ
）、Ｂｏｏ　−て−５〜θ℃でＩ）００（４，１３ｒ、
２０ｍＭ）含有！ＨＦ　（５０ゴ）溶液を滴下した。室
温で一晩攪拌して、ＤＯＵを除きＴＨＦを留去した。次
いで残渣を酢酸エチル（３００ｍ）にとかして、冷しＮ
　１９− −Ｈｏｔ、水、飽和ＮａＨＯＯ３溶液、飽和食塩水（各
５０ｄＸ３　）で洗浄し無水Ｍｇ８０４で乾燥した。酢
酸エチルを留去し、得られた結晶を酢酸エチル／ヘキサ
ンで再結晶した。

収量＝８．８９ｆ（６０，５％） 融点：１０８−１１０℃ 〔α几　−−２９，０’　（０＝ＬＯ，１ｉ１ｔＯＨ）
、Ｒｆ＝０．７６（クロロホルム；酢酸エチル＝　４　
：　１）元素分析値［０１２２Ｈ３５Ｎ３０５（４２１
，５４１）として〕００％　Ｎ％　　Ｎ％ 測定値　：　６２．．６４　　ｇ、６４　　９．８１計
算値　：　　６１９　８．４０　　９．９７赤外部吸収
スペクトル　第１図の通り （２）Ｌ−ロイシル−４−アミノアニリド・二塩酸３　
ｍ　Ｍ　）に室温で２　Ｎ−４（Ｏｔ／ＡｏＯＨ（１４
ｄ　）を加えて１時間攪拌した。無水エーテル（６０Ｉ
Ｉ＋７りを加えて結晶化させた後Ｆ取して減圧乾燥した
。

　２１　− 　２０− 収量：５８０■（６氏７％） 融点：１９０−１９３℃ 〔α〕讐−＋３１．２　（０−１，０，Ｉ！ｔｏ■）Ｒ
ｆ　＝　０．４８　（ｎ　ＢｕＯＨ：　ＡｏＯＨ：水−
４；１：１）元素分析値Ｃ０１２Ｎ１９　Ｎ３０・２Ｉ
（Ｏｔ・τＨｇＯとして〕０％　　Ｎ％　　Ｎ％　　０
２％ 測定値　　４６．８６　　１．５’ｌ　　１８．５５　
２＆４５計算値　　４６．６　　　’７．３９　１８．
５９　３ｍ９Ｂ赤外部吸収スペクトル　第２図の通り 実施例２ Ｌ−ロイシル−４−アミノアニリドに対するロイシンア
ミノベブテダーゼおよびアミノペプチダーゼの作用 り一ロイフルー４−アミノアニリド・二塩酸塩を０．１
　Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ’７．０）に溶解して基質溶
液（５０ｍ　Ｍ　）とした。この基質溶液５ｏｐｔに、
それぞれ日イシンアミノペプチダーゼ（ベーリンガー社
製、　　１００　ｕ／ｍｇ）　５μｔまたはアリルアミ
ダーゼ（ベーリンガ社製、１１ｕ／ｄ）５μｔを加えて
３７℃で反応させた。各反応時間毎の反応液を、アミノ
化ガラスに固定化せしめた固定化Ｌ−アミノ酸オキシダ
ーゼ（％願昭５５−５７１８０号明細書参照；　Ｃ！ｏ
１１ｅｔｏｔｒ土ｃｈｕｍ　８Ｐ０Ｍ　５０７３由米の
Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ）カラム１（２×３０ｕ）と
７０−セル２付き酸素電極３を具備した装置を用いて基
質の分解塵を測定した。その装置のフローダイヤグラム
を第３図に示す。即ち、３７℃に加温した０、１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）を有する緩衝液槽４から流速１
ゴ／分の条件にて定量ポンプ５にて送り、固定化Ｌ−ア
ミノ酸オキシダーゼカラム（０，５ｕ／７担体）１を介
するフローセル２内の溶存酵素が安定になった後、その
固定化Ｌ−アミノ酸オキシダーゼカラムに、上記各反応
時間毎の反応液１０μＬを注入パルプ６を介して注入し
た。注入後、合成基質の分解により生成したＬ−ロイシ
ンの固定化Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ作用による酸素の
減少量を、フローセル２内の酸素電極３により測定し、
これを増巾器７により電気的変化として測定し、記録計
８にて酸素消費率として記録し、合成基質に対するロイ
シンアミノペプチダーゼおよびアリルアミダーゼの作用
の相違を求めた。その結果を第４図に示した。図中〇−
〇はロイシンアミノペプチダーゼの定量曲線・−・はア
リルアミダーゼの定量曲線を示す。

すなわち、本発明の合成基質は、臨床上、重要とされテ
イルアリルアξダーゼ（０１１ｎｉｏａｌ　ＬＡＰ）に
対して良く作用する事が示された。

実施例３ Ｌ−ロイシル−４−アミノアニリド、ナトリウムペンタ
シアノアコ７エリアートを用いるＬＡＰ活性測定法 り一ロイシルー４−アミノアニリド・二酸塩を０、１　
Ｍ　Ｉ）ン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解して基質溶液
（２ｍＭ　）とした。この基質溶液１−に患者血清（２
０名）２０μｔを加え、３７℃、１５分間インキュベー
トし、反応後、１％−ナトリウムペンタシアノアコフェ
リアート３０ｄに０．２　Ｍ　ｌｉｌ　Ｄ’ＦＡ（ｐＨ
１１）溶液９０−を加えて調製した溶液４ゴを加え、３
７℃、１５分反応させた。反応後６８０ｎｍの波長にて
吸光度を測定した。

２３− 別にＬＡＰ活性既知の血清（セラクリアＮ、　　１２２
Ｇ−１’Ｌ単位、日本商事社製）を用いて同様に操作を
行い、上記の患者血清中のＬＡＰ活性値を算出した。

また、上記の測定法の比較として、既知のＬＡＰ活性測
定法（ヤトロン社製、イアトロセラ）ＬＡＰＸＲＭＩ　
５４−Ｋ　）により、上記の血清を用いてそのＬＡＰ活
性の測定を行った。

その結果は第５図に示す通りであり、その相関係数はγ
＝　０．９７１であった。第５図に示す通り、本発明に
おけるＬ−ロイシル−４−アミノアニリドは、人血清中
のＬＡＰ活性を適格にとらえることのできる良好な合成
基質であると認められた。

１％−ナトリウムペンタシアノアコフェリアートは、１
％−二トロプルシツドナトリウムＮａ［Ｆθ（ＯＮ）５
ＮＯ：］　−１１％炭酸ナトリウムを１５分間、紫外線
照射して作製した。

実施例４ Ｌ−ロイシル−４−Ｎ−Ｎ−ジエチル−アミノアニリド
、アスコルビン酸オキシダーゼを用いる２４− ＬＡＰ活性測定法 り一ロイシルー４−Ｎ−Ｎ−ジエチル−アミ／アニリド
・二塩酸塩を０．１　Ｍ　！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７、０
）に溶解して基質溶液（２，５ｍＭ）とした。

この基質溶液Ｌ　５　ｔｎｌにハヤトウリ由来のアスコ
ルビン酸オキ／ダーゼ（％開昭５６−８８７９３号公報
）１００μｔ（１３０Ｕ）および血清（ＬＡＰ活性６０
０　Ｇ、Ｒ，単位）５０μｔを加えて３７℃で反応させ
た。各反応時間ごとに発色する色素を５５０ｎｍの波長
にて吸光度を測定した。

その結果を第６図に示した。第６図に示す通り、本発明
における測定法は、人血清中のＬＡＰ活性を適格にとら
えることのできる方法であり、さらに、従来の化学発色
法と比べ、ＬＡＰの反応が始まると同時に、反応液が呈
色してくるため、レートアッセイが行える特徴を有する
。第７図は上記と同様の反応を行ない、生成した色素の
吸収波長を示す。

実施例５ Ｌ−ロイフルーアミノアニリド、アスコルビン酸オキシ
ダーゼを用いるＬＡＰ活性測定法り一ロイシルー４−ア
ミノアニリド・二塩酸塩を０．１　Ｍ　１３ン酸緩衝液
１ｐＨ７，０）に溶解して基質溶液（２５ｍＭ）とした
。この基質溶液２ゴにハヤトウリ由来のアスコルビン酸
オキシダーゼ１００μｔ（１３０Ｕ）および血清（ＬＡ
Ｐ活性６００Ｇ、　Ｒ６単位）５０μｔを加えて３７℃
で反応させた。

各時間毎に発色する色素を５１０ｎｍの波長にて吸光度
を測定した。

その結果を第８図に示した。第８図に示した通り、本発
明の測定法は人血清中のＬＡＰ活性を適格にとらえるこ
とができた。

第９図は上記と同様に行なって生成した色素の吸収波長
を示す。

実施例６ Ｌ−ロイシル−４−アミノアニリド、ラッカーゼを用い
るＬＡＰ活性測定 り一ロイシルー４−アミノアニリド・二塩酸塩を０．１
　Ｍ　！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解して基質溶
液（２５ｍ　Ｍ　）とした。この基質溶液２−に、ポリ
ポラス・ベルシカラー（ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ　ｖｅｒ８
１００１０ｒ　）由来のラッカーゼ１００μｔ（８００
Ｕ／ｍｔ）およびアリルアミダーゼ（ベーリンガー社製
、６００Ｇ−Ｒ単位）１００μｔを加えて３７℃、６０
分間反応させた。６０分反応後の発色した色素を５５０
ｎｍの波長にて吸光度を測定したところ０．Ｄ５５０＝
０．０８であった。本発明の測定法は、ＬＡＰ活性をと
らえることができた。

実施例７ Ｌ−ロイクルー４−Ｎ−Ｎ−ジメチルアミノアニリド、
アスコルビン酸オキシダーゼを用いるＬＡＰ活性測定 り一ロイシルー４−Ｎ−Ｎ−ジメチルアミノアニリド・
二塩酸塩を０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７゜Ｏ
）に溶解して基質溶液（２５ｍＭ）とした。この基質溶
液２ゴに、ハヤトウリ由来のアスコルビン酸オキシダー
ゼ１００μｔ（１３０Ｕ）およびアリルアミダーゼ（ベ
ーリンガー社製、６００Ｇ−Ｒ単位）１００μｔを加え
て３７℃で、６０分間反応させた。その６０分後の発色
した色素を５５０２７− ｎｍの波長にて吸光度を測定したところＯ，Ｄ５５０＝
　０．０９であった。本発明の測定法はＬＡＰ活性をと
らえることができた。

実施例８ Ｌ−ロイシル−４−Ｎ−Ｎ−ジ−ｎ−プロピルアミノア
ニリド、アスコルビン酸オキシダーゼを用いるＬＡＰ活
性測定 実施例７のＬ−ロイシル−４−Ｎ−Ｎ−ジメチルアミノ
アニリドの代りにＬ−ロイシル−４−Ｎ−ジ−ｎ−プロ
ビルアミノアニリド・二塩酸塩を用いた以外は同様に行
なった。６０分反応後の発色した色素を５５０ｎｍの波
長にて吸光度を測定したところ０．Ｄ５５０　＝０．０
７５であった。本発明の測定法はＬＡＰ活性をとらえる
ことができた。

実施例９ Ｌ−ロイシル−４−Ｎ−Ｎ−ジエチルアミノアニリド、
ラッカーゼを用いるアミノペプチダーゼ活性測定 り一ロイシルー４−Ｎ−Ｎ−ジエチルアミノアニリド・
二塩酸塩を０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，０）
　２８　− に溶解して基質溶液（１５ｍ　Ｍ　）とした、この基質
溶液１．５−にポリポラス・ベルシカラー由来のラッカ
ーゼ１００μｔ（８００Ｕ／ｄ）およびアミノペプチダ
ーゼ（ペーリンガー社製、１２００Ｇ−Ｒ単位）１００
μｔを加えて３７℃で反応させた。各反応時間毎に発色
する色素を５５０ｎｍの波長にて吸光度を測定した。そ
の結果を第１０図に示した。第１０図に示す通り、本発
明における測定法は、アミノペプチダーゼ活性を適格に
とらえることのできる方法であり、さらに、従来の化学
発色法と異なり、アミノペプチダーゼの作用が始まると
同時に反応液が呈色してくるため、レートアッセイが行
なえる特徴を有したものであった。

また、第１１図は上記と同様の反応を行ない、生成した
色素の吸収波長を示す。

実施例１０ Ｌ−ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノアニリド、
ラッカーゼを用いるアミノペプチダーゼ活性測定 り一ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミンアニリド・
二塩酸塩を０．１　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液（ｐ　ｉ（７，
０、）に溶解して基質溶液（２，５ｍＭ）とした。この
基質溶液１．５−にボリボラスペルシカラー由来のラッ
カーゼ１００μｔ（８００Ｕ／ｍｌ）およびアミノペプ
チダーゼ（ペーリンガー社製、１２００Ｇ−Ｒ単位）１
００μｔを加えて３７℃、３０分反応させた。

その３０分後の発色した色素を５５０ｎｍの波長にて吸
光度を測定したところ０．Ｄ５５０　＝　０．２８であ
った。本発明の測定法は、アミノペプチダーゼ活性をと
らえることができた。

実施例１１ Ｌ−ロイシル−ｐ−ヒドロキシアニリド、ラッカーゼを
用いるアミノペプチダーゼ活性測定り一ロイシルーｐ−
ヒドロキシアニＩＪ　）”ヲ０．１Ｍ　ｌｊン酸緩衝液
（ｐＨ７，０）に溶解して基質溶液（２，，５ｍＭ）と
した。この基質溶液１５−に、ポリポラス・ベルシカラ
ー由来のラッカーゼ１００μｔ（８００Ｕ／ｍＡ）およ
びアミノペプチダーゼ（ベーリンガー社製、１２００Ｇ
−１’Ｌ単位）１００μｔを加えて３７℃、３０分間反
応させた。その８０分後の発色した色素を３７０ｎｍの
波長にて吸光度を測定したところ、０．Ｄ；３６０＝０
．１４であった。

本発明の測定法は、アミノペプチダーゼ活性を捕えるこ
とができた。

実施例１２ Ｌ−ロイシン−３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリ
ド、ラッカーゼを用いるアミノペプチダーゼ活性測定 り一ロインルー３−カルボキシー４−ヒドロキシアニリ
ド・塩酸塩を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７、０）に溶
解して基質溶液（５％５ｍＭ）とした。

この基質溶液２−に、ボリボラスペルシカラー由来のラ
ッカーゼ１００μｔ（８００Ｕ／ｄ）およびアミノペプ
チダーゼ（ベーリンガー社製、１２００Ｇ−Ｒ単位）１
００μｔを加えて３７℃、３０分間反応させた。その３
０分後の発色した色素を５００ｎｍの波長にて吸光度を
測定したところ０．Ｄ、５０（１＝　０．３２であった
。本発明の測定は、アミノペプチダーゼ活性を捕えるこ
とができた。

実施例１３ Ｌ−ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノアニリドの
合成 三級ブトキシアルボニル−Ｌ−ロイシン−水和物１５．
ＯｆとＮ、Ｎ−ジメチル−ｐ−７エニレンジアミン２．
．７９のジクロメタン懸濁液に、Ｉ）００１４．９ｒの
ジクロメタン溶液を攪拌下部下し溶媒を留去した。残留
物を、塩化水素２２ｔを含んだ酢酸エチルに加えると結
晶が生じた。これをメタノールから再結晶した。Ｌ−ロ
イ’／に−４−ＮＮ−ジメチルアミノアニリド・二塩酸
塩、白色針状晶（メタノールイソプロピルアルコール〕
、融点　１９３〜７℃（分解）。

収量　８．６９（収率５５．１％） 元素分析：〔Ｃｌ４Ｈ２３Ｎ３０・四ｏｔ−１／４Ｈ２
ｏトシテ〕０％　　Ｎ％　　Ｎ％ 計算値　５Ｌ４６　　７．８７　１２．８６実測値　５
１．１８　７．６９　１８．０６：［Ｒ（Ｎｕｊｏｌ）
ｍ　　、　１６８７．１６１５（０Ｏ−ＮＨ−、）実施
例１４ Ｌ−ロイシル−４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノアニリド塩
酸塩の合成 Ｐ−ジメチルアミノアニリン１．８０　ｆ　（１１ｍＭ
）を’［’ＨＦ１０＃Ｉ／に溶解サセテ、ＮａＨＯＯ３
０，８４ｔ（１０ｍ　Ｍ　）を水１０　ｍｌに溶がした
ものを加えた。

０℃に冷却してＢｏ：ｏ　−Ｌｅｕ　−０８ｕ　８．２
８　ｆ　（１０ｍＭ）をジオキサン２０−に溶かして滴
下した。

室温で３時間攪拌後、減圧で留去して残液に酢酸エチル
１５０ｍＡを加えて水（５０ｓｄＸｌ）洗いし、無水Ｍ
ｇＳＯ４で乾燥した。その後酢酸エチルを留去し残渣を
シリカゲルのカラム（５０ｒ）にチャージし、クロロホ
ルム：酢酸エチル−４：１の溶媒〇−に溶解して室温で
２時間攪拌、無水エーテルを加えて結晶化させた。メタ
ノール／エーテルより再結晶した。

（ｄ）、ｃα〕七’　−＋　３０．５°（０−１、Ｍｓ
ＯＨ）、ＴＬＯ（ｎＢｕＯＨ：ＡｃＯＨ：Ｈ２０＝４　
：　１　：　２　）、Ｒｆ＝０．３５ 元素分析：　Ｃ０１６Ｈ２７Ｎ３０・２ＨＯ２として〕
０％　　　Ｎ％　　　Ｎ％ 測定値：　　５４．７９　８．３０　１１．９５計算値
：　５４．８６　８．３４　　１１．９９実施例１５ Ｌ−ロイシル−２−メチル−４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミ
ンアニリドの合成 実施例１３のＮ、　　Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジ
アミンの代りに、２−メチル−４−Ｎ、　Ｎ　−ジエチ
ルアミノアニリン８．６ｖを用いて同様に操作し、Ｌ−
ロイシル−２−メチル−４−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノア
ニリド・二塩酸塩を得た。

融点：１８４〜６℃ 元素分析：　ＣＣ１ｑ　Ｈ２９ＮｓＯ・２ＨＯ１として
〕０％　　Ｎ％　　Ｎ９６ 計算値：　　５６．０４　８．５８　１１．５３笑測値
：　　５５．７４　８．４１　　１１．２７ＩＲ（Ｎｕ
ｊｏｌ）ｃｒｎ−１：　１６８５，１６２０（−００−
ＮＨ−）実施例１６ −　祁　− り一ロインルー４−Ｎ、Ｎ−ジーｎ−プロピルアミノア
ニリドの合成 実施例１３のＮ、Ｎ−ジメチル−ｐ−フェニレンジアミ
ンの代りにＮ、Ｎ−ジ−ｎ−プロピル−ｐ−フェニレン
ジアミン８．８１を用いて、同様に操作し、Ｌ−ロイシ
ル−４−ジ−ｎ−プロピルアミノアニリド・二基酸塩白
色粉末を得た。

融点＝１６３〜７℃ 元素分析：　［Ｏｒｇ　Ｎ３１　Ｎ３０・２ＨＯ７とし
て〕０％　　Ｎ％　　Ｎ％ 計算値：　　５７．１４　８．７９　１１．１０実測値
：　　５ａ８９　８．７２　　１１．０５ＩＲ（Ｎｕｊ
ｏｌ）ｃｍ　”：　１６９０，１６２０（＝００−ＮＨ
−）実施例１７ Ｌ　−口（’／ルーｐ−ヒドロキシアニリドの合成りｏ
ａ　−Ｌｅｕ−ＯＨ１０，Ｏｆ　（０，０４モル）をＤ
ＭＦ８０−に溶解し、−５℃〜Ｏ℃に保ちながらこれに
Ｄ００８．３ｆ（α０４モル）をＩ）Ｍ１＋’３０−に
懸濁した液を激しく攪拌しながら加えた。加え終ってか
らさらに２０分間同温度にて攪拌をつづけた。次に液温
を同温度に保ったまま、ｐ−アミンフェノール４．４９
（０，０４モル）をＤ　Ｍ　Ｆ　８８ｍ１に溶解した溶
液を約３０分間を要して滴下し、さらに３時間攪拌を続
けた。次に酢酸数滴を加え、室温で３０分間攪拌した後
、副生じた不溶性のＤｏｕｔ−ｐ別し、溶液を減圧下に
濃縮乾固する。Ｂｏａ−Ｌｅｕ−ＯＨのｐ−ヒドロキシ
アニリドを黒褐色油状物として得た。これを精製するた
めにエチルエーテル１５０ゴを加えて溶解し、１０％ク
エン酸水溶液１００−づつで３回、１％炭酸ナトリウム
水溶液１００ＩＩ＋７！づつで３回、飽和食塩水１００
ゴづつで２回、順次洗浄し、芒硝を用いて乾燥した。

次に、溶媒を減圧下に濃縮乾固すると微桃色油状物を得
た。

此の物質のＮ−保論基であるＢｏａ基を外して最終目的
物を得るために、先に得た微桃色油状物にトリクロル酢
酸１２０−を加えて溶解し、１０分後浴媒を４０℃以下
にて減圧濃縮乾固した。残留する油状物を水３ｔに溶解
し、炭酸ナトリウム粉　３６− 末を用いてｐＨ８〜９に調整した彼、酢酸エチル３００
−を用いて３回（計９００ｍ）抽出を行い、酢酸エチル
層を芒硝を用いて乾燥後、減圧下に溶媒を蒸発乾固した
。残留する結晶を水より再結晶し、白色針状晶を得た。

収量５．８　ｆ　（４２％／理論）。

融点　１３氏９〜１３　？、　０℃ 窒素含量　０１２　Ｎ１１３　Ｎ２０Ｂに対し　実験値
１２５２％理論値１１６０％ 〔α〕名’＝＋８６．６７（ＩＮＨＯｔ、０＝３　）実
施例１８ Ｌ−ロイシル−３−カルボキシ−４−ヒドロキシアニリ
ド・塩酸塩の合成 ５−アミンサリチル酸７．７９　（０，０５モル）とト
リエチルアミン１４　ｍ　（０，噛１０モル）をＤＭＦ
１００ｍ７！に溶解し、これに、Ｂｏｏ　−Ｌｅｕ　−
０８ｕ　９．９ｔ　（０，０３％ル）をＴＨＦ　１５０
−に溶解した溶液を一５〜０℃にて１時間にわたり滴下
、次いで攪拌上常温にて更に１８時間反応させた後、溶
液を留去し、酢酸エチル３００ｍを加え残渣より可溶分
を抽出し、酢酸エチル層を冷５％塩酸、水、飽和食塩水
にて洗浄後、硫酸マグネシウム／活性炭上にて脱色乾燥
した。酢酸エチルを留去して、１区８ｔを得た。

融点：１６８〜１７０℃ 元素分析値：　Ｏ＋ａＨｇ４Ｎｇ　０４　（分子量３６
ｆＬ４）ＯＨＮ 実測値　　５８．９０　　？、２２　　７．７５計算値
　　５９．０１　　？、１５　７．６５薄層クロマトグ
ラフィ： Ｒｆ値　α３９　（０ＨＯｔ３　：　ＭｅＯＨ：ＡａＯ
Ｈ：　ＨｊＯｔ　（０，０２７−ｒ−＃　）を１４　Ｎ
　−ＨＯｔ／ＡａＯＨ３０ｄに溶解させ、常温で２時間
反応させ、Ｂｏｏ−基を除去した。これを乾燥エーテル
５００−に加えると白色沈澱が生じ、これをｐ取乾燥し
て、定量的に所望のＬ−ロイシン−３−カルボキシ−４
−ヒドロキシアニリド・塩酸塩（８，５ｒ　）を得た。

融点：２１７℃（分解） Ｒｆ値：　０．７０ （ｎ−ＢｕＯＨ：ＡｏＯＨ！Ｈ２０＝　４　：　１　：
　１　）元素分析値：　０１３１１１９　Ｎｇ　０４０
４・”／ＢＨａＯ（分子量３１１．７８３　） ＨＮ 実測値：　　５０．１１　６．４４　８．８７計算値：
　　５０．０４　　＆、４７　８．９８

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られたＢｏａ−ロイシル−４−ｔ
−ブトキシカルボニル−アミノアニリドの赤外部吸収ス
ペクトルを示し、第２図は実施例１で得られたＬ−ロイ
シル−４−アミノアニリド・二塩酸塩の赤外部吸収スペ
クトルを示し、第３図は本発明の合成基質を用いる測定
装置の７０−ダイヤグラムを示し、 １；アミン化ガラスに固定化したＬ−アミノ酸オキシダ
ーゼカラム ２ニア０−セル ３：酸素電極 ４：緩衝液槽 ５：定量ポンプ ６：試料流入バルブ ７：増巾器 ８：記録針 縞４図はＬ−ロイシル−４−アきノアニリドを用いるロ
イシンアミノペプチダーゼとアクリルアミダーゼの定量
曲線を示し、第５図はＬ−ロイシル−４−アミノアニリ
ドによるＬＡＰ活性測定値と公知のＬＡＰ活性測定キッ
トとの相関図を示し、８６１３１Ｇ；ｔＬ−ロイシル−
４−Ｎ、　Ｎ−シェｆ、Ｉ＋／アミノアニリド、アスコ
ルビン酸オキシダーゼを用いるＬＡＰ活性測定曲線を示
し、第７図は実施例４における生成色素の吸収波長の曲
線を示し、第８図はＬ−ロイシル−４−アミノアニリド
とアスコルビン酸オキシダーゼを用いるＬＡＰ活性測定
曲線を示し、第９図は実施例５における生成色素の吸収
波長の曲線を示し、第１０図はＬ−ロイシル−４−Ｎ、
Ｎ−ジエチルアミノアニリドとラッ　４０− カーゼとを用いるアミノペプチダーゼ活性測定曲線を示
し、第１１図は実施例１０における生成色素の吸収波長
の曲線を示す。 ０　　　２　　　４　　　６　　　８　　　１０（９５
） ７０　１４０　　２１０　２８０３５０ヤトロン矢ソト
　（Ｇ−Ｒ隼佐） （市販） ｔｏ　　　　２０　　３０ （仝） ４８０　　５２０　　５６０ 弐艮（ｎｍ） 第８図 ＋０　　　２０　　　３０　　４０　　　５０　　　６
０（令） ４２０　４６０　５００　５４０　５８０ミ皮長　（ｎ
ｍ） 反応晴間　　（介） 波長　　　（ｎｍ）

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記一般式　〔ｌ） ４ （ただし式中、Ｒはヒドロキシル基または一−Ｎ　＜　
   ”４ｇで表わされる基、Ｒ１はＬ−ロイシル基、Ｒ２ま
   たはＲ３は水素原子または低級アルキル基、Ｒ４は水素
   原子、低級アルキル基またはカルボキシル基を示す）で
   表わされるアミド化合物またはその塩を基質とし、これ
   にアミノペプチダーゼ活性測定用被検液を作用させた後
   反応生成物たるアニリン系化合物に作用して少なくとも
   酸素を消費して色素を生成する酸化酵素を作用せしめ、
   次いで反応によって消費された酸素の量または生成した
   色素の量を定量することを特徴とするアミノペプチダー
   ゼ活性測定法。
2. （２）酸化酵素が、アスコルビン酸オキシダーゼまたは
   ラッカーゼである特許請求の範囲第１項記載の測定法。
3. （３）消費された酸素の量の定量が、酸素電極による電
   気化学的定量である特許請求の範囲第１項記載の測定法
   。
4. （４）生成した色素の量の定量が、呈色色素の特異的吸
   収波長による吸光度測定（比色定量）である特許請求の
   範囲第１項記載の測定法。
5. （５）下記式　ＣＩＩ） （ただし、式中Ｒ１はＬ−ロイシル基を示す）で表わさ
   れるＩ７−ロイシル−４−アミノア＝ｌＪ）”ｔたはそ
   の塩。