JPS5985299A - カルボキシペプチダ−ゼａの活性測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 、　　カル前キシペプチダーゼＡ　１ｉ＃臓由来の蛋白
加水分解酵素であル、膵臓に疾患があると血清、尿など
における活性値が涙化するところから、これらの体液の
活性飼足が臨床検査にｙｒ”Ｊ川されている。

この臨床検査方法は柚々β；ｊう６されているが、その
ひとつにベンゾイル−し−グリシル−Ｌ−７二−ルアラ
＝ンを基質に７１１いて、この基質を一体液中のカルが
キシペグチダ ーゼＡで分解し、分解生成１１ｕであるアミノ酸を油体
クロマトグラフィーなどで分析する方法がある。

この方法祉分析結果に（ｉ’ｉ頼性があｐ実用に供され
ているが、操作が煩雑でがｌｌｋに長時間を要するとい
う問題があった。また、アミノｒｉａｋｊ）　９ｒ’す
る場合には血清等の体液中にもともとアミノ酸が含まれ
ていてこれが分析鞘駄上間組になりでいた。

本発明者らはカルがキシペノチダーゼＡを簡便かつ正確
に検出する方法を開発すべく柚々仙肘の結呆、前記＆負
のベンゾイル基に新たに′目能基を祷大してこの官能基
を利用して定、［１４する方法を眉想するに至った。そ
して、ベンゾイル基にヒドロキシル基、アミノ／Ｉｉｉ
またれメトキシル基７Ｌ−尋人しだ侶足のジペプチドを
基質に用いでカルがキシペグチダーゼＡと反応させれば
、酵素反工し、も組Ｕ−ｔに行なわれ、分解生成物中の
この１能基な利用して分解生成物量を飼足することによ
っで酵素活性を′８Ｊｉ４にかつ正確に側足しうろこと
を見出して、これに晶いて本発ＩＪ！Ｊ　ｋ完成するこ
とができた。

すなわち本発ψｊは、一般式 （式中、Ｘはオルト位または・譬ヅ位に結合される置換
基でめ−て、オルト位′に、１１合される場合にはヒド
ロキシル＆またはアミン基、そして／ｆう位に結合され
る場合に瘉ユヒドロキシル基、アミノ＆またＬメトキシ
ル輌である。Ｙはグリシン、Ｌ−アラニン、し−バリン
、Ｌ−ロイシンまたはし一イソロイシンのいずれかのア
ミノ酸！Ａ基であり、２はＬ−フェニルアラニン、Ｌ−
チロシンまたｔ、ｉ：　Ｌ　−）リフトファンのいずれ
かのアミノ酸残基である。）で示されるジペゾチド訪導
体にカルポキシペグチダーゼＡを作用させて該ジにグチ
ド誘導体を分解させる反応を含む仁とｔ特徴とするカル
ボキシペグチダーゼＡの活性側足方法に聞するものであ
る。

測定対象でるるカルブキシペプチダーゼＡ　ハＪｔＷｆ
臓由来の蛋白加水す解ｔｉｊ累で、（グチドおよび蛋白
質のカルボキシル４−側末端からアミノ酸を順次切断し
ていくエキンペグチ〆−ゼである。このカルブキシペプ
チダーゼＡ）まヒト由来のもののｔｌか各種Ｊ甫乳動物
由来のものも含む。この”カルブキシペプチダーゼＡは
臨床分析の１合には血清とか尿のような体液に＠まれた
状態で測定に供さｉするが、本発明の方法を適用する状
態はこれに駆足６れる屯のではなく、測定目的に応じ柚
々の状態のものであらてよいことはいうまでもない。

基質でめるジペプチドＩみ導体ｔよりＵ連の一般式でボ
されるものであるが、末端の７ミノｈａ　／Ａ基（ｚ）
２Ｌ−７エニルア２ニン、し−チロシン、し−）リフト
ファンのいずれかにしたのは、カル？キシペ！チダーー
Ａがこれらのアミノ酸残基を特に切、ｈＪｉ　Ｌやすい
からである。これらのなかでは、シー７エニルアラニン
が一瞥’；１ｆ＆しく、シーチロシンがその次にタイま
しい。

−ｈ式中央のアミノ酸残基（Ｙ）はグリシン、し−アラ
ニン、し−バリン、Ｌ−μイシン’ｔｌｉＬ−イン目イ
シンのいずれかである。これは左側のベンゾイル部分を
ヒゾリカーゼで切断すること′を考直したものである。

すなわぢ、これらのアミノ酸残基の場合にヒゾリカーゼ
がベンゾイル部分を特に切断しやすいからである。これ
らのなかではし−アラニンが一番１ｔｆましく、グリシ
ンがその次に好ましい。

一般式左側のベンゾイル部分の官能基ｔまオルト位また
は・臂う位に結合され、オルト位の場合の官能基祉ヒド
ロキシル基かアミノ基のいずれかであシ、パ２直の場合
にはヒドロキシル基、アミン晶、メトキシル基のいずれ
かである。これは後述する足置法と前述の酵素反応との
β°、１係で定められたものである。すなわち、このよ
うな＋ｊｉ造のベンゾイル部分を採用することによって
過切な延賦法と結合させることができ、かつカルｒＪｆ
キシベグチダーゼおよびヒグリカーゼのいずれの酵素に
よる反応も順調に行なわせることかできるからである。

このようなゾペグチド誘尋体はいずれ本新規化合物であ
るが、各残基に対応するアミノ酸および安息査酸肪導体
から合成することができる。その゛場合、まず脂肪族ア
ミノ酸のカルボキシルシ（と芳香族アミノ酸のアミノ基
とを結合させてジペプチドを合成し、これに安息査酸訪
導体を結合させてもよく、前に脂肪族アミノ酸と安恩香
１ｙ誘導体を先に結合させて、これに芳香族アミノ酸を
さらに結合させてもよい。

いずれにせよ、ジペプチド＆ｉｉ　ｎの合成は公知のベ
グチド合成法、例えは「ペプチド合成」（丸物■発行１
９７５年１１６〜１５８貞）記載の方法等によル合成す
ればよい。対応するジペグチド〃五市販されているとき
はそれを用いればよｈことはいうまでもない。脂肪族ア
ミノ酸のアミノ基と女息否飲１ヶ４体のカル？キシル基
との反応も公知のベグチド合成法、例えば１ｉｉｌ記に
例示した力がくで１［なえはよい。

合成反応終了後は常法によシ保説基をｔよずし、ｚｊ？
　リスチレンージビニルベンゼンなどのハイポーラスポ
リマーを光崩し九カラムとかシリカダルをりて糾品をイ
）することかできる。

４・５度のジペプチド訪導体とを−１６，０〜９．０倫
緩、幻ましくはＩＪＩ７Ｊ〜８．５程度の緩衝液中で温
阪を３０〜４０℃ＪＪ庇で一定に保って５分〜２時間り
度反工らさせれはよい。後述する定量方法が４−アミノ
アンチピリンを使用する方法、ジアゾニウム塩による方
法および酵素による方法の場合にはジペプチド訪導体の
うち安息香電鋳導体部分と脂肪族アミノ酸部分を切ル１
する必擬がめシ、この切断にはヒノリカーゼを用いるの
かに宜である。ヒグリカーゼには市販品を用いれ−よよ
く、至適−１はＰＩＩ６．０〜８．５程直のもの音用い
れはカルボキシベグチダーゼＡと同時に作用させること
ができる。ヒゾリカーゼの添加量は１−１０００７ｍ４
ｊ鑞、通當２〜１０　Ｕ／１１４程度でよい。定置法が
Ｏｎによる方法、すなわち遊龜される安息香ｔｒｉ　ｂ
ｓ導体の水酸化静電を使用するときれ当該酵素とその補
酵素も加、えておけば足置に必要なすべての反応を一時
に行なわせることができる。

カルボキシにグチダーゼＡをジペプチド肪導体に作用さ
せたのちは、１３「定時開俵に總ｒｌ　、酢酸、Ｅ　Ｄ
　Ｔ　Ａ　％Ｎｈ　Ｉ　０４．８−ヒドロキシギノン、
オルトフェナントロリンなどを加え１カルビキシペプチ
ダーゼＡ、ヒノリカーゼが含まれているときＫはヒグリ
カーゼも、による酵素反応を停止塾せ、カル〆キシペグ
チダーゼＡの反応に基づく糸のに化反金屋ム４４するこ
とによってカルボキシペノチダーゼＡの活性を求める。

この系の変化は物理的手段で検出してもよく、また、ジ
ペプチド訪導体の減少Ｍｉあるへはアミノ酸の増加：ｔ
ｉｔ：を化学的９１級で検出してもよいわけでめるが、
本発ψ」の方法で用いられるジペプチド訪導体の特徴を
清かす点で生成する安息香酸誘導体製を測定するの〃毫
よい。

この女息香酸ｖｊ尋体のに置方法としては、′［口ｊじ
基がヒドロキシル基の場合には４−アミノアンチピリン
を用いる方法と当該ヒドロキシ安息香ＣＰの水酸化酵素
を用いる方法を適用でき、アミノ基の場合には４−アミ
ノアンチピリン法、尚該アミノ安息香酸の水酸化酵素を
用いる方法、およびジアゾニウム塩を用いる方法を適用
で粘る。そして、メトキシル基の場合には当該メトキシ
安息香酸の水酸化酵素を用いる方法を適用できる。これ
らの方法においてはいずれもジペノチド部分が切断され
てい喰ければならないので、通富はカルポキシペグチダ
ーゼＡとともにヒグリカーゼも作用させてからこれらの
方法を適用する。

４−アミノア、フチピリン法ｔよ支息査ｔ４ｙ訪導体に
４−７ミノアンチビリン？Ｌ−酢化剤のイＪ在下で作用
させてキノンイミン色素を生成ｄゼ、この色素による虻
色を比色妃にする方法であシ、例えば特１＋９昭５７−
１０５１９７号に記載されている。

水酸化醇始法れ安息香酸■νｆｄ）・体に当該肪専体の
水酸化酵素を補酵素の存在下で作７１」させてこの補酵
素の度化を比色定ｉｔする方法であシ、補酪系にはニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ　
）　トか二戸チンアミドアデニンソヌクレオチド（ＮＡ
Ｄ　）などが用いられる。この方法は例えば特開昭５７
−　ａ　６９９　ｋ記載−・４されている。

ジアゾニウム塩法は、アミノ安息香Ｃｈｉのアミノ基に
亜硝酸塩を作用壊せてジアゾニウム塩・に皺え、続いて
ｌ−ナフトール−２−スルホン酸カリウムなどの発色試
薬を作用させて比色犀にする力ｉ人であシ、例えば「臨
床化学」第１１谷ム３２号１３８−１４５頁（１９８２
年）に記載されている。

尚、本発明の方法で伯られる活性１１ｉｔ　ｔよ基質に
よりて異なるところから１占性自自には月ｊいた基欠り
、すなわちソペグチド綽導体を明示する必臂がある。

本発明の方法を用いれをよりルーキシペプチダーゼＡＩ
Ｄ）粘性を簡便かつ正確に足ｉすることかでき、し〃・
も短時間に数多くの試料について６１１１　Ｗできると
いう太＠な利点を壱する。

次に、本釦ゆ］の方法に用いるヅペグチド肪尋体の製造
例を示す。

製造例１ ｐ−ヒドロキシベンゾイル−し−アラニル−し−７エニ
ルア２二ン Ｌ−フェニルアラニンエチルエステルｍ　陪ｔ＝ｔｏ、
１モルをジクロロメタン５００　ｆＩｌ　＆４−　ＪＢ
１＋７ｔ’Ｊさせてこの蝕濁赦にトリエチルアミン０．
１モルを加えた。

次ニ、カルｙｌｅベンゾキシ−し一アラニン０．１モル
を加え、水冷下でさらにｌ−エチル−３（３−ジメチル
アミノノロビル）カルボジイミド０．１％ルを加えた。

混合液を冷温で３時間攪拌した。こうして得られた反応
Ｑ　ｔｏ、　１％炭はナトリウム水浴液で３回、０．Ｉ
Ｎ＃Ｌ酸で３回、そして盛溜水で３回沈漬した。況捗後
は無水硫酸す）　ＩＪウムで乾燥し、減圧下でジクロロ
メタンを除いて、カルボベンゾキシ−し一アラニルーし
一フェニル７ラニンエチルエステルヲ得り。

これに２５％英化水系（ａ＋；　ＩＭ浴敢２６０ｄを水
冷下でカロえ、１時間攪拌した。次に、ｐＨ（（水工チ
ルエーテル５ｔを加え、生じた沈澱をｐ遇して集めてエ
チルエーテルで十分にＩｔｔｉ’シ、Ｌ−アラニ／ｌ／
　−し−７エニルアラニンエチルエステル臭化水素ａｋ
塩を得た。

この臭化水素酸塩０．０５モルをジクロロメタン２５０
Ｍに懸濁させて、これにトリエチルアミン０．０５モル
およびｐ−アセトキシ安息香［０，０５モルを加えた。

水冷下で１−エチル−３（３−ジメチルアミノノロビル
）カルボシイミド０．０５モルを加えて冷温で３１１．
７１ＨＪ攪拌した。この反応数を０、１％炭敞水素ナト
リウム水浴亀で３ＩＣ！Ｊ、０．１Ｎ塙酸で３回、続い
て蒸溜水で３１洗１’／）Ｌ、硫酸ナトリウムで乾燥し
た。乾燥物から減圧下でジクロロメタンを除いてｐ−ア
セトキシベンゾイル−し−アラニル−し−７エニルアラ
ニンエチルエステルを得た。

得られたジペグチド誘導体エチルエステル０．０２％ｋ
をメタノール５０１／に溶解し、Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨ７０
Ｍを水冷下で加えて室温で２時間攪拌した。この反応液
をＩＮ塩酸で〆Ｉ７にｍｕしてから減圧下で溶媒を留去
し、残渣を８ｖ四の水溶紗とし、ポリスチレン−ジビニ
ルベンゼン系のハイ１８−ラス？リマーＨＰ−２００（
三菱化成工業■製品）乞元撫したカラムに５に包−樹層
の割合で通液し、流出滴のＵＶ　２８０　ｎｍ吸収区分
を集めてｐ−ヒ・ドロキシベンゾイル−し−アジニル−
し−７エニルアシニン６．４１を得た。このものの融点
は２１１−２１１．６℃（分解）であυ、亦外線吸収ス
にり“トルは第１図に示すとおシであった。

ル（、゛造例２ ｐ−ヒドロキシベンゾイルダリシルーし一７エニルアラ
ニン カルポベンゾキシグリシン０．１モルにジクロロメタン
５００ｔｘｌＫ溶解し、これにＬ−フェニルアラニンエ
チルエステル０．１モルｆ：　加；Ｌ　ｆｃ、。０℃の
水浴中で冷却し、ジシクロへキシルカルボジイミド０．
１モルを加えて一夜位拌した。

反応液を０．１％炭酸ナトリウム水浴蔽で３回、０．１
規定塩酸で３回、そしてに沿！水で３回ｆ９Ｌ、ＩＪｋ
シ、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下でジクロロ
メタンを除きカルがベンゾキシグリシル−Ｌ−７エニル
ア２ニンエチルユ、ステル’ｆｔ：　４’Ｊ　ｆｃ。

これに臭化水累飽和酢１１２２５０　ｍｌ　ｆ加え、冷
温で３０分間捜拌した。熱水エチルエーテル５ｔを加え
て生じた沈殿を濾過して其めてエチルエーテルで十分沈
漬し、グリシル’Ｌ−フェニルアラニンエチルエステル
の臭化水素酸塩を得た。

この臭化水素酸塩０．０５モル、ｐ−アセトキシ安息ｆ
＃Ｒ０，０５モルおよびトリエチルアミン０．０５モル
をジクロロメタン２５０　ｍｌに浴ＰＪ！１′シ、ｏｃ
に冷却後ジシクロへキシルカルボジイミド０．０５モル
を加えて一夜句拌した。反Ｌｃ、＋　１？ｔを０．１％
炭岐水素ナトリウム水溶教および０．１規足塙を狭で洗
ｗし、無水硫酸ナトリウムで乾燥し７′ｃ０ノクロ日メ
タンｋ　Ｋ圧下で除き、ｐ−ア七トキシペンゾイルグリ
シルーし一７エニルアラニンエチルエステル含得た。

このイノチド０．０２モルをメタノール５０ｙに俗ルｒ
し、１９を定木酸化ナトリウム水１ｉ＋　ｎ’ｃ　７０
　ｍｌを加えて室温で１時間撹拌した。この反Ｌｉ＞亀
の１ＡＩＩをＩＮ塩岐によシフ、０に調腫し、減圧下で
？Ｉｆｌｌ裟を貿去した。残渣にメタノールを加えて不
俗物をｂｉ別し、ｒｙａにエーテルを加えて生じた沈殿
１ｆ：戸数し目的とするｐ−ヒドロキシベンソイルグリ
シル−Ｌ−７エニルアラニン４．５ｔを得り。

このものの融点は１　６　３　−　１６７、５℃（分ハ
・１）でめシ、プロトンの核磁気共鳴吸収スペクトルは
第２図に、そして扉外線吸収スペクトルはｔ１°５３図
にｐ−ヒドロキシベンゾイルグリシル−し−チロシン Ｌ−フェニルアラニンエチルエステルノ，ｉ−　ワｈに
Ｌ−チロシンエチルエステルヲ用い（−Ｌ’ｔジシクロ
へキシルカルがジイミドのかわシに１−二チルー３−（
３−ジメチルアミノプロピル）−力ルゼジイミドを用い
て製造例２と同様に反応、精製を行ない、ｐ−ヒドロキ
シベンゾイルグリシル−２−チロシン５．７ｚを伯た。

このものの融点は１８４−２１０℃（分解）であり、赤
外線吸収スペクトルは第４図に示すとおシでめった。

製造例４ ０−ヒドロキシベンゾイル−し−イソロイシル−し−フ
ェニルアラニンカルボベンゾキシクリシンのかわシにカ
ルボベンゾキシイソロイシンを用イ、ジシクロへキシル
カルｙＷジイミドのかわシニ１ーエチル−３−（３−ジ
メチルアミノノロピル）−カルボジイミドを用い、そし
てｐ−アセトキシ安息香酸のかわシに０−７セトキシ安
息香師を用いて製造例２と同（ポに反応、！＋ｌ＆Ｑを
行ない、ｏ−ヒドロキシベンゾイル−し−イソロイシル
−し−フェニルアラニン４．６ｙ−を得た。

製造例５ ｐ−アミノベンゾイル−し−アジニル−し−チロシン カルボベンゾキシグリシンのかわシにカル号ｆベンゾキ
シ−し一アラニンを用い、し−７エニルアラニンエチル
エステルのカワシにＬ−チロシンエチルエステル全相い
た。そして、ジシクロへキシルカルボシイミドの〃１わ
ルに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノノロピル）
−カルボッイミドを用い、ｐ−アセトキシ安息−ｉＩ融
のかわりにｐ−アセタミド安Ｍ．査酸を用いて製造例２
と同様に反応、梢Ｍを行ない、ｐ−７ミノベンゾイルー
Ｌ−アシエル−し−フェニルアラニン４．４ｙ−ｉａ＊
。

製造例６ り　−、７’　）キシベンゾイル−し−ロイシル−し−
７エニルア２ニン カルボベンゾキシグリシンのかわシにカルがベンゾ今シ
ーＬーロイシンを用い、ジシクロへキシルカルボシイミ
ドのかわシに１〜ニーＪ−ルー　’３　−（３−ジメチ
ルアミンプロピル）−カルボジイミドを用い、そしてｐ
−７セトキシ安息有除のかわυにｐ−メトキシ安息香酸
を用いて製造例２と同様に反応、和製を行ない、ｐ−メ
トキシベンゾイル−Ｌ−ロイシル−し−７エニルアラニ
ン３．６ｙを得た。

実施例１ ヒグリカーゼ３Ｕ／＆／，および４−７ミノアンチビリ
ン５　ｍＭを含むｐＨ　８．　０の１００ｍＭホウ１ｍ
　ｋ　（＃ｉｒ　ＤＯ．ｓｄに、カルがキシペノチダー
ゼＡを含むｉｌＩＩ清検体０．　０　５　ｍｌ　＜加え
、３７℃で２０分間反応させた。この反応液に反応停止
および発色用試薬として１　８　ｍＭ　ＮａＩＯ４水醪
ｔｉ　Ｏ．　５　ｍｌ　’に加えて３７℃に５分間保ち
、５分後に５　Ｑ　５　ｎｍにおける吸光度（Ａ）を測
定し次。

一方、ブランクとして、土Ｈ１２方ｋ、において血清を
ＮａＩＯ４水躊液添加後に加えて同様に吸光度ＣＢ）を
銅定した。

上記血清のカル、１？ギシペプチグーゼＡのｒ＋ｋｔｉ
ｆ以下に示す式ズＩ出した。

この方法によシ同一の血清検体について２０回測５Ｊｉ
を繰返し、以下の結果を得だ。

活性単位（ｍＵ／ＩＩｔｌ）　＝　５．１変動係数（Ｃ
Ｍ）　　＝３．４％ 実施例 血ｆ＋Ｖ検体のかわシに牛カル？キシペゾチタ゛−ゼＡ
を４０μ［Ｊ／ｄに、そして牛膵臓トリグシン、牛胚臓
キモトリプシン、牛ｖ１ペグシンをそれぞれ１０　Ｕ／
ＩＲＩになるようにμｍ８．３のホウルゐ虻掬油に溶か
してハ」いた。そして、ｐ−ヒドロキシベンゾイル−し
−７ラニルーし一フェニルアラニンのカワシにＩＲ造例
２で得られたｐ−ヒドロキシグリシル−し−７エニルア
ラニンを用いて実り例１とｒＩＪＪ＆に吸光度乏仰ｊ定
し、活性をＪＪ−出したところ、この基質についての牛
カルボキシーミグチダーゼＡの活性は６９．４　Ｕ／１
％ｌでおシ、その他の３つの酵素の活性はいずれもＯＵ
／ｍ９でりつｉＬ。

実施例３ ｐ−ヒドロキシベンゾイル−し−アジニル−し−７エニ
ルアラニンのかわシに、製造例２で得られたｐ−ヒドロ
キシベンゾイルグリシル−し−７エニルア２ニン、ａ造
ｅ−Ｊ　３で得らｈｆｃｐ−ヒドロキシベンソイルグリ
シルーし−グーロシン、マたは製造例４で得られたＯ−
ヒドロキシベンゾイル−し−イソロイシル−し−フェニ
ルアラニンを用いて４５２０回宛同−の血清検体につい
て実施例１と同様に活性測定を繰返したところ以下に示
す結果が得られた。

ｐ−ヒドロキシベンゾイルグリシル−し−フェニルアラ
ニン ｍＵ〜＝６，２ ＣＶ　　り３．１チ ｐ−ヒドロキシベンソイルグリシル−し−チロシン ｍＵ／ｌｎｌ　−２，４ ＣＶ＝４．５チ ０−ヒドロキシベンゾイル−し−インロイシル−し−７
エニルア２ニン ｍＵ／ｌｓｌ　＝　１．２ ＣＶ＝６．０％ 実施例４ カーゼ３Ｗ１ニコチンアミド７ｒニンノヌクレオチドリ
ンｆｆ＆還元’ｉｊ　（ＮＡＤＰＨ２）　０．２　ｍＭ
、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸水酸化酢誠１０Ｕ／′
ＩｒＬｌを営むｐＨ８，０の１００　ｍＭリン酸緩慟ｇ
ｏ、５ｍに実カー例１と同じ血清検体０．０５　ｍｌを
加えた。この混合截を直ちに３７℃の恒温セルに入れて
３４０酊ｎにおける吸光度の初期の５分間−一−−嘩諺
の笈化誓を測足し、１分間尚シの吸光度のλ化、１Ｉ１
１．（ΔＥ）を求めた。

カルポキシペ！チ〆−ゼＡの活性を以下に示す式で光用
した。

反応時間（分） この方法で２０回飼冗奮ｈ１返し、以下の精米を得た。

ｍＵ／ｌ／　＝　６．２ ＣＶ−５，２％ 次に、健常人１０名の血７Ｈにりいて同様にａ＋＋ｊ足
したとζろ１　ｍＵｌｒｉｇ±０．４という結果が得ら
れた。

実施例５ ｐ−ヒドロキシベンゾイルグリシル−し−フェニルアラ
ニンのかわシに製造例４が得られたｏ−ヒドロキシベン
ゾイル−し−イソロイシ、／Ｉ／−Ｌ−７エニルア２ニ
ンを月］い、ｐ−ヒドロキシ女息食麿水酸化酵素のかわ
シにサリチル酸水）メ化酵素を用い、そしてＮＡＤＰＨ
ｊのかわ９にニコチンアミドアデニンノヌクレオチド還
元１２（ＮＡＤＨ２）ヲ用いて実施例４と同様にして同
じ皿７ｆｔ検体のカル７Ｉ？キシペグタダーゼＡの活性
を２０回繰返し測定したところ、以下に示す結果が得ら
れた。

ｍＵ／Ｈ７ｗ　ｌ、　Ｉ ＣＶ冨７．０％ 尚、杯出しｚＥ式は実施例４と同じものを用いた。

実施例６ ヒグリカーゼ１ｏ　Ｕ／Ｉｔ／、ＮＡＤＨ，０，２，ｍ
Ｍ、　ｐ−メトキシ安息り油水酸化酵素２０　ＵＡｎｌ
　ｋ含む、、１４８．　Ｏの１００　ｔｎＭリン師Ｍ４
ｉｉ　Ｍ　ｔｌ、　５　ｖｒｌに実施例１と回し血清検
体０．０５　ｍｌ　５加え、以下１４籏例４と１１り様
にして吸光腹の変化を２０回１足し、同じ式を用いて活
性を測定したところ、以下に示す結！、１１．かイ０ら
れた。

ｍＵ／ゴ＝２．５ ＣＶ　　−４，７ 実施例７ −ゼ３Ｕ／ｄを含む−１８，０の１００　ｍＭホウ取緩
％ｌＪ　ｅ。

０．５ｄに実施例１と同じ血清検体０．０５１７を加え
て３７℃に２０分間保持した。２０分仮に亜硝酸ナトリ
ウム２　ｍＭおよび水酸化ナトリウム１　ｍＭを含む試
業０．５ｄを加え、室癖にて約１０分間放置した。続い
て、１−ナフトール−２−スルホン酸カリウム１ｍＭ、
ホウ［５０ｍＭおよび水酸化ナトリウム２００　ｍＭを
含む発色試’４Ｊ４　Ｑ、　５　ｒｔｒｌを加え、５０
５ｎｍにおける吸光度（Ａ）　ｆｃ−δｌＩ　Ｍした。

一方、血清検体のかわりに１０μＭパラアミノ女息香飲
水溶沿またｔま水を加えて回４７Ｊりに吸ｔｔｉを測定
し、この３つの吸光緻から下式で活性を昇出した。

１（：）ｆラアミノ安息査酸水γａ准を用いた場合にお
ける吸光良 Ｃ：水を用いた場合の吸光度 この方法で２０回ａｌｌ翅を幻き返し、以−１り結果を
イ１ｊ　７’ｃ　。

ｍ　Ｕ／ｄ　＝　１．７ ＣＶ＝５．３％ 尚、実施例４〜６において用いた各水酸化酵素の活性は
いずれも次の通シである。

Ｉ　Ｕ　＝　ｌ　ｎ　ｍｏｌ　／ｎｌ／ｍ

【図面の簡単な説明】

第１図はｐ−ヒドロキシベンゾイル−し−アシエル−Ｌ
−フェニルアラニンの、ｄ’ｉ　ａ　ｂｌ　ｔｊ、　ｐ
　＝　ヒドロキシベンゾイルグリシル−し−フェニルア
ラニンの、そして第４図はｐ−ヒドロキシベンゾイルグ
リシル−し−チロシンの、いずれも勿（外腺吸収スペク
トル因である。第２図はｐ−ヒドロキシベンゾイルグリ
シル−Ｌ−フェニルアラニンのプロトンの核磁気共鳴ス
ペクトル１でりる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 一般式 （式中、Ｘはオルト位またはパラ位に結合される働゛換
   基であって、オルト位に結合棒れる場合にはヒドロキシ
   ル基またはアミン基、そして・母う位に結合される場合
   にはヒドロキシル基、アミン基またはメトキシル基であ
   る。Ｙ社りリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−口
   ・ｆシンまたはＬ−インロイシンのいずｈかの７ミノ鈑
   残基であシ、ｚはし一フェニルアラニン、し−チロシン
   また壷よＬ−）リットファンのいずれかのアミノ酸残基
   でめる。）で示もれるジペグチド酩導体にカルがキシペ
   グチダーゼＡを作用さ七て駄ジペグテド訪専体を分ルｔ
   させる反応を含むことを％倣とするカルポキシペ！チダ
   ーゼＡの活性測定方法。