ES2633172T3 - Método para la producción de trombina humana y sus usos - Google Patents

Abstract

Pretrombina-2 mutante caracterizada porque tiene la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 o sus secuencias nucleotídicas codificantes caracterizadas por la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6, respectivamente.

Description

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DESCRIPCION

Metodo para la produccion de trombina humana y sus usos Campo de la invencion

La invencion se refiere al campo de la biotecnologfa. Espedficamente, la invencion se refiere a una pretrombina-2 mutada recombinante estable que es capaz de convertirse ella misma autocataltticamente en a-trombina activa que puede usarse como hemostatico. Otro aspecto de la invencion incluye la aplicacion de la pretrombina-2 recombinante mutada y la a-trombina obtenida por su propia actividad autocatalttica, en el diagnostico y/o pronostico de enfermedades relacionadas con la coagulacion.

Antecedentes de la invencion

La a-trombina desempena un papel importante en la hemostasia y, por tanto, es una protema altamente util para su uso como hemostatico. Actualmente, la a-trombina se utiliza en mas de 1 000 000 de pacientes en los EE.uU. cada ano [1]. La principal fuente de a-trombina es el plasma humano recogido de donantes combinado. El plasma se trata mediante una filtracion y una separacion complicadas, sin embargo, ningun procedimiento es completamente eficaz contra las partmulas virales derivadas de la sangre humana [2].

Como alternativa, puede producirse a-trombina recombinante que esta desprovista de los riesgos de las partmulas virales. La trombina se sintetiza en forma de protrombina que es una de las enzimas proteolfticas que normalmente se sintetizan en su forma inactiva, conocidas como proenzimas o zimogenos, los cuales pueden escindirse por el factor Xa o por la ecarina, una proteasa que se encuentra en el veneno de serpiente, [3] en dos sitios, los enlaces Arg-Thr y Arg-Ile. La escision en el primer sitio del factor Xa da como resultado pretrombina-2, un precursor monocatenario inactivo que tiene el mismo tamano que la a-trombina. La activacion de la pretrombina-2 a a-trombina se produce a traves de la reordenacion interna de la cadena peptfdica inicial tras la escision del enlace Arg-Ile con el factor Xa o por la ecarina [4]. La seccion peptfdica mas corta escindida no sale de la macromolecula de a-trombina, sino que permanece unida a la secuencia peptfdica mas larga a traves de un enlace S-S.

Actualmente, es imposible expresar directamente a-trombina recombinante activa a partir del fragmento del gen correspondiente a la protrombina debido a que la protema resultante siempre sera pretrombina-2 inactiva. La preparacion de pretrombina-2 recombinante y su activacion a a-trombina por ecarina, se ha descrito en la bibliograffa [5]. El principal inconveniente de este procedimiento es la necesidad de emplear ecarina extremadamente peligrosa, el reactivo principal en el veneno de la serpiente Echis carinatus [6], para activar la a-trombina. La eliminacion de la ecarina, disminuye significativamente el rendimiento y aumenta los costes de la preparacion de la a-trombina. Aun asf, no hay seguridad del 100 % de que la a-trombina recombinante no este contaminada con ecarina. Puede utilizarse factor Xa en lugar de ecarina mortal, pero requiere para su funcionamiento optimo un complejo con el factor V, fosfolfpidos de las plaquetas y calcio [7], que tambien deben separarse de la a-trombina.

Por otro lado, las enzimas, tales como la a-trombina se han usado frecuentemente en diferentes ensayos bioanaltticos para la deteccion y la amplificacion de la senal. Se emplean en la cuantificacion de glucosa [8], H2O2 [9], pesticidas [10], colesterol [11] y etanol [12] y son la base para los ensayos ELISA (ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas) [13]. Se han utilizado tecnicas de amplificacion enzimatica [14] para mejorar la sensibilidad de varios ensayos bioanalfticos. En este sentido, el estado de la tecnica desvela un ensayo que incluye una cascada de amplificacion doble en la que la ecarina convirtio la protrombina en a-trombina para digerir un sustrato fluorogeno artificial [15]. Como se ha mencionado anteriormente, la protrombina es una de las enzimas proteolfticas que normalmente se sintetizan en su forma inactiva, conocidas como proenzimas o zimogenos [16]. Cuando el producto de la reaccion de escision de la proenzima cataliza la misma reaccion, el proceso se denomina activacion autocatalttica. Algunos ejemplos de enzimas autocataltticas naturales son el tripsinogeno, el pepsinogeno o el factor XII de coagulacion sangumea. El comportamiento autocatalttico de estas enzimas se podna aplicar con fines analtticos. Ademas, se usan ensayos para determinar la actividad de la a-trombina para evaluar la tasa de coagulacion sangumea, por tanto, es importante desarrollar metodos sensibles para controlar su actividad.

La senal obtenida por una baja concentracion de una enzima puede amplificarse considerablemente por medio de una reaccion autocatalttica. El uso de zimogenos en bioanalisis es limitado, ya que todas las proenzimas autocataltticas naturales conocidas son inestables in vitro y sus preparaciones siempre contienen trazas de las correspondientes enzimas activas [19]. Hasta donde sabemos, todavfa no hay disponibles en el mercado kits basados en proenzimas autocatalfticas naturales. Anteriormente, los inventores usaron las maquinas de ADN auto- replicante basadas en endonucleasas para crear redes de amplificacion de senal [20, 21]. Desafortunadamente, las maquinas de ADN no son estables en lfquidos corporales y no pueden aplicarse para el analisis de muestras derivadas de la sangre.

A pesar de la considerable investigacion en la amplificacion de la senal en bioensayos, espedficamente usando enzimas de auto-replicantes y tambien en la preparacion y en la produccion de estas enzimas, todavfa se necesitan mas estudios. Ademas, todavfa no se ha descubierto una proenzima estable in vitro sin trazas de las enzimas

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activas correspondientes y tambien con actividad autocatalftica, en particular no se divulga en la tecnica anterior acerca de una pretrombina-2 recombinante, con caractensticas autocatalfticas, que muestre estabilidad in vitro, sin trazas de a-trombina.

Descripcion de la invencion

Breve descripcion de la invencion

La presente invencion supera estos problemas de la tecnica mediante la divulgacion de una nueva metodolog^a para la produccion de pretrombina-2 estable recombinante mutante de raton (SEQ ID NO: 1) y humana (SEQ ID NO: 2) que son capaces de convertirse en a-trombina activa ellas mismas autocatalfticamente en ausencia de ecarina o factor Xa o cualquier otra sustancia.

El metodo para la obtencion de una pretrombina-2 estable recombinante mutante consiste en cambiar el sitio de escision de una proenzima recombinante mediante mutagenesis dirigida para obtener una protema estable que pueda ser escindida por la enzima activa correspondiente. Espedficamente, los inventores han modificado el sitio de escision de la pretrombina-2 de raton (SEQ ID NO: 3) y humana (SEQ ID NO: 4) de tipo nativo o silvestre (TS) a un sitio de escision de a-trombina para obtener una enzima autocatalftica artificial estable. La proenzima recombinante mutante es activada por la a-trombina lo que desencadena la reaccion autocatalftica. El concepto de amplificacion de la senal usando enzimas autorreplicantes puede aplicarse para la mejora de la sensibilidad de los ensayos de a- trombina y tambien para la preparacion de diferentes enzimas. Por tanto, la presente invencion muestra una enzima recombinante mutante autocatalftica, la pretrombina-2, y su aplicacion para la amplificacion de la senal en bioensayos para la deteccion de a-trombina/protrombina y para la smtesis de a-trombina recombinante.

Sorprendentemente, la pretrombina-2 mutada descrita en la presente invencion es completamente estable, sin ninguna traza de trombina, ni de ninguna otra proteasa o de cualquier factor, componente, contaminantes, etc. no deseados, que puedan iniciar una escision no deseada y/o no controlada de la pretrombina-2 mutante. La invencion descrita en el presente documento, permite el control total de la autocatalisis de la pretrombina-2 debido a la estabilidad inesperada mostrada por la pretrombina-2 mutada de la invencion. Esta caractenstica de estabilidad de la pretrombina-2 mutada de la presente invencion, tiene como ventaja su uso en ensayos in vitro para la deteccion de a-trombina/protrombina, con mas precision debido a que la pretrombina-2 mutada estable de la invencion no tiene actividad basal autocatalftica debido a contaminantes, como los que se han mencionado anteriormente, y su autocatalisis solamente se desencadena por la cantidad de a-trombina presente en la muestra de ensayo.

Por tanto, en un primer aspecto la presente invencion se refiere a una pretrombina-2 mutante estable y autocatalftica, de origen murino o de origen humano (SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, respectivamente) y sus correspondientes secuencias de codificacion de ADN (SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, respectivamente).

En un segundo aspecto, la invencion se refiere al uso de al menos una de las proenzimas de pretrombina-2 mutada o sus secuencias nucleotfdicas codificantes, como se ha mencionado anteriormente, para la produccion de a- trombina.

En otro aspecto, la invencion se refiere a pretrombina-2 mutante para su uso en la deteccion in vitro de a- trombina/protrombina. En otro aspecto, la invencion se refiere a pretrombina-2 mutante para su uso en el diagnostico in vitro y/o pronostico de enfermedades relacionadas con la coagulacion. Las enfermedades relacionadas con la coagulacion se seleccionan entre el grupo que comprende: hemofilia; trombosis; deficiencia de protrombina heredada, ya sea de tipo I tambien conocida como hipoprotrombinemia, o de tipo II, tambien conocida como disprotrombinemia; deficiencia de protrombina adquirida; smdrome de hipoprotrombinemia y enfermedad de von Willebrand.

En un tercer aspecto, la invencion se refiere a un kit para la deteccion de a-trombina/protrombina en una muestra que comprende la pretrombina-2 mutante como se ha mencionado anteriormente, que comprende al menos una de las proenzimas de pretrombina-2 mutada descritas en la presente invencion. El kit descrito en el presente documento tambien podna incluir otros reactivos, es decir: reactivos de ensayo, tampones y solucion salina esteril u otra base farmaceuticamente aceptable de emulsion y de suspension. Ademas, los kits pueden incluir materiales instructivos que contienen indicaciones (por ejemplo, protocolos) para la practica de los metodos de ensayo de la presente invencion.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso del kit descrito en el presente documento para el diagnostico y/o pronostico in vitro de enfermedades relacionadas con la coagulacion. La enfermedad relacionada con la coagulacion se selecciona entre el grupo que comprende: hemofilia, trombosis, deficiencia de protrombina heredada de tipo I o de tipo II, deficiencia de protrombina adquirida y enfermedad de von Willebrand.

En otro aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo para preparar a-trombina activa usando la pretrombina-2 recombinante mutante descrita en la presente invencion.

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En otro aspecto mas, la invencion se refiere a un metodo de diagnostico y/o pronostico in vitro de enfermedades relacionadas con la coagulacion que comprende determinar en una muestra de un sujeto, el nivel de expresion o actividad de a-trombina/protrombina usando el kit descrito en el presente documento y la comparacion de dicho nivel de expresion con respecto a los valores de expresion obtenidos de controles sanos. La enfermedad relacionada con la coagulacion se selecciona entre el grupo que comprende: hemofilia, trombosis, deficiencia de protrombina heredada de tipo I o de tipo II, deficiencia de protrombina adquirida y enfermedad de von Willebrand. Los niveles de expresion o actividad de a-trombina/protrombina se analizan en una muestra de sangre. Para este fin es extremadamente importante que la pretrombina-2 que se ha de usar en la reaccion de amplificacion en la que se basa el ensayo in vitro sea estable, porque las trazas de trombina o cualesquiera otras proteasas que contaminan la pretrombina-2 que se ha de usar en la deteccion de trombina en muestras biologicas, producinan artefactos.

A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invencion. Sin embargo, para facilidad de referencia, algunos de estos terminos se definiran ahora.

El nivel de expresion o actividad de una a-trombina/protrombina asociada a una enfermedad es informacion en un numero de formas. Por ejemplo, puede usarse una expresion diferencial de una a-trombina/protrombina asociada a una enfermedad en comparacion con un control, como un diagnostico de que un paciente padece la enfermedad. Tambien pueden usarse niveles de expresion o actividad de una a-trombina/protrombina asociada a una enfermedad para controlar el tratamiento y la patologfa de un paciente. Ademas, los niveles de expresion o actividad de la a- trombina/protrombina asociada a una enfermedad pueden permitir la deteccion de farmacos candidatos para alterar un perfil de expresion particular o suprimir un perfil de expresion asociado a una enfermedad. En la presente invencion, los terminos "expresion o actividad" en relacion con los niveles de a-trombina/protrombina se usan indistintamente.

El termino "muestra" se refiere preferentemente a una muestra de un fluido tal como una solucion y mas preferentemente se refiere a una muestra de un fluido corporal. Las muestras de fluidos corporales pueden obtenerse mediante tecnicas bien conocidas e incluyen, preferentemente, muestras de sangre, plasma, suero, mas preferentemente, muestras de plasma.

El termino "sujeto" como se usa en el presente documento se refiere a un animal, preferentemente un mairnfero, mas preferentemente un ser humano, incluyendo los seres humanos tanto jovenes como ancianos de ambos sexos que pueden padecer o estar predispuestos a una patologfa. El sujeto de acuerdo con este aspecto de la presente invencion puede sufrir de una patologfa asociada a la expresion o actividad anormal de la via de coagulacion. Los terminos "sujeto" y "paciente" se podnan usar indistintamente a lo largo de la presente invencion.

La expresion "pretrombina-2 estable" significa, dentro presente invencion, una pretrombina-2 en una muestra sin trombina o cualesquiera otras proteasas o cualquier factor, componente, contaminantes, etc. no deseados, que pueden desencadenar la actividad autocatalftica de la pretrombina-2 en sL

Leyendas de las figuras

Figura 1. Alineamiento de secuencia del sitio de escision de la pretrombina-2 de tipo silvestre (TS) y mutante. El sitio de escision de FXa presente en la pretrombina-2 de TS, correspondiente a los restos IDGRIV, se cambio a IVPRGV que corresponde a un sitio de escision de a-trombina (Th). Los aminoacidos modificados estan subrayados.

Figura 2. Analisis de la pretrombina-2 mutante de raton purificada. A) SDS-PAGE al 12 % tenido con Azul Brillante Coomassie. B) Membrana de nitrocelulosa reconocida por anticuerpos monoclonales de raton anti- marcador His. Calle 1, referencias de masa molecular; carril 2, 0,3 |jg de pretrombina-2 mutante.

Figura 3. Ensayo de estabilidad de la pretrombina-2 mutante humana. Evolucion de la intensidad de fluorescencia en muestras que contienen pretrombina-2 recombinante de tipo silvestre humana (1,6*10‘6 M) (a) o pretrombina-2 recombinante mutante humana (1,6*10‘6 M) (b), con el sustrato fluorogeno rodamina 110, bis- (amida de p-tosil-L-glicil-L-prolil-L-arginina) (4*10‘6 M) (Invitrogen) en Tris-HCl 50 mM, pH 9,0, NaCl 150 mM. Figura 4. Evolucion de la intensidad de fluorescencia en muestras que contienen a) a-trombina de tipo silvestre humana 2,2*10'12 M y pretrombina-2 mutante humana 2,1*10'7 M; b) a-trombina de tipo silvestre humana 2,2*10'12 m y pretrombina-2 mutante de raton 2,1*10'7 M; c) a-trombina de tipo silvestre humana 2,2*10'12 M; d) pretrombina-2 mutante humana 2,1*10'7 M; e) pretrombina-2 mutante de raton 2,1*10'7 M.

Figura 5. Cursos temporales de activacion y autorreplicacion de pretrombina-2 mutante, a) pretrombina-2 mutante escindida 5,38*10'9 M y pretrombina-2 mutante sin tratar 2,3*10'7 M; b) pretrombina-2 mutante escindida 5,38*10'9 M; c) pretrombina-2 mutante sin tratar 2,3*10'7 M.

Figura 6. A) Evolucion de la intensidad de fluorescencia en presencia de pretrombina-2 mutante 5,3*10'7 M (curvas a-h) o en su ausencia (curvas i-p). Las muestras conteman diferentes concentraciones de a-trombina humana: a) e i) 5*10'12 M; b) y j) 3,75*10'12 M; c) y k) 2,5*10'12 M; d) y 1) de 1,5*10'12 M; e) y m) 7,5*10'13 M; f) y n) 5*10'13 M; g) y o) 2,5*10'13 M; h) y p) 0 M. B) Curva de calibracion de a-trombina en presencia (curva a) y en ausencia (curva b) de pretrombina-2 mutante.

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Figura 7. A) Evolucion de la intensidad de fluorescencia en muestras de plasma humano en presencia de pretrombina-2 mutante 1,5x10-6 M (curvas a-f) o en su ausencia (curvas de g-1). Las muestras conteman ecarina 6*10'8 M y diferentes volumenes de plasma humano: a) y g) 2,6 nl; b) y h) 2 nl; c) y i) 1,3 nl; d) y j) 0,67 nl; e) y k)

0. 33.nl; f) y 1) 0 nl. B) Curva de calibracion de plasma humano en presencia (curva a) o en ausencia (curva b) de pretrombina-2 mutante.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se refiere a una pretrombina-2 mutante que se caracteriza por que tiene la SEQ ID NO: 1, o la SEQ ID NO: 2, o sus secuencias nucleotfdicas que las codifican caracterizadas por la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6, respectivamente.

En una realizacion particular de la invencion, la pretrombina-2 mutante es la SEQ ID NO: 2 o su secuencia nucleotidica codificante caracterizada por la SEQ ID NO: 6.

En otra realizacion particular de la invencion, la pretrombina-2 mutante que se caracteriza por tener la SEQ ID NO: 2 o por su secuencia nucleotidica codificante: SEQ ID NO: 6, que es de origen humano.

En otra realizacion particular de la invencion, la pretrombina-2 mutante descrita en la presente invencion se caracteriza por tener actividad autocatalttica y por ser estable in vitro.

La presente invencion tambien se refiere al uso de la pretrombina-2 mutada mencionada anteriormente para la produccion de a-trombina. Ademas, la presente invencion se refiere tambien a la protrombina-2 mutada para su uso en la deteccion in vitro de a-trombina/protrombina en muestras biologicas.

La presente invencion tambien describe el uso de la pretrombina-2 mutada mencionada anteriormente para la fabricacion de un kit para el diagnostico y/o pronostico in vitro de enfermedades relacionadas con la coagulacion.

En una realizacion particular del kit de la presente invencion, la enfermedad relacionada con la coagulacion-se selecciona entre el grupo que comprende: hemofilia, trombosis, deficiencia de protrombina heredada de tipo I o de tipo II, deficiencia de protrombina adquirida y enfermedad de von Willebrand.

La presente invencion tambien describe una pretrombina-2 mutante mencionada anteriormente para su uso en el diagnostico y/o pronostico in vitro de enfermedades relacionadas con la coagulacion. En una realizacion particular, la enfermedad relacionada con la coagulacion se selecciona entre el grupo que comprende: hemofilia, trombosis, deficiencia de protrombina heredada de tipo I o de tipo II, deficiencia de protrombina adquirida y enfermedad de von Willebrand.

La presente invencion tambien se refiere a un metodo para la preparacion de a-trombina que comprende las siguientes etapas:

1. Modificar, preferentemente por mutagenesis dirigida, la secuencia de ADN que codifica el sitio de escision del factor Xa en el gen de la pretrombina-2 de tipo silvestre a una secuencia de ADN que codifica el sitio de escision de a-trombina.

2. Insertar el ADN mutado de la pretrombina-2 en un vector de expresion.

3. Transformar una celula hospedadora con el vector descrito en la etapa anterior.

4. Cultivar la celula huesped transformada de la etapa anterior en un medio de cultivo apropiado.

5. Recoger las celulas transformadas y solubilizar las protemas en cuerpos de inclusion.

6. Aislar el sobrenadante para obtener pretrombina-2 mutante purificada.

7. Poner en contacto la pretrombina-2 mutante purificada obtenida en la etapa anterior con a-trombina.

8. Separar la a-trombina obtenida en la etapa anterior 7.

En una realizacion preferida de la invencion, el metodo descrito en el presente documento se caracteriza porque la secuencia de aminoacidos del sitio de escision del factor Xa en la pretrombina-2 de tipo silvestre es la SEQ ID NO: 17.

En una realizacion preferida de la invencion, el metodo descrito en el presente documento se caracteriza porque la secuencia de aminoacidos del sitio de escision de la trombina en la pretrombina-2 mutante es la SEQ ID NO: 18.

En una realizacion preferida de la invencion, el metodo descrito en el presente documento se caracteriza porque la secuencia de ADN de la pretrombina-2 de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que comprende la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 8.

En una realizacion preferida de la invencion, el metodo descrito en el presente documento se caracteriza porque el vector es preferentemente un plasmido. Se podna usar cualquier vector o plasmido conocido en la tecnica anterior para el mismo fin. En este sentido, puede emplearse cualquier vector adecuado para la expresion en bacterias que

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contenga el promotor T7 y que codifique un marcador de His en N-terminal. Por otro lado, tambien puede usarse en la presente invencion cualquier vector adecuado para expresion en levadura, que contenga promotores inducibles por galactosa o por metanol y que codifique un marcador de His. Mas en particular el plasmido es el plasmido pET- TEV-prethr-2 o el plasmido pQE9-hprethr-2.

En una realizacion preferida de la invencion, el metodo descrito en el presente documento se caracteriza porque la celula hospedadora se selecciona entre el grupo que comprende: celulas bacterianas, celulas de animales y/o levadura.

En una realizacion mas preferida de la invencion la celula hospedadora bacteriana es E. coli, preferentemente, E. coli XL1-blue o E. coli BL21 o cualquier cepa derivada de las mismas.

En una realizacion mas preferida de la invencion la celula hospedadora es una levadura seleccionada entre el grupo que comprende: Saccharomyces sp. o Pichia pastoris o cualquier cepa derivada de las mismas.

En una realizacion preferida de la invencion, el metodo descrito en el presente documento se caracteriza porque la relacion pretrombina-2:a-trombina de la etapa 7 oscilo en 1:10-6.

En una realizacion preferida de la invencion, el metodo descrito en el presente documento se caracteriza porque la purificacion de la a-trombina comprende al menos una etapa de tecnicas de cromatograffa de afinidad.

La presente invencion tambien describe un kit para la deteccion de a-trombina/protrombina en una muestra que comprende la pretrombina-2 mutante, murina o humana, como se desvela en el presente documento.

La presente invencion tambien describe el uso del kit mencionado anteriormente para el diagnostico y/o pronostico in vitro de enfermedades relacionadas con la coagulacion.

En una realizacion preferida, la enfermedad relacionada con la coagulacion se selecciona entre el grupo que comprende: hemofilia, trombosis, deficiencia de protrombina heredada de tipo I o de tipo II, deficiencia de protrombina adquirida y enfermedad de von Willebrand.

La presente invencion tambien describe un metodo de diagnostico y/o pronostico in vitro de enfermedades relacionadas con la coagulacion que comprende la determinacion en una muestra de un sujeto del nivel de expresion o actividad de a-trombina/protrombina usando el kit mencionado anteriormente y la comparacion de dicho nivel de expresion o actividad con respecto a los valores para la misma expresion o actividad obtenidos de controles sanos.

En una realizacion preferida del metodo in vitro, la enfermedad relacionada con la coagulacion-se selecciona entre el grupo que comprende: hemofilia, trombosis, deficiencia de protrombina heredada de tipo I o de tipo II, deficiencia de protrombina adquirida y enfermedad de von Willebrand.

En una realizacion preferida del metodo in vitro, la muestra del sujeto se selecciona entre sangre, plasma y/o suero, mas preferentemente, muestras de plasma.

Aunque tambien pueden usarse cualesquiera metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la practica o el ensayo de la presente invencion, se describen ahora metodos y materiales preferidos.

Los siguientes ejemplos ilustran la invencion y no deben considerarse en un sentido limitante, sino mas bien en un sentido ilustrativo de la invencion.

Ejemplo 1. Clonacion y mutaciones dirigidas especificas del gen de la pretrombina-2

La presente invencion describe el cambio del sitio de escision de una proenzima recombinante, la pretrombina-2, por mutagenesis dirigida, para obtener una enzima autocatalftica artificial estable. Para conseguir este fin, los inventores han clonado el gen de TS de la pretrombina-2 y han modificado el sitio de escision del factor Xa en la misma, a un sitio de escision de la trombina para obtener una enzima autocatalftica artificial estable. La estrategia de mutacion se basa en la conversion del sitio de escision del factor Xa (enlace Arg-Ile) en el sitio de escision de la a-trombina por mutagenesis dirigida para crear una proteasa autorreplicativa.

En resumen, para este enfoque, las secuencias correspondientes a los genes de la pretrombina-2 humana y de raton se clonaron y se introdujeron cinco mutaciones individuales por mutagenesis dirigida, como se ha mencionado anteriormente, con el fin de crear una pretrombina-2 mutante.

En primer lugar, el vector pCMV-SPORT6 que contiene el ADNc de protrombina de raton de longitud completa se obtuvo de Geneservice (RU). El fragmento de pretrombina-2 se amplifico a partir del mismo vector mediante PCR

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utilizando PfuTurbo (Stratagene) y una mezcla de nucleotidos de PCR (Promega). Los cebadores de amplificacion fueron la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 10, que contienen los sitios de restriccion BamHI y XhoI respectivamente. El producto de la PCR se corrio en un gel de agarosa, se purifico con el kit de extraccion de gel QIAquick (Qiagen) y se digirio con BamHI y XhoI (Takara). Posteriormente, el fragmento se purifico usando el kit de purificacion de PCR QIAquick (Qiagen) y se ligo en el vector de expresion pET-TEV, un vector pET-19b modificado mediante la introduccion de un sitio de escision de la proteasa TEV (proporcionado generosamente por el Dr. Lars Backman) dando lugar al plasmido pET TEV-prethr-2. Se verifico la exactitud de la secuencia insertada (MWG Alemania). El plasmido pET-TEV-prethr-2 se uso como molde para mutar el gen de la pretrombina-2. Se introdujeron las mutaciones espedficas dirigidas usando los siguientes cebadores: SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 con el kit de mutagenesis dirigida QuikChange II (Stratagene). Se verifico la exactitud de la secuencia mutante (MWG Alemania).

El vector pOTB7 que contiene el ADNc de longitud completa de la protrombina humana se obtuvo de Geneservice (RU). El fragmento de pretrombina-2 se amplifico a partir del mismo vector mediante PCR usando PfuTurbo (Stratagene) y una mezcla de nucleotidos de PCR (Promega). Los cebadores de amplificacion fueron la SEQ ID NO: 13 y la SEQ ID NO: 14 que contienen los sitios de restriccion SalI y HindIII, respectivamente. El producto de la PCR se corrio en un gel de agarosa, se purifico con el kit de extraccion de gel QIAquick (Qiagen) y se digirio con SalI y HindIII (Takara). Posteriormente, el fragmento se purifico usando el kit de purificacion de PCR QIAquick (Qiagen) y se ligo en el vector de expresion pQE9 (Qiagen), dando lugar al plasmido pQE9-hprethr-2. Se verifico la exactitud de la secuencia insertada (MWG Alemania). El plasmido pQE9-hprethr-2 se uso como molde para mutar el gen de la pretrombina-2 humana. Se introdujeron mutaciones espedficas dirigidas usando los siguientes cebadores SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 con el kit de mutagenesis dirigida QuikChange II (Stratagene). Se verifico la exactitud de la secuencia mutante (MWG Alemania).

Como resultado, el sitio de escision de FXa presente en la pretrombina-2 de tipo silvestre (TS), correspondiente a los restos de la SEQ ID NO: 17, se cambio por los restos de la SEQ ID NO: 18, que corresponden al sitio de escision de trombina. La Figura 1 muestra la alineacion de los sitios de escision de FXa y de la trombina de la pretrombina-2 mutante y del TS, respectivamente. Los aminoacidos modificados estan subrayados. La trombina escinde selectivamente los enlaces Arg-Gly en el fibrinogeno y otros polipeptidos. Los estudios sobre el sitio de escision de la trombina a partir de 30 polipeptidos diferentes, revelo que el sitio de escision optimo tiene la estructura de P4-P3- Pro-Arg-P1'-P2', donde P4 y P3 son aminoacidos hidrofobos y P1' y P2' son aminoacidos no acidos. Se observo tambien que los polipeptidos que conteman Gly en P1' eran especialmente susceptibles a la escision por trombina

[24].

Ejemplo 2. Expresion y purificacion de la pretrombina-2 mutante

El plasmido que contema las secuencias mutadas de la pretrombina-2 humana y de raton se uso para transformar celulas de Escherichia coli y las protemas protrombina-2 mutante humana y de raton, se expresaron y se purificaron.

En particular, se transformaron celulas de Escherichia coli BL21 (DE3) por choque termico con el plasmido que contema el gen de la pretrombina-2 mutante de raton. Las celulas se cultivaron a 37°C en medio Luria-Bertani suplementado con 100 pg/ml de ampicilina hasta alcanzar una DO600 de “0,7. La expresion de las protemas se indujo mediante la adicion de tio-p-D-galactosido de isopropilo 0,1 mM. Las celulas se cultivaron durante 4 horas a 37°C y se recogieron por centrifugacion. Se realizo una purificacion de protemas de cuerpos de inclusion como se describe en Soejima et al. [25] con algunas modificaciones. Despues del replegamiento de las protemas, la muestra se dializo frente a Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM, durante dos dfas a 4°C sin agitacion. La muestra dializada se centrifugo y el sobrenadante resultante se filtro. La fraccion de transferencia se cargo en una columna de afinidad HisTrapTM HP de mquel (GE Healthcare) controlada por un equipo purificador AKTA (GE Healthcare). La protema se eluyo con un gradiente lineal de 0 a 500 mM de imidazol en Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM. La pureza de la protema se investigo por SDS-PAGE al 12%.

El analisis electroforetico de la protema purificada mostro una unica banda correspondiente al tamano esperado (Figura 2A). La identidad de la protema se confirmo por transferencia Western usando anticuerpos contra polipeptidos marcada con His (Figura 2B).

Para la purificacion de la pretrombina-2 humana mutada, se transformaron celulas de Escherichia coli XL1-blue (DE3) por choque termico con el plasmido que contema el gen de pretrombina-2 humana mutante. Las celulas se cultivaron a 37 °C en medio Luria-Bertani suplementado con 100 pg/ml de ampicilina para alcanzar una DO600 de “0,6. La expresion de protemas se indujo mediante la adicion de tio-p-D-galactosido de isopropilo 0,1 mM. Las celulas se cultivaron durante 4 horas a 37 °C y se recogieron por centrifugacion. Se realizo una purificacion de protemas de cuerpos de inclusion como se ha descrito anteriormente para la pretrombina-2 mutante de raton. Despues del replegamiento de las protemas, la muestra se dializo frente a Tris-HCl 50 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM, durante dos dfas a 4 °C sin agitacion. La muestra dializada se centrifugo y el sobrenadante resultante se filtro. La fraccion de transferencia se cargo en una columna de afinidad HiTrapTM HeparinHP de mquel (GE Healthcare) controlada por un equipo purificador AKTA (GE Healthcare). La protema se eluyo con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 2 M en Tris-HCl 50 mM, pH 7,0. La pureza de la protema se investigo por SDS-PAGE al 12 % (Figura 2A).

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T ransferencia Western

Las protemas, la pretrombina-2 mutante de raton y la pretrombina-2 mutante humana, se separaron por SDS-PAGE al 12% y se electrotransfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa. Despues, la membrana se incubo durante 1 h en solucion salina tamponada con fosfato (PBS), que contema Tween 20 al 0,05% y leche desnatada al 10%. Despues, la membrana se lavo con PBS que contema Tween 20 al 0,05% y se incubo con anticuerpos anti-His monoclonales de raton (GE Healthcare) durante 1 h. Despues, la membrana se lavo con PBS que contema Tween 20 al 0,05% y se incubaron adicionalmente con anticuerpos IgG anti-raton secundarios de conejo conjugados con fosfatasa alcalina (Sigma-Aldrich) durante 1 h. Despues de lavar con PBS que contema Tween 20 al 0,05%, las bandas de protema se desarrollaron con una solucion de fosfato/nitro de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo azul de tetrazolio (Fluka) (Figura 2B).

Ejemplo 3. Ensayo de Estabilidad de la pretrombina-2 mutante

Se realizaron ensayos de estabilidad mezclando pretrombina-2 de TS humana o mutante humana (1,6 * 10'6 M) ambas producidas por recombinacion en E. coli, con el sustrato fluorogeno rodamina 110, bis-(amida de p-tosil-L- glicil-L-prolil-L-arginina) (4*10‘6 M) (Invitrogen) en Tris-HCl 50 mM, pH 9,0, NaCl 150 mM. La fluorescencia de las soluciones resultantes se controlo usando A de excitacion = 498 nm y A de emision = 521 nm.

El ensayo de estabilidad mide en tiempo real la actividad enzimatica de la a-trombina activa en presencia del sustrato fluorogeno (p-tosil-Gly-Pro-Arg)2- rodamina 110 (Invitrogen). Este sustrato contiene la secuencia de aminoacidos reconocida por la a-trombina, que es una peptidasa. La trombina escinde el aminoacido liberando la rodamina fluorescente. Durante el ensayo, se midio el aumento de fluorescencia con el tiempo. A mayor actividad enzimatica de la a-trombina mayor es la velocidad de escision, y por tanto la liberacion de rodamina, lo que provoca el aumento de la fluorescencia. La Figura 3 muestra que la pretrombina-2 recombinante humana de TS (a) es menos estable que la pretrombina-2 recombinante humana mutante desvelada en la presente invencion (b). El ensayo con pretrombina-2 recombinante mutada de la invencion no muestra ningun aumento en la fluorescencia durante 15 h (55 000 s). Esto implica que en la preparacion de la pretrombina-2 recombinante mutada de la invencion no hay restos de a-trombina activa, ni se producen durante el tiempo que se realiza el ensayo. Por otro lado, el ensayo con pretrombina-2 recombinante humana de TS muestra un aumento en la fluorescencia desde el comienzo del ensayo. Este aumento de la fluorescencia indica la presencia de a-trombina activa en la preparacion; aunque tambien se obtuvo pretrombina-2 recombinante humana de TS por ingeniena genetica en E. coli. Por tanto, la estabilidad in vitro mostrada por la pretrombina humana mutante de la presente invencion se debio a la mutagenesis operada en el presente documento.

Ejemplo 4. Ensayos de actividad de a-trombina

Con el fin de verificar si la a-trombina humana podfa escindir la pretrombina-2 mutada recombinante humana y de raton, se incubaron ambas protemas recombinantes mutadas con a-trombina humana de TS (Sigma Aldrich) en presencia del sustrato fluorogeno (p-tosil-Gly-Pro-Arg)2-rodamina 110 (Invitrogen). Los ensayos de actividad de la trombina se realizaron en un lector de microplacas Varioskan Flash (Thermo Scientific) usando placas de micropocillos negros a temperatura ambiente. Se incubaron las muestras (100 |jl de volumen final) en Tris-HCl 50 mM, pH 9,0, NaCl 150 mM con rodamina 110 4*10'6 M, bis-(amida de p-tosil-L-glicil-L-prolil-L-arginina) (Invitrogen) y la fluorescencia de la solucion resultante se controlo usando A de excitacion = 498 nm y A de emision = 521 nm.

Los resultados obtenidos del experimento demostraron que en presencia de a-trombina humana de TS, la actividad de la proteasa aumenta considerablemente con el tiempo (Figura 4, curvas a, b), en comparacion con las muestras en las que solo se anadio a-trombina de TS (Figura 4, curva c). Por otra parte, en ausencia de a-trombina de TS, ninguno de los dos mutantes presento actividad enzimatica (Figura 4, curvas d, e), lo que demuestra su estabilidad en las condiciones experimentales. Estos resultados indican claramente que la a-trombina de TS es capaz de escindir ambas pretrombinas-2 mutantes recombinantes para generar enzimas activas con actividad a-trombina. La a-trombina exogena activa la pretrombina-2 mutante recombinante convirtiendola en a-trombina endogena que a su vez escinde otras macromoleculas de pretrombina-2 y el sustrato fluorogeno en el curso de esta reaccion autocatalftica.

Ejemplo 5. Ensayos de autorreplicacion de pretrombina-2 mutante

Otro experimento demostro que la a-trombina endogena generada es capaz de escindir la pretrombina-2 mutada recombinante para mantener el proceso autocatalftico. Una solucion de pretrombina-2 mutada se trato con a- trombina inmovilizada sobre agarosa. Se escindio pretrombina-2 mutante de raton usando el kit Thrombin CleanCleave™ (Sigma-Aldrich) como se describe en las instrucciones del fabricante. Despues, la solucion de protema se filtro a traves de un filtro de 0,22 jm para eliminar cualquier resto. Para investigar la reaccion autocatalftica, se mezclo pretrombina-2 mutante de raton escindida 5,38*10'9 M con y sin pretrombina-2 mutante de raton sin tratar 2,3*10'7 M y con el sustrato fluorogeno (p-tosil-Gly-Pro-Arg)2-rodamina 110 (Invitrogen). Despues, la evolucion de la intensidad de fluorescencia se controlo usando A de excitacion = 498 nm y A de emision = 521 nm.

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La Figura 5 muestra que en presencia de la pretrombina-2 mutante escindido y exceso de la pretrombina-2 mutante no tratada (Figura 5 curva a), la senal de fluorescencia aumento considerablemente en comparacion con la muestra en la que solo se incluyo la pretrombina-2 mutante escindida (Figura 5 curva b). La pretrombina-2 mutante no tratada se trato con la solucion tampon utilizada para lavar la a-trombina sobre agarosa no mostro ninguna actividad (Figura

5 curva c). En consecuencia, el crecimiento de la actividad de la proteasa no fue provocado por la a-trombina exogena que podna haberse desprendido de la agarosa. Este experimento confirma la capacidad de la a-trombina endogena derivada de pretrombina-2 mutada para participar en la reaccion autocatalttica.

Ejemplo 6. Deteccion de a-trombina

Se mezclaron diferentes concentraciones de a-trombina humana (Sigma-Aldrich) con y sin pretrombina-2 mutante de raton no tratada 5,3*10-7 M descrita en el presente documento. Las reacciones se realizaron en Tris-HCl 50 mM, pH 9,0, NaCl 150 mM con rodamina 110 4*10-6 M, bis-(amida de p-tosil-L-glicil-L-prolil-L-arginina) (Invitrogen) y la fluorescencia de la solucion resultante se controlo usando A de excitacion = 498 nm y A de emision = 521 nm.

La Figura 6A muestra la evolucion de las intensidades de fluorescencia para cantidades variables de a-trombina humana mezclada con el sustrato fluorogeno en presencia (Figura 6 curvas a-h) o ausencia (Figura 6 curvas i-p) de pretrombina-2 mutada. Las intensidades de fluorescencia mostraron un crecimiento exponencial en presencia del mutante, lo que apunta al caracter autocatalftico de la reaccion. En dicho caso, las curvas de calibracion de la primera derivada de la intensidad de la fluorescencia con respecto al tiempo dF/dt, que representa la velocidad de reaccion despues de 2 horas, frente al analisis de la concentracion (Figura 6B) son mas informativas que las curvas convencionales [26]. Sobre la base de las curvas de calibracion obtenidas se calculo el lfmite de deteccion de los sistemas operando sin pretrombina-2 mutada (0,488 pM, S/N = 3, n = 3) y con el mutante (10 fM, S/N = 3, n = 3).

Ejemplo 7. Deteccion de protrombina en plasma humano

La presente invencion muestra la ventaja del ensayo amplificado para determinar la protrombina sobre un metodo de cuantificacion no amplificado convencional (Figura 7). Se mezclaron concentraciones variables de plasma humano combinado (Sigma-Aldrich) con ecarina 6*10-8 M (Sigma-Aldrich) con o sin pretrombina-2 mutante de raton 1,5*10'

6 M. Las reacciones se realizaron en Tris-HCl 50 mM, pH 9,0, NaCl 150 mM con rodamina 4*10-6 M 110, bis-(amida de p-tosil-L-glicil-L-prolil-L-arginina) (Invitrogen) y la fluorescencia de la solucion resultante se controlo usando A de excitacion = 498 nm y A de emision = 521 nm.

Los lfmites de deteccion de los ensayos amplificado (7,7 pl, S/N = 3, DTR = 12 %, n = 3) y no amplificado (710 pl, S/N = 3, DTR = 6 %, n = 3) se calcularon de acuerdo con las curvas de calibracion (Figura 7B) que representan dF/dt en el tiempo fijo de 60 min frente al volumen de plasma humano por pocillo de la microplaca. Teniendo en cuenta que el plasma humano por lo general contiene 90 pg/ml de protrombina [27] el ensayo con la amplificacion autocatalttica permitio detectar tan poco como 0,693 pg de protrombina por pocillo de la microplaca. El ensayo no amplificado convencional permitio cuantificar tan poco como 63,9 pg del analito por pocillo. Por tanto, el empleo de cascada de amplificacion autocatalftica permite disminuir el volumen de plasma humano necesario para el ensayo de protrombina en dos ordenes de magnitud.

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[27] J. A. Rob, S. Tollefsen, L. Helgeland, Anal. Biochem. 1997, 245, 222-225.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Asociacion Centro de Investigacion Cooperativa en Biomateriales-CIC biomaGUNE <120> METODO PARA LA PRODUCCION DE TROMBINA HUMANA Y USOS DEL MISMO <130> PCT-05774 <160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 339 <212> PRT <213> Mus musculus

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (3)..(12)

<223> Cola de histidina

<220>

<221> MUTAGEN <222> (79)..(80)

<223> Restos mutados obtenidos por mutagenesis dirigida <220>

<221> MUTAGEN <222> (82)..(82)

<223> Restos mutados obtenidos por mutagenesis dirigida <400> 1

Claims (26)

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   REIVINDICACIONES

   1. Pretrombina-2 mutante caracterizada porque tiene la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 o sus secuencias nucleotidicas codificantes caracterizadas por la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6, respectivamente.
2. 2. Pretrombina-2 mutante de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizada porque tiene actividad autocatalftica y porque es estable in vitro.
3. 3. Uso de la pretrombina-2 mutante de las reivindicaciones 1 a 2 para la produccion de a-trombina.
4. 4. Pretrombina-2 mutante de las reivindicaciones 1 a 2 para su uso en la deteccion in vitro de a- trombina/protrombina.
5. 5. Pretrombina-2 mutante de las reivindicaciones 1 a 2 para su uso en el diagnostico y/o pronostico in vitro de enfermedades relacionadas con la coagulacion.
6. 6. Pretrombina-2 mutante para su uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en la que la enfermedad relacionada con la coagulacion se selecciona entre el grupo que comprende: hemofilia; trombosis; deficiencia de protrombina heredada de tipo o de tipo II; deficiencia de protrombina adquirida; smdrome de hipoprotrombinemia y enfermedad de von Willebrand.
7. 7. Metodo para la preparacion de a-trombina que comprende las etapas siguientes:

   1. Modificar, preferentemente por mutagenesis dirigida, la secuencia de ADN que codifica el sitio de escision del factor Xa en el gen de la pretrombina-2 de tipo silvestre a una secuencia de ADN que codifica el sitio de escision de a-trombina.
8. 2. Insertar el ADN mutado de pretrombina-2 en un vector de expresion.
9. 3. Transformar una celula hospedadora con el vector descrito en la etapa anterior.
10. 4. Cultivar la celula huesped transformada de la etapa anterior en un medio de cultivo apropiado.
11. 5. Recoger las celulas transformadas y solubilizar las protemas en cuerpos de inclusion.
12. 6. Aislar el sobrenadante para obtener pretrombina-2 mutante purificada.
13. 7. Poner en contacto la pretrombina-2 mutante purificada obtenida en la etapa anterior con a-trombina.
14. 8. Separar la a-trombina obtenida en la etapa anterior 7.
15. 8. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 7 en el que la secuencia de aminoacidos del sitio de escision del factor Xa en la pretrombina-2 de tipo silvestre es la SEQ ID NO: 17.
16. 9. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 7 en el que la secuencia de aminoacidos del sitio de escision de la trombina en la pretrombina-2 mutante es la SEQ ID NO: 18.
17. 10. Metodo de acuerdo con la reivindicacion 7 en el que la secuencia de ADN de la pretrombina-2 de tipo silvestre se selecciona entre el grupo que comprende la SEQ ID NO: 7 o la SEQ ID NO: 8.
18. 11. Un kit para la deteccion de a-trombina/protrombina en una muestra que comprende la pretrombina-2 mutante de las reivindicaciones 1 a 2.
19. 12. Uso del kit de la reivindicacion 11 para el diagnostico y/o pronostico in vitro de enfermedades relacionadas con la coagulacion.
20. 13. Uso de acuerdo con la reivindicacion 12 en el que las enfermedades de la coagulacion se seleccionan entre el grupo que comprende: hemofilia; trombosis; deficiencia de protrombina heredada de tipo o de tipo II; deficiencia de protrombina adquirida; smdrome de hipoprotrombinemia y enfermedad de von Willebrand.
21. 14. Un metodo in vitro de diagnostico y/o pronostico de enfermedades relacionadas con la coagulacion que comprende la determinacion en una muestra de un sujeto del nivel de actividad de a-trombina/protrombina usando el kit de la reivindicacion 11 y la comparacion de dicho nivel de actividad con respecto a los valores para la misma actividad obtenidos de controles sanos.
22. 15. Un metodo in vitro de acuerdo con la reivindicacion 14 en el que la enfermedad relacionada con la coagulacion se selecciona entre el grupo que comprende: hemofilia; trombosis; deficiencia de protrombina heredada de tipo o de tipo II; deficiencia de protrombina adquirida; smdrome de hipoprotrombinemia y enfermedad de von Willebrand.

    Figura 1

    TS

    Mutante

    P4 P3 P1 P2’

    FXa

    I D G R I V

    I VP RGV

    Th

    A)

    kDa

    150

    75

    50

    37

    25

    20

    imagen1

    150

    75

    50

    37

    ■' ■ r,r 11 ■ ■

    25

    20

    imagen2

    imagen3

    Figura 3

    20000

    40000

    60000

    Tiempo (s)

    Figura 4

    15 -

    10 -

    521nm

    180

    t / min

    imagen4

    imagen5
23. 0.008

    0X06

    dF/dt

    ti min

    Figura 6

    60 -

    40-

    521nm
24. 0.004
25. 0.002
26. 0.000

    180

    Trombina /pM

    imagen6