JPH0458898A - トリペプチド及びそれを用いるアンギオテンシン変換酵素の活性測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、一般式 ％式％（１） （式中、Ａは旧Ｓ又はＡｌａ　、　Ｂはしｅｕ又はＡｌ
ａで表わされるアミノ酸である）で表わされるトリペプ
チドに関する。またさらに、本発明は、前記−般式（１
）で表わされるトリペプチド、フェニルアラニンオキシ
ダーゼとアンギオテンシン変換酵素を含む液体とを混合
し、生ずる過酸化水素を定量することによりアンギオテ
ンシン変換酵素（以下ＡＣＥと省略する）の活性の測定
をする方法に関する。

（従来の技術） ＡＣＥは！内においてアンギオテンシン■に作用し、そ
のＣ−末端のジペプチドすなわちＬ−ヒスチジル−し−
ロイシンを遊離させ、血圧上昇作用のある活性型のアン
ギオテンシン■を生成する酵素である。このアンギオテ
ンシン■は、レニン・アンギオテンシン系あるいはキニ
ン・カリクレイン系と関連して血管平滑筋に作用し血圧
を調節する作用、腎臓に作用してアディティブの分泌を
促す作用を有し生体内で重要な役割を担っている。また
、ＡＣＥ活性の測定は、サルコイド−シスの診断にも重
要な項目となっている。

従来のＡＣＥの測定方法は、（１）放射性同位元素を用
いる方法（ＲｒＡ）（２）蛍光を用いる方法（３）液体
クロマトグラフィーによる方法等が知られているものの
、使用場所が限られること、抽出等の煩雑な操作を必要
としていること、低感度であること等の欠点を有してい
た。そこで基質としてＸ−ヒプリルーＬ−ヒスチジルー
Ｌ−ロイシン又はＸ−ヒブリルーし一グリシルーし一グ
リシン（Ｘは水酸基でなる）と、ピプリカーゼ、ペルオ
キシダーゼ、４−アミノアンチピリン及び過酸化水素を
用いＡＣＥを含有する液体と混合し生成するキノンイミ
ン色素の濃度を比色法で測定することによるＡＣＥ活性
の測定方法が見い出された（特公昭５８−２３０８０号
、特公昭５９−３５５９３号参照）。この方法は前記し
た従来の各方法に比べて特別な測定機器を使用せず簡単
な操作でＡＣＥの活性を測定する方法である。

（発明が解決しようとする問題点） しかしながら基質としてビプリル酸誘導体を用いる前記
した方法は、反応が２ステツプであり操作が煩雑である
こと、反応時間が２０分間と長いこと等現在測定に求め
られている自動分析機器に対応した方法ではなく多量検
体の測定ができなかった。また生成する色素の測定波長
が５０Ｏｒ＋ｍ付近であるため、血清中に存在し５００
ｎｍ付近に吸収のあるビリルビンやヘモグロビンなどの
影響を受けやすいという欠点を有していた。

（問題点を解決するための手段） 本発明者は、前記一般式（１）で表わされるトリペプチ
ドが基質として従来の欠点を解決した新たなＡＣＥ活性
の測定法に用いることができることを見い出し本発明を
完成した。

本発明における前記一般式（１）で表わされるトリペプ
チドは、アミノ末端がフェニルアラニンで表わされるト
リペプチドであり、具体的には、Ｐｈｅ−旧ｓ　−Ｌｅ
ｕ　５Ｐｈｅ−＾１ａ　−Ａｌａ　、　Ｐｈｅ　−Ｈｌ
ｓ−Ａｌａ又はＰｈｅ　−Ａｌａ−Ｌｅｕである。

本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基、溶媒
等は当該技術分野で慣用されている略号、或いは、ＩＵ
ＰＡＣ−ＩＵＢの命名委員会で採用された略号を使用し
ている０例えば下記の略号が使用される。また、アミノ
酸はＬ型を意味するものとする。

Ａｌａ　　：アラニン 旧Ｓ　：ヒスチジン Ｌｅｕ　　：ロイシン ＥＤＴＡ　：エチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム
塩 ＤＣＣ：Ｎ、Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミドＺ
（ＯＭｅ）　：　ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニ
ル基 本発明のトリペプチドは、先ずペプチド化学において通
常用いられる方法、例えば、５ｃｈｒ６ｄｅｒａｎｄ　
Ｌ；ｂｋｅ著「ザ　ペプチド（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ）　Ｊ第−巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　＋　
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、　Ｕ、Ｓ、＾。

Ｎ９６５年）、泉屋信夫ら著「ペプチド合成の基礎と実
験」丸善（株）（１９８５年）などに記載されている方
法である液相法及び固相法によって製造することができ
る。

ペプチド結合を形成するための縮合方法として、アジド
法、酸クロライド法、酸無水物法、混合酸無水物法、Ｄ
ＣＣ法、ＤＣＣ−アディティブ法、活性エステル法、カ
ルボニルジイミダゾール法、酸化還元法、ウッドワード
試薬Ｋを用いる方法等が挙げられる。

縮合反応を行なう前に、それ自体公知の手段により、反
応に関与しないカルボキシル基、アミノ基等を保護した
り、また反応に関与するカルボキシル基、アミノ基を活
性化してもよい。

カルボキシル基の保護基としては、例えば、メチル、エ
チル、ベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｔ−ブチル、シ
クロヘキシル等のエステルを挙げることができる。

アミノ基の保護基としては、例えば、ベンジルオキシカ
ルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、イソボルニル
オキシカルボニル基、９−フルオレニルメトキシカルボ
ニル基等を挙げることができる。

カルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、
対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール
（例えば、ペンタクロロフェノール、２．４−ジニトロ
フェノール、シアノメチルアルコール、ｐ−ニトロフェ
ノール、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−
ジカルボキシイミド、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、
Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、１−ヒドロキシベンゾト
リアゾール等）とのエステル〕等が挙げられる。アミノ
基の活性化されたものとしては、例えば、対応する燐酸
アミドが挙げられる。

反応は、通常溶媒中で行なわれ、例えば、クロロホルム
、ジクロルメタン等のハロゲン化炭化水素類、酢酸エチ
ル等のエステル類、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジ
メチルスルホキシド等の極性有機溶媒、ジオキサン、テ
トラヒドロフラン等のエーテル類、メタノール、エタノ
ール等のアルコール類、ピリジン、水等の溶媒、又は、
これらの混合物中で行なうことができる。

反応温度は、一般に使用される約−３０°Ｃ〜約５０°
Ｃの範囲で行なうことができる。

本発明のペプチドの保護基脱離反応は、使用する保護基
の種類によって異なるが、ペプチド結合に影響を与えず
、保護基が除かれることが必要である。

保護基の脱離方法としては、例えば、塩化水素、無水フ
ッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスル
ホン酸、トリフルオロ酢酸、又は、これらの混合物等に
よる酸処理が挙げられるが、この他に、液体アンモニア
中ナトリウム、パラジウム炭素による還元等も挙げられ
る。上記酸処理による脱保護基反応においては、アニソ
ール、フェノール、チオアニソールの如きカチオン捕捉
剤の添加が有効である。

二のようにして製造された本発明のトリペプチドは、反
応終了後、それ自体公知のペプチドの分離手段、例えば
、抽出、分配、再沈殿、再結晶、カラムクロマトグラフ
ィー等によって収得することができる。

また、前記一般式（Ｉ）で表わされるトリペプチドは、
塩として酸付加塩及び塩基性塩を挙げることができる。

このような酸付加塩としては、無機酸（例えば、塩酸、
硫酸、燐酸等）又は有機酸（例えば、酢酸、プロピオン
酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、シュウ酸、メタンス
ルホン酸等）等の塩が挙げられる。また、塩基性塩とし
ては、ナトリウム塩、カリウム塩、トリエチルアミン塩
等が挙げられる。

本発明の測定方法は、前記一般式（Ｉ）で表わされるト
リペプチドをＡＣＥを含む液体例えば血清等の体液と混
合することにより生成するフェニルアラニンを、フェニ
ルアラニンオキシダーゼにより分解し、生ずる過酸化水
素を定量する方法である。この本発明の測定反応式を式
−２に示す。

式と二重 オキシダーゼ （式中、ＰＯＤはパーオキシダーゼを表わす。）′この
式−２において用いられるし一フェニルアラニンオキシ
ダーゼは、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄ。

ａ＋ｏｎａｓ　）属に属する細菌より得られた酵素であ
り、Ｌ−フェニルアラニンに対して高い特異性を示しＬ
−フェニルアラニンを分解する酵素である（特開昭５７
−１４６５７３号参照）。

本発明の方法では、上記式−２に示したように、生成す
る過酸化水素を定量することにより、目的とするＡＣＥ
の活性を知ることができる。過酸化水素の定量法として
は従来知られているＰＯＤを用い、例えば４−アミノア
ンチピリンとトリンダー試薬との縮合による発色を測定
する方法（Ｋ。

Ｔａｍａｏｋｕ　　ｅｔ　　ａｌ、　　Ａｎａｌ、　　
Ｃｈｉ＋＊、　　Ａｃｔａ、　　１３６．　　ヱ２ｌ−
１２７（１９Ｂ２）　　）、ロイコ色素を用い発色を測
定する方法（特開昭６０−２２０８５９号、特開昭６０
＝２１８０６９号参照）等を用いることができる。

具体的なトリンダー試薬としてはＮ−エチル−Ｎ−（２
−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメト
キシアニリンナトリウム（以下ＤＡＯ５省略する）、Ｎ
−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル
）−ｍ−アニシジン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル
−ｍ−アニシリジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキ
シ−３スルホプロピル）アニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−Ｎ
−スルホプロピルアニリン、Ｎ−スルホプロピル３．５
−ジメトキシアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホプロピル）　−３，５−ジメチルアニ
リン、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメ
チルアニリン、Ｎ−エチルＮ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）−ｍ−ルイシン、Ｎ−エチル−Ｎ−ス
ルホプロピルｍ−トルイジン等を挙げることができる。

このトリンダー試薬の中でも、ＤＡＯ３は４−アミノア
ンチピリンとの縮合により生ずるキノンイミン色素が波
長５９０ｎｍ付近に吸収を持つことにより、生体内に存
在するビリルビン、ヘモグロビン等の影響を受けること
が少なく、好適に用いることができる。又、ロイコ色素
の具体例としては、ロイコクリスタルバイオレット、ロ
イコマラカイトグリーン、特開昭５６−１４５３５２号
及び同５８−４５５５７号に開示されているロイコ色素
等である。

本発明のＡＣＥ測定の実施方法を４−アミノアンチピリ
ン及びＤＡＯ３をもって説明する。

前記一般式（１）で表わされるトリペプチドを５ｍＭ〜
２０ｍＭ、Ｌ−フェニルアラニンオキシダーゼを５０〜
２００　Ｕ／Ｌ、４−アミノアンチピリンを０．２ｍＭ
　〜１ｍＭ、ＤＡＯ３Ｏ１１ｍＭ〜２ｍＭを含む緩衝液
（例えばホウ酸緩衝液ｐ）ｌ＝８．３．０．７Ｍ　−Ｎ
ａ　Ｃ１，）　、Ｐ　ＯＤにＡＣＥを含む検体例えば血
清を加えて混合し反応させる。反応温度は２０〜４５°
Ｃ好ましくは３７°Ｃ付近である。

この反応時間は５〜１５分間で行なうことができる０次
いでＥＤＴＡ水溶液を加え反応を停止させたのち、発色
を波長５９０ｎ−付近で分光光度計により測定する。そ
して既知濃度の試薬により測定した検量線から、検体中
のＡＣＥの濃度を測定することができる。またこの測定
方法で用いた停止液であるＥＤＴＡ溶液を用いずレート
法を採用することも自動化されたＡＣＨの測定には有利
である。

以上のように、本発明の方法は、緩衝液中検体と各試薬
を一度に混合し、生ずる色素を測定する１ステップ反応
による測定方法である。このため、測定機器は分注機構
、温度調節機構及び吸光度測定機構を有する汎用されて
いる自動分析機器を用いることができる。

（実施例） 本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。

漬」１例」−Ｐｈｅ−）１ｉｓ−Ｌｅｕの合成（１）ｐ
−メトキシベンゾイルオキシカルボニル−フェニルアラ
ニル−ヒスチジンメチルエステル（Ｚ（ＯＭｅ）　−Ｐ
ｈｅ−ＨｉｓＯＭｅ）の合成ｐ−メトキシベンゾイルオ
キシ力ルポニルフェニルアラニン（Ｚ（ＯＭｅ）Ｐｈｅ
）　　３３　ｇ　（０，ｉｎ＋ｏｆ　）をジクロロメタ
ン２００ｄに懸濁させ、これにＬヒスチジンメチルエス
テル２塩酸塩２６．６　ｇ（０，１１ｍｏｆ）の２００
ｄジクロロメタンを加える、更にトリエチルアミ７２３
　ｇ　（０，２２ｍｏｆ　）　ヲ加エル。

コノ液を４°Ｃに冷却し、水溶性カルボジイミド（ＷＳ
　Ｃ）　２１　ｇ　（０，１１ｍｏＡ）を加える。室温
で３時間攪拌する。反応終了後水で三回洗浄、１％Ｎａ
１（ＣＯ３水溶液で三回洗浄、水で三回洗浄しジクロロ
メタン相を分ける。ジクロロメタン層に無水硫酸ナトリ
ウムを加え乾燥後、４０″Ｃ以下で減圧上溶媒を除去し
、Ｚ　（ＯＭｅ）　−Ｐｈｅ−旧ｓＯＭｅ５２　ｇを得
た。（収率８８％） （２）Ｐ−メトキシベンゾイルオキシカルボニル−フェ
ニルアラニル−ヒスチジンヒドラジド（Ｚ（ＯＭｅ）−
Ｐｈｅ−１（ｉｓ−ＮＨ−ＮＨｔ）の合成前記Ｚ（ＯＭ
ｅ）　−Ｐｈｅ−ＨｉｓＯＭｅ５０　ｇ　（０，１ｍｏ
ｌ　／２００−メタノール溶液）に抱水ヒドラジン２５
ｇ（０，５ｍｏｉ！、）を加え、室温で５時間放置する
。

生じた沈殿を濾取し、水、メタノールとエーテルで洗浄
した後、真空乾燥させ、Ｚ（ＯＭｅ）　−Ｐｈｅ−Ｈｉ
ｓＮＨＮＨｚ４Ｂｇを得た。（収率９６％）（３）Ｐ−
メトキシベンゾイルオキシカルボニルフェニルアラニル
−ヒスチジル−ロイシンメチルエステル（Ｚ（ＯＭｅ）
　−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−ＬｅｕＯＭｅ）の合成前記Ｚ（Ｏ
Ｍｅ）　　Ｐｈｅ　　Ｈｉｓ　　ＮＨＮＨｚ　４ｇｇ（
０゜１ｍｏｆ）をジメチルフォルムアミド（ＤＭＦ）４
００ｄに懸濁させ、ドライアイス／アセトン浴で一６０
°Ｃに冷却した。次に攪拌しなから０°Ｃに冷却した４
Ｎ−塩酸／ジオキサン７５　ＩＲｌ（０，３ｒａｏｌ　
）を滴下する。更に亜硝酸イソアミル１５Ｉ１１（０，
１１＋ｎｏｆｆｉ）を滴下する。滴下終了後、反応液の
温度を一２５°Ｃ〜−２０°Ｃまで上げ、３０分間反応
させる。３０分後再度反応温度を一６０°Ｃまで下げ、
トリエチルアミン３０ａｄ　（０，３ｍｏｆ）を加え中
和する。この溶液にロイシンメチルエステル塩酸塩２５
．３ｇ　　（０，１４ｍｏｆ）とＯ″Ｃに冷却した１９
．６ｄｌ　（０，１４ｍｏ　ｌ　）のトリエチルアミン
／ジメチルスルホオキサイド溶液３００ｄを加え０“Ｃ
で一昼夜反応させた。これを３％炭酸水素ナトリウム水
溶液３１に滴下し、０°Ｃに一昼夜放置した。生じた結
晶を濾取し、水で十分に洗浄した後、少量のメタノール
に溶かす。このメタノール溶液を３％炭酸水素ナトリウ
ム水溶液２１に滴下し、Ｏ″Ｃに一昼夜放置した。生じ
た結晶を濾取し、水で十分に洗浄した後、五酸化リンを
入れたデシケータ−中で真空乾燥し、Ｚ（ＯＭｅ）　−
Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−ＬｅｕＯＭｅ　３０ｇを得た。（収率
７０％） （４）　　フェニルアラニル−しスチジルーロイシンメ
チルエステル（Ｐｈｅ　−Ｈｉ　ｓ　−ＬｅｕＯＭｅ　
）の合成Ｚ（ＯＭｅ）　−Ｐｈｅ−Ｆｉｔｓ−ＬｅｕＯ
Ｍｅ３０　ｇ　（０，０５ｍｏｆｆｉ）をエタノール２
００−に懸濁させこれを０〜４°Ｃに冷却し、１２７ｄ
　（０，４６ｍｏｆ）の４Ｎ−ＨＣ＃、／ジオキサンを
加える。この状態で約１０分間攪拌し、更に室温で２時
間攪拌した。これを２５°Ｃで減圧下で濃縮後、エーテ
ルを加えて粉末にした。これを減圧下で乾燥し、Ｐｈｅ
−Ｈｉｓ−ＬｅｕＯＭｅ２０ｇを得た。（収率８９％） （５）　　Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕの合成前記Ｐｈｅ−
Ｈｉｓ−ＬｅｕＯＭｅ２０　ｇをメタノール２００ｄに
溶かし、０〜４°Ｃに冷却する。これに、攪拌しながら
ｌＮ−ＮａＯＨ水溶液を加え、ｐＦｌ＝１２〜１３の間
になるようにする。４時間反応させ、エステル氷解後２
Ｎ　−）１ｃ　ｆを加えｐＨを７〜８の間に合わせる。

これを３５°Ｃで減圧下に約１／２になるまで濃縮し、
Ｌ−フェニルアラニル−ヒスチジル−ロイシンを析出さ
せる。析出した結晶を濾取し冷水で素早く洗浄し、減圧
下で乾燥し、Ｐｈｅ−Ｈｉｓ　−Ｌｅｕ１９ｇを得た。

（収率９５％）さらに水から再結晶することにより精製
することができる。得られたＰｈｅ　−Ｈｉｓ　−Ｌｅ
ｕのＦＩＰＬＣ（溶出液；水ニアセトニトリル＝９＝１
〜４：６．トリフルオロ酢酸０．１％含有；検出：２２
０ｎｍ；力ラム二Ｃ８゜（ＯＤＳ）　　ｌ−−ソー社製
）の結果を第１図に示す。また、アミノ酸分析の結果を
表−２に示す。

１旌［２Ｐｈｅ−ｔ（ｉｓ−Ａｆｆｉａの合成実施例１
において用いたロイシンメチルエステル塩酸塩の代わり
にアラニンメチルエステル塩酸塩２０ｇ　（０，１４＋
＋＋ｏｆ）を用い、同じ反応を行い標記Ｐｈｅ−Ｈｉｓ
−Ａ　ｌ　ａを合成した。得られたＰｈｅ−Ｈｉｓ　−
Ａｌａは水から再結晶により精製することができた。

爽施拠主　ＡＣＨの活性測定 実施例１で合成した基’ｆ（Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ　
　１０■Ｈ、パーオキシダーゼ４００００／　ｎ、４−
アミノアンチピリン０．５ｇａＭ、ＤＡＯ３１，ＯｎＭ
、Ｌ−フェニルアラニンオキシダーゼ１５０Ｕ＃！を含
むホウ酸緩衝液（ｐＨ＝８．３．０．７　Ｍ−ＮａＣ１
！、）　５００　ｕ　ｉにＡＣＥを含む検体（血清）５
．１０又は２０μ！を加え３７°Ｃで１０分間加温する
。１０分後、２００ｍＭ−ＥＤＴＡ水溶液５００μ！を
加えて反応を停止させる。その後波長５９３ｎｍにて吸
光度を測定する。未知濃度検体のＡＣＥ活性は濃度既知
の検体あるいは生成した色素の分子吸光係数から求めら
れる。

また、本発明とＡＣＥカラー（富士レビオ社製）の感度
比較を１分間当たりの吸光度変化量として結果を得た（
第２図参照）。

裏口■↓　ＡＣＥの活性測定 前記実施例２で合成した基質（Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−八ｆｆ
１ａ）を用い、実施例３と同様な操作を繰り返すことに
より、各検体量中のＡＣＥ活性を測定することができる
。

（発明の効果） 本発明は、前記一般式（Ｉ）で表わされるトリペプチド
を提供する。前記一般式（Ｉ）で表されるトリペプチド
は、例えばＡＣＥの活性測定用基質として用いることが
できる。またこのトリペプチドを用いたＡＣＥの活性測
定方法は、従来の方法に比べ検体中に存在するビリルビ
ン、ヘモグロビン等の影響を受けず、１ステツプで反応
を行なうことができる。そのため短時間で測定を可能に
した簡便な方法であり、さらに自動分析にも容易に応用
することができる。

【図面の簡単な説明】 第１図は、Ｐｈｅ　−Ｈｉｓ　−Ｌｅｕで表されるペプ
チドのＨＰＬＣ分析図である。第２図は、各検体量のＡ
ＣＥ活性測定図であり、本発明で合成した基質を用いた
ときの測定結果（−〇−）及びＡＣＥカラー（富士レビ
オ社製）による測定結果（−△−）である。 特許出願人　冨士レビオ株式会社 第１図 第２図

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式 Ｐｈｅ−Ａ−Ｂ で表わされるトリペプチド（式中、ＡはＨｉｓ又はＡｌ
   ａ、ＢはＬｅｕ又はＡｌａで表わされるアミノ酸である
   。）。
2. （２）式 Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ で表わされる請求項（１）記載のトリペプチド。
3. （３）一般式 Ｐｈｅ−Ａ−Ｂ （式中、ＡはＨｉｓ又はＡｌａ、ＢはＬｅｕ又はＡｌａ
   で表されるアミノ酸である）で表わされるトリペプチド
   、フェニルアラニンオキシダーゼ及びアンギオテンシン
   変換酵素を含む液体とを混合し、生ずる過酸化水素を定
   量することを特徴とするアンギオテンシン変換酵素の活
   性測定方法。
4. （４）トリペプチドが Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ である請求項（３）記載の方法。