CN109929818A

CN109929818A - 经修饰的苯丙氨酸氧化酶酶原及其用途

Info

Publication number: CN109929818A
Application number: CN201910265832.9A
Authority: CN
Inventors: 王辰; 肖飞; 张俊华; 许小毛; 邹丽辉; 李传保; 王萌; 苏斐
Original assignee: Beijing Hospital
Current assignee: Beijing Hospital
Priority date: 2019-04-03
Filing date: 2019-04-03
Publication date: 2019-06-25
Anticipated expiration: 2039-04-03
Also published as: CN109929818B; WO2020200315A1

Abstract

本申请提供一种经修饰的苯丙氨酸氧化酶酶原，以及其用于蛋白酶活性检测的用途。在该用途中，各待测蛋白酶浓度信号得到有效的放大，提高了检测的灵敏度，实现了体内蛋白酶活性的特异、灵敏、快捷检测。

Description

经修饰的苯丙氨酸氧化酶酶原及其用途

技术领域

本申请涉及一种经修饰的酶原及其用途，属于蛋白酶活性检测领域。

背景技术

人体内存在多种蛋白酶，然而缺乏一种能够广泛用于检测各种蛋白酶活性的直接、特异、灵敏、快捷、有效的方法。

以凝血系统为例，系统中的因子IIa也被称为凝血酶，属于丝氨酸蛋白酶，为血液促凝系统中血栓与止血的关键环节。循环血液中的凝血酶以无活性的凝血酶原形式存在，正常人体内仅含有极微量的有活性的凝血酶。目前，凝血酶的检测方法大致分为间接检测法，包含测定凝血酶原片段1+2(F1+2)、纤维蛋白肽A、可溶性纤维蛋白单体复合物、凝血酶-抗凝血酶复合物、凝血活酶生成等；直接检测法，包含发色底物法与荧光法。然而，由于激活状态与非激活状态的凝血因子间在氨基酸序列上仅有十几至几十个的数目差异，上述办法均难以对其进行区分。此外，目前凝血酶的间接检测法应用较为广泛，但其敏感性和特异性相对较差。目前还未见有直接检测血液中生理状态和激活状态的凝血因子IIa活性的相关报道。

体内的纤溶系统和凝血系统紧密联系，纤溶系统中的纤溶酶原(Plasminogen)被链激酶或尿激酶激活后成为纤溶酶(Plasmin)，后者可专一降解纤维蛋白凝胶，使其被分解成可溶性产物，通过负反馈效应降低体内纤维蛋白原的水平，从而避免纤维蛋白的过多凝聚。目前还未见有直接检测血液中生理状态和激活状态的纤溶酶活性的相关报道。

凝血象的检测结果反应的是凝血系统的一种整体表现，很难定位到某一个凝血因子的情况。而关于现有的检测凝血因子的ELISA方法，只是检测特定蛋白是否存在及其含量，而并没有反应酶的活性。此外，该方法中的抗体效价及特异性问题限制了检测结果的标准化。

目前仍需要一种能够广泛用于人体内各种蛋白酶活性检测的直接、灵敏、快捷、特异、有效的方法。

发明概述

一方面，本发明提供一种经修饰的苯丙氨酸氧化酶酶原(the proenzyme of L-phenylalanine oxidase，简写为proPAO)，其特征在于：所述修饰是在苯丙氨酸氧化酶酶原序列中的前导序列与α亚基间以及α亚基与β亚基间引入有蛋白酶的特异性识别位点序列。

在一些实施方案中，苯丙氨酸氧化酶酶原来源于细菌，例如Pseudomonas Sp.P-501，东湖假单胞菌(Pseudomonas donghuensis)，茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)UW551或洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)ATCC 25416。

在一些实施方案中，蛋白酶选自凝血级联蛋白酶，例如凝血因子IIa、Va、VIIa、VIIIa、IXa、Xa、XIa或XIIa；纤溶酶；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶，例如Caspase-1、Caspase-2、Caspase-3、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-6、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10或Caspase-11；补体途径蛋白酶，例如因子C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C3/C5转换酶；MMP家族蛋白酶；NisP酶。

技术人员知晓如何确定蛋白酶的特异性识别位点序列，且熟知本领域已知的蛋白酶的特异性识别位点序列。

在一些实施方案中，所述蛋白酶的特异识别位点序列如SEQ ID NO:8-44、67任一所示，例如SEQ ID NO:9-12任一所示。

例如，凝血因子IIa的切割序列包括但不限于Xaa Xaa Xab Arg Xac(SEQ ID NO:8)，切割位点在Arg与Xac之间，其中“Xaa”为任意氨基酸残基，“Xab”为优选自Pro、Ala、Gly或Val的氨基酸残基，“Xac”为优选自Ser、Ala、Gly的氨基酸残基，优选Leu Val Pro ArgGly(SEQ ID NO:10)；凝血因子IIa的切割序列也可以为Leu Arg Pro Arg(SEQ ID NO:9)(切割位点在Arg之后)、Phe Pro Arg(SEQ ID NO:11)(切割位点在Arg之后)和Gly Arg Gly(SEQ ID NO:12)(切割位点在Arg与Gly之间)等。凝血因子VIIa的切割序列包括但不限于Leu Ile Gln Arg(SEQ ID NO:13)。凝血因子IXa的切割序列包括但不限于Xaa Xaa GlyArg(SEQ ID NO:14)，“Xaa”为任意氨基酸残基，优选Pro Gln Gly Arg(SEQ ID NO:15)。凝血因子Xa的切割序列包括但不限于Xad Xaa Xae Xaf(SEQ ID NO:16)，其中“Xaa”为任意氨基酸残基，“Xad”为优选自Ala或Ile的氨基酸残基，“Xae”为优选自Pro、Phe或Gly的氨基酸残基，“Xaf”为选自Arg或Lys的氨基酸残基，优选Ile Glu Gly Arg(SEQ ID NO:17)和IleAsp Gly Arg(SEQ ID NO:18)等。凝血因子XIa的切割序列包括但不限于Xag Xah Thr Arg(SEQ ID NO:19)，其中“Xag”为优选自Lys或Asp的氨基酸残基，“Xah”为优选自Phe或Leu的氨基酸残基，优选Lys Leu Thr Arg(SEQ ID NO:20)。凝血因子XIIa的切割序列包括但不限于Thr Ser Thr Arg(SEQ ID NO:21)。纤溶酶Plasmin的切割序列包括但不限于Xaa XaaXai Xaj(SEQ ID NO:22)，切割位点在Xai与Xaj之间，其中“Xaa”为任意氨基酸残基，“Xai”为优选自Arg或Lys的氨基酸残基，“Xaj”为优选自Ala、Ser、Gly或Arg的氨基酸残基，优选Gly Tyr Arg Ala(SEQ ID NO:23)和Pro Ala Lys Ala(SEQ ID NO:24)。Caspase-2的切割序列包括但不限于Asp Glu Xaa Asp(SEQ ID NO:25)，其中“Xaa”为任意氨基酸残基。Caspase-3的切割序列包括但不限于Xak Glu Val Asp(SEQ ID NO:26)，其中“Xak”为优选自Asp或Glu的氨基酸残基，优选Asp Glu Val Asp(SEQ ID NO:27)。Caspase-6的切割序列包括但不限于Xaa Glu Xaa Asp(SEQ ID NO:28)，其中“Xaa”为任意氨基酸残基。Caspase-7的切割序列包括但不限于Asp Xaa Xaa Asp(SEQ ID NO:29)，其中“Xaa”为任意氨基酸残基。Caspase-8的切割序列包括但不限于Xal Xam Thr Asp(SEQ ID NO:30)，其中“Xal”为优选自Asp或Leu的氨基酸残基，“Xam”为优选自Glu或Ser的氨基酸残基，优选Asp Glu ThrAsp(SEQ ID NO:31)。Caspase-9的切割序列包括但不限于Xaa Xan Xaa Asp(SEQ ID NO:32)，其中，“Xaa”为任意氨基酸残基，“Xan”为优选自Asp或Glu的氨基酸残基。Caspase-10的切割序列包括但不限于Xaa Xao Xap Asp(SEQ ID NO:33)，其中，“Xaa”为任意氨基酸残基，“Xao”为优选自Glu、Gln或Ser的氨基酸残基，“Xap”为优选自Thr或Val的氨基酸残基。Caspase-14的切割序列包括但不限于Leu Glu Xaa Asp(SEQ ID NO:34)，其中“Xaa”为任意氨基酸残基。补体途径C3/C5转化酶的切割序列包括但不限于Gln Leu Gly Arg Leu HisMet Lys(SEQ ID NO:35)(切割位点在Arg与Leu之间)和Gly Leu Ala Arg Ser Asn LeuAsp(SEQ ID NO:36)(切割位点在Arg与Ser之间)。MMP-8的切割序列包括但不限于Gly XaqXaa Gly(SEQ ID NO:37)，其中，“Xaa”为任意氨基酸残基，“Xaq”为优选自Pro、Ala或Ser的氨基酸残基。MMP-11的切割序列包括但不限于Xaa Ala Ala Ala(SEQ ID NO:38)，其中“Xaa”为任意氨基酸残基。MMP-12的切割序列包括但不限于Gly Xar Xas Xas(SEQ ID NO:39),其中“Xar”为优选自Pro、Ala或Gly的氨基酸残基,“Xas”为优选自Ala或Gly的氨基酸残基。MMP-13的切割序列包括但不限于Gly Pro Xaa Gly Xat(SEQ ID NO:40)(切割位点在Gly与Xat之间)，其中“Xaa”为任意氨基酸残基，“Xat”为优选自Leu、Ile或Val的氨基酸残基，优选Gly Pro Ala Gly Leu(SEQ ID NO:41)。MMP-20的切割序列包括但不限于Pro XaaLeu Pro Xau(SEQ ID NO:42)(切割位点在Pro与Xau之间)，其中“Xaa”为任意氨基酸残基，“Xau”为优选自Leu或Met的氨基酸残基，优选Pro Ala Leu Pro Leu(SEQ ID NO:43)或ProAla Leu Pro Met(SEQ ID NO:44)。

在一些实施方案中，所述苯丙氨酸氧化酶酶原序列如SEQ ID NO:1所示。

在一些实施方案中，所述经修饰的苯丙氨酸氧化酶酶原序列如SEQ ID NO:2、4-7任一项所述。

在第二方面，本发明提供了第一方面所述经修饰的苯丙氨酸氧化酶酶原用于检测样品中蛋白酶活性的用途。

在本发明中，所述样品可以是体液、全血、血浆、血清或组织。

在凝血因子IIa活性检测中，以来源于Pseudomonas Sp.P-501的苯丙氨酸氧化酶酶原为反应底物，通过基因工程技术在其中引入凝血因子IIa的特异识别序列，利用苯丙氨酸氧化酶(PAO)与底物的氧化还原与显色反应，构建凝血因子IIa浓度与反应产物吸光度变化间的时间曲线，建立凝血因子IIa活性的直接检测体系。同时，使用临床样本对检测体系进行可行性验证，确认检测方法适用于枸橼酸钠抗凝血浆样本的检测。本发明构建了完整的凝血因子IIa检测方法，通过凝血因子IIa、氧化还原酶两级级联反应，拓宽了检测范围、提高了检测灵敏度。

在低含量待测蛋白酶的实施方案中，如对于凝血因子Xa，运用该检测体系需要增加一步酶原激活级联反应以放大Xa因子的浓度信号，例如中间蛋白酶原满足基本的放大要求，即不存在于人体内，识别序列特异性强，反应pH值呈中性，可以于30分钟内检测出血浆样本的吸光度变化。

在一些实施方案中，中间蛋白酶原是经修饰的NisP蛋白酶酶原(proNisP)，其在前导肽和催化亚基之间包含酶特异性识别位点序列。例如，经修饰的proNisP来自乳酸链球菌。

在凝血因子Xa和IIa的活性检测过程中，运用链激酶对血浆进行预处理,可防止全激活状态时血浆样本的凝固。

在纤溶酶酶活性的检测中，纤溶酶原可以被链激酶直接激活生成纤溶酶，后者引起酶联激活反应，从而建立纤溶酶活性的直接检测体系。

此外，使用枸橼酸钠抗凝的血浆样本对凝血因子和纤溶酶进行了可行性验证，比较了血浆在生理状态和全激活状态下的各蛋白酶活性。

在Caspase-3酶活性的检测中，以苯丙氨酸氧化酶酶原为反应底物，通过基因工程技术构建入Caspase-3的特异识别序列，利用PAO与底物的氧化还原与显色反应，建立Caspase-3活性的直接检测体系。同时，使用临床样本对检测体系进行可行性验证，确认检测方法适用于血清样本的检测。

在C5转换酶酶活性的检测中，以苯丙氨酸氧化酶酶原为反应底物，通过基因工程技术构建入C5转换酶的特异识别序列，利用PAO与底物的氧化还原与显色反应，建立补体系统中C5转换酶活性的直接检测体系。同时，使用临床样本对检测体系进行可行性验证，确认检测方法适用于血清样本的检测。

在一些实施方案中，采用的血浆标本为枸橼酸钠抗凝血浆样本或肝素抗凝血浆样本。

在一些实施方案中，还包括采用链激酶或尿激酶预处理样品。

在一些实施方案中，包括激活的苯丙氨酸氧化酶与底物的氧化还原与显色反应。

在第三方面，本发明提供了一种分离的核酸，其编码第一方面所述的经修饰的苯丙氨酸氧化酶酶原。

在第四方面，本发明提供了一种表达载体，其包含第三方面所述的分离的核酸。

在第五方面，本发明提供了用第四方面所述的表达载体转化或转染的宿主细胞。

第六方面，本发明提供了一种检测样品中蛋白酶活性的试剂盒，其包括第一方面所述的经修饰的苯丙氨酸氧化酶酶原。

在一些实施方案中，所述试剂盒还包含经修饰的proNisP，其在前导肽和催化亚基之间包含酶特异性识别位点序列，例如凝血因子Xa的特异识别序列。

来自Psuedomonas Sp.P-501的没有催化活性的L-苯丙氨酸氧化酶酶原(proPAO)基本由14个氨基酸残基的前导序列、92个氨基酸残基的α亚基、一个二肽(Ile-Lys)和605个残基的β亚基组成。根据已有文献中体外蛋白酶水解proPAO的实验结果，proPAO可以被蛋白酶Pronase和Trypsin共同水解成缺失第一个赖氨酸残基的α亚基和β亚基片段，该水解产物的活性与含有α亚基和β亚基片段的活化形式的PAO活性相当(Suzuki,H.et al.Sequencingand expression of the L-phenylalanine oxidase gene from Pseudomonas sp.P-501.Proteolytic activation of the proenzyme.Journal of biochemistry 136,617-627,doi:10.1093/jb/mvh169(2004)；Ida,K.et al.Structural basis of proteolyticactivation of L-phenylalanine oxidase from Pseudomonas sp.P-501.The Journalof biological chemistry 283,16584-16590,doi:10.1074/jbc.M800366200(2008)；Ida,K.,Suguro,M.&Suzuki,H.High resolution X-ray crystal structures of L-phenylalanine oxidase(deaminating and decarboxylating)from Pseudomonas sp.P-501.Structures of the enzyme-ligand complex and catalytic mechanism.Journalof biochemistry 150,659-669,doi:10.1093/jb/mvr103(2011))。因此，本文中所称的α亚基包括了N端缺少一个赖氨酸的形式，此时所称前导序列则可以对应地在C端多一个赖氨酸。

定义

苯丙氨酸氧化酶：指苯丙氨酸2-单加氧酶(EC 1.13.12.9)，其主要催化L-苯丙氨酸生成2-苯基乙酰胺或3-苯丙酮酸，其底物还包括β-2-噻吩丙氨酸，L-酪氨酸、L-甲硫氨酸等。

酶原：具有酶的特定活性的酶的前体形式，由此一般称之为无活性形式的酶。本文所称的酶原可以指在检测方法中经酶切活化成有活性的酶的前体形式。酶原可通过导致活化级联的其他酶活化成对应活性酶。

修饰：在多肽(例如酶)中的一个或多个氨基酸残基的突变(置换)、插入(添加)或缺失，以获得修饰的多肽。本文中，术语“重组”、“修饰”、“改造”可互换使用。

识别位点序列：是指检测中被酶所特异性识别并切割的氨基酸序列。本文中，术语“识别位点序列”、“识别序列”或“切割序列”可互换使用。

蛋白酶酶原：可活化成活性蛋白酶的蛋白酶前体形式。本文所称的蛋白酶包括丝氨酸蛋白酶，苏氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，金属蛋白酶或谷氨酸蛋白酶等任意可切割蛋白序列的酶。

氨基酸残基：包括但不限于由以下氨基酸组成的集合的氨基酸残基：丙氨酸(三字母代码：Ala，单字母代码：A)，精氨酸(Arg，R)，天冬酰胺(Asn，N)，天冬氨酸(Asp，D)，半胱氨酸(Cys，C)，谷氨酰胺(Gln，Q)，谷氨酸(Glu，E)，甘氨酸(Gly，G)，组氨酸(His，H)，异亮氨酸(Ile，I)，亮氨酸(Leu，L)，赖氨酸(Lys，K)，甲硫氨酸(Met，M)，苯丙氨酸(Phe，F)，脯氨酸(Pro，P)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr，T)，色氨酸(Trp，W)，酪氨酸(Tyr，Y)，和缬氨酸(Val，V)。

编码序列：编码序列的边界一般由开放阅读框架确定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

转化：指将DNA导入受体宿主细胞，其改变基因型并随后导致受体细胞中的改变。

宿主细胞：指经过使用重组DNA技术构建且编码至少一种异源基因的载体转化的细胞。

酶活性检测方法：

A.凝血因子IIa

1.凝血因子IIa特异底物(即包含凝血因子IIa特异识别位点序列的经修饰苯丙氨酸氧化酶酶原)的制备方法

凝血因子IIa特异底物的制备方法，包括菌株、质粒、酶与培养基，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化。具体步骤如下：

(1)菌株、质粒、酶与培养基：

大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α、BL21(DE3)、克隆与表达质粒载体pRSFDuet-1购自Novagen公司；DNA高保真聚合酶混合液购自Tsingke公司；限制性内切酶、DNA连接酶购自NEB公司；大肠杆菌LB培养基：每升含Tryptone 10g，Yeast extract 5g，NaCl 10g，卡那霉素浓度为50mg/L。

(2)重叠延伸PCR扩增及重组质粒的构建：

全基因合成编码proPAO(即SEQ ID NO:1)的基因序列，设计三对引物，通过重叠延伸PCR在酶原proPAO的激活位点处(即前导序列与α亚基间，和α亚基与β亚基间)加入两个凝血因子IIa的特异识别序列(氨基酸序列LRPR，SEQ ID NO:9)。经限制性内切酶双酶切连接至经同样内切酶酶切的表达载体pRSFDuet-1上，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，并进行双酶切及测序验证。

上述重叠延伸PCR的引物如下：

上游PAO A1-45:

5′-catgccatggtgggcgttaccgtcattccccggctgc-3′(SEQ ID NO:45)

下游PAO A2-46:

5′-gcccgcgtaccttgatcgcacgtggacgcagtcccgggcggtcatgaaga-3′(SEQ ID NO:46)

上游PAO B1-47:

5′-tcttcatgaccgcccgggactgcgtccacgtgcgatcaaggtacgcgggc-3′(SEQ ID NO:47)

下游PAO B2-48:

5′-ggaattccatatgttaatgatgatgatgatgatgctggctggtggccagctccgc-3′(SEQ IDNO:48)

上游PAO C1-49:

5′-cggcctgaaggacgagaagctgcgtccacgtaagattgccaccaccgttg-3′(SEQ ID NO:49)

下游PAO C2-50:

5′-caacggtggtggcaatcttacgtggacgcagcttctcgtccttcaggccg-3′(SEQ ID NO:50)

其中，划线部分为修饰后的proPAO上游引物NcoI酶切位点及下游引物NdeI酶切位点。限制性内切酶选用NcoI和NdeI两种。

(3)基因的诱导表达与蛋白质的纯化：

将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)。加入IPTG于培养物中进行诱导表达。诱导表达的蛋白经过超声破壁，离心，取上清液进行镍柱亲和层析(QIAGEN公司产品)和脱盐层析柱(Amersham公司产品)得到纯化的凝血因子IIa底物特异性的proPAO。

(4)凝血因子IIa酶解底物的验证

取商品化凝血因子IIa纯品(Sigma公司产品)，加入至上述纯化的凝血因子IIa底物特异性proPAO蛋白溶液，37℃孵育，SDS-PAGE验证水解效率。

2.凝血因子IIa活性检测方法的建立

(1)凝血因子IIa对其底物的酶解

凝血因子IIa底物特异性proPAO经凝血因子IIa催化水解后，α与β亚基被释放出，PAO的结构不受影响，具有催化活性。

(2)PAO与底物的氧化还原反应与显色反应

反应过程可分为二步：

首先，PAO催化底物L-苯丙氨酸(L-Phe)的氧化脱氨基反应，生成β-苯丙酮酸(β-phenylpyruvate)、氨(NH₃)和过氧化氢(H₂O₂)。接着根据Trinder反应，在辣根过氧化物酶(HRP)的催化作用下，过氧化氢(H₂O₂)与酚衍生物(TOOS)、4-氨基安替比林(4-AAT)反应生成醌类显色化合物(Quinones)，该化合物为红紫色，最大吸收峰位于550-560nm处，颜色强度与过氧化氢的浓度成正比。为消除检测过程中的随机误差，本体系的信号检测选取双波长分光光度法。以最大吸收峰处波长550-560nm为测定波长，以可见光范围内吸收最小处的波长700nm为组合波长。以Abs_555nm-Abs_700nm处理吸光度检测数据，作为检测的分析信号。

(3)酶活性检测条件的优化

酶反应速率随底物proPAO浓度的升高而加快。然而，高浓度的proPAO将造成底物的空间距离过近，导致较高的proPAO背景反应。故选择反应速率相对较高的proPAO浓度为检测反应的终浓度。同时对其他底物(L-Phe、HRP、TOOS和4-AAT)浓度及反应pH值分别进行优化，使得反应体系有最大吸光度变化速率。

3.临床标本的检测

采用临床枸橼酸钠抗凝的血浆标本，在反应体系中补充足量的钙离子(CaCl₂)和组织因子(Tissue Factor，TF)以充分激活待测血浆中的凝血因子IIa。为去除标本中的纤维蛋白原以阻止标本凝固，采用链激酶(Streptokinase，SK)预先处理标本以降解其中的纤维蛋白，再对处理过的标本进行检测，可以防止反应体系凝固。

B.凝血因子Xa

在人体凝血系统中，凝血因子Xa位于凝血因子IIa的上游，本发明中通过选择中间酶原增加一步酶原激活反应以放大Xa因子的浓度信号。具体选择了来源于乳酸链球菌(Streptococcus lactis)的NisP酶酶原(Nisin leader peptide-processing serineprotease proenzyme，proNisP)。全基因合成重组的proNisp基因序列，在该酶原的前导肽序列与催化亚基之间加入Xa因子的特异识别序列IEGR(SEQ ID NO:17)。接着设计三对引物，通过重叠延伸PCR在proPAO的激活位点处加入两个NisP的特异识别序列ASPRI(SEQ IDNO:67)。

上述重叠延伸PCR的引物如下：

上游PAO A1-45:

5′-catgccatggtgggcgttaccgtcattccccggctgc-3′(SEQ ID NO:45)

下游PAO A2-51:

5′-gcccgcgtaccttgatcgcaatacgaggagatgctcccgggcggtcatga-3′(SEQ ID NO:51)

上游PAO B1-52:

5′-tcatgaccgcccgggagcatctcctcgtattgcgatcaaggtacgcgggc-3′(SEQ ID NO:52)

下游PAO B2-48:

5′-ggaattccatatgttaatgatgatgatgatgatgctggctggtggccagctccgc-3′(SEQ IDNO:48)

上游PAO C1-53:

5′-cctgaaggacgagaaggcatctcctcgtattaagattgccaccaccgttg-3′(SEQ ID NO:53)

下游PAO C2-54:

5′-caacggtggtggcaatcttaatacgaggagatgccttctcgtccttcagg-3′(SEQ ID NO:54)

其中，划线部分为改造后的proPAO上游引物NcoI酶切位点及下游引物NdeI酶切位点。限制性内切酶选用NcoI和NdeI两种。

将构建好的重组酶原proNisp和proPAO分别连接至表达载体pRSFDuet-1并转化入E.coli BL21(DE3)，分别进行基因的诱导表达与蛋白质的纯化。proNisp的诱导表达与蛋白质的纯化如下：加入IPTG于培养物中进行诱导表达。诱导表达的蛋白经过超声破壁，离心，取上清液进行镍柱亲和层析(QIAGEN公司产品)和脱盐层析柱(Amersham公司产品)得到蛋白产物。

取商品化凝血因子Xa纯品(NEB公司产品)和纯化的重组proNisP酶原加入至上述的重组proPAO，37℃孵育，SDS-PAGE验证水解效率。

临床标本的凝血因子Xa活性检测：采用临床枸橼酸钠抗凝的血浆标本，在反应体系中补充足量的CaCl₂和TF以充分激活待测血浆中的凝血因子Xa。为去除标本中的纤维蛋白原以阻止标本凝固，采用链激酶预先处理标本以降解其中的纤维蛋白，再对处理过的标本进行检测。

C.纤溶酶

以proPAO(Pseudomonas Sp.P-501)基因为模板，设计三对引物，通过重叠延伸PCR在酶原proPAO的激活位点处加入两个Plasmin的特异识别序列GYRA(SEQ ID NO:23)。经限制性内切酶双酶切连接至经同样内切酶酶切的表达载体pRSFDuet-1上，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，并进行双酶切及测序验证。

上述重叠延伸PCR的引物如下：

上游PAO A1-45:

5′-catgccatggtgggcgttaccgtcattccccggctgc-3′(SEQ ID NO:45)

下游PAO A2-55:

5′-cagcccgcgtaccttgatcgcacgataacctcccgggcggtcatgaagaa-3′(SEQ ID NO:55)

上游PAO B1-56:

5′-ttcttcatgaccgcccgggaggttatcgtgcgatcaaggtacgcgggctg-3′(SEQ ID NO:56)

下游PAO B2-48:

5′-ggaattccatatgttaatgatgatgatgatgatgctggctggtggccagctccgc-3′(SEQ IDNO:48)

上游PAO C1-57:

5′-cggcctgaaggacgagaagggttatcgtgcaaagattgccaccaccgttg-3′(SEQ ID NO:57)

下游PAO C2-58:

5′-caacggtggtggcaatctttgcacgataacccttctcgtccttcaggccg-3′(SEQ ID NO:58)

后续的实施内容可以参照凝血因子IIa活性检测方法，需注意，与凝血因子IIa和Xa不同的是，在纤溶酶活性检测方法的实施方案中，链激酶可以直接激活血浆中的纤溶酶原使之生成纤溶酶，后者引起酶联激活反应，从而建立纤溶酶活性的直接检测体系。

D.Caspase-3

以proPAO(Pseudomonas Sp.P-501)基因为模板，设计三对引物，通过重叠延伸PCR在酶原proPAO的激活位点处加入两个Caspase-3的特异识别序列DEVD(SEQ ID NO:27)。经限制性内切酶双酶切连接至经同样内切酶酶切的表达载体pRSFDuet-1上，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，并进行双酶切及测序验证。

上述重叠延伸PCR的引物如下：

上游PAO A1-45:

5′-catgccatggtgggcgttaccgtcattccccggctgc-3′(SEQ ID NO:45)

下游PAO A2-59:

5′-gcccgcgtaccttgatcgcatcaacttcgtctcccgggcggtcatgaaga-3′(SEQ ID NO:59)

上游PAO B1-60:

5′-tcttcatgaccgcccgggagacgaagttgatgcgatcaaggtacgcgggc-3′(SEQ ID NO:60)

下游PAO B2-48:

5′-ggaattccatatgttaatgatgatgatgatgatgctggctggtggccagctccgc-3′(SEQ IDNO:48)

上游PAO C1-61:

5′-cggcctgaaggacgagaaggacgaagttgataagattgccaccaccgttg-3′(SEQ ID NO:61)

下游PAO C2-62:

5′-caacggtggtggcaatcttatcaacttcgtccttctcgtccttcaggccg-3′(SEQ ID NO:62)

Caspase-3的酶活力单位：Caspase-3可水解乙酰基-Asp-Glu-Val-Asp-对硝基苯胺(Ac-DEVD-pNA)，释放对硝基苯胺(pNA)部分，可在405nm处测定。通过检测重组Caspase-3对显色底物Ac-DEVD-pNA的切割活性可以定义Caspase-3的酶活力单位。

后续底物proPAO激活反应的实施内容可以参照凝血因子IIa活性检测方法，需注意，与凝血系统中的检测方法不同的是，在所有的Caspase活性检测方法的实施方案中，采用的临床标本为血清成分。此外，反应中不需要使用激活剂，可以直接通过检测血清中Caspase-3对含有特异切割序列的重组酶原proPAO的激活反应，建立Caspase-3活性的直接检测体系。

E.C5转化酶

以proPAO(Pseudomonas Sp.P-501)基因为模板，设计三对引物，通过重叠延伸PCR在酶原proPAO的激活位点处加入两个C5转化酶的特异识别序列QLGRLHMK(SEQ ID NO:35)。经限制性内切酶双酶切连接至经同样内切酶酶切的表达载体pRSFDuet-1上，连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，筛选重组质粒，并进行双酶切及测序验证。

上述重叠延伸PCR的引物如下：

上游PAO A1-45:

5′-catgccatggtgggcgttaccgtcattccccggctgc-3′(SEQ ID NO:45)

下游PAO A2-63:

5′-cgcgtaccttgatcgctttcatgtgcagacgacccagttgtcccgggcggtcatga-3′(SEQ IDNO:63)

上游PAO B1-64:

5′-tcatgaccgcccgggacaactgggtcgtctgcacatgaaagcgatcaaggtacgcg-3′(SEQ IDNO:64)

下游PAO B2-48:

5′-ggaattccatatgttaatgatgatgatgatgatgctggctggtggccagctccgc-3′(SEQ IDNO:48)

上游PAO C1-65:

5′-cctgaaggacgagaagcaactgggtcgtctgcacatgaagattgccaccaccgttg-3′(SEQ IDNO:65)

下游PAO C2-66:

5′-caacggtggtggcaatcttcatgtgcagacgacccagttgcttctcgtccttcagg-3′(SEQ IDNO:66)

后续的实施内容可以参照Caspase-3活性检测方法，可以直接通过检测血清中C5转化酶对含有特异切割序列的重组酶原proPAO的激活反应，建立补体系统中C5转化酶活性的直接检测体系。

附图说明

图1为凝血因子IIa特异底物proPAO(含LRPR识别序列)纯化产物的SDS-PAGE检测结果，其中：M是蛋白marker。

图2为凝血因子IIa对特异底物proPAO(含LRPR识别序列)酶解的SDS-PAGE检测结果，其中：M是蛋白marker。

图3为凝血因子IIa纯品对因子IIa特异底物proPAO(含LRPR识别序列)的酶解活性定量检测结果。

图4为凝血因子IIa活力单位与对应反应速率方程参数间的线性关系。

图5为链激酶预处理后血浆中的凝血因子IIa对底物proPAO(含LRPR识别序列)的酶解活性检测结果。

图6为含有两个凝血因子Xa切割位点的proNisP(含IEGR识别序列)和NisP特异性底物proPAO(含ASPRI识别序列)纯化产物的SDS-PAGE检测结果，其中：M是蛋白marker。

图7为凝血因子Xa酶解因子Xa特异底物proNisP(含IEGR识别序列)后的产物NisP，以及产物NisP对NisP特异底物proPAO(含ASPRI识别序列)酶解的SDS-PAGE检测结果，其中：M是蛋白marker。

图8为链激酶预处理后血浆中的凝血因子Xa通过酶解因子Xa特异底物proNisP(含IEGR识别序列)对NisP特异底物proPAO(含ASPRI识别序列)的酶联水解活性检测结果。

图9为链激酶激活纤溶酶原后血浆中的纤溶酶对特异底物proPAO(含GYRA识别序列)的酶解活性检测结果。

图10为重组Caspase-3对合成底物Ac-DEVD-pNA的切割活性检测结果。

图11为不同受检者血清中Caspase-3对特异底物proPAO(含DEVD识别序列)的酶解活性检测结果。其中：Sample 1为小细胞肺癌和肝转移患者，Sample 2为贲门病变患者，Sample 3为疑似淋巴瘤患者，Sample 4为体检者。

图12为不同受检者血清中C5Convertase对特异底物proPAO(含QLGRLHMK识别序列)的酶解活性检测结果。其中：Sample 1与Sample 2为风湿免疫疾病患者，Sample 3与Sample 4为体检者。

图13中A和B分别为特异底物多酚氧化酶原proCPO(signal crayfishPacifastacus leniusculus)和proDPO(Drosophila melanogaster)被凝血因子激活的检测结果。

图14为链激酶预处理后血浆中的凝血因子IIa对底物proPAO(含一个LRPR识别序列)的酶解活性检测结果。

图15为链激酶预处理后血浆中的凝血因子IIa对来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的SplB蛋白酶特异底物proPAO(含WELQ，SEQ ID NO:68识别序列)的酶解活性检测结果。

图16为经特定蛋白酶识别序列修饰的proPAO的酶原激活反应测定相应蛋白酶活性的流程图。

具体实施方式

蛋白酶活性检测的具体实施例包含凝血级联蛋白酶(包含多种凝血因子)，纤溶酶，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶(包含Caspase家族成员)，补体途径蛋白酶(包含各个补体成分)和基质金属蛋白酶(包含MMP家族成员)。

实施例1.凝血因子IIa活性检测

1.凝血因子IIa底物特异性的proPAO序列的构建

(1)扩增获得含有一个凝血因子IIa切割位点的proPAO DNA片段

分别设计引物PAO A1-45上游和PAO A2-46下游，PAO B1-47上游和PAO B2-48下游，引物PAO A1-45上游和PAO B2-48下游中分别加入了NcoI和NdeI酶切位点。全基因合成Pseudomonas Sp.P-501中的proPAO序列(编码序列为SEQ ID NO:1)，以此DNA序列为模板，用引物PAO A1-45上游和PAO A2-46下游，PAO B1-47上游和PAO B2-48下游分别扩增含有一个凝血因子IIa切割位点(位于α亚基与β亚基之间)的两部分DNA片段A和B。PCR反应体系：1.1×PCR mix buffer 20μl，上游、下游引物(10μM)各1μl，模板0.2μl。反应条件：94℃热变性5min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸30s(使用引物PAO A1和PAO A2时)或2min(使用引物PAO B1和PAO B2时)，共30个循环；72℃延伸10min。PCR产物在0.5×TAE配制的琼脂糖凝胶中电泳，DNA回收试剂盒(Tiangen公司)回收目的片段，方法参考其说明书，回收产物-20℃保存备用。

将使用引物PAO A1-45和PAO A2-46扩增得到的A片段与使用引物PAO B1-47和PAOB2-48得到的B片段进行重叠延伸PCR。引物使用PAO A1-45上游和PAO B2-48下游。PCR反应体系：1.1×PCR mix buffer 20μl，上游、下游引物(10μM)各1μl，模板A片段与B片段各1μl。反应条件：94℃热变性5min；94℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸2min 10s，共30个循环；72℃延伸10min。琼脂糖凝胶中电泳回收PCR产物同前。得到纯的含有一个凝血因子IIa切割位点(位于α亚基与β亚基之间)的DNA片段。

(2)克隆含有一个凝血因子IIa切割位点的proPAO DNA片段

对回收得到的DNA片段进行限制性内切酶消化，反应体系：回收的PCR产物43μl，10×限制性内切酶缓冲液5μl，NcoI(Thermal Scientific公司)1μl，NdeI(ThermalScientific公司)1μl。混匀，37℃过夜酶解。通过琼脂糖电泳回收经过酶切的PCR扩增基因，与经过同样的两个限制性内切酶酶切回收得到的质粒载体pRSFDuet-1相连。连接反应体系：经过酶切处理的PCR扩增基因12μl，经过酶切处理的质粒载体2μl，10×T4连接酶缓冲液2μl，T4连接酶(Thermal Scientific公司)0.2μl，ddH₂O 3.8μl。混匀，20℃反应2h。

连接产物的转化：取100μl感受态细胞E.coli DH5α于1.5ml离心管中，加入10μl连接产物。冰上放置30min，42℃热激90s，冰上放置2min。加入500μl LB培养基，37℃振荡培养45min，使细菌复苏。

转化菌的培养：12000rpm离心1min，弃上清，用100μl LB培养基重悬菌体，涂布于卡那霉素抗性的LB平板上。将平板于37℃孵箱内培养16h。

重组质粒的鉴定：挑取单克隆菌落于反应管中，加入10μl ddH₂O重悬混匀，取1μl作为模板，以引物PAO A1-45和PAO B2-48进行菌落PCR。PCR结果通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。取菌落PCR正确的单克隆菌落接种到5ml卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃振荡培养12h。使用质粒提取试剂盒(Axygen公司)小量提取质粒DNA。取5μl质粒，限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳确认酶切结果，挑选酶切鉴定正确的重组质粒，选择相应的引物，送Tsingke公司进行DNA测序分析，确认目的基因序列阅读框的正确性。

(3)扩增获得含有两个凝血因子IIa切割位点的proPAO DNA片段

设计引物PAO C1-49上游和PAO C2-50下游，分别以引物PAO A1-45上游和PAO C2-50下游，PAO C1-49上游和PAO B2-48下游，以含有一个凝血因子IIa切割位点的质粒DNA为模板，分别扩增含有第二个凝血因子IIa切割位点(位于前导肽与α亚基之间)的两部分DNA片段C和D。PCR反应体系和条件同(1)。将使用引物PAO A1-45和PAO C2-50扩增得到的C片段与使用引物PAO C1-49和PAO B2-48得到的D片段进行重叠延伸PCR。引物使用PAO A1-45上游和PAO B2-48下游。PCR反应体系和条件同(1)。得到纯的含有两个凝血因子IIa切割位点的proPAO DNA片段，其对应的氨基酸序列见SEQ ID NO:2。

(4)克隆含有两个凝血因子IIa切割位点的proPAO DNA片段

步骤同(2)。

2.凝血因子底物特异性proPAO蛋白的表达与纯化

将前述含有两个凝血因子IIa切割位点的修饰的proPAO DNA片段的重组质粒转化入E.coli BL21(DE3)。挑取平板上的单克隆菌落，接种到5ml LB培养基中，37℃振荡培养12h。将上述全部培养物接种到含400ml新鲜LB培养基中，37℃振荡培养3h，当菌液OD_600nm达到0.6，向培养物中加入终浓度为0.5mM的IPTG，20℃继续培养16h。将培养物收集于50ml离心管中，4℃，6000rpm离心20min。弃上清液。

菌体溶解：将离心得到的菌体沉淀使用缓冲液A[50mM KH₂PO₄/K₂HPO₄，300mMNaCl，pH8.0]充分重悬。

菌体破碎：选择超声破碎。超声破碎条件为功率20％，超声2s间歇4s，5-30min。待菌液清亮后，于4℃，13000rpm离心30min，收集上清液。

镍柱亲和层析：向上清中加入0.8ml 50％的Ni-NTA悬液(QIAGEN公司)，于4℃摇床匀速混匀1h。将混合液加入层析柱中，上清在重力作用下流出，Ni-NTA基质沉淀于层析柱中。向层析柱中加入1倍柱体积的缓冲液A，洗涤层析柱，重复三次。待缓冲液A流净，向层析柱中加入5ml含有20mM咪唑的缓冲液A，洗脱杂质蛋白，重复三次。接着，向层析柱中分次加入2ml洗脱缓冲液B[50mM KH₂PO₄/K₂HPO₄，300mM NaCl，250mM Imidazole，pH8.0]，洗脱目的蛋白。收集蛋白洗脱液于1.5ml离心管中。

脱盐柱层析与保存：将得到的目的蛋白洗脱液于4℃，13000rpm离心30min，取上清液使用ATKA蛋白纯化仪(Amersham公司)进行脱盐层析，使蛋白处于缓冲液C[10mM KH₂PO₄/K₂HPO₄，pH8.0]中，加入甘油至10％，于-80℃保存备用。同时使用蛋白质定量试剂盒(Beyotime公司)对纯化产物进行含量测定，将目的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳以检测蛋白的表达与纯化情况。电泳图如图1所示。

3.凝血因子IIa的酶解验证

取人的凝血因子IIa纯品(Sigma公司)，按反应体系(凝血因子IIa纯品1μg，修饰的proPAO 10μg，30mM KH₂PO₄/Na₂HPO₄，pH7.37)，37℃孵育3h后，SDS-PAGE验证水解效率。电泳图如图2所示。由图2可以看出凝血因子IIa可以成功地对修饰的proPAO进行切割。从左至右的每个泳道为未被切割的修饰的proPAO，凝血因子IIa将修饰的proPAO切割成具有较小迁移率的片段，商品化凝血因子IIa，蛋白marker。

4.凝血因子IIa活性检测方法的建立

选择Trinder显色反应，并优化相应的显色反应底物浓度、缓冲液、反应条件，检测条件，确定两种反应试剂R1、R2的组成及检测波长，初步建立检测体系。

反应试剂R1：TOOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐)；反应试剂R2：L-Phe，HRP，4-AAT。吸光度检测反应体系：凝血因子IIa纯品(不同活力单位)，凝血因子IIa底物特异性proPAO，反应试剂R1，反应试剂R2。将上述组分加入酶标板小孔中，使用酶标仪振荡混匀反应体系，检测555nm和700nm处的吸光度随时间的变化。

数据处理与绘图：△Abs＝Abs_555nm-Abs_700nm，以时间t为横坐标，△Abs为纵坐标，绘制不同活力单位的FIIa(Sigma公司)纯品酶解动力学的散点图。检测结果如图3所示。由图3可以看出随着反应体系中凝血因子IIa活力单位的增加，修饰的proPAO被切割的反应速率随之增大。

分别对各散点图进行函数拟合以描述相应的反应速率，使用简单线性回归检验动力学方程参数与凝血因子FIIa活力单位间的关系。结果如图4所示。由图4可以看出得到的动力学方程参数与FIIa活力单位间成线性相关，R²＝0.9989，解释度良好。

优化检测反应条件：分别配制含不同底物浓度的检测试剂。控制其他底物及反应条件不变，选择含有同一底物的不同浓度的试剂，以经凝血因子IIa纯品水解后的特异底物作为样品进行反应。使用酶标仪连续监测反应体系的吸光度变化，以时间t为横坐标，△Abs为纵坐标，绘制散点图。确定的最优反应底物浓度分别为8mM TOOS，7.5mM L-phenylalanine，6mM 4-AAT，5U/ml HRP和0.20μg/μl经修饰proPAO，最佳反应温度为37℃。

优化检测反应pH值：在凝血因子IIa活性的最适pH条件和血液pH条件下，配制梯度pH的磷酸盐缓冲液。以经凝血因子IIa纯品水解后的特异底物作为样品进行反应，使用酶标仪连续监测反应体系的吸光度变化。以时间t为横坐标，△Abs为纵坐标，绘制散点图。最佳pH值为7.35-7.45。

5.临床样本的初步检测

(1)枸橼酸钠抗凝血浆标本的检测实验

收集样本：选取2017年6月至9月期间北京医院普通门诊(非心血管疾病、非妊娠、非骨科住院复查患者、非甲状腺疾病等有高血栓风险的患者，非抗凝治疗及避孕药使用的患者)的枸橼酸钠抗凝血浆样本，枸橼酸钠：血液＝1:9(枸橼酸钠终浓度约为0.109mmol/L)。为最大程度的避免随机误差，将血浆标本以10份为一组混匀制备血浆盘。以混合血浆为样本进行检测。

样品检测：在酶标板中加入下列成分(混合血浆样本，反应试剂R1(90μl)，反应试剂R2(90μl)和特异底物proPAO(10μl))后，设置酶标仪的反应程序：振荡混匀，检测555nm和700nm处吸光度随时间的变化。

(2)血浆激活实验

在枸橼酸钠抗凝血浆标本的检测反应体系(血浆样本，R1，R2和修饰的proPAO)中加入CaCl₂，同时加入组织因子(TF)，以充分激活待测血浆中的凝血因子IIa。

(3)链激酶实验

样品准备：备枸橼酸钠抗凝的混合血浆标本，使用20μl链激酶+100μl混合血浆标本制备预处理的血浆样本。对照样本使用20μl ddH₂O+100μl混合血浆标本制成。在干净的酶标板中加入下列成分(预处理样本/对照样本(20μl)，反应试剂R1(90μl)，反应试剂R2(90μl)和修饰的proPAO(10μl))后，使用酶标仪进行反应检测。检测结果如图5所示(图注方框中物质预先混合)。由图5可以看出使用链激酶预处理血浆后，激活状态的凝血因子IIa引起了酶联激活反应。

(4)凝血酶与吸光度之间定量关系的建立

Trinder反应是较为成熟的临床生化检验常用反应，其反应条件、底物及过氧化物酶的浓度的选择均根据过氧化物酶的反应参数而得。为保证信号检测模块的反应速度只与过氧化氢浓度成正比，其余底物及酶在反应体系中的浓度均远高于K_m值。

对信号检测的吸光度值与待测样本凝血因子IIa的浓度间的数量关系进行分析。在一级反应阶段时，信号检测的吸光度值与待测样本凝血因子IIa的浓度间成线性关系。根据相应的苯丙氨酸氧化酶酶原激活的时间反应曲线计算，得到吸光度值变化(△Abs)与凝血因子IIa标准品的浓度(c_(FIIa))之间的方程式y＝ax+b，将实际测得的吸光度值变化代入上述方程式可以计算得到待测样本中凝血因子IIa的浓度。

实施例2.凝血因子Xa活性检测

由于凝血因子Xa活性检测多了一步中间蛋白酶原的激活反应，因此，首先合成了修饰的proNisP(Streptococcus lactis)酶原DNA片段，该DNA片段的前导肽序列与催化亚基序列之间包含有凝血因子Xa的特异识别序列IEGR(SEQ ID NO:17)的DNA序列。完整氨基酸序列图见SEQ ID NO:3。对此DNA片段进行限制性内切酶消化(BamHI，NcoI)，与经过同样的两个限制性内切酶酶切回收得到的质粒载体pRSFDuet-1相连。将连接产物进行转化并鉴定得到正确序列的重组质粒，将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)。挑取平板上的单克隆菌落，进行修饰蛋白proNisP的诱导表达，镍柱亲和层析和脱盐层析，表达与纯化的步骤参见凝血因子IIa底物特异性proPAO的表达与纯化。将目的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳以检测蛋白的表达与纯化情况。电泳如图6所示。

接着，以编码SEQ ID NO:1的proPAO基因为模板，运用三对相应引物进行重叠延伸PCR，最终获得含有二个NisP切割位点的DNA片段，完成Xa因子酶联检测特异底物序列的构建，其编码的氨基酸序列图见SEQ ID NO:4。修饰的proPAO特异底物蛋白的表达与纯化参见凝血因子IIa实施方案中的相应描述。目的蛋白的SDS-PAGE电泳如图6所示。

凝血因子Xa的酶解验证：取牛的凝血因子Xa纯品(NEB公司)，按反应体系(Xa因子纯品0.5μg，修饰的proNisP 2μg，修饰的proPAO 6μg，30mM KH₂PO₄/Na₂HPO₄，pH 7.37)，37℃孵育2.5h后，SDS-PAGE验证水解效率。电泳图如图7所示。由图7可以看出凝血因子Xa可以成功地通过切割修饰proNisP实现对修饰proPAO的切割。从左至右的每个泳道为蛋白marker，未被切割的修饰proNisP，凝血因子Xa对修饰proNisP的切割，凝血因子Xa通过切割修饰proNisP进行对修饰proPAO的切割，未被切割的修饰proPAO，未被切割的修饰proNisP和修饰proPAO，蛋白marker。

Xa因子活性检测方法的建立：参见凝血因子IIa活性检测方法，反应体系包含Xa因子纯品或枸橼酸钠抗凝血浆样本(20μl)，修饰的proNisP(6μl)，修饰的proPAO(20μl)，反应试剂R1(90μl)，反应试剂R2(90μl)。将上述组分加入酶标板小孔中，使用酶标仪振荡混匀反应体系，检测555nm和700nm处的吸光度随时间的变化。

数据处理与绘图：△Abs＝Abs_555nm-Abs_700nm，以时间t为横坐标，△Abs为纵坐标，绘制酶解动力学的散点图，分别对各散点图进行函数拟合以描述相应的反应速率。枸橼酸钠抗凝血浆样本的处理与激活方法参见凝血因子IIa活性检测的实施方案。检测结果如图8所示(图注方框中物质预先混合)。由图8可以看出使用链激酶预处理血浆后，激活状态的凝血因子Xa引起了酶联激活反应。

实施例3.纤溶酶Plasmin活性检测

以编码SEQ ID NO:1的proPAO基因为模板，运用三对相应引物进行重叠延伸PCR，最终获得含有二个Plasmin切割位点(GYRA，SEQ ID NO:23)的DNA片段，完成Plasmin活性检测特异底物序列的构建。氨基酸序列图见SEQ ID NO:5。修饰proPAO特异底物蛋白的表达与纯化参见凝血因子IIa实施方案中的相应描述。

Plasmin活性检测方法的建立：反应体系包含枸橼酸钠抗凝血浆样本(20μl)，特异底物修饰的proPAO(5μl)，反应试剂R1(90μl)，反应试剂R2(90μl)。将上述组分加入酶标板小孔中，使用酶标仪振荡混匀反应体系，检测555nm和700nm处的吸光度随时间的变化。数据处理与绘图参见凝血因子IIa活性检测的实施方案。由于链激酶可以直接激活血浆中的纤溶酶原使之生成纤溶酶，因此，血浆中全激活状态的Plasmin的活性可以通过链激酶的加入直接被检测。检测结果如图9所示。由图9可以看出血浆中的Plasminogen被链激酶激活后生成Plasmin，后者引起酶联激活反应。

实施例4.Caspase-3活性检测

以编码SEQ ID NO:1的proPAO基因为模板，运用三对相应引物进行重叠延伸PCR，最终获得含有二个Caspase-3切割位点的DNA片段，完成Caspase-3活性检测特异底物序列的构建。氨基酸序列图见SEQ ID NO:6。修饰proPAO特异底物蛋白的表达与纯化参见凝血因子IIa实施方案中的相应描述。

Caspase-3蛋白的活性检测方法如下：将定量的Caspase-3与不同浓度的显色底物Ac-DEVD-pNA加入酶标板小孔中，反应体系包含Caspase-3(2μl)，Ac-DEVD-pNA(2μl)，30mMKH₂PO₄/Na₂HPO₄，pH8.0(200μl)，使用酶标仪振荡混匀反应体系，检测405nm处的吸光度随时间的变化。检测结果如图10所示。由图10可以看出在一定浓度的Caspase-3的条件下，提高底物Ac-DEVD-pNA的浓度可以增大反应速率。该反应可以得到一定质量Caspase-3对应的酶活力单位。

Caspase-3活性检测方法的建立：反应体系包含血清样本(20μl)，特异底物修饰proPAO(5μl)，反应试剂R1(90μl)，反应试剂R2(90μl)。将上述组分加入酶标板小孔中，使用酶标仪振荡混匀反应体系，检测555nm和700nm处的吸光度随时间的变化。数据处理与绘图参见凝血因子IIa活性检测的实施方案。该反应可以直接检测血清中Caspase-3对含有Caspase-3特异切割序列的修饰proPAO的激活反应。检测结果如图11所示。由图11可以看出不同血清标本中所含的Caspase-3对修饰proPAO的酶联激活反应速率不同。

实施例5.C5转化酶活性检测

以编码SEQ ID NO:1的proPAO基因为模板，运用三对相应引物进行重叠延伸PCR，最终获得含有二个C5转化酶切割位点的DNA片段，完成C5转化酶活性检测特异底物序列的构建。氨基酸序列图见SEQ ID NO:7。C5转化酶特异底物蛋白修饰proPAO的表达与纯化参见凝血因子IIa实施方案中的相应描述。

C5转化酶活性检测方法的建立：反应体系包含血清样本(20μl)，特异底物修饰proPAO(15μl)，反应试剂R1(90μl)，反应试剂R2(90μl)。将上述组分加入酶标板小孔中，使用酶标仪振荡混匀反应体系，检测555nm和700nm处的吸光度随时间的变化。数据处理与绘图参见凝血因子IIa活性检测的实施方案。该反应可以直接检测血清中C5转化酶对含有该酶特异切割序列的修饰proPAO的激活反应。检测结果如图12所示。由图12可以看出不同血清标本中所含的C5转化酶对修饰proPAO的酶联激活反应速率不同。

比较例6

除了苯丙氨酸氧化酶酶原，本发明还选用了其他的酶原并进行特异底物的改造，用来检测人体内蛋白酶的活性。在一些实施方案中，选用了两种不同来源的多酚氧化酶酶原，分别为Prophenoloxidase(signal crayfish Pacifastacus leniusculus)(简称为proCPO)和Prophenoloxidase 1(Drosophila melanogaster)(简称为proDPO)。检测结果显示，相应蛋白酶对修饰底物proCPO的激活作用在大约100min后才开始显现，相应蛋白酶对修饰底物proDPO几乎无激活作用(如图13所示)。该结果表明这两种重组酶原底物的灵敏度较低，检测时间较长，并且在血浆中不稳定。

这些比较实验显示了苯丙氨酸氧化酶酶原作为底物酶的优势，它具有特异性好，灵敏度高，检测时间短，方便制备等多种优点。

比较例7

关于苯丙氨酸氧化酶酶原的改造位置和具体序列，本发明中还进行了将特定酶切位点序列只插入到α亚基与β亚基之间，试验过程如下：以编码SEQ ID NO:1的proPAO基因为模板，运用二对相应引物进行重叠延伸PCR，获得含有一个凝血因子IIa切割位点的DNA片段(苯丙氨酸氧化酶酶原序列中的α亚基与β亚基间)，完成凝血因子IIa活性检测特异底物序列的构建。修饰proPAO的表达与纯化、凝血因子IIa的活性检测方法参见凝血因子IIa实施方案中的相应描述。检测结果如图14所示。由图14可以看出血浆样本中凝血因子IIa的活性几乎不能被检测到。

可以看出，苯丙氨酸氧化酶酶原的前导肽序列和α亚基之间、α亚基与β亚基之间分别含有特定的酶切位点时，才能够完成某种蛋白酶活性的检测。

比较例8

对于某种特定的蛋白酶激活反应，在苯丙氨酸氧化酶酶原中没有插入该种蛋白酶偏爱的切割位点序列时，无法检测酶原激活反应。试验过程如下：以proPAO基因为模板，运用三对相应引物进行重叠延伸PCR，获得含有一个来源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的SplB蛋白酶切割位点(WELQ，SEQ ID NO:68)的DNA片段，完成特异底物序列的构建。特异底物蛋白修饰proPAO的表达与纯化、凝血因子IIa的活性检测方法参见凝血因子IIa实施方案中的相应描述。检测结果如图15所示。由图15可以看出使用不含有凝血因子IIa切割位点序列的proPAO时，无法检测到血浆样本中凝血因子IIa的活性，同时无显色反应。因此在本实施案例中，选择在苯丙氨酸氧化酶酶原中插入相应蛋白酶特异切割序列，使得检测反应具有速度快、灵敏度高等优势。

序列表

SEQ ID NO:1：来自Psuedomonas Sp.P-501的苯丙氨酸氧化酶酶原氨基酸序列

前导肽序列以粗体双下划线显示，α亚基以虚线下划线显示，β亚基以实线下划线显示，连接α与β亚基的前体接头以粗体显示。

SEQ ID NO:2：含有两个凝血因子IIa切割位点的来自Psuedomonas Sp.P-501的苯丙氨酸氧化酶酶原的氨基酸序列(凝血因子IIa底物特异性proPAO)

前导肽序列以粗体双下划线显示，α亚基以虚线下划线显示，β亚基以实线下划线显示。凝血因子IIa的切割识别序列LRPR分别位于前导肽序列与α亚基之间，α亚基与β亚基之间，以粗斜体显示。

SEQ ID NO:3：含有两个凝血因子Xa切割位点的来自乳酸链球菌(Streptococcuslactis)的NisP酶酶原proNisP(凝血因子Xa底物特异性proNisP)

前导肽序列以双下划线显示。凝血因子Xa的切割识别序列IEGR分别位于前导肽序列与催化亚基之间，以粗斜体显示。

SEQ ID NO:4：含有两个NisP切割位点的来自Psuedomonas Sp.P-501的苯丙氨酸氧化酶酶原(NisP底物特异性proPAO)

前导肽序列以粗体双下划线显示，α亚基以虚线下划线显示，β亚基以实线下划线显示。NisP的识别切割序列ASPRI分别位于前导肽序列与α亚基之间，α亚基与β亚基之间，以粗斜体显示。

SEQ ID NO:5：含有两个Plasmin切割位点的来自Psuedomonas Sp.P-501的苯丙氨酸氧化酶酶原(Plasmin特异性proPAO)

前导肽序列以粗体双下划线显示，α亚基以虚线下划线显示，β亚基以实线下划线显示。Plasmin的识别切割序列GYRA分别位于前导肽序列与α亚基之间，α亚基与β亚基之间，以粗斜体显示。

SEQ ID NO:6：含有两个Caspase-3切割位点的来自Psuedomonas Sp.P-501的苯丙氨酸氧化酶酶原(Caspase-3底物特异性proPAO)

前导肽序列以粗体双下划线显示，α亚基以虚线下划线显示，β亚基以实线下划线显示。Caspase-3的识别切割序列DEVD分别位于前导肽序列与α亚基之间，α亚基与β亚基之间，以粗斜体显示。

SEQ ID NO:7：含有两个C5转化酶切割位点的来自Psuedomonas Sp.P-501的苯丙氨酸氧化酶酶原(C5转化酶底物特异性proPAO)

前导肽序列以粗体双下划线显示，α亚基以虚线下划线显示，β亚基以实线下划线显示。C5转化酶的识别切割序列QLGRLHMK分别位于前导肽序列与α亚基之间，α亚基与β亚基之间，以粗斜体显示。

SEQ ID NO:8：凝血因子IIa的特异性切割序列

Xaa Xaa Xab Arg Xac

其中“Xaa”为任意氨基酸残基，“Xab”为优选自Pro、Ala、Gly或Val的氨基酸残基，“Xac”为优选自Ser、Ala、Gly的氨基酸残基

SEQ ID NO:9：凝血因子IIa的特异性切割序列

Leu Arg Pro Arg

SEQ ID NO:10：凝血因子IIa的特异性切割序列

Leu Val Pro Arg Gly

SEQ ID NO:11：凝血因子IIa的特异性切割序列

Phe Pro Arg

SEQ ID NO:12：凝血因子IIa的特异性切割序列

Gly Arg Gly

SEQ ID NO:13：凝血因子VIIa的特异性切割序列

Leu Ile Gln Arg

SEQ ID NO:14：凝血因子IXa的特异性切割序列

Xaa Xaa Gly Arg

其中“Xaa”为任意氨基酸残基

SEQ ID NO:15：凝血因子IXa的特异性切割序列

Pro Gln Gly Arg

SEQ ID NO:16：凝血因子Xa的特异性切割序列

Xad Xaa Xae Xaf

其中“Xaa”为任意氨基酸残基，“Xad”为优选自Ala或Ile的氨基酸残基，“Xae”为优选自Pro、Phe或Gly的氨基酸残基，“Xaf”为选自Arg或Lys的氨基酸残基

SEQ ID NO:17：凝血因子Xa的特异性切割序列

Ile Glu Gly Arg

SEQ ID NO:18：凝血因子Xa的特异性切割序列

Ile Asp Gly Arg

SEQ ID NO:19：凝血因子XIa的特异性切割序列

Xag Xah Thr Arg

其中“Xag”为优选自Lys或Asp的氨基酸残基，“Xah”为优选自Phe或Leu的氨基酸残基

SEQ ID NO:20：凝血因子XIa的特异性切割序列

Lys Leu Thr Arg

SEQ ID NO:21：凝血因子XIIa的特异性切割序列

Thr Ser Thr Arg

SEQ ID NO:22：纤溶酶Plasmin的特异性切割序列

Xaa Xaa Xai Xaj

其中“Xaa”为任意氨基酸残基，“Xai”为优选自Arg或Lys的氨基酸残基，“Xaj”为优选自Ala、Ser、Gly或Arg的氨基酸残基

SEQ ID NO:23：纤溶酶Plasmin的特异性切割序列

Gly Tyr Arg Ala

SEQ ID NO:24：纤溶酶Plasmin的特异性切割序列

Pro Ala Lys Ala

SEQ ID NO:25：Caspase-2的特异性切割序列

Asp Glu Xaa Asp

其中“Xaa”为任意氨基酸残基

SEQ ID NO:26：Caspase-3的特异性切割序列

Xak Glu Val Asp

其中“Xak”为优选自Asp或Glu的氨基酸残基

SEQ ID NO:27：Caspase-3的特异性切割序列

Asp Glu Val Asp

SEQ ID NO:28：Caspase-6的特异性切割序列

Xaa Glu Xaa Asp

其中“Xaa”为任意氨基酸残基

SEQ ID NO:29：Caspase-7的特异性切割序列

Asp Xaa Xaa Asp

其中“Xaa”为任意氨基酸残基

SEQ ID NO:30：Caspase-8的特异性切割序列

Xal Xam Thr Asp

其中“Xal”为优选自Asp或Leu的氨基酸残基，“Xam”为优选自Glu或Ser的氨基酸残基

SEQ ID NO:31：Caspase-8的特异性切割序列

Asp Glu Thr Asp

SEQ ID NO:32：Caspase-9的特异性切割序列

Xaa Xan Xaa Asp

其中“Xaa”为任意氨基酸残基，“Xan”为优选自Asp或Glu的氨基酸残基

SEQ ID NO:33：Caspase-10的特异性切割序列

Xaa Xao Xap Asp

其中“Xaa”为任意氨基酸残基，“Xao”为优选自Glu、Gln或Ser的氨基酸残基，“Xap”为优选自Thr或Val的氨基酸残基

SEQ ID NO:34：Caspase-14的特异性切割序列

Leu Glu Xaa Asp

其中“Xaa”为任意氨基酸残基

SEQ ID NO:35：补体途径C3/C5转化酶的特异性切割序列

Gln Leu Gly Arg Leu His Met Lys

SEQ ID NO:36：补体途径C3/C5转化酶的特异性切割序列

Gly Leu Ala Arg Ser Asn Leu Asp

SEQ ID NO:37：MMP-8的特异性切割序列

Gly Xaq Xaa Gly

其中“Xaa”为任意氨基酸残基，“Xaq”为优选自Pro、Ala或Ser的氨基酸残基

SEQ ID NO:38：MMP-11的特异性切割序列

Xaa Ala Ala Ala

其中“Xaa”为任意氨基酸残基

SEQ ID NO:39：MMP-12的特异性切割序列

Gly Xar Xas Xas

其中“Xar”为优选自Pro、Ala或Gly的氨基酸残基,“Xas”为优选自Ala或Gly的氨基酸残基

SEQ ID NO:40：MMP-13的特异性切割序列

Gly Pro Xaa Gly Xat

其中“Xaa”为任意氨基酸残基，“Xat”为优选自Leu、Ile或Val的氨基酸残基

SEQ ID NO:41：MMP-13的特异性切割序列

Gly Pro Ala Gly Leu

SEQ ID NO:42：MMP-20的特异性切割序列

Pro Xaa Leu Pro Xau

其中“Xaa”为任意氨基酸残基，“Xau”为优选自Leu或Met的氨基酸残基

SEQ ID NO:43：MMP-20的特异性切割序列

Pro Ala Leu Pro Leu

SEQ ID NO:44：MMP-20的特异性切割序列

Pro Ala Leu Pro Met

SEQ ID NO:45：上游PAO A1-45

5′-catgccatggtgggcgttaccgtcattccccggctgc-3′

SEQ ID NO:46：下游PAO A2-46

5′-gcccgcgtaccttgatcgcacgtggacgcagtcccgggcggtcatgaaga-3′

SEQ ID NO:47：上游PAO B1-47

5′-tcttcatgaccgcccgggactgcgtccacgtgcgatcaaggtacgcgggc-3′

SEQ ID NO:48：下游PAO B2-48

5′-ggaattccatatgttaatgatgatgatgatgatgctggctggtggccagctccgc-3′

SEQ ID NO:49：上游PAO C1-49

5′-cggcctgaaggacgagaagctgcgtccacgtaagattgccaccaccgttg-3′

SEQ ID NO:50：下游PAO C2-50

5′-caacggtggtggcaatcttacgtggacgcagcttctcgtccttcaggccg-3′

SEQ ID NO:51：下游PAO A2-51

5′-gcccgcgtaccttgatcgcaatacgaggagatgctcccgggcggtcatga-3′

SEQ ID NO:52：上游PAO B1-52

5′-tcatgaccgcccgggagcatctcctcgtattgcgatcaaggtacgcgggc-3′

SEQ ID NO:53：上游PAO C1-53

5′-cctgaaggacgagaaggcatctcctcgtattaagattgccaccaccgttg-3′

SEQ ID NO:54：下游PAO C2-54

5′-caacggtggtggcaatcttaatacgaggagatgccttctcgtccttcagg-3′

SEQ ID NO:55：下游PAO A2-55

5′-cagcccgcgtaccttgatcgcacgataacctcccgggcggtcatgaagaa-3′

SEQ ID NO:56：上游PAO B1-56

5′-ttcttcatgaccgcccgggaggttatcgtgcgatcaaggtacgcgggctg-3′

SEQ ID NO:57：上游PAO C1-57

5′-cggcctgaaggacgagaagggttatcgtgcaaagattgccaccaccgttg-3′

SEQ ID NO:58：下游PAO C2-58

5′-caacggtggtggcaatctttgcacgataacccttctcgtccttcaggccg-3′

SEQ ID NO:59：下游PAO A2-59

5′-gcccgcgtaccttgatcgcatcaacttcgtctcccgggcggtcatgaaga-3′

SEQ ID NO:60：上游PAO B1-60

5′-tcttcatgaccgcccgggagacgaagttgatgcgatcaaggtacgcgggc-3′

SEQ ID NO:61：上游PAO C1-61

5′-cggcctgaaggacgagaaggacgaagttgataagattgccaccaccgttg-3′

SEQ ID NO:62：下游PAO C2-62

5′-caacggtggtggcaatcttatcaacttcgtccttctcgtccttcaggccg-3′

SEQ ID NO:63：下游PAO A2-63

5′-cgcgtaccttgatcgctttcatgtgcagacgacccagttgtcccgggcggtcatga-3′

SEQ ID NO:64：上游PAO B1-64

5′-tcatgaccgcccgggacaactgggtcgtctgcacatgaaagcgatcaaggtacgcg-3′

SEQ ID NO:65：上游PAO C1-65

5′-cctgaaggacgagaagcaactgggtcgtctgcacatgaagattgccaccaccgttg-3′

SEQ ID NO:66：下游PAO C2-66

5′-caacggtggtggcaatcttcatgtgcagacgacccagttgcttctcgtccttcagg-3′

SEQ ID NO:67：NisP的特异识别序列

Ala Ser Pro Arg Ile

SEQ ID NO:68：SplB蛋白酶切割位点

Trp Glu Leu Gln

序列表

<110> 北京医院

<120> 经修饰的苯丙氨酸氧化酶酶原及其用途

<130> LZ1811927CN01

<160> 68

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 721

<212> PRT

<213> Psuedomonas Sp.P501

<220>

<221>

<222>

<223> 苯丙氨酸氧化酶酶原氨基酸

<400> 1

Met Val Gly Val Thr Val Ile Pro Arg Leu Leu Gly Leu Lys Asp Glu

1 5 10 15

Lys Lys Ile Ala Thr Thr Val Gly Glu Ala Arg Leu Ser Gly Ile Asn

20 25 30

Tyr Arg His Pro Asp Ser Ala Leu Val Ser Tyr Pro Val Ala Ala Ala

35 40 45

Ala Pro Leu Gly Arg Leu Pro Ala Gly Asn Tyr Arg Ile Ala Ile Val

50 55 60

Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ile Ala Ala Leu Tyr Glu Leu Gly Arg Leu

65 70 75 80

Ala Ala Thr Leu Pro Ala Gly Ser Gly Ile Asp Val Gln Ile Tyr Glu

85 90 95

Ala Asp Pro Asp Ser Phe Leu His Asp Arg Pro Gly Ile Lys Ala Ile

100 105 110

Lys Val Arg Gly Leu Lys Ala Gly Arg Val Ser Ala Ala Leu Val His

115 120 125

Asn Gly Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Ile Tyr Glu Val Gly Ala Met

130 135 140

Arg Phe Pro Glu Ile Ala Gly Leu Thr Trp His Tyr Ala Ser Ala Ala

145 150 155 160

Phe Gly Asp Ala Ala Pro Ile Lys Val Phe Pro Asn Pro Gly Lys Val

165 170 175

Pro Thr Glu Phe Val Phe Gly Asn Arg Val Asp Arg Tyr Val Gly Ser

180 185 190

Asp Pro Lys Asp Trp Glu Asp Pro Asp Ser Pro Thr Leu Lys Val Leu

195 200 205

Gly Val Val Ala Gly Gly Leu Val Gly Asn Pro Gln Gly Glu Asn Val

210 215 220

Ala Met Tyr Pro Ile Ala Asn Val Asp Pro Ala Lys Ile Ala Ala Ile

225 230 235 240

Leu Asn Ala Ala Thr Pro Pro Ala Asp Ala Leu Glu Arg Ile Gln Thr

245 250 255

Lys Tyr Trp Pro Glu Phe Ile Ala Gln Tyr Asp Gly Leu Thr Leu Gly

260 265 270

Ala Ala Val Arg Glu Ile Val Thr Val Ala Phe Glu Lys Gly Thr Leu

275 280 285

Pro Pro Val Asp Gly Val Leu Asp Val Asp Glu Ser Ile Ser Tyr Tyr

290 295 300

Val Glu Leu Phe Gly Arg Phe Gly Phe Gly Thr Gly Gly Phe Lys Pro

305 310 315 320

Leu Tyr Asn Ile Ser Leu Val Glu Met Met Arg Leu Ile Leu Trp Asp

325 330 335

Tyr Ser Asn Glu Tyr Thr Leu Pro Val Thr Glu Asn Val Glu Phe Ile

340 345 350

Arg Asn Leu Phe Leu Lys Ala Gln Asn Val Gly Ala Gly Lys Leu Val

355 360 365

Val Gln Val Arg Gln Glu Arg Val Ala Asn Ala Cys His Ser Gly Thr

370 375 380

Ala Ser Ala Arg Ala Gln Leu Leu Ser Tyr Asp Ser His Asn Ala Val

385 390 395 400

His Ser Glu Ala Tyr Asp Phe Val Ile Leu Ala Val Pro His Asp Gln

405 410 415

Leu Thr Pro Ile Val Ser Arg Ser Gly Phe Glu His Ala Ala Ser Gln

420 425 430

Asn Leu Gly Asp Ala Gly Leu Gly Leu Glu Thr His Thr Tyr Asn Gln

435 440 445

Val Tyr Pro Pro Leu Leu Leu Ser Asp Ser Ser Pro Ala Ala Asn Ala

450 455 460

Arg Ile Val Thr Ala Ile Gly Gln Leu His Met Ala Arg Ser Ser Lys

465 470 475 480

Val Phe Ala Thr Val Lys Thr Ala Ala Leu Asp Gln Pro Trp Val Pro

485 490 495

Gln Trp Arg Gly Glu Pro Ile Lys Ala Val Val Ser Asp Ser Gly Leu

500 505 510

Ala Ala Ser Tyr Val Val Pro Ser Pro Ile Val Glu Asp Gly Gln Ala

515 520 525

Pro Glu Tyr Ser Ser Leu Leu Ala Ser Tyr Thr Trp Glu Asp Asp Ser

530 535 540

Thr Arg Leu Arg His Asp Phe Gly Leu Tyr Pro Gln Asn Pro Ala Thr

545 550 555 560

Glu Thr Gly Thr Ala Asp Gly Met Tyr Arg Thr Met Val Asn Arg Ala

565 570 575

Tyr Arg Tyr Val Lys Tyr Ala Gly Ala Ser Asn Ala Gln Pro Trp Trp

580 585 590

Phe Tyr Gln Leu Leu Ala Glu Ala Arg Thr Ala Asp Arg Phe Val Phe

595 600 605

Asp Trp Thr Thr Asn Lys Thr Ala Gly Gly Phe Lys Leu Asp Met Thr

610 615 620

Gly Asp His His Gln Ser Asn Leu Cys Phe Arg Tyr His Thr His Ala

625 630 635 640

Leu Ala Ala Ser Leu Asp Asn Arg Phe Phe Ile Ala Ser Asp Ser Tyr

645 650 655

Ser His Leu Gly Gly Trp Leu Glu Gly Ala Phe Met Ser Ala Leu Asn

660 665 670

Ala Val Ala Gly Leu Ile Val Arg Ala Asn Arg Gly Asp Val Ser Ala

675 680 685

Leu Ser Thr Glu Ala Arg Pro Leu Val Ile Gly Leu Arg Pro Val Val

690 695 700

Lys Val Pro Ala Ala Glu Leu Ala Thr Ser Gln His His His His His

705 710 715 720

His

<210> 2

<211> 727

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 凝血因子IIa底物特异性proPAO

<400> 2

Met Val Gly Val Thr Val Ile Pro Arg Leu Leu Gly Leu Lys Asp Glu

1 5 10 15

Lys Leu Arg Pro Arg Lys Ile Ala Thr Thr Val Gly Glu Ala Arg Leu

20 25 30

Ser Gly Ile Asn Tyr Arg His Pro Asp Ser Ala Leu Val Ser Tyr Pro

35 40 45

Val Ala Ala Ala Ala Pro Leu Gly Arg Leu Pro Ala Gly Asn Tyr Arg

50 55 60

Ile Ala Ile Val Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ile Ala Ala Leu Tyr Glu

65 70 75 80

Leu Gly Arg Leu Ala Ala Thr Leu Pro Ala Gly Ser Gly Ile Asp Val

85 90 95

Gln Ile Tyr Glu Ala Asp Pro Asp Ser Phe Leu His Asp Arg Pro Gly

100 105 110

Leu Arg Pro Arg Ala Ile Lys Val Arg Gly Leu Lys Ala Gly Arg Val

115 120 125

Ser Ala Ala Leu Val His Asn Gly Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Ile

130 135 140

Tyr Glu Val Gly Ala Met Arg Phe Pro Glu Ile Ala Gly Leu Thr Trp

145 150 155 160

His Tyr Ala Ser Ala Ala Phe Gly Asp Ala Ala Pro Ile Lys Val Phe

165 170 175

Pro Asn Pro Gly Lys Val Pro Thr Glu Phe Val Phe Gly Asn Arg Val

180 185 190

Asp Arg Tyr Val Gly Ser Asp Pro Lys Asp Trp Glu Asp Pro Asp Ser

195 200 205

Pro Thr Leu Lys Val Leu Gly Val Val Ala Gly Gly Leu Val Gly Asn

210 215 220

Pro Gln Gly Glu Asn Val Ala Met Tyr Pro Ile Ala Asn Val Asp Pro

225 230 235 240

Ala Lys Ile Ala Ala Ile Leu Asn Ala Ala Thr Pro Pro Ala Asp Ala

245 250 255

Leu Glu Arg Ile Gln Thr Lys Tyr Trp Pro Glu Phe Ile Ala Gln Tyr

260 265 270

Asp Gly Leu Thr Leu Gly Ala Ala Val Arg Glu Ile Val Thr Val Ala

275 280 285

Phe Glu Lys Gly Thr Leu Pro Pro Val Asp Gly Val Leu Asp Val Asp

290 295 300

Glu Ser Ile Ser Tyr Tyr Val Glu Leu Phe Gly Arg Phe Gly Phe Gly

305 310 315 320

Thr Gly Gly Phe Lys Pro Leu Tyr Asn Ile Ser Leu Val Glu Met Met

325 330 335

Arg Leu Ile Leu Trp Asp Tyr Ser Asn Glu Tyr Thr Leu Pro Val Thr

340 345 350

Glu Asn Val Glu Phe Ile Arg Asn Leu Phe Leu Lys Ala Gln Asn Val

355 360 365

Gly Ala Gly Lys Leu Val Val Gln Val Arg Gln Glu Arg Val Ala Asn

370 375 380

Ala Cys His Ser Gly Thr Ala Ser Ala Arg Ala Gln Leu Leu Ser Tyr

385 390 395 400

Asp Ser His Asn Ala Val His Ser Glu Ala Tyr Asp Phe Val Ile Leu

405 410 415

Ala Val Pro His Asp Gln Leu Thr Pro Ile Val Ser Arg Ser Gly Phe

420 425 430

Glu His Ala Ala Ser Gln Asn Leu Gly Asp Ala Gly Leu Gly Leu Glu

435 440 445

Thr His Thr Tyr Asn Gln Val Tyr Pro Pro Leu Leu Leu Ser Asp Ser

450 455 460

Ser Pro Ala Ala Asn Ala Arg Ile Val Thr Ala Ile Gly Gln Leu His

465 470 475 480

Met Ala Arg Ser Ser Lys Val Phe Ala Thr Val Lys Thr Ala Ala Leu

485 490 495

Asp Gln Pro Trp Val Pro Gln Trp Arg Gly Glu Pro Ile Lys Ala Val

500 505 510

Val Ser Asp Ser Gly Leu Ala Ala Ser Tyr Val Val Pro Ser Pro Ile

515 520 525

Val Glu Asp Gly Gln Ala Pro Glu Tyr Ser Ser Leu Leu Ala Ser Tyr

530 535 540

Thr Trp Glu Asp Asp Ser Thr Arg Leu Arg His Asp Phe Gly Leu Tyr

545 550 555 560

Pro Gln Asn Pro Ala Thr Glu Thr Gly Thr Ala Asp Gly Met Tyr Arg

565 570 575

Thr Met Val Asn Arg Ala Tyr Arg Tyr Val Lys Tyr Ala Gly Ala Ser

580 585 590

Asn Ala Gln Pro Trp Trp Phe Tyr Gln Leu Leu Ala Glu Ala Arg Thr

595 600 605

Ala Asp Arg Phe Val Phe Asp Trp Thr Thr Asn Lys Thr Ala Gly Gly

610 615 620

Phe Lys Leu Asp Met Thr Gly Asp His His Gln Ser Asn Leu Cys Phe

625 630 635 640

Arg Tyr His Thr His Ala Leu Ala Ala Ser Leu Asp Asn Arg Phe Phe

645 650 655

Ile Ala Ser Asp Ser Tyr Ser His Leu Gly Gly Trp Leu Glu Gly Ala

660 665 670

Phe Met Ser Ala Leu Asn Ala Val Ala Gly Leu Ile Val Arg Ala Asn

675 680 685

Arg Gly Asp Val Ser Ala Leu Ser Thr Glu Ala Arg Pro Leu Val Ile

690 695 700

Gly Leu Arg Pro Val Val Lys Val Pro Ala Ala Glu Leu Ala Thr Ser

705 710 715 720

Gln His His His His His His

725

<210> 3

<211> 707

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 凝血因子Xa底物特异性proNisP

<400> 3

Met Gly His His His His His His Gly Gly Ser Gly Lys Lys Ile Leu

1 5 10 15

Gly Phe Leu Phe Ile Val Cys Ser Leu Gly Leu Ser Ala Thr Val His

20 25 30

Gly Glu Thr Thr Asn Ser Gln Gln Leu Leu Ser Asn Asn Ile Asn Thr

35 40 45

Glu Leu Ile Asn His Asn Ser Asn Ala Ile Leu Ser Ser Thr Glu Gly

50 55 60

Ser Thr Thr Asp Ser Ile Asn Leu Gly Ala Gln Ser Pro Ala Val Lys

65 70 75 80

Ser Thr Thr Arg Thr Glu Leu Asp Val Thr Gly Ala Ala Lys Thr Leu

85 90 95

Leu Gln Thr Ser Ala Val Gln Lys Glu Met Lys Val Ser Leu Gln Glu

100 105 110

Thr Gln Val Ser Ser Glu Phe Ser Lys Arg Asp Ser Val Thr Asn Lys

115 120 125

Glu Ala Val Pro Val Ser Lys Asp Glu Leu Leu Glu Gln Ser Glu Val

130 135 140

Val Val Ser Thr Ser Ser Ile Gln Lys Asn Lys Ile Leu Asp Asn Lys

145 150 155 160

Lys Lys Arg Ala Asn Phe Val Thr Ser Ser Pro Leu Ile Lys Glu Lys

165 170 175

Pro Ser Asn Ser Lys Asp Ala Ser Gly Val Ile Asp Asn Ser Ala Ser

180 185 190

Pro Leu Ser Tyr Arg Lys Ala Lys Glu Val Val Ser Leu Arg Ile Glu

195 200 205

Gly Arg Gln Pro Leu Lys Asn Gln Lys Val Glu Ala Gln Pro Leu Leu

210 215 220

Ile Ser Asn Ser Ser Glu Lys Lys Ala Ser Val Tyr Thr Asn Ser His

225 230 235 240

Asp Phe Trp Asp Tyr Gln Trp Asp Met Lys Tyr Val Thr Asn Asn Gly

245 250 255

Glu Ser Tyr Ala Leu Tyr Gln Pro Ser Lys Lys Ile Ser Val Gly Ile

260 265 270

Ile Asp Ser Gly Ile Met Glu Glu His Pro Asp Leu Ser Asn Ser Leu

275 280 285

Gly Asn Tyr Phe Lys Asn Leu Val Pro Lys Gly Gly Phe Asp Asn Glu

290 295 300

Glu Pro Asp Glu Thr Gly Asn Pro Ser Asp Ile Val Asp Lys Met Gly

305 310 315 320

His Gly Thr Glu Val Ala Gly Gln Ile Thr Ala Asn Gly Asn Ile Leu

325 330 335

Gly Val Ala Pro Gly Ile Thr Val Asn Ile Tyr Arg Val Phe Gly Glu

340 345 350

Asn Leu Ser Lys Ser Glu Trp Val Ala Arg Ala Ile Arg Arg Ala Ala

355 360 365

Asp Asp Gly Asn Lys Val Ile Asn Ile Ser Ala Gly Gln Tyr Leu Met

370 375 380

Ile Ser Gly Ser Tyr Asp Asp Gly Thr Asn Asp Tyr Gln Glu Tyr Leu

385 390 395 400

Asn Tyr Lys Ser Ala Ile Asn Tyr Ala Thr Ala Lys Gly Ser Ile Val

405 410 415

Val Ala Ala Leu Gly Asn Asp Ser Leu Asn Ile Gln Asp Asn Gln Thr

420 425 430

Met Ile Asn Phe Leu Lys Arg Phe Arg Ser Ile Lys Val Pro Gly Lys

435 440 445

Val Val Asp Ala Pro Ser Val Phe Glu Asp Val Ile Ala Val Gly Gly

450 455 460

Ile Asp Gly Tyr Gly Asn Ile Ser Asp Phe Ser Asn Ile Gly Ala Asp

465 470 475 480

Ala Ile Tyr Ala Pro Ala Gly Thr Thr Ala Asn Phe Lys Lys Tyr Gly

485 490 495

Gln Asp Lys Phe Val Ser Gln Gly Tyr Tyr Leu Lys Asp Trp Leu Phe

500 505 510

Thr Thr Ala Asn Thr Gly Trp Tyr Gln Tyr Val Tyr Gly Asn Ser Phe

515 520 525

Ala Thr Pro Lys Val Ser Gly Ala Leu Ala Leu Val Val Asp Lys Tyr

530 535 540

Gly Ile Lys Asn Pro Asn Gln Leu Lys Arg Phe Leu Leu Met Asn Ser

545 550 555 560

Pro Glu Val Asn Gly Asn Arg Val Leu Asn Ile Val Asp Leu Leu Asn

565 570 575

Gly Lys Asn Lys Ala Phe Ser Leu Asp Thr Asp Lys Gly Gln Asp Asp

580 585 590

Ala Ile Asn His Lys Ser Met Glu Asn Leu Lys Glu Ser Arg Asp Thr

595 600 605

Met Lys Gln Glu Gln Asp Lys Glu Ile Gln Arg Asn Thr Asn Asn Asn

610 615 620

Phe Ser Ile Lys Asn Asp Phe His Asn Ile Ser Lys Glu Val Ile Ser

625 630 635 640

Val Asp Tyr Asn Ile Asn Gln Lys Met Ala Asn Asn Arg Asn Ser Arg

645 650 655

Gly Ala Val Ser Val Arg Ser Gln Glu Ile Leu Pro Val Thr Ile Glu

660 665 670

Gly Arg Gly Asp Gly Glu Asp Phe Leu Pro Ala Leu Gly Ile Val Cys

675 680 685

Ile Ser Ile Leu Gly Ile Leu Lys Arg Lys Thr Lys Asn His His His

690 695 700

His His His

705

<210> 4

<211> 729

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> NisP底物特异性proPAO

<400> 4

Met Val Gly Val Thr Val Ile Pro Arg Leu Leu Gly Leu Lys Asp Glu

1 5 10 15

Lys Ala Ser Pro Arg Ile Lys Ile Ala Thr Thr Val Gly Glu Ala Arg

20 25 30

Leu Ser Gly Ile Asn Tyr Arg His Pro Asp Ser Ala Leu Val Ser Tyr

35 40 45

Pro Val Ala Ala Ala Ala Pro Leu Gly Arg Leu Pro Ala Gly Asn Tyr

50 55 60

Arg Ile Ala Ile Val Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ile Ala Ala Leu Tyr

65 70 75 80

Glu Leu Gly Arg Leu Ala Ala Thr Leu Pro Ala Gly Ser Gly Ile Asp

85 90 95

Val Gln Ile Tyr Glu Ala Asp Pro Asp Ser Phe Leu His Asp Arg Pro

100 105 110

Gly Ala Ser Pro Arg Ile Ala Ile Lys Val Arg Gly Leu Lys Ala Gly

115 120 125

Arg Val Ser Ala Ala Leu Val His Asn Gly Asp Pro Ala Ser Gly Asp

130 135 140

Thr Ile Tyr Glu Val Gly Ala Met Arg Phe Pro Glu Ile Ala Gly Leu

145 150 155 160

Thr Trp His Tyr Ala Ser Ala Ala Phe Gly Asp Ala Ala Pro Ile Lys

165 170 175

Val Phe Pro Asn Pro Gly Lys Val Pro Thr Glu Phe Val Phe Gly Asn

180 185 190

Arg Val Asp Arg Tyr Val Gly Ser Asp Pro Lys Asp Trp Glu Asp Pro

195 200 205

Asp Ser Pro Thr Leu Lys Val Leu Gly Val Val Ala Gly Gly Leu Val

210 215 220

Gly Asn Pro Gln Gly Glu Asn Val Ala Met Tyr Pro Ile Ala Asn Val

225 230 235 240

Asp Pro Ala Lys Ile Ala Ala Ile Leu Asn Ala Ala Thr Pro Pro Ala

245 250 255

Asp Ala Leu Glu Arg Ile Gln Thr Lys Tyr Trp Pro Glu Phe Ile Ala

260 265 270

Gln Tyr Asp Gly Leu Thr Leu Gly Ala Ala Val Arg Glu Ile Val Thr

275 280 285

Val Ala Phe Glu Lys Gly Thr Leu Pro Pro Val Asp Gly Val Leu Asp

290 295 300

Val Asp Glu Ser Ile Ser Tyr Tyr Val Glu Leu Phe Gly Arg Phe Gly

305 310 315 320

Phe Gly Thr Gly Gly Phe Lys Pro Leu Tyr Asn Ile Ser Leu Val Glu

325 330 335

Met Met Arg Leu Ile Leu Trp Asp Tyr Ser Asn Glu Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Val Thr Glu Asn Val Glu Phe Ile Arg Asn Leu Phe Leu Lys Ala Gln

355 360 365

Asn Val Gly Ala Gly Lys Leu Val Val Gln Val Arg Gln Glu Arg Val

370 375 380

Ala Asn Ala Cys His Ser Gly Thr Ala Ser Ala Arg Ala Gln Leu Leu

385 390 395 400

Ser Tyr Asp Ser His Asn Ala Val His Ser Glu Ala Tyr Asp Phe Val

405 410 415

Ile Leu Ala Val Pro His Asp Gln Leu Thr Pro Ile Val Ser Arg Ser

420 425 430

Gly Phe Glu His Ala Ala Ser Gln Asn Leu Gly Asp Ala Gly Leu Gly

435 440 445

Leu Glu Thr His Thr Tyr Asn Gln Val Tyr Pro Pro Leu Leu Leu Ser

450 455 460

Asp Ser Ser Pro Ala Ala Asn Ala Arg Ile Val Thr Ala Ile Gly Gln

465 470 475 480

Leu His Met Ala Arg Ser Ser Lys Val Phe Ala Thr Val Lys Thr Ala

485 490 495

Ala Leu Asp Gln Pro Trp Val Pro Gln Trp Arg Gly Glu Pro Ile Lys

500 505 510

Ala Val Val Ser Asp Ser Gly Leu Ala Ala Ser Tyr Val Val Pro Ser

515 520 525

Pro Ile Val Glu Asp Gly Gln Ala Pro Glu Tyr Ser Ser Leu Leu Ala

530 535 540

Ser Tyr Thr Trp Glu Asp Asp Ser Thr Arg Leu Arg His Asp Phe Gly

545 550 555 560

Leu Tyr Pro Gln Asn Pro Ala Thr Glu Thr Gly Thr Ala Asp Gly Met

565 570 575

Tyr Arg Thr Met Val Asn Arg Ala Tyr Arg Tyr Val Lys Tyr Ala Gly

580 585 590

Ala Ser Asn Ala Gln Pro Trp Trp Phe Tyr Gln Leu Leu Ala Glu Ala

595 600 605

Arg Thr Ala Asp Arg Phe Val Phe Asp Trp Thr Thr Asn Lys Thr Ala

610 615 620

Gly Gly Phe Lys Leu Asp Met Thr Gly Asp His His Gln Ser Asn Leu

625 630 635 640

Cys Phe Arg Tyr His Thr His Ala Leu Ala Ala Ser Leu Asp Asn Arg

645 650 655

Phe Phe Ile Ala Ser Asp Ser Tyr Ser His Leu Gly Gly Trp Leu Glu

660 665 670

Gly Ala Phe Met Ser Ala Leu Asn Ala Val Ala Gly Leu Ile Val Arg

675 680 685

Ala Asn Arg Gly Asp Val Ser Ala Leu Ser Thr Glu Ala Arg Pro Leu

690 695 700

Val Ile Gly Leu Arg Pro Val Val Lys Val Pro Ala Ala Glu Leu Ala

705 710 715 720

Thr Ser Gln His His His His His His

725

<210> 5

<211> 726

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> Plasmin特异性proPAO

<400> 5

Met Val Gly Val Thr Val Ile Pro Arg Leu Leu Gly Leu Lys Asp Glu

1 5 10 15

Lys Gly Tyr Arg Ala Lys Ile Ala Thr Thr Val Gly Glu Ala Arg Leu

20 25 30

Ser Gly Ile Asn Tyr Arg His Pro Asp Ser Ala Leu Val Ser Tyr Pro

35 40 45

Val Ala Ala Ala Ala Pro Leu Gly Arg Leu Pro Ala Gly Asn Tyr Arg

50 55 60

Ile Ala Ile Val Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ile Ala Ala Leu Tyr Glu

65 70 75 80

Leu Gly Arg Leu Ala Ala Thr Leu Pro Ala Gly Ser Gly Ile Asp Val

85 90 95

Gln Ile Tyr Glu Ala Asp Pro Asp Ser Phe Leu His Asp Arg Pro Gly

100 105 110

Gly Tyr Arg Ala Ile Lys Val Arg Gly Leu Lys Ala Gly Arg Val Ser

115 120 125

Ala Ala Leu Val His Asn Gly Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Ile Tyr

130 135 140

Glu Val Gly Ala Met Arg Phe Pro Glu Ile Ala Gly Leu Thr Trp His

145 150 155 160

Tyr Ala Ser Ala Ala Phe Gly Asp Ala Ala Pro Ile Lys Val Phe Pro

165 170 175

Asn Pro Gly Lys Val Pro Thr Glu Phe Val Phe Gly Asn Arg Val Asp

180 185 190

Arg Tyr Val Gly Ser Asp Pro Lys Asp Trp Glu Asp Pro Asp Ser Pro

195 200 205

Thr Leu Lys Val Leu Gly Val Val Ala Gly Gly Leu Val Gly Asn Pro

210 215 220

Gln Gly Glu Asn Val Ala Met Tyr Pro Ile Ala Asn Val Asp Pro Ala

225 230 235 240

Lys Ile Ala Ala Ile Leu Asn Ala Ala Thr Pro Pro Ala Asp Ala Leu

245 250 255

Glu Arg Ile Gln Thr Lys Tyr Trp Pro Glu Phe Ile Ala Gln Tyr Asp

260 265 270

Gly Leu Thr Leu Gly Ala Ala Val Arg Glu Ile Val Thr Val Ala Phe

275 280 285

Glu Lys Gly Thr Leu Pro Pro Val Asp Gly Val Leu Asp Val Asp Glu

290 295 300

Ser Ile Ser Tyr Tyr Val Glu Leu Phe Gly Arg Phe Gly Phe Gly Thr

305 310 315 320

Gly Gly Phe Lys Pro Leu Tyr Asn Ile Ser Leu Val Glu Met Met Arg

325 330 335

Leu Ile Leu Trp Asp Tyr Ser Asn Glu Tyr Thr Leu Pro Val Thr Glu

340 345 350

Asn Val Glu Phe Ile Arg Asn Leu Phe Leu Lys Ala Gln Asn Val Gly

355 360 365

Ala Gly Lys Leu Val Val Gln Val Arg Gln Glu Arg Val Ala Asn Ala

370 375 380

Cys His Ser Gly Thr Ala Ser Ala Arg Ala Gln Leu Leu Ser Tyr Asp

385 390 395 400

Ser His Asn Ala Val His Ser Glu Ala Tyr Asp Phe Val Ile Leu Ala

405 410 415

Val Pro His Asp Gln Leu Thr Pro Ile Val Ser Arg Ser Gly Phe Glu

420 425 430

His Ala Ala Ser Gln Asn Leu Gly Asp Ala Gly Leu Gly Leu Glu Thr

435 440 445

His Thr Tyr Asn Gln Val Tyr Pro Pro Leu Leu Leu Ser Asp Ser Ser

450 455 460

Pro Ala Ala Asn Ala Arg Ile Val Thr Ala Ile Gly Gln Leu His Met

465 470 475 480

Ala Arg Ser Ser Lys Val Phe Ala Thr Val Lys Thr Ala Ala Leu Asp

485 490 495

Gln Pro Trp Val Pro Gln Trp Arg Gly Glu Pro Ile Lys Ala Val Val

500 505 510

Ser Asp Ser Gly Leu Ala Ala Ser Tyr Val Val Pro Ser Pro Ile Val

515 520 525

Glu Asp Gly Gln Ala Pro Glu Tyr Ser Ser Leu Leu Ala Ser Tyr Thr

530 535 540

Trp Glu Asp Asp Ser Thr Arg Leu Arg His Asp Phe Gly Leu Tyr Pro

545 550 555 560

Gln Asn Pro Ala Thr Glu Thr Gly Thr Ala Asp Gly Met Tyr Arg Thr

565 570 575

Met Val Asn Arg Ala Tyr Arg Tyr Val Lys Tyr Ala Gly Ala Ser Asn

580 585 590

Ala Gln Pro Trp Trp Phe Tyr Gln Leu Leu Ala Glu Ala Arg Thr Ala

595 600 605

Asp Arg Phe Val Phe Asp Trp Thr Thr Asn Lys Thr Ala Gly Gly Phe

610 615 620

Lys Leu Asp Met Thr Gly Asp His His Gln Ser Asn Leu Cys Phe Arg

625 630 635 640

Tyr His Thr His Ala Leu Ala Ala Ser Leu Asp Asn Arg Phe Phe Ile

645 650 655

Ala Ser Asp Ser Tyr Ser His Leu Gly Gly Trp Leu Glu Gly Ala Phe

660 665 670

Met Ser Ala Leu Asn Ala Val Ala Gly Leu Ile Val Arg Ala Asn Arg

675 680 685

Gly Asp Val Ser Ala Leu Ser Thr Glu Ala Arg Pro Leu Val Ile Gly

690 695 700

Leu Arg Pro Val Val Lys Val Pro Ala Ala Glu Leu Ala Thr Ser Gln

705 710 715 720

His His His His His His

725

<210> 6

<211> 727

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> Caspase-3底物特异性proPAO

<400> 6

Met Val Gly Val Thr Val Ile Pro Arg Leu Leu Gly Leu Lys Asp Glu

1 5 10 15

Lys Asp Glu Val Asp Lys Ile Ala Thr Thr Val Gly Glu Ala Arg Leu

20 25 30

Ser Gly Ile Asn Tyr Arg His Pro Asp Ser Ala Leu Val Ser Tyr Pro

35 40 45

Val Ala Ala Ala Ala Pro Leu Gly Arg Leu Pro Ala Gly Asn Tyr Arg

50 55 60

Ile Ala Ile Val Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ile Ala Ala Leu Tyr Glu

65 70 75 80

Leu Gly Arg Leu Ala Ala Thr Leu Pro Ala Gly Ser Gly Ile Asp Val

85 90 95

Gln Ile Tyr Glu Ala Asp Pro Asp Ser Phe Leu His Asp Arg Pro Gly

100 105 110

Asp Glu Val Asp Ala Ile Lys Val Arg Gly Leu Lys Ala Gly Arg Val

115 120 125

Ser Ala Ala Leu Val His Asn Gly Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Ile

130 135 140

Tyr Glu Val Gly Ala Met Arg Phe Pro Glu Ile Ala Gly Leu Thr Trp

145 150 155 160

His Tyr Ala Ser Ala Ala Phe Gly Asp Ala Ala Pro Ile Lys Val Phe

165 170 175

Pro Asn Pro Gly Lys Val Pro Thr Glu Phe Val Phe Gly Asn Arg Val

180 185 190

Asp Arg Tyr Val Gly Ser Asp Pro Lys Asp Trp Glu Asp Pro Asp Ser

195 200 205

Pro Thr Leu Lys Val Leu Gly Val Val Ala Gly Gly Leu Val Gly Asn

210 215 220

Pro Gln Gly Glu Asn Val Ala Met Tyr Pro Ile Ala Asn Val Asp Pro

225 230 235 240

Ala Lys Ile Ala Ala Ile Leu Asn Ala Ala Thr Pro Pro Ala Asp Ala

245 250 255

Leu Glu Arg Ile Gln Thr Lys Tyr Trp Pro Glu Phe Ile Ala Gln Tyr

260 265 270

Asp Gly Leu Thr Leu Gly Ala Ala Val Arg Glu Ile Val Thr Val Ala

275 280 285

Phe Glu Lys Gly Thr Leu Pro Pro Val Asp Gly Val Leu Asp Val Asp

290 295 300

Glu Ser Ile Ser Tyr Tyr Val Glu Leu Phe Gly Arg Phe Gly Phe Gly

305 310 315 320

Thr Gly Gly Phe Lys Pro Leu Tyr Asn Ile Ser Leu Val Glu Met Met

325 330 335

Arg Leu Ile Leu Trp Asp Tyr Ser Asn Glu Tyr Thr Leu Pro Val Thr

340 345 350

Glu Asn Val Glu Phe Ile Arg Asn Leu Phe Leu Lys Ala Gln Asn Val

355 360 365

Gly Ala Gly Lys Leu Val Val Gln Val Arg Gln Glu Arg Val Ala Asn

370 375 380

Ala Cys His Ser Gly Thr Ala Ser Ala Arg Ala Gln Leu Leu Ser Tyr

385 390 395 400

Asp Ser His Asn Ala Val His Ser Glu Ala Tyr Asp Phe Val Ile Leu

405 410 415

Ala Val Pro His Asp Gln Leu Thr Pro Ile Val Ser Arg Ser Gly Phe

420 425 430

Glu His Ala Ala Ser Gln Asn Leu Gly Asp Ala Gly Leu Gly Leu Glu

435 440 445

Thr His Thr Tyr Asn Gln Val Tyr Pro Pro Leu Leu Leu Ser Asp Ser

450 455 460

Ser Pro Ala Ala Asn Ala Arg Ile Val Thr Ala Ile Gly Gln Leu His

465 470 475 480

Met Ala Arg Ser Ser Lys Val Phe Ala Thr Val Lys Thr Ala Ala Leu

485 490 495

Asp Gln Pro Trp Val Pro Gln Trp Arg Gly Glu Pro Ile Lys Ala Val

500 505 510

Val Ser Asp Ser Gly Leu Ala Ala Ser Tyr Val Val Pro Ser Pro Ile

515 520 525

Val Glu Asp Gly Gln Ala Pro Glu Tyr Ser Ser Leu Leu Ala Ser Tyr

530 535 540

Thr Trp Glu Asp Asp Ser Thr Arg Leu Arg His Asp Phe Gly Leu Tyr

545 550 555 560

Pro Gln Asn Pro Ala Thr Glu Thr Gly Thr Ala Asp Gly Met Tyr Arg

565 570 575

Thr Met Val Asn Arg Ala Tyr Arg Tyr Val Lys Tyr Ala Gly Ala Ser

580 585 590

Asn Ala Gln Pro Trp Trp Phe Tyr Gln Leu Leu Ala Glu Ala Arg Thr

595 600 605

Ala Asp Arg Phe Val Phe Asp Trp Thr Thr Asn Lys Thr Ala Gly Gly

610 615 620

Phe Lys Leu Asp Met Thr Gly Asp His His Gln Ser Asn Leu Cys Phe

625 630 635 640

Arg Tyr His Thr His Ala Leu Ala Ala Ser Leu Asp Asn Arg Phe Phe

645 650 655

Ile Ala Ser Asp Ser Tyr Ser His Leu Gly Gly Trp Leu Glu Gly Ala

660 665 670

Phe Met Ser Ala Leu Asn Ala Val Ala Gly Leu Ile Val Arg Ala Asn

675 680 685

Arg Gly Asp Val Ser Ala Leu Ser Thr Glu Ala Arg Pro Leu Val Ile

690 695 700

Gly Leu Arg Pro Val Val Lys Val Pro Ala Ala Glu Leu Ala Thr Ser

705 710 715 720

Gln His His His His His His

725

<210> 7

<211> 735

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> C5转化酶底物特异性proPAO

<400> 7

Met Val Gly Val Thr Val Ile Pro Arg Leu Leu Gly Leu Lys Asp Glu

1 5 10 15

Lys Gln Leu Gly Arg Leu His Met Lys Lys Ile Ala Thr Thr Val Gly

20 25 30

Glu Ala Arg Leu Ser Gly Ile Asn Tyr Arg His Pro Asp Ser Ala Leu

35 40 45

Val Ser Tyr Pro Val Ala Ala Ala Ala Pro Leu Gly Arg Leu Pro Ala

50 55 60

Gly Asn Tyr Arg Ile Ala Ile Val Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ile Ala

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Glu Leu Gly Arg Leu Ala Ala Thr Leu Pro Ala Gly Ser

85 90 95

Gly Ile Asp Val Gln Ile Tyr Glu Ala Asp Pro Asp Ser Phe Leu His

100 105 110

Asp Arg Pro Gly Gln Leu Gly Arg Leu His Met Lys Ala Ile Lys Val

115 120 125

Arg Gly Leu Lys Ala Gly Arg Val Ser Ala Ala Leu Val His Asn Gly

130 135 140

Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Ile Tyr Glu Val Gly Ala Met Arg Phe

145 150 155 160

Pro Glu Ile Ala Gly Leu Thr Trp His Tyr Ala Ser Ala Ala Phe Gly

165 170 175

Asp Ala Ala Pro Ile Lys Val Phe Pro Asn Pro Gly Lys Val Pro Thr

180 185 190

Glu Phe Val Phe Gly Asn Arg Val Asp Arg Tyr Val Gly Ser Asp Pro

195 200 205

Lys Asp Trp Glu Asp Pro Asp Ser Pro Thr Leu Lys Val Leu Gly Val

210 215 220

Val Ala Gly Gly Leu Val Gly Asn Pro Gln Gly Glu Asn Val Ala Met

225 230 235 240

Tyr Pro Ile Ala Asn Val Asp Pro Ala Lys Ile Ala Ala Ile Leu Asn

245 250 255

Ala Ala Thr Pro Pro Ala Asp Ala Leu Glu Arg Ile Gln Thr Lys Tyr

260 265 270

Trp Pro Glu Phe Ile Ala Gln Tyr Asp Gly Leu Thr Leu Gly Ala Ala

275 280 285

Val Arg Glu Ile Val Thr Val Ala Phe Glu Lys Gly Thr Leu Pro Pro

290 295 300

Val Asp Gly Val Leu Asp Val Asp Glu Ser Ile Ser Tyr Tyr Val Glu

305 310 315 320

Leu Phe Gly Arg Phe Gly Phe Gly Thr Gly Gly Phe Lys Pro Leu Tyr

325 330 335

Asn Ile Ser Leu Val Glu Met Met Arg Leu Ile Leu Trp Asp Tyr Ser

340 345 350

Asn Glu Tyr Thr Leu Pro Val Thr Glu Asn Val Glu Phe Ile Arg Asn

355 360 365

Leu Phe Leu Lys Ala Gln Asn Val Gly Ala Gly Lys Leu Val Val Gln

370 375 380

Val Arg Gln Glu Arg Val Ala Asn Ala Cys His Ser Gly Thr Ala Ser

385 390 395 400

Ala Arg Ala Gln Leu Leu Ser Tyr Asp Ser His Asn Ala Val His Ser

405 410 415

Glu Ala Tyr Asp Phe Val Ile Leu Ala Val Pro His Asp Gln Leu Thr

420 425 430

Pro Ile Val Ser Arg Ser Gly Phe Glu His Ala Ala Ser Gln Asn Leu

435 440 445

Gly Asp Ala Gly Leu Gly Leu Glu Thr His Thr Tyr Asn Gln Val Tyr

450 455 460

Pro Pro Leu Leu Leu Ser Asp Ser Ser Pro Ala Ala Asn Ala Arg Ile

465 470 475 480

Val Thr Ala Ile Gly Gln Leu His Met Ala Arg Ser Ser Lys Val Phe

485 490 495

Ala Thr Val Lys Thr Ala Ala Leu Asp Gln Pro Trp Val Pro Gln Trp

500 505 510

Arg Gly Glu Pro Ile Lys Ala Val Val Ser Asp Ser Gly Leu Ala Ala

515 520 525

Ser Tyr Val Val Pro Ser Pro Ile Val Glu Asp Gly Gln Ala Pro Glu

530 535 540

Tyr Ser Ser Leu Leu Ala Ser Tyr Thr Trp Glu Asp Asp Ser Thr Arg

545 550 555 560

Leu Arg His Asp Phe Gly Leu Tyr Pro Gln Asn Pro Ala Thr Glu Thr

565 570 575

Gly Thr Ala Asp Gly Met Tyr Arg Thr Met Val Asn Arg Ala Tyr Arg

580 585 590

Tyr Val Lys Tyr Ala Gly Ala Ser Asn Ala Gln Pro Trp Trp Phe Tyr

595 600 605

Gln Leu Leu Ala Glu Ala Arg Thr Ala Asp Arg Phe Val Phe Asp Trp

610 615 620

Thr Thr Asn Lys Thr Ala Gly Gly Phe Lys Leu Asp Met Thr Gly Asp

625 630 635 640

His His Gln Ser Asn Leu Cys Phe Arg Tyr His Thr His Ala Leu Ala

645 650 655

Ala Ser Leu Asp Asn Arg Phe Phe Ile Ala Ser Asp Ser Tyr Ser His

660 665 670

Leu Gly Gly Trp Leu Glu Gly Ala Phe Met Ser Ala Leu Asn Ala Val

675 680 685

Ala Gly Leu Ile Val Arg Ala Asn Arg Gly Asp Val Ser Ala Leu Ser

690 695 700

Thr Glu Ala Arg Pro Leu Val Ile Gly Leu Arg Pro Val Val Lys Val

705 710 715 720

Pro Ala Ala Glu Leu Ala Thr Ser Gln His His His His His His

725 730 735

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 凝血因子IIa的特异性切割序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> "Xaa"为任意氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> "Xab"为优选自Pro、Ala、Gly或Val的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> "Xac"为优选自Ser、Ala、Gly等的氨基酸残基

<400> 8

Xaa Xaa Xab Arg Xac

1 5

<210> 9

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 凝血因子IIa的特异性切割序列9

<400> 9

Leu Arg Pro Arg

1

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 凝血因子IIa的特异性切割序列10

<400> 10

Leu Val Pro Arg Gly

1 5

<210> 11

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 凝血因子IIa的特异性切割序列11

<400> 11

Phe Pro Arg

1

<210> 12

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 凝血因子IIa的特异性切割序列12

<400> 12

Gly Arg Gly

1

<210> 13

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 凝血因子VIIa的特异性切割序列

<400> 13

Leu Ile Gln Arg

1

<210> 14

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 凝血因子IXa的特异性切割序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2)

<223> “Xaa”为任意氨基酸残基

<400> 14

Xaa Xaa Gly Arg

1

<210> 15

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 凝血因子IXa的特异性切割序列15

<400> 15

Pro Gln Gly Arg

1

<210> 16

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 凝血因子Xa的特异性切割序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> "Xad"为优选自Ala或Ile的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> "Xaa"为任意氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> "Xae"为优选自Pro、Phe或Gly的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> "Xaf"为选自Arg或Lys的氨基酸残基

<400> 16

Xad Xaa Xae Xaf

1

<210> 17

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 凝血因子Xa的特异性切割序列17

<400> 17

Ile Glu Gly Arg

1

<210> 18

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 凝血因子Xa的特异性切割序列18

<400> 18

Ile Asp Gly Arg

1

<210> 19

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 凝血因子XIa的特异性切割序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> "Xag"为优选自Lys或Asp的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> "Xah"为优选自Phe或Leu的氨基酸残基

<400> 19

Xag Xah Thr Arg

1

<210> 20

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 凝血因子XIa的特异性切割序列20

<400> 20

Lys Leu Thr Arg

1

<210> 21

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 凝血因子XIIa的特异性切割序列

<400> 21

Thr Ser Thr Arg

1

<210> 22

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 纤溶酶Plasmin的特异性切割序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> "Xaa"为任意氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> "Xai"为优选自Arg或Lys的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> "Xaj"为优选自Ala、Ser、Gly或Arg的氨基酸残基

<400> 22

Xaa Xaa Xai Xaj

1

<210> 23

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 纤溶酶Plasmin的特异性切割序列23

<400> 23

Gly Tyr Arg Ala

1

<210> 24

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 纤溶酶Plasmin的特异性切割序列24

<400> 24

Pro Ala Lys Ala

1

<210> 25

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> Caspase-2的特异性切割序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> "Xaa"为任意氨基酸残基

<400> 25

Asp Glu Xaa Asp

1

<210> 26

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> Caspase-3的特异性切割序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> "Xak"为优选自Asp或Glu的氨基酸残基

<400> 26

Xak Glu Val Asp

1

<210> 27

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> Caspase-3的特异性切割序列27

<400> 27

Asp Glu Val Asp

1

<210> 28

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> Caspase-6的特异性切割序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> "Xaa"为任意氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> "Xaa"为任意氨基酸残基

<400> 28

Xaa Glu Xaa Asp

1

<210> 29

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> Caspase-7的特异性切割序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(3)

<223> "Xaa"为任意氨基酸残基

<400> 29

Asp Xaa Xaa Asp

1

<210> 30

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> Caspase-8的特异性切割序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> "Xal"为优选自Asp或Leu的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> "Xam"为优选自Glu或Ser的氨基酸残基

<400> 30

Xal Xam Thr Asp

1

<210> 31

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> Caspase-8的特异性切割序列31

<400> 31

Asp Glu Thr Asp

1

<210> 32

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> Caspase-9的特异性切割序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> "Xaa"为任意氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> "Xan"为优选自Asp或Glu的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> "Xaa"为任意氨基酸残基

<400> 32

Xaa Xan Xaa Asp

1

<210> 33

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> Caspase-10的特异性切割序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> "Xaa"为任意氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> "Xao"为优选自Glu、Gln或Ser的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> "Xap"为优选自Thr或Val的氨基酸残基

<400> 33

Xaa Xao Xap Asp

1

<210> 34

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> Caspase-14的特异性切割序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> "Xaa"为任意氨基酸残基

<400> 34

Leu Glu Xaa Asp

1

<210> 35

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 补体途径C3/C5转化酶的特异性切割序列35

<400> 35

Gln Leu Gly Arg Leu His Met Lys

1 5

<210> 36

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 补体途径C3/C5转化酶的特异性切割序列36

<400> 36

Gly Leu Ala Arg Ser Asn Leu Asp

1 5

<210> 37

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> MMP-8的特异性切割序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> "Xaq"为优选自Pro、Ala或Ser的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> "Xaa"为任意氨基酸残基

<400> 37

Gly Xaq Xaa Gly

1

<210> 38

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> MMP-11的特异性切割序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> "Xaa"为任意氨基酸残基

<400> 38

Xaa Ala Ala Ala

1

<210> 39

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> MMP-12的特异性切割序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> "Xar"为优选自Pro、Ala或Gly的氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(4)

<223> "Xas"为优选自Ala或Gly的氨基酸残基

<400> 39

Gly Xar Xas Xas

1

<210> 40

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> MMP-13的特异性切割序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> "Xaa"为任意氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> "Xat"为优选自Leu、Ile或Val的氨基酸残基

<400> 40

Gly Pro Xaa Gly Xat

1 5

<210> 41

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> MMP-13的特异性切割序列41

<400> 41

Gly Pro Ala Gly Leu

1 5

<210> 42

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> MMP-20的特异性切割序列

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> "Xaa"为任意氨基酸残基

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (5)..(5)

<223> "Xau"为优选自Leu或Met的氨基酸残基

<400> 42

Pro Xaa Leu Pro Xau

1 5

<210> 43

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> MMP-20的特异性切割序列43

<400> 43

Pro Ala Leu Pro Leu

1 5

<210> 44

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> MMP-20的特异性切割序列44

<400> 44

Pro Ala Leu Pro Met

1 5

<210> 45

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 上游PAO A1-45

<400> 45

catgccatgg tgggcgttac cgtcattccc cggctgc 37

<210> 46

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 下游PAO A2-46

<400> 46

gcccgcgtac cttgatcgca cgtggacgca gtcccgggcg gtcatgaaga 50

<210> 47

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 上游PAO B1-47

<400> 47

tcttcatgac cgcccgggac tgcgtccacg tgcgatcaag gtacgcgggc 50

<210> 48

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 下游PAO B2-48

<400> 48

ggaattccat atgttaatga tgatgatgat gatgctggct ggtggccagc tccgc 55

<210> 49

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 上游PAO C1-49

<400> 49

cggcctgaag gacgagaagc tgcgtccacg taagattgcc accaccgttg 50

<210> 50

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 下游PAO C2-50

<400> 50

caacggtggt ggcaatctta cgtggacgca gcttctcgtc cttcaggccg 50

<210> 51

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 下游PAO A2-51

<400> 51

gcccgcgtac cttgatcgca atacgaggag atgctcccgg gcggtcatga 50

<210> 52

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 上游PAO B1-52

<400> 52

tcatgaccgc ccgggagcat ctcctcgtat tgcgatcaag gtacgcgggc 50

<210> 53

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 上游PAO C1-53

<400> 53

cctgaaggac gagaaggcat ctcctcgtat taagattgcc accaccgttg 50

<210> 54

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 下游PAO C2-54

<400> 54

caacggtggt ggcaatctta atacgaggag atgccttctc gtccttcagg 50

<210> 55

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 下游PAO A2-55

<400> 55

cagcccgcgt accttgatcg cacgataacc tcccgggcgg tcatgaagaa 50

<210> 56

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 上游PAO B1-56

<400> 56

ttcttcatga ccgcccggga ggttatcgtg cgatcaaggt acgcgggctg 50

<210> 57

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 上游PAO C1-57

<400> 57

cggcctgaag gacgagaagg gttatcgtgc aaagattgcc accaccgttg 50

<210> 58

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 下游PAO C2-58

<400> 58

caacggtggt ggcaatcttt gcacgataac ccttctcgtc cttcaggccg 50

<210> 59

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 下游PAO A2-59

<400> 59

gcccgcgtac cttgatcgca tcaacttcgt ctcccgggcg gtcatgaaga 50

<210> 60

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 上游PAO B1-60

<400> 60

tcttcatgac cgcccgggag acgaagttga tgcgatcaag gtacgcgggc 50

<210> 61

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 上游PAO C1-61

<400> 61

cggcctgaag gacgagaagg acgaagttga taagattgcc accaccgttg 50

<210> 62

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 下游PAO C2-62

<400> 62

caacggtggt ggcaatctta tcaacttcgt ccttctcgtc cttcaggccg 50

<210> 63

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 下游PAO A2-63

<400> 63

cgcgtacctt gatcgctttc atgtgcagac gacccagttg tcccgggcgg tcatga 56

<210> 64

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 上游PAO B1-64

<400> 64

tcatgaccgc ccgggacaac tgggtcgtct gcacatgaaa gcgatcaagg tacgcg 56

<210> 65

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 上游PAO C1-65

<400> 65

cctgaaggac gagaagcaac tgggtcgtct gcacatgaag attgccacca ccgttg 56

<210> 66

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 下游PAO C2-66

<400> 66

caacggtggt ggcaatcttc atgtgcagac gacccagttg cttctcgtcc ttcagg 56

<210> 67

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> NisP的特异识别序列

<400> 67

Ala Ser Pro Arg Ile

1 5

<210> 68

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> SplB蛋白酶切割位点

<400> 68

Trp Glu Leu Gln

1

Claims

1.一种经修饰的苯丙氨酸氧化酶酶原，其特征在于：所述修饰是在苯丙氨酸氧化酶酶原序列中的前导序列与α亚基间以及α亚基与β亚基间引入蛋白酶的特异性识别位点序列。

2.如权利要求1所述的经修饰的苯丙氨酸氧化酶酶原，其来源于Pseudomonas Sp.P-501，东湖假单胞菌(Pseudomonas donghuensis)，茄科雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)UW551或洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)ATCC 25416。

3.如权利要求1或2所述的经修饰的苯丙氨酸氧化酶酶原，所述蛋白酶选自凝血级联蛋白酶，例如凝血因子IIa、Va、VIIa、VIIIa、IXa、Xa、XIa或XIIa；纤溶酶；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶，例如Caspase-1、Caspase-2、Caspase-3、Caspase-4、Caspase-5、Caspase-6、Caspase-7、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10或Caspase-11；补体途径蛋白酶，例如因子C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C3/C5转换酶；MMP家族蛋白酶；NisP酶。

4.如权利要求1或2所述的经修饰的苯丙氨酸氧化酶酶原，所述蛋白酶的特异识别位点序列如SEQ ID NO:8-44、67任一所示。

5.如权利要求1-4任一项所述的经修饰的苯丙氨酸氧化酶酶原，所述苯丙氨酸氧化酶酶原序列如SEQ ID NO:1所示。

6.如权利要求1-5任一项所述的经修饰的苯丙氨酸氧化酶酶原，其序列如SEQ ID NO:2、4-7任一项所示。

7.权利要求1-6中任一项所述的经修饰的苯丙氨酸氧化酶酶原用于检测样品中蛋白酶活性的用途。

8.如权利要求7所述的用途，所述样品选自体液、全血、血浆、血清或组织。

9.一种分离的核酸，其编码权利要求1-6中的任一项所述的经修饰的苯丙氨酸氧化酶酶原。

10.一种表达载体，其包含权利要求9所述的分离的核酸。

11.用权利要求10所述的表达载体转化或转染的宿主细胞。

12.一种检测样品中蛋白酶活性的试剂盒，其包括权利要求1-6任一项所述的经修饰的苯丙氨酸氧化酶酶原。

13.如权利要求12所述的试剂盒，所述试剂盒还包含经修饰的NisP蛋白酶酶原，其在前导肽和催化亚基之间包含酶特异性识别位点序列，例如凝血因子Xa的特异识别序列。