FI77229B

FI77229B - Indoxyl-aminoestrar och -peptidestrar, deras framstaellning och anvaendning foer paovisande av proteolytiska enzymer.

Info

Publication number: FI77229B
Application number: FI793986A
Authority: FI
Inventors: Dieter Berger; Manfred Kuhr; Wolfgang Werner; Franz Braun; Werner Guethlein
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1978-12-20
Filing date: 1979-12-19
Publication date: 1988-10-31
Also published as: US4278763A; ZA796880B; PL127198B1; PL220526A1; JPS593475B2; DK155318C; SU1156595A3; PT70608A; DK155318B; DE2960857D1; SU1184444A3; DK535679A; FI77229C; JPS5585561A; ES486932A1; FI793986A; EP0012957A1; DE2854987A1; AU515190B2; YU311579A

Description

Indokeyyliaminohappoesterit ja -peptidiesterit, niiden val mistus ja käyttö proteolyyttieten entsyymien osoittamiseksi 1 77229

Leukosyyttien osoittaminen kehon nesteissä, erikoisesti virtsassa, on tärkeä diagnostisoitaessa munuaisten ja virtsateiden sairauksia.

Tähän asti on tämä osoittaminen tapahtunut laskemalla vaivalloisesti leukosyytit sentrifugoimattomassa virtsassa tai virt-sasedimentissä.

Kummallekin menetelmälle on luonnollisesti yhteistä se, että ainoastaan terveet leukosyytit voidaan laskea. Toiselta puolen on tunnettua, että leukosyyttien hajoamisnopeus riippuu voimakkaasti virtsan ympäristövaikutuksista, ja niinpä esim. voimakkaasti alkalisessa virtsassa leukosyyttien puoliintumisaika on 60 min. Tästä ovat seurauksena liian alhaiset leuko-syyttimäärät tai virtsaa pidemmän aikaa varastoitaessa vieläpä väärät negatiiviset tulokset.

Analyysivirheisiin nähden saadaan leukosyyttien kvantitatiivinen mikroskooppisen määrityksen avulla sentrifugoimattomas-ta homogenoidusta virtsasta erittäin luotettavia arvoja las-kukammiossa. Käytännössä tätä menetelmää käytetään kuitenkin vain harvoin, koska se on erittäin vaivalloinen ja aikaavievä ja tarvitsee hyvin koulutettua henkilökuntaa. Virtsan leuko-syyttimääritysten ylivoimainen pääosa suoritetaan lääketieteellisessä käytännössä ns. näkökenttämenetelmää käyttäen virtsasedimentin avulla. Tätä varten on tutkittava aine (sedimentti) saatava ensin sentrifugoimista käyttäen. Tällöin rikastuvat kuitenkin muut virtsan aineosat, jotka kuten esim. suolat ja epiteelisolut vaikeuttavat huomattavasti leukosyyttien mikroskooppista laskemista. Vaihteleva sedimenttipitoi-suus, sedimentin epähomogeenisuus sekä erilaiset mikroskoop- 2 77229 pieet suurennukset tai mikroskoopin erilaiset optiset ominaisuudet aiheuttavat sen, että tässä yhteydessä tavanomaiset leukosyyttien lukumäärän tulokset mikroskooppista näkökenttää kohden voivat olla monta sataa prosenttia virheellisiä puoleen tai toiseen.

Esillä olevan keksinnön päämääränä on näin ollen aikaansaada diagnostinen aine, jolla kehon nesteissä olevat leukosyytit voidaan osoittaa yksinkertaisella ja helpolla tavalla sekä mahdollisimman nopeasti ja täydellisesti.

Osoitusperiaatteen tällaista leukosyyttikoetta varten tarjoaa entsymaattinen reaktio, koska leukosyyteillä on hyvin laaja entsyymispektri.

US-patenttijulkaisussa 3 087 794 on esitetty jo sellainen leukosyyttien osoitustapa, joka perustuu rakeisissa leukosyyteissä esiintyvään peroksidaasiaktiivisuuteen. Imukykyinen kantaja, joka on kyllästetty vetyperoksidilla ja orgaanisella indikaattorilla esim. o-tolidiinilla, osoittaa leukosyyttien läsnäolon muodostamalla värillisen hapetustuotteen. Tällaisilla kokeilla on kuitenkin huomattavia haittoja: ensiksikin on peroksidaattisilla reaktioilla o-tolidiinia käytettäessä yleisesti virtsassa oleviin pelkistäviin aineisiin, esim. as-korbiinihappoon, nähden huomattava häiritsevä vaikutus. Sitäpaitsi kirjallisuudessa on usein esitetty (ke. esim. L. Mettler, Med. Welt 2Lä, 399 Γ1972.7) leukoeyytt iperoksidaasin epästabiilisuus virtsaympäristössä, joka aiheuttaa vääriä negatiivisia tuloksia. Huomattava on myös tämän kokeen odotettavissa oleva puutteellinen selektiivisyys erytrosyyttien suhteen.

Muutamia vuosia on histo- ja tsytokemialliseasa entsymolo-giassa sellaisilla koemenetelmillä ollut huomattava merkitys, jotka perustuvat kokeiltavissa järjestelmissä esiintyvien entsyymien esterolyyttiseen aktiivisuuteen (vertaa esim.

3 77229 A.6.E. Pearse, Histochemistry, Theoretical and Applied). Periaatteessa lisätään tällöin värittömiä tai heikosti värjään-tyneitä estereitä, jotka hajoavat entsymaattisen lohkeamisen johdosta pääasiallisesti värittömiksi happo- ja myös värittömiksi alkoholi-(fenoli>-komponenteiksi. Viimemainittu muutetaan sitten entsymaattista saippuoimista seuraavan reaktion avulla värillisiksi tuotteiksi (esim. kytkemällä diatsonium-suolojen kanssa tai hapettavien reaktioiden avulla).

Niinpä kuvaavat esim. F. Schmalzl ja H. Braunsteiner teoksessa Klin. Wschr. 46., 642 (1966) erään spesifisen taytoke-miallisen leukosyyttiesteraasi-kokeen käyttäen naftoli-AS-D-klooriasetaattia substraattina ja diatsoniumsuolaa värillisen atsoyhdisteen muodostamiseksi.

Diagnostiseksi aineeksi leukosyyttien nopeaksi ja yksinkertaiseksi osoittamiseksi kehon nesteissä, esim. virtsassa, eivät tällaiset kaksikomponenttijärjestelmät ole sopivia, koska useat virtsassa esiintyvät yhdisteet, kuten urobilinogeeni, sterkobi1inogeeni, bilirubiini yms. reagoivat tunnetusti diatsoniumsuolojen kanssa. Tämän lisäksi on tällainen osoitustapa aivan liian epäherkkä. Esimerkiksi näytteet, joissa on 5000 leukosyyttiä/^ul, eivät osoita minkäänlaista reaktiota .

Brittiläisessä patenttijulkaisussa 1 128 371 on esitetty diagnostinen aine hydrolyyttisten entsyymien osoittamiseksi kehon nesteissä. Tällöin kyllästetään imukykyinen kantaja värittömillä indoksyyli- tai tioindoksyyli-estereillä ja sopivassa tapauksessa puskurilla ja hapetusaineella. Hydrolyyt-tisten entsyymien läsnäollessa syntyy estereistä vapaa indok-syyli tai tioindoksyyli ja tästä ilman hapen tai hapetusai-neen vaikutuksesta voimakkaan värinen indigo tai tioindigo. Tässä patenttijulkaisussa esitetyt yhdisteet eivät ole käyttökelpoisia leukosyyttikokeissa, koska ne eivät osoita 4 77229 minkäänlaista reaktiota vaikka läenä oliei 10 ooo leukosyyt-tiä/^ul.

Tämän johdosta ei tällä hetkellä ole käytettävissä minkäänlaista sellaista koeliuskaa, joka osoittaisi leukosyytit yksinkertaisesti ja nopeasti, vaikka leukosyyttien osoittaminen virtsassa on eräs kaikkein useimmin suoritettavista kliinisistä tutkimuksista.

Yllättäen on nyt todettu, että saadaan stabiileja ja nopeasti osoittavia diagnostisia aineita, joilla leukosyytit voidaan osoittaa hyvin kehon nesteissä, jos substraattina käytetään neutrofiilisissa leukosyytti-granulosyyteissä esiintyvien es-teraasien (proteaasien) osoittamiseksi indokeyyli-aminohappo-eeteriä tai -peptidiesteriä. Sitäpaitsi on osoittautunut, että nämä substraatit soveltuvat erinomaisesti proteolyyttisten entsyymien, kuten elastaasin, kymotrypsiinin tai trypsiinin yleiseen osoittamiseen puhtaissa vesipitoisissa liuoksissa tai myös kehon nesteissä, esim. plasmassa, seerumissa, virtsassa, haimauutteessa ja vesipitoisissa ulosteuutteissa

Esillä olevan keksinnön kohteena on tämän johdosta diagnostinen aine proteolyyttisten entsyymien osoittamiseksi erikoisesti leukosyyteissä esiintyvien proteaasien osoittamiseksi kehon nesteissä. Aine on indoksyyliaminohappoesteri ja -pep-tidiesteri, jolla on yleinen kaava I

R1

R2 I O-A-B

,Xx/ R4 jossa kaavassa

Rl' R2, R3* R4, jotka voivat olla samanlaisia tai erilaisia, ovat kukin vety tai halogeeni, Cj-Cg- alkyyli- tai Cj-c alkoks iryhmä, 5 77229 X on mahdollisesti Cj-Cg-alkyyli-, benteyyli- tai bentso-yylijäännöksellä aubetituoitu iminoryhmä, A on luonnollinen a-aminohappo- tai di- tai trialanyyli-jäännös, B on peptidikemiasea tavanomainen tai tästä johdettu typpi-suojaryhmä.

Keksinnön lisäkohteena on yleisen kaavan I mukaisten indok-eyyli-aminohappoestereiden ja/tai -peptidieetereiden käyttö diagnostisen aineen valmistamiseen proteolyyttisten entsyymien osoittamiseksi, erikoisesti leukosyyteissä esiintyvien Proteaasien osoittamiseksi kehon nesteissä.

Kaikki indoksyyli-aminohappoesterit ja -peptidiesterit, joilla on yleinen kaava I, ovat uusia yhdisteitä.

Esillä olevan keksinnön kohteena on myös menetelmä indoksyy-1iaminohappoesteräiden ja -peptidiestereiden valmistamiseksi.

Yleisen kaavan I mukaisten indoksyy1i-aminohappoestereiden ja 'peptidiestereiden valmistaminen voi tapahtua peptidikemiasta sinänsä tunnetuilla menetelmillä.

Edullisesti saatetaan vastaavat indoksyyliyhdisteet, joilla on yleinen kaava II

R1

R2 I 0-H

..Xx/ R4 jossa kaavassa

Rj, R2, R3, R4 ja X tarkoittavat samaa kuin edellä, reagoimaan tunnetulla tavalla sellaisten aminohappojen ja peptidien kanssa, joilla on yleinen kaava III

6 77229 H-O-A-B ( I 11 ) joaea kaavaaaa A ji B tarkoittavat samaa kuin edellä, tai sopivassa tapauksessa näiden sopivien reaktiokykyisten johdannaisten kanssa.

Reaktiokykyisinä johdannaisina lisätään esim. happoklorideja, sopivassa tapauksessa peptidisynteesissä yleisesti käytettyjä anhydridiseoksia, esim. kloorimuurahaishappoetyyliesteriä, tai aktiivista esteriä.

Yleisen kaavan II mukaiset indoksyyli-yhdisteet sekä yleisen kaavan III mukaiset aminohapot ja peptidit ovat tunnettuja yhdisteitä (vrt. esimerkiksi P. Friedlaender; Fortschritte der Teerfarbenfabrikation und verwandter Industriezweige, Bd.

3-20, vast. Houben-Weyl; Methoden der organischen Chemie, Bd. 15/1) tai voidaan valmistaa analogisella tavalla tunnetuiksi yhdisteiksi.

Halogeenilla tarkoitetaan ryhmien Rj, R2, R3 ja R4 yhteydessä fluoria, klooria, bromia ja jodia, edullisesti klooria ja bromia.

Alkyyliryhmät (Rj, R2 , R3, R4, X) ja alkoks iryhmät <Rj_, R2, R3, R4) sisältävät 1-3 hiiliatomia, jolloin matoksi- ja me-tyyliryhmät ovat erittäin edullisia.

" α-aminohappojäännöksellä" määriteltäessä ryhmää A ymmärretään edullisesti jäännöksiä niiden L- tai D-muodossa tai myös niiden raeemaattista muotoa. Erittäin edullisia ovat glysii-ni-, alaniini-, väliini-, leusiini-, isoleusiini-, fenyylia-laniini- ja tyrosiinijäännökset. Sopivassa tapauksessa läsnä olevat vapaat hydroksiryhmät voivat olla asyloituja, edullisesti asetyloituja. Ryhmä A voi myös olla di- tai trialanyy-lijäännös.

7 77229 "Peptidikemiassa tavanomaisilla typpi-auojaryhmillä" määri-taltäeaaä ryhmää B tarkoitetaan eaim. asyyli-, oksikarbonyy-li-, tiokarbonyyli-, aulfonyyli-, sulfenyyli-, vinyyli-, sykloheksenyyli-, foeforyyli- tai karbamoyyli-ryhmiä.

Keksinnön mukaisesti kromogeeneina käytettyjä indoksyyli-aminohappoestereitä ja -peptidiestereitä, joilla on yleinen kaava I, lisätään väkevyydessä 10 - 1 moolia/1, edullisesti 10 - 10 moolia/1, kyllästysliuosta, päällystysliuosta tai tutkittavaa nestettä.

Eräs sellaisen diagnostisen aineen tai tuotteen lisäaine, jota käytetään proteolyyttisen entsyymin ja erikoisesti leuko-syyttiproteaasien osoittamiseen, on sopiva puskurijärjestelmä. Tällöin tulevat kysymykseen esim. fosfaatti-, boraatti-, barbituraatti-, tris-<hydroksimetyyli >-aminometaani-<*tris->-, 2-amino-2-metyyli-propaanidioli-l,3-<=amediol>- tai aminohap-popuskurit, jolloin pH-arvo ja kapasiteetti on valittava siten, että mittausliuoksessa tai koeliuskassa pH-arvokei saadaan 6-10, edullisesti 7-9.

Edelleen voidaan lisätä keksinnön mukaisiin diagnostisiin aineisiin proteolyyttisten entsyymien osoittamiseksi, erikoisesti leukosyytti-proteaasien osoittamiseksi kehon nesteissä, myös hapetusaineita entsymaattisossa reaktiossa pääasiallisesti muodostuneiden indoksyyli-yhdisteiden muuttamiseksi värillisiksi indigo-yhdisteiksi. Tällaisia hapetusaineita, kuten esim. kalium-heksasyanoferraattia-111, kaliumbromaattia, kaliumkromaattia, fenatsiini-metosulfaattia tai tetratsolium- -4 suoloja, lisätään väkevyydessä 10 - 1 mooli/1, edullisesti <5 ” 1 10 - 10 moolia/1, kyllästysliuokseen, päällystyamassaan tai tutkittavaan nesteeseen.

Eräs lisäaineosa diagnostisessa aineessa, jolla osoitetaan proteolyyttisiä entsyymejä, erikoisesti leukoayytti-proteaa- seja, voi olla pesuaine, koska tällöin aikaansaadaan jonkin β 77229 verran lyhyempiä reaktioaikoja ja kirkkaampia värejä. Edulli-eeati lisätään ei-ionogeenieia tai myöe amfoteerieia kationi-eia tai anioniaktiivieia pesuaineita väkevyydeeeä 0,05-2 X, edullisesti 0,1-1 X.

Keksinnön mukaisten tuotteiden valmistamiseksi kyllästetään esim. imukykyisiä kantajia, edullisesti suodatuspaperia, selluloosaa tai tekoainekuituliuekoja, tarpeellisten, tavanomaisesti koeliuskojen valmistukseen käytettyjen reagenssien liuoksilla (substraatti, puskuri, mahdollisesti pesuaine, ha-petusaine jne.) helposti haihtuvissa liuottimissa, esim. vedessä, metanolissa, etanolissa tai asetonissa. Tämä tapahtuu tarkoituksenmukaisesti kahtena erillisenä vaiheena: ensin kyllästetään käyttäen vesipitoista liuosta, joka sisältää puskuria ja muita vesiliukoisia lisäaineita. Tämän jälkeen kyllästetään yleisen kaavan I mukaisen proteaasisubstraatin liuoksella. Erikoistapauksissa voidaan käyttää käänteistä kyllästysmenetelmää.

Valmiita koepapereita voidaan käyttää joko sellaisenaan tai sinänsä tunnetulla tavalla, joko alustalle liimattuna tai edullisesti tekoaineen ja hienosilmäisen verkon välissä, saksalaisen patenttijulkaisun 2 118 455 mukaisesti.

Kalvolla päällystettyjen koeliuskojen valmistamiseksi lisätään kaikki reagenssit kalvon muodostavan aineen, kuten esim. polyvinyyliesterin tai polyamidin, liuokseen tai dispersioon ja sekoitetaan homogeenisesti. Seos levitetään ohueksi kerrokseksi tekoainekantajalle ja kuivataan. Keksinnön mukaisesti kalvolla päällystetyt koeliuskat leikataan kuivaamisen jälkeen ja niitä voidaan käyttää sellaisinaan tai sinänsä tunnetulla tavalla liimattuina kiinnittimiin, tai esim. tekoaineen ja hienosilmäisen verkon välissä saksalaisen patenttijulkaisun 2 118 455 mukaisesti.

9 77229

Keksinnön mukainen diagnostinen aine proteolyyttisten entsyymien osoittamiseksi, erikoisesti leukosyytti-proteaasien osoittamiseksi, voidaan valmistaa jauheseoksen tai reagenssi-tablettien muotoon lisäämällä edellä mainittuihin aineosiin tavanomaisia galeenisia lisäaineita ja suorittamalla rakeistaminen. Tällaisia lisäaineita ovat esim. hiilihydraatit, kuten esim. mono-, oligo- ja polysakkaridit, tai sokerialkoho-lit, kuten esim. manniitti, sorbiitti tai ksyliitti, tai muut liukoiset inertit yhdisteet, kuten polyetyleeniglykoli tai polyvinyylipyrrolidoni. Jauheseosten tai reagenssitablettien tavallinen loppupaino on suunnilleen 50-200 mg, edullisesti 50-80 mg.

Sellaisten lyofilisaattien valmistamiseksi, joiden kokonaispaino on noin 5-20 mg, edullisesti noin 10 mg, jäädytyskui-vataan liuos, joka sisältää kaikkien kokeeseen tarvittavien reagenssien ohella tavanomaisia rakenteen muodostajia, kuten esim. polyvinyylipyrrolidonia ja mahdollisesti muita lisäaineita, kuten esim. manniittia, sorbiittia tai ksyliittia.

Keksinnön mukainen liuoksen muodossa oleva diagnostinen aine sisältää edullisesti kaikki koetta varten tarvittavat rea-genssit. Liuottimena tulevat kysymykseen vesi tai veden seokset vesiliuokoisen, orgaanisen liuottimen, esim. metanolin, etanolin, asetonin tai dimetyyliformamidin kanssa. Säilyvyys-syistä voi olla edullista jakaa koetta varten tarvittavat reagenssit kahdeksi tai useammaksi liuokseksi, jotka vasta varsinaisen tutkimuksen aikana lisätään toisiinsa.

Täten valmistetut diagnostiset aineet mahdollistavat, kastamisen jälkeen tutkittavaan tai lisäämisen jälkeen kysymyksessä olevaan kehon nesteeseen, osoittaa proteolyyttisten entsyymien, erikoisesti leukosyyttiprotsaasien, esiintyminen nopeasti ja yksinkertaisesti värinmuodostuksen perusteella, jota voidaan arvostella visuaalisesti tai fotometrisesti esim. remissio-fotometriseati, tai maljassa. Koska leukosyytti- 10 77229 proteaasien aktiivisuutta solua kohden voidaan pitää oleellisesti vakiosuureena, voidaan värin muodostuksen voimakkuudesta saada tutkittavan kehon nesteen leukosyyttiväkevyys, Tällöin saadaan keksinnön mukaisen diagnostisen aineen avulla sekä hajoamattomat että hajonneet leukosyytit, koska leuko-eyytti-proteaasin aktiivisuus säilyy täydellisesti myös leukosyyttien hajoamisen jälkeen. Hajoamisesta aiheutuvaa virhettä ei täten esiinny.

Esimerkki 1

Suodatuspaperi (esim. Schleicher + Schiill 23 SL) kyllästetään peräkkäin seuraavilla liuoksilla ja kuivataan sitten lämpöti-o lassa 60 C.

Liuoe 1

Di-natrium-tetraboraatti-dekahydraattia 1,91 g

Vettä, tislattua noin 30 ml

Liuos säädetään 0,1-n suolahapolla pH-arvoon 6,0 Tislattua vettä, ad 100,0 ml

Liuoe 2 3-^jj-<bentsyylioksikarbonyyli >-L-alanyylioksi7-indolia 33,6 mg Asetonia, ad 100,0 ml

Saadaan väritön koepaperi, joka värjääntyy, kun se kastetaan leukosyyttipitoiseen virtsaan, leukosyyttiväkevyydestä riippuen kirkkaan punaisesta siniseen. Tällöin voidaan osoittaa: 5000 leukosyyttiä//Ui virtsaa noin 2 minuutissa 1000 leukosyyttiä//Ui virtsaa noin 6 minuutissa 500 leukoayyttiä//Ul virtsaa noin 10 minuutissa 200 leukoeyyttiä//Ul virtsaa noin 15 minuutissa.

Kokeen herkkyys on suunnilleen 200 leukosyyttiä/y.ul. Koe voidaan suorittaa myös remissiofotometrisesti arvossa 620 nm.

il 77229

Koepapereita, joilla on samankaltaiset ominaisuudet (herkkyys 200-2000 leukosyyttiä/^ul), saadaan kun 3-/"N-(bentsyylioksi-karbonyyli)-L-alanyyii0ksiJ-indolin sijasta lisätään seuraa-via substraatteja, jolloin - ellei muuta ole mainittu - saadaan myös kirkkaan punaisesta siniseen värjäytyminen muutoin värittömissä koepapereissa kastettaessa ne leukosyyttipitoi-seen virtsaan: 1.1. 3-/N-(bentsyyHoksikarbonyyli)-L-alanyylioksi^-ä-metyyli-indoli 1.2. 3-/1(-( bent syy 1 ioka ikärbonyyl i > -L-alanyyl ioks i«7-5-metyyli-indoli 1.3. 3-/H-(bentsyy1ioksikarbonyyli >-L-alanyylioks i7-6-metyyli-indoli 1.4. 3-/Ti- (bentsyy li ok s ikarbonyy 1 i ) -L-alanyylioksi7-7-metyyli-indoli 1.5. 3-/"N-(benteyyiiokeikarbonyyli>-L-alanyyliokei7-4,7-dimetyyli-indoli 1.6. 3-/K-(bentsyylioksikarbonyyli)-L-alanyylioksi/-4-kloori-indoli 1.7. 3-/Ti-(bentsyylioksikarbonyyli >-L-alanyylioksi7-5-bromi-indoli 1.8. 3-/Ti-(bentsyylioksikarbonyyli)-L-alanyyliokei7-6-kloori-indoli; värjäytyminen värittömästä purppuraan 1.9. 3-/Ti-(toluol i-4' -sulf onyy li) -L-alanyylioksi/-4-kloori- 5-bromi-indoli 12 77229 1.10. 3-£N-(toluoli-4'-eulf onyyli)-L-alanyy1ioke17-4,5,7-trikloori-indoli 1 . 11 . 3-/H-(toluoli-4'-eulfonyyli>-L-alanyyliokei«7-4-kloori-5-bromi-7-metyyli-indoli 1.12. 3-/N-(toluoli-4'-eulfonyyli>-L-alanyy1iokei7-5-hydrok-ai-indoli 1.13. 3-/N-(benteyyliokeikarbonyyli >-L-alanyy1iokei7-5-metokei-indoli 1.14. 3-/N-< toluoli-4'-eulf onyyli >-L-alanyy 1 ioke :^7-5-benteyyliokei-indoli 1.15. 3-/N-<toluoli-4'-eulfonyyli)-L-alanyyliokeL7-4-karbokei-indoli 1.16. 3-/N-(toluoli-4'-eulfonyyli)-L-alanyyliokei7-4-benteyyliokeikarbonyyli-indoli 1.17. 3-/K-(toluoli-4'-eulfonyyli)-L-alanyy1ioke i7-5- < karbokeimetokei)-indoli 1.18. 3-^>f-(toluoli-4'-eulf onyyli ) -L-alanyyliokei7-5- < benteyyliokeikarbonyyli-metokei)-indoli 1.19. 3-^H-(toluoli-4'-eulf onyyli)-L-alanyyliokei7~6-nitro-indoli 1.20. 3-£N-(toluoli-4'-eulf onyyli)-L-alanyyliokei7~6-aeetyyliamino-indoli 1.21. 3-iK-<toluoli-4'-eulfonyyli)-L-alanyyliokei7-b*nteo-ζ g J-indoli; värjäytyminen värittömäeeä vihreään 1.22 . l-metyyli-3-/N-<b«nt»yyU0|c*iicarbonyyli>-L-»l*nyyli- oksL7-indoli; värjäytyminen värittömästä vihreään 13 11229 1.23. l-benteyyli-3-^Τί- < toluoli-4 ' -eulf onyy 1 i ) -L-alanyy1i-okeL7-indoli; värjäytyminen värittömästä vihreään 1.24. 1-fenyyli-3-/N-<toluoli-4 ' -eulf onyy li) -L-alanyy li-oksi^-indoli; värjäytyminen värittömästä sinivihreään 1.25. 1-asetyyli-3-/N-< toluoli-4'-eulfonyyli)-L-alanyyli-okeL7-indoli; värjäytyminen värittömästä punaiseksi 1.26. 1-benteoyy1i-3-/N-<toluoli-4'-eulf onyy1i)-L-alanyyli-okeiJ-indoli; värjäytyminen värittömästä violettiin 1.27. 3-/N-<bentsyylioksikarbonyyli>-glyeyyliokei7-indoli 1.28. 3-^N-<toluoli-4'-eulfonyyli)-glyeyyliokeL7-indoli 1.29. 3-/N-<toluoli-2'-eulf onyyli)-L-alanyyliokeU-indoli 1.30. 3-^- <toluoli-3' -eulf onyy li ) -L-alanyy li oksi/ -indo li 1·31· 3-^N-(toluoli-4'-eulfonyyli>-L-alanyyliokei7-indoli 1.32. 3-£N-<toluoli-4'-eulfonyyli>-D-alanyyliokeiJ-indoli 1.33. 3-£N-(bentsyyiiokeikarbonyyli)-D,L-alanyyliokaijr-indoli 14 77229 1.34. 3-/Ή-(benteyyliokeikarbonyyli>-L-vaiyyliokaU-indoli 1.35. 3-Λϊ-<toluoli-4'aulf onyyli>-L-valyyliokei.7-indoli 1.36. 3-/N-( benteyy liokaikarbonyyl i ) -L-leukyyliokei7-indoli 1.37. 3-/N-(benteyyliokeikarbonyyli ) -L-ieoleukyyliokei.7-indoli 1.38. 3-/>I- Cbenteyyliokaikarbonyy 1 i > - L-f enyy 1 ialanyyl iok-ei/-indoli 1.39. 3-fH-<toluoli-4'-eulf onyyli >-L-f enyy1ialanyyliokei/-indoli 1.40. 3-<H-aeetyyli-L-tyroeyyliokei >-indoli 1.41. 3-(N-benteoyyli-L-tyroeyyliokai)-indoli 1.42. 3-£N-<benteyylikarbonyyli>-L-tyroeyyliokei.7-indoli 1.43. 3-£N-<toluoli-4'-eulfonyyli)-L-tyroeyyliokaiJ-indoli 1.44. 3-£N-< toluoli-4'-eulf onyyli >-O-aeetyyli-L-tyroeyy1i-okei7-indoli 1.45. 3-£H-(. benteyy li ok e ikarbonyy li > -L-alanyy li-L-alanyyl i-okeij-indoli 1.46. 3-£N-<toluoli-4'-eulfonyyli>-D-alanyyli-L-alanyyli-okei»7-indoli 1.47. 3-£N-<benteyy1iokeikarbonyyli >-L-alanyyli-L-alanyyli-L-alanyyl iokeij-indo li ,5 77229 1.48. 3-£N-(toluoli-4'-eulfonyyli)-D-alanyyli-D-alanyyli-L-alanyyliokeiJ-indoli 1.49. 3-(N-formyyli-L-alanyyliokei>-indoli 1.50. 3-(N-aeetyyli-L-alanyyliokei)-indoli 1.51. 3-<N-eukkinyyli-L-alanyyliokai)-indoli 1.52. 3-(N-benteoyy1i-D,L-alanyy1ioke i)-indoli 1.53. 3-(N-f taloyy1i-L-alanyy1iokei)-indoli 1.54. 3-/H-(etokeikarbonyy1i>-L-alanyy1iokei7-indoli 1.55. 3-/"N-(tert. -butyyliokeikarbonyyli ) - L-alanyy 1 ioke xJ-indoli 1.56. 3-Λί-(3',6'-diokea-n-heptyyliokeikarbonyyli>-L-alanyy 1iokei7~indoli 1.57. 3-^N-(syklohekeyyliokeikarbonyyli)-L-alanyyliokei7-indoli 1.58. 3-ΓΝ - ( f enyy1iokeikarbonyyli)-L-alanyy1iokei7-indoli 1.59. 3-/H-(4'-metyyli-benteyyliokeikarbonyyli)-L-alanyyli-okei7-indoli 1.60. 3-^K-(4'-metokei-benteyylikarbonyyli>-L-alanyyli-okei7~indoli 1.61. 3-£N-<4'-nitro-benteyyliokeikarbonyyli)-L-alanyyli-okei7~indoli ie 77229 1.62. 3-fN- < N'-<piperidino>-okaikarbonyy1i>-L-alanyyliokaL7-indoli 1.63. 3-£N-(furyyli-<2'>-metokaikarbonyy1i)-L-alanyyli-okaij-indoli 1.64. 3 —Λί—(t ienyy1i-<2'>-metokaikarbonyyli>-L-alanyyli-okai^-indoli 1.65. 3-^N- < bentayy1 itiokarbonyyli >-L-alanyylioka ij-indoli 1.66 . 3-^Ti- (me taan iau If onyyli ) -L-alanyyliokaij-indoli 1.67. 3-/Ή- ( bentayy 1 iau If onyy li ) - L-alanyyl ioka i_7-indol i 1.68 . 3-/li-<bentaolieulf onyyli ) - L-alanyyliokai»7-indoli 1.69. 3-£N-<4'-bromi-benteolieulfonyyli)-L-alanyylioke^-indoli 1.70. 3-/N-< 4'-nitro-bentaoliaulf onyyli )-L-alanyyliokai.7-indoli 1.71. 3-£N-(4'dimetyyliamino-bentaoliaulfonyyli>-L-alanyy-liokei«7-indoli 1.72. 3-£H-(4'-aaetyyliamino-benteolieulfonyyli>-L-alanyy-liokaiJ-indoli 1.73. 3-£N-<4'-n-butyyli-bentaoliaulfonyyli>-L-alanyyli-okai7-indoli 1.74. 3-£N-<4'-tert.-butyyli-bentaoliaulfonyy1i >-L-alanyy-liokaiJ-indoli 17 77229 1.75. 3-/H-(4' -n-oktyy 1 i-bentsolieul f onyyl i ) -L-alanyy li okei^ -indoli 1.76. 3-£“N- < 4'-hydroka i-bentaolieulf onyyli>-L-alanyyliok-aij-indoli 1.77. 3-ZTl- < 4 '-metoka i-bentaoliaulfonyy1i)-L-alanyy1iok-ai«7-indoli 1.78. 3-^N-< 4'-bentayy1iokai-bentaoliaulf onyyli>-L-alanyy-1 ioka ij-indo li 1.79. 3-/X-C 4'< 2"-hydroka i-etokai>-bentaoliaulf onyyli >-L-alanyyliokaiJ-indoli 1.80. < 4'-<3”-okaa-5" -hydroka i-n-pentyy1ioka i?-bentao-1iaulf onyy1i >-L-alanyy1ioka ij-indo1i 1.81. 3-/N-<4'-<3",6“-di-okaa-n-heptyyliokai>-bentaoliaul-f onyy 1 i ) -L-alanyyliokeU-indol i 1.82. 3-ΓΝ-<4'-<2"-hydrokai-etyyli?-benteoliaulfonyy1i)-L-alanyyliokai^-indo1i 1.83. 3-/M-< 4'-^2“-^4'''-nitro-bentayyliokai}-etyyli>-bent-aoliaulfonyyli)-L-alanyy1ioka ij -indoli 1.84. 3-/N-<4'-<2“-kloori-etyyli^-bentaoliaulfonyyli>-L-alanyyliokaiJ-indoli 1.85. 3-/fW-< 4'-aaetyyli-bentaoliaulf onyyli >-L-alanyy 1 iok-ei7-indoli 1.86. 3-Λϊ-(4'-ayano-bentaoliaulfonyyli>-L-alanyy1iokai?-indoli 18 77229 1.87. 3-/H-< 4'-karbokei-bentaoliaulfonyyli >-L-alanyyliok-eij-indoli 1.88. 3-£N-< 4'-metoke ikarbonyyli-benteolieulfonyyli)-L-ala-nyy 1 i ok ei.7-indoli 1.89. 3-Λί-< 4'-bentsyyliokaikarbonyy1i-benteolieulf onyyli)-L-alanyy 1 i oke i»7-indol i 1.90. 3-/N-<4'-karbamoyyli-benteolieuIf onyyli)-L-alanyyli-okeij-indoli 1.91. 3-£fo-< 4'—<dimetyyli-karbamoyyli?-benteolieulf onyyli)-L-alanyyliokaiJ-indoli 1.92. 3-Λί-< 4'-karbokeimetyyli-benteolieulf onyyli >-L-alanyy-liokeij-indoli 1.93. 3-ΓΝ-< 4'-karbokeimetoke i-benteolieulf onyyli >-L-alanyy-liokeij-indoli 1.94. 3-/H-(4'-karbokeimetyyliamino-benteolieuIf onyyli)-L-alanyyliokel7-indoli 1.95. 3-ZK-C 4' -<-benteyyliokeikarbonyyli-metyyliamino>-bent-eo1ieuIf onyyli >-L-alanyy1ioke ij-indoli 1.96. 3-m-(4'-fluori-benteolieulfonyyli>-L-alanyyliokei7-indoli 1.97. 3-/N-(4'-fluorieulfonyyli-benteolieulfonyyli)-L-ala-nyy 1 i oke U-indoli 1.98. 3-rN-(4'-eulfamoyyli-benteolieulfonyyli)-L-alanyyli-okeiZ-indoli is 77229 1.99. 3-£N-metyyli-N-< toluoli-4'-eulfonyyli>-L-alanyyliok-eU-indoli 1 .100 . 3-/Ti-aeetyyli-N-< toluol i-4'-eulf onyyli>-L-alanyyli-okaij-indoli 1.101. 3-/Ή-(2',4',6'-trimetyy1i-bentβο1ieulf onyy1i)-L-ala nyy 1 ioka x7- indoli 1 .102 . 3-^"N-(bifenyyli-4'-aulfonyyli>-L-alanyylioke 17-indoli 1 . 103 . 3-/N-<naftaliini-2'-aulf onyyli>-L-alanyyliokai7~indo li 1.104. 3-/Ή- < 4 '-asetyy1iamino-naftaliini-l'-aulf onyy1i > -L-alanyy 1 iokei7-indol i 1.105. 3-Λ - ( 5 '-dimetyyliamino-naf taliini-l'-eulf onyyli)-L-alanyyliokaij’-indoli 1.106. 3-/Ή-<kinoliini-8'-aulfonyyli)-L-alanyy1iokal7-indoli 1.107. 3-£N-<pyridiini-3'-eulfonyy1i)-L-alanyy1ioka 17-indoli 1.108. 3-£K - (2'-nitro-bentaolieulf onyyli)-L-alanyy1ioka17-indoli; värjäytyminen keltaiaeata vihreään.

1.109. 3-/N-<1'-metyyli-2'-bentaoyyli-vinyyli>-L-alanyy1i-okaiJ-indoli 1.110. 3-/N-<5'-5'-dimatyyli-3'-okao-ayklohekaen-l'-yyli>-L-alanyyliokei?-indoli 20 7 7 2 2 9 1 . 111 . 3-/N-(dif enyy1ikarbamoyy1i >-L-alanyy1iokeL7-indo1i 1.112. 3-rN-(di-<4'-nitrobentayy1i>-f oaf oryy1i)-L-alanyyli-okel7-indoli 1.113. 3-^i-(di-<4'-bromibentayy1i>-foaforyyli)-L-alanyyli-okai-7-indol i 1.114. 3-£N-(toluoli-4'-aulf onyy1i)-L-alanyyliokai7-5-bent-ayyli-indoli 1 .115 . 3-£H-<toluoli-4'-aulf onyyli >-L-alanyy1iokai7-5-fenyy- li-indoli 1.116. 3-£N- < toluoli-4'-aulf onyy1i>-L-alanyy1ioka x7-5-metok- ai-indoli

Btim4.iTiiX.i_ 2.

Suodatuepaperi (eaim. Schleicher + Schull 23 SL) kylläetetään peräkkäin aeuraavilla Huokailla ja kuivataan aitten lämpöti-o laaaa 60 C.

Liuoa 1

Tria-Chydrokaimetyy1i>-aminometaania 0,61 g

Kaiium-hekaaayano-ferraattia-111 32,9 mg

Vettä, tialattua noin 30 ml

Liuoa aäädetään 0,1-n auolahapolla pH-arvoon 8,0

Vettä, tialattua, ad 100,0 ml

BtimtrKXi. 3

Suodatuepaperi <eaim. Schleicher + Schull 23 SL) kylläetetään peräkkäin aeuraavilla Huokeilla ja kuivataan aitten lämpöti-o laaaa 60 C.

2i 77229

Liuos 1

Di-natrium-tetraboraatti-dekahydraattia 1,91 g

Vettä, tislattua noin 30 ml

Nonyylifenolipolyglykolieetteriä 0,2 g

Liuos säädetään 0,1-n suolahapolla pH-arvoon 8,0 Vettä tislattua, ad 100,0 ml

Liuos 2 3-/N-(bentsyylioksikarbonyyli)-L-alanyyliokei7- indolia 33,8 mg

Asetonia, ad 100,0 ml

Saadaan väritön koepaperi, joka värjäytyy, kun se kastetaan leukosyyttipitoiseen virtsaan, kirkkaan punaisesta siniseen leukoeyyttiväkevyydestä riippuen. Esimerkin 1 mukaiseen tuotteeseen verrattuna saadaan hieman lyhyempiä reaktioaikoja ja jossain määrin kirkkaampia värejä.

Myös käytettäessä muita esimerkin 1 ja 2 mukaisia substraatteja saadaan käytettäessä pesuaineita, kuten esim. edellä mainittua nonyylifenolipolyglykolieetteriä (ei-ionogeeninen), sekä myös esimerkiksi kookosimidatsoliini-yhdisteitä (amfotee-rinen) tai bentsyylitrimetyyliammoniumkloridia (kationiaktii-vinen) tai natriumsulfonato-dodekyylibentsolia (anioniaktii-vinen) käytettäessä sellaisia koepapereita, jotka pesuainetta sisältämättömiin koepapsreihin verrattuna aikaansaavat jossain määrin lyhyempiä reaktioaikoja ja jonkin verran kirkkaampia värejä.

Esimerkki 4

Itiusa . 1 3-(N-bentsoyyli-D,L-alanyylioksi>-indolia 154,2 mg

Metanolia, ad 100,0 ml 22 77229

Liuos 2

Di-natrium-tetraboraatti-dekahydraattia 7,63 g

Vettä, tislattua noin 50 ml

Liuos säädetään 1-n suolahapolla pH-arvoon 8,0 Vettä, tislattua, ad 100,0 ml

Reagenesilaaissa sekoitetaan keskenään: 1 ml liuosta 1 1 ml liuosta 2 2 ml leukosyyttipitoista virtsaa

Seos värjääntyy vähitellen, leukosyyttiväkevyydeatä riippuen, kirkkaan vihreästä syvän siniseksi.

Noin 10 minuutin pituisen seisottamisen jälkeen huoneen lämpötilassa määrätään leukosyyttiväkevyya silmämääräisesti ver-tailuvärin avulla tai fotometrisesti esim. 1 cm-maljassa arvossa 620 nm.

Kokeen herkkyys on noin 200 leukoeyyttiä/y.ul virtsaa.

Myös käyttäen muita esimerkkien 1 ja 2 mukaisia substraatteja voidaan reagenasilasi- tai maljakokeet suorittaa vastaavalla herkkyydellä <200-1000 leukosyyttiä//ul virtsaa).

E.ainaiLEK-i-Jä-

Tabletti, joka sisältää 3-/N-< 4'-karboksimetyyliamino-bentsolisulf onyyli >-L-alanyyli-oksi7-indolia 2,0 mg

Kaliumdivetyfosfaattia 0,6 mg

Di-natriumvetyfosfaatti-dihydraattia 16,8 mg

Manniittia, ad 70,0 mg 23 7 7 2 2 9 lisätään 2 ml:aan reagenssilaeiesa olevaa leukosyyttipitoista virtsaa. Virtsa värjääntyy vähitellen, leukosyyttiväkevyydes-tä riippuen, kirkkaan vihreästä syvän siniseksi.

10 minuutin pituisen seisottamisen jälkeen huoneen lämpötilassa määrätään leukosyyttiväkevyys silmämääräisesti vertai-luvärin avulla tai fotometrisesti esimerkiksi 1 cm-mikromal-jassa arvossa 620 nm.

Kokeen herkkyys on noin 200 leukosyyttiä/^ul virtsaa. Reaktio- aikaa voidaan lyhentää huomattavasti, jos hautominen suorite- o taan lämpötilassa 37 C.

Muiden esimerkin 1 ja 2 mukaisten substraattien avulla voidaan aikaansaada vastaavia herkkyyksiä <200-1000 leukosyyt-tiä//ul, jolloin vaikealiukoisista substraateista kysymyksen ollessa on edullista lisätä orgaanisia liuottimia, esim. meta-nolia tai dimetyy1iformamidia.

Esimerkki 6

Suodatinpaperi (esimerkiksi Schleicher + Schull 23 SL) kyllästetään peräkkäin seuraavilla liuoksilla ja kuivataan sit- o ten lämpötilassa 60 C. kiMPg.l

Di-natrium-tetraboraatti-dekahydraattia 1,91 g

Vettä, tislattua noin 30 ml

Liuos säädetään 0,1-n suolahapolla pH-arvoon 8,0 Vettä, tislattua, ad 100,0 ml

Livdä Z

3-£H-<toluoli-4'-sulfonyyli>-L-tyroeyyliokei7-indolia 45,1 mg

Asetonia, ad 100,0 ml 24 77229

Saadaan väritön koepaperi, joka, kun se kastetaan vesipitoisiin liuoksiin, jotka sisältävät proteolyyttistä entsyymiä, kymotrypsiiniä, värjäytyy siniseksi. Tällöin voidaan osoittaa jopa 0,002 U kymotrypsiini-väkevyys/ml noin 6-7 minuutin kuluessa .

(Esitetty entsyymiaktiivisuus määrättiin käyttäen N-asetyyli- o L-tyrosiini-etyyliesteriä substraattina lämpötilassa 25 C, PH 7,0 ja λ a 237 nm).

Myös käyttäen muita esimerkin 1 ja 2 mukaisia substraatteja voidaan - riippuen aminohappo- vast, peptidi jäännöksestä -osoittaa kymotrypsiini tai muut proteolyyttiset entsyymit, kuten esim. elastaasi tai trypsiini, pelkissä vesiliuoksissa tai myös esim. kehon nesteissä, kuten esim. täysvereseä, seerumissa, virtsassa, haimaeritteessä tai vesipitoisissa ulos-teuutteissa.

Esimerkki 7 3-ffi- <toluoli-4*-sulfonvvli?-L-alanvvljoksi/-indoli

Happokloridin valmistamiseksi yksivaihemenetelmällä liuotetaan 5,35 g (0,022 moolia) N-(toluoli-4-sulfonyyli)-L-alanii- nia 20 ml:aan abs. dimetyyliforamidia (DMP) ja jäähdytetään o lämpötilaan -30 C. Tämän jälkeen lisätään pipetin avulla samalla sekoittaen ja jäähdyttäen 1,76 ml (0,024 moolia) tio- nyylikloridia ja reaktioseosta pidetään 30 min jäähdytyskyΙο vyllä lämpötilassa -30 C.

Liuos 2 250 ml:n kolmikaulapulloon, joka on varustettu sekoittajalla, lämpömittarilla ja kaasun syöttö- ja poistojohdolla, lisätään sen jälkeen, kun ilma on täydellisesti poistettu heikossa typpivirrassa, liuos, jossa on 2,90 g (0,022 moolia) indok-syyliä (3-hydroksi-indolia) 40 ml:ssa abs. DMF, sitten lisätään 9,74 ml abs. pyridiiniä ja jäähdytetään lämpötilaan o -15 C.

25 77229

Rials t i<?

Liuos 1 kaadetaan liuokseen 2 ja sekoitetaan hapelta ja ve- o delta suojaten noin 5 h lämpötilassa -15 C siksi, kunnes in-doksyyliä ei enää voida todeta.

Tämän jälkeen reaktioseos haihdutetaan tyhjössä hauteen läm- o pötilan ollessa korkeintaan 40-50 C. Jäännös liuotetaan 100 ml;aan etikkaesteriä ja pestään peräkkäin kahdesti 30 ml :11a 1-n sitruunahappoa, 20 ml:lla vettä, 50 ml:lla 5-X:sta nat-riumvetykarbonaattiliuosta ja 25 ml :11a vettä. Etikkaesteri-faaei haihdutetaan natriumsulfaatin avulla tapahtuvan kuivaamisen jälkeen tyhjössä.

Täten saatu raakatuote puhdistetaan patsaekromatografisesti piigeelin avulla toluoli-dioksaani-seosta (9:1) käyttäen. Kun yhdistettyjen fraktioiden liuotin on tislattu pois tyhjössä, saadaan sekoitettaessa jäännöstä eetterissä 1,45 g (18,4 X) 3-£fi-( toluoli-4' -sulf onyyli )-L-alanyyliokei/-indolia värittö- o 20 o minä kiteinä, sp. 103 C; oD : -56,6 , c s 1 X (metanoli).

Analogisella tavalla saadaan saatettaessa vastaavat eubeti- tuoidut indoksyyli-yhdisteet reagoimaan kulloistenkin aminohappojen kanssa seuraavat substraatit: 7.1. 3-/Tf-(benteyyliokeikarbonyyli>-L-alanyyliokei7~indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 123 C, 20 o a Q : -49,0 , c = 1 X (metanoli).

7.2. 3-/H-(bentsyyliokeikarbonyyli)-L-alanyyliokei7-4-metyyli-indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 113 C, 20 o a g : -44,6 , c = 1 X (metanoli).

26 77229 7.3. 3-^5-( benteyyliokeikarbonyyli)-L-alanyy1iokei7-5-metyyli-indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 143-144 C, 20 o d p -48,2 , c * 1 * (metanoli) .

7.4. 3benteyyliokeikärbonyyli>-L-alanyy1iokei/-6-metyy-li-indoli, o värittömiä kiteitä, βρ. 14Θ C, 20 o a jj -49,0 , c * 1 X (metanoli).

7.5. 3-£fi-(benteyyliokeikarbonyyli)-L-alanyyliokei/-7-metyy-li-indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 146 C, 20 o a jj : -51,2 , c = 1 X (metanoli).

7.6. 3 -£jf-( bent eyy 1 ioke ikä rbonyyli ) -L-alanyy 1 ioke i7-4,7-dimetyyli-indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 121 C, 20 o a^t -46,3 , c * 1 X (metanoli).

7.7. 3-£N- (bent eyy li ok e ikä rbonyyli ) -L-alanyyliokei_/-4-kloori-indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 142-143 C, 20 o aD : -61,4 , c = 1 X (metanoli).

7.8. 3-/N-(benteyyliokeikarbonyyli)-L-alanyyliokei/-5-bromi-indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 138 C, 20 o aD : -28,0 , c = 1 X (metanoli).

7.9. 3-/N-(benteyyliokaikarbonyyli)-L-alanyyliokei7-6-kloori-indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 170 C, 20 o dp : -41,3 , c * 1 X (metanoli).

27 7 7 2 2 9 7.10. 3-ZN-(toluoli-4'-eulf onyyli >-L-alanyyliokei7~4-kloori- 5-bromi-indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 150-152 , 20 o a p -31,0 , c = 1 X (metanoli).

7.11. 3-£N-(toluoli-4' -aulf onyyli ) -L-alanyyliokei7“4,5,7-trikloori-indoli 7.12. 3-Zjl-(toluoli-4' -eul f onyyl i ) - L-alanyyl iokei?-4-kloor i- 5-bromi-7-metyyli-indoli, o heikosti kellertäviä kiteitä, ep. 143-145 C, DC: valmis piigeelilevy (eluoimieaine: toluoli-diok-eaam 2:1, todettu: UV, NHg (kaasu), Rf-arvo: 0,56).

7.23. l-metyyli-3-/N-<benteyylioksikarbonyyli)-L-alanyyli-okei7-indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 92 C, 20 o oi p -49,5 , c = 1 X (metanoli).

7.24. 1-benteyyli-3-/N-(toluoli-4'-eulfonyyli)-L-alanyyli-oksi?-indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 149-152 C, 20 o a p : -54,9 , c = 1 X (DMF).

7.25. 1 - f enyy 1 i-3-£fi- (toluoli-4'-eulf onyyli ) -L-alanyyl i okei./ -indoli 7.26. 1 -aeetyyl i-3-£JH-( toluoli-4'-sulf onyyli )-L-alanyyliok-sjy-indoli 7.27. l-benteoyyli-3-£2l-( toluol i-4'-eul f onyyli >-L-alanyyli-ok8j[7-indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 155-156 C, 20 o 0t p : -54,7 , c = 1 X (DMF).

7.28 . 3-/N-<benteyyiiokeilcarbonyyli>-giyeyy1i0)Cei7-indoli , värittömiä kiteitä, βρ. 122-124°C.

28 772 2 9 7.29. 3-£S-<tolu°li.-4'_auif onyyli >-glyeyyiiokeiy-indoli , värittömiä kiteitä, ep. 103-105 C.

7.30. 3-£Jl-( toluoli-2 '-eulf onyyli )-L-alanyylioksi7"in<loli * väritön amorfinen jauhe, a g : -62,5 , c = 1 X (metanoli), DC: valmie piigeelilevy, <eluoimieaine: toluoli-diok-aaani 9:1, todettu: UV, nh3 (kaasu), Rf-arvo: 0,20).

7.31. 3-£!i“<toluoli-3'-eulfonyyli)-L-alanyyliokei7-indoli, värittömiä kiteitä, ep. 94°C, α D : "5^,9 , c = 1 X (metanoli).

7.32. 3-£J*~<toluoli-4'-eulfonyyli)-D-alanyyliokei7-indoli, värittömiä kiteitä, ep. 98°C, a j) : -53,1 , c * 1 X (metanoli).

7.33. 3-^.N~<bent*Yyiiokeikarbonyyli)-D,L-alanyyliokei7·· indoli, värittömiä kiteitä, ep. 110-111 C.

7.34. 3-/N-(benteyyliokeikarbonyyli>-L-valyyliokei7-indoli, värittömiä kiteitä, ep. 64-65°C, a g : -41,1 , c x i % (metanoli).

7.35. 3“^-N“<benteYYliokeikarbonyyli)-L-leueyyliokei7-indoli värittömiä kiteitä, ep. 73-75°C, α D : _42»2 , c » 1 X (metanoli).

7.36. 3"^N“<b*nt*YYliokeikarbonyyli)-L-ieoleueyyli0jcei^-indoli, 29 7 7 2 2 9 väritön, amorfinen jauhe, 20 o a q : -30,6 , c * 1 % (metanoli).

DC: valmiit piigeelilevyt, (eluoimieaine: toluoli- diokeaani 2:1, todettu: UV, NHg (kaasu), R^-arvo: 0,57>.

7.37. 3-/}i-(benteyyliokeikarbonyyli )-L-f enyy liana lyyliokeij-indoli, o kellertäviä kiteitä, ep. 125 C, DC: valmiit piigeelilevyt, (eluoimieaine: toluoli-diokeaani 9:1, todettu: UV, NHg (kaasu), Rf-arvo: 0,56).

7.38. 3-£N-(toluoli-4'-eulf onyyli)-L-f enyylialanyyliokeiT-indoli , o värittömiä kiteitä, ep. 167-169 C, 20 o a d -34,4 , c » 1 X (metanoli).

7.39. 3-(N-aeetyyli-L-tyroayyliokei)-indoli 7.40. 3-(N-benteoyyli-L-tyroeyyliokei)-indoli 7.41. 3-/_N-( benteyy li oka ikarbonyyl i )-L-t yroeyyiiokei"?-indoli, väritön amorfinen vaahto, 20 o ot d : "22,6 , c = 1 X (metanoli).

DC: valmis piigeelilevy, (eluoimieaine: toluoli-diokeaani 4:1, todettu: UV, NHg (kaaau), Rf-arvo: 0,27).

7.42. 3-/N-(toluoli-4'-eulfonyyli)-L-tyroayyiiokei7_indoli o - 1 värittömiä kiteitä, ep. 171 C, 20 o α D : -28,3 , c » 1 X (metanoli).

7.43. 3-ZN-(toluoli-4'-eulfonyyli)-0-aeetyyli_L_tyroeyyli_ okei7-indoli, 3„ 77229 o värittömiä kiteitä, ap. 168-170 C, 20 o ap : -24,1 , c = 1 X (dimetyyliformamidi).

7.44. 3-ZR-< benteyyllokaikärbonyyli)-L-alanyy1i-L-alanyyli- okai/-indoli, - o värittömiä kiteitä, ap. 144 C, 20 o a j) : -17,3 , c = 1 X (metanoli).

7.45. 3-/TI- ( toluoli-4'-aulf onyyli)-D-alanyy1i-L-alanyy1i-oka indoli, kellertävä amorfinen vaahto, 20 o ad +5,8 , c = 1 X (metanoli), DC: valmiit piigeelilevyt, (eluoimiaaine: toluoli- diokaaani 4:1, todettu: UV, NHg (kaasu), Rf-arvo: 0,19).

7.46. 3-£N-( bentayyliokaikärbonyyli)-L-alanyyli-L-alanyyli- L-alanyyliokai/-indoli, ~ o värittömiä kiteitä, ap. 156 C, 20 o a q : -39,5 , c * 1 X (metanoli).

7.47. 3-/iJf-(toluoli-4'-eulf onyy 1 i ) -D-alanyy 1 i-D-alanyy 1 i-L-alanyy liokei7-indoli, o värittömiä kiteitä, ap. 216 C, 20 o ap : +53,8 , c = 1 X (metanoli).

7.48. 3-(N-aaetyyli-L-alanyyliokai)-indoli, väritön amorfinen vaahto, 20 o ap : -12,5 , c * 1 X (metanoli), DC: valmiit piigeelilevyt, (eluoimiaaine: etikkaea- teri-dikloorimetaani 10:1, todettu: UV, NHg (kaaau), Rf-arvo: 0,33).

3i 77229 7.49 . 3 -< N-aukkinyyli-L-alanyyliokai > - indoli , o värittömiä kiteitä, ap. 142 C, 20 o a jj -63,9 , c = 1 X (metanoli) .

7.50. 3 - ( H-bentaoyyli-D,L-alanyyliokai)-indoli, o värittömiä kiteitä, ap. 171 C.

7.51. 3-(N-f taloyyli-L-alanyyliokai)-indoli, o värittömiä kiteitä, ap. 58 C, 20 o a jj : -26,3 , c = 1 X (metanoli).

7.52. 3-/N-(etoka ikarbonyyli>-L-alanyyliokai/-indo1i, o — värittömiä kiteitä, ap. 96 C, 20 o a jj : -68,9 , c = 1 X (metanoli).

7.53. 3-/N-(ayklohekayyliokeikarbonyyli)-L-alanyyliokai/-indoli, o värittömiä kiteitä, ap. 149 C, 20 o aD : -60,4 , c * 1 X (metanoli).

7.54. 3-/N-(fenyyliokaikarbonyyli)-L-alanyyliokai7-indoli, - o värittömiä kiteitä, ap. 161 C, 20 o a jj : -96,0 , c = 1 X (metanoli).

7.55. 3-/N-(4'-metyyli-bentayyliokaikarbonyyli)-L-alanyyli-okaiT-indoli, o värittömiä kiteitä, ap. 135 C, 20 o aD : -45,9 , c = 1 X (metanoli).

7.56. 3-/N-(4'-nitro-bentayyliokaikarbonyyli)-L-alanyyli-okai7-indoli, o kellertäviä kiteitä, ap. 160 C, 20 o a jj : -29,4 , c * 1 X (metanoli).

32 77229 7.57 . 3-/K- ( benteyylit ioJcarbonyy 1 i > -L-alanyy 1 iokei/-indoli , ~ o — värittömiä kiteitä, ap. 122 C, 20 o oijj : -77,8 , c = 1 X (metanoli).

7.58. 3 - /It-(met aaniaulf onyy li)-L-alanyy li okei/- indo li , ~ o värittömiä kiteitä, ap. 164-166 C, 20 o -54,0 , c * 1 X (metanoli).

7.59. 3-/N-(bentayyliaulf onyy li ) -L-alanyy li okei/"-indo li , väritön viakoottinen öljy, 20 o oig : -54,8 , c = 1 X (metanoli), DC: valmiit piigeelilevyt, (eluoimiaaine: toluoli-etikkaeateri 2:1, todettu: UV; NHg (kaasu), R^-arvo: 0,40).

7.60. 3-/N-(bentaolieulf onyyli)-L-alanyy1iokei/-indo1i, väritön viakoottinen öljy, 20 o otp : -59,8 , c 1 X (metanoli), DC: valmiit piigeelilevyt, (eluoimiaaine: toluoli-etikkaeateri 2:1, todettu: UV, NHg (kaasu), R^-arvo: 0,48).

7.61. 3-/N-(4'-bromi-bentaolisulfonyyli)-L-alanyyliokei/-indoli, kellertävä amorfinen jauhe, DC: valmiit piigeelilevyt, (eluoimiaaine: toluoli-diokaaani 4:1, todettu: UV, NH3 (kaaau), Rf-arvo: 0,39).

7.62. 3-/N-( 4' -nitro-bentaoliaulf onyyli )-L-alanyyliokai./-indoli, o värittömiä kiteitä, ap. 136-137 C, 20 o dp : -35,9 , c * 1 X (metanoli).

7.63. 3-ZJi-(4'-aaetyyliamino-bentaoliaulfonyyli)-L-alanyyli-okai7-indoli, 33 77229

O

värittömiä kiteitä, ep. 162-163 C, 20 o a jj -57,2 , c 1 % (metanoli).

7.64. 3-£S - (4'-n-butyyli-benteolieulf onyy1i>-L-alanyyli-okei_7-indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 105 C, 20 o ap : -46,1 , c = 1 X (metanoli).

7.65. 3-/N-(4'-tert.-butyyli-benteolieulfonyyli)-L-alanyyli-okei7-indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 140 C, 20 o aD : -43,3 , c = 1 X (metanoli).

7.66. 3-/N-(4'-n-oktyy1i-benteolieulf onyyli)-L-alanyyli- okei/-indoli, - o värittömiä kiteitä, ep. 57 C, 20 o ap : -34,2 , c - 1 X (metanoli).

7.67. 3-/N-(4'-hydrokei-benteolieulfonyyli)-L-alanyyliokei7-indoli, viekoottinen, hieman punertava öljy, DC: valmiit piigeelilevyt, (eluoimieaine: toluoli- diokeaani 1:1, todettu: UV, NH3 (kaaeu), Rf-arvo: 0,62).

7.66. 3-^N-(4'-metokei-benteolieulf onyyli)-L-alanyyliokei7- indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 126-126 C, 20 o ap -54,3 , c » 1 X (metanoli).

7.69. 3-/H-(4'-benteyyliokei-benteolieulfonyyli)-L-alanyyli-okei/-indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 112 C, 20 o aj) : -40,3 , c * 1 X (metanoli).

34 77229 7.70 . 3-/N-( 4' - <2 " -hydrokai-etokai> -bentaol iaulf onyy ^ ^ ^ 1.- alanyyliokei/-indoli .

7.71. 3-/N-(4' - <3’’-okaa-5"-hydroltei-n-p«ntyyiiokei 1iaulfonyyli>-L-alanyyliokai7-indoli , väritön viakoottinen öljy, 20 o otp : -36,4 , c * 1 X <metanoli>, DC: valmiit piigeelilevyt (eluoimieaine: toluojj^ etikkahappoetikkaeateri 1:10, todettu: UV; NHg (kaasu), R^-arvo: 0,37.

7.72. 3-/K-(4'-<3”,6"-di-okaa-n-haptyyliokai >-bantaoi4 _ l*ulf0- nyyli)-L-alanyyliokei/-indoli, hieman punertava viakoottinen öljy, DC: valmiit piigeelilevyt, (eluoimieaine: toluQ^ diokeaani 4:1, todettu: UV, NHg (kaasu), Rf-arvo: 0,21).

7.73. 3-/Ή-( 4'-<2’’-hydrokei-etyyl i >-bentaoliaulf onyyi^ j _ 1«— alanyyliokai/-indoli, kellertävä amorfinen jauhe, 20 o a p : -54,50 , c * 1 % (metanoli), DC: valmiit piigeelilevyt (eluoimieaine: toluoii-.

etikkahappoetyylieateri 1:2, todettu: UV, HHg (kaasu), Rj-arvo: 0,26).

7.74. 3 — ZJf— <4 '- <2 {4 ' ' ' -nitro-bentayyliokai }-etyyli >-bent-aoliaulfonyyli)-L-alanyyliokai/-indoli.

7.75. 3-£R-(4'-<2“-kloori-etyy1 i> —benteoliaulf onyyli)-L- alanyyliokei/-indoli, hieman punertava amorfinen vaahto.

20 o a jj : -48,3 , c * 1 X (metanoli), DC: valmiit piigeelilevyt, (eluoimieaine: toluoii- 35 77229 etikkahappoeeteri: 5:1, todettu: UV, NHg (kaasu), R^-arvo: 0,20).

7.76. 3-/K-( 4'-eyano-bentaolieulfonyyli)-L-alanyyliokei7-indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 131 C, 20 o &Q : -47,0 , c = 1 X (dimetyyliformamidi).

7.77. 3-/N-(4'-karbokei-benteolieulf onyyli >-L-alanyyliokei/-indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 143 C, 20 o otjj : -51,0 , c = 1 * (metanoli).

7.78. 3-/JI- (4' -benteyyliokeikarbonyy 1 i-bent soi ieulf onyy 1 i ) -L-alanyyliokei/-indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 178 C, 20 o q : -42,8 , c = 1 % (asetoni).

7.79. 3-/N-(4'-karbamoyyli-benteolieulfonyyli)-L-alanyyli- okei7-indoli, - o värittömiä kiteitä, ep. 206 C, 20 o αD : -58,0 , c = 1 % (asetoni).

7.80. 3-£N-(4'-<dimetyyli-karbamoyyli>-benteolieulfonyy1i)-L-alanyyliokei/-indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 170-172 C, 20 o ctjj : -46,4 , c * 1 X (dimetyy 1 i f ormamidi) .

7.81. 3-£R-metyyli-N-(toluoli-4'-eulfonyyli)-L-alanyyliok-ei7-indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 82 C, 20 o oc jj -42,2 , c 1 X (metanoli).

7.82. 3-ZR-(2',4',6'-trimetyyli-benteolieulfonyyli)-L-ala-nyyliokei_7-indoli, 36 77229 o värittömiä kiteitä, ep. 192-194 C, 20 o aq : -63,8 , c * 1 X (metanoli).

7.83. 3-/Ji-(bif enyyli-4'-eulfonyyli >-L-alanyyliokai/-indoli, o *“ värittömiä kiteitä, ap. 159 C, 20 o a Q : -42,0 , c = 1 % (metanoli).

7.84. 3-/H-(naftaliini-2'-eulfonyyli >-L-alanyyliokei?-indo- o li hieman punertavia kiteitä, ep. 103-105 C, DC: valmiit piigeelilevyt, <eluoimieaine: toluoli-diokeaani 4:1, todettu: UV, NHg, (kaasu), R^-arvo: 0,41).

7.85. 3-/N-( 4'-aeetyyliamino-naf taliini-1'-aulfonyy1i)-L-alanyylioke £7 "indoli, o värittömiä kiteitä, ap. 129-132 C, α 20 o jj : -63,2 , c = 1 % (metanoli).

7.86. 3-£N-(5'-dimetyyliamino-naftaliini-1'-sulfonyyli)-L- a 1 anyy li okei?-indo 1 i , o värittömiä kiteitä, ap. 170 C, 20 o aD : -30,7 , c = 1 * (metanoli).

SeitnerfcXi β 3-Zn-(tert.-butyv1iokaikarbonyyli)-L-alanyylioka£7-indoli Reaktion auorittamiaekai karbodi-imidi-menetelmällä liuotetaan 3,23 g (0,017 moolia) N-tert.-butyy1iokaikarbonyy1i-L-alaniinia ja 2,27 g (0,017 moolia) indokayyliä 100 ml:aan aba. diokaaani-dikloorimetaania 1:1. Kun on lisätty liuos, jossa on 3,87 g (0,019 moolia) disyklohekayylikarbodi-imidiä (DCC) 20 ml:ssa abs. dioksaania, sekoitetaan samalla vedeltä ja hapelta suojaten 68 h huoneen lämpötilassa. Saostunut Ν,Ν'-diaykloheksyyliurea erotetaan suodattamalla, liuotin tislataan pois tyhjössä ja jäännös liuotetaan noin 100 ml:aan etik-kahappoetyy1ieateriä. Kun saostuneet N,N'-dieykloheksyyli- 37 7 7 2 2 9 urean ylimäärä on erotettu imueuodattamalla, pestään kirkas etikkaesteriliuos peräkkäin kulloinkin kahdesti 30 ml :11a l~n sitruunahappoa, 20 mltlla vettä, 50 ml:lla 5-10-X:sta natrium-vetykarbonaattiliuoeta ja 25 ml :11a vettä. Kuivaamisen jälkeen natriumeulfaatin avulla haihdutetaan etikkaesterifaasi tyhjössä. Amorfinen jäännös puhdistetaan patsaskromatografi-sesti piigeelin avulla käyttäen toluoli-dioksaaniseosta (9:1).

Kun talteenotetut fraktiot on haihdutettu tyhjössä ja jäännös kiteytetty uudelleen etikkaesteri-eetteristä (1:10) saadaan 1,04 g <20 X) (tert.-butyylioksikarbonyyli)-L-alanyy- _ o liokei/-indolia värittöminä kiteinä, sp. 158 C, 20 " o a jj : -65,0 , c = 1 X (metanoli).

Sivutuotteena tässä reaktiossa saadaan l-asemassa substituoi-tua 3-hydrokei-indolia (esimerkissä 7).

Analogisella tavalla saadaan saatettaessa vastaavat substi-tuoidut indoksyy1i-yhdisteet reagoimaan kulloistenkin aminohappojen kansaa seuraavat substraatit, jolloin myös tällöin kaikissa tapauksissa muodostuu sivutuotteena vastaavia 1-ase-massa substituoituja 3-hydroksi-indoleita: g i 3-<N-formyyli-L-alanyylioksi>-indoli, o värittömiä kiteitä, sp. 121-122 C, 20 ° dp : -2,5 , c = 1 X (metanoli).

8.2. 3-/JI- < 4' -metoks i-bent syy 1 ioksikarbonyyli ) -L-alanyyli- oksi7-indoli, T o värittömiä kiteitä, sp. 92 C, 20 ° aD : -42,9 , c = 1 % (metanoli).

8.3. 3-/5i-<N'“<PiPeridino>-okeikarbonyyli)-L-alanyylioke_r7- indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 104 C, 20 ° dp : -24,7 , c = 1 X (metanoli).

3β 77229 8.4 . 3-/Ν-< tienyyli-<2' )-metoksikarbonyyli)-L-alanyylioksi7- indoli, o värittömiä kiteitä, ep. 134 C, 20 o aQ : -55,7 , c = 1 * (metanoli).

8.5. 3-/N-< kinoliini-8'-eulfonyy1i)-L-alanyyliokai?-indoli, amorfinen heikosti punertava jauhe, DC: valmiit piigeelilevyt, (eluoimisaine: toluoli-dioksaani 4:1, todettu: UV, NHg, (kaasu), Rf-arvo: 0,23).

8.6. 3-/N-<dif enyylikarbamoyyli ) -L-alanyy 1 ioksi./-indo 1 i , o värittömiä kiteitä, sp. 188-190 C, 20 o d D : +22,2 , c = 1 X (pyridiini).

Esimerkki 9 3-/~N-< furvvli- <2'> -metoksikarbonvvli )-L-alanvvlioksi7-indoli Reaktion suorittamiseksi aktiiviesteri-menetelmällä liuotetaan 4,26 g <0,02 moolia) N-(furyyli-<2'>-metoksikarbonyyli)-L-alaniinia ja 5,4 g <0,04 moolia) N-hydroksi-bentsotriatso- lia 50 ml:aan abs. tetrahydrofuraania (THF) ja jäähdytetään o lämpötilaan 0 C, ja tähän lisätään liuos, jossa on 4,4 g <0,022 moolia) disykloheksyylikarbodi-imidiä (DCC) 10 ml:ssa abs. THF. Aktiivieeterin muodostamiseksi sekoitetaan reaktio- o seosta 1,5 h lämpötilassa 0 C ja sitten 2 h huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen lisätään samalla hapelta ja vedeltä suojaten 2,66 g <0,02 moolia) indoksyyliä ja 2,77 ml <0,04 moolia) abs. trietyyliamiinia. Seosta sekoitetaan 18 h huoneen lämpötilassa. Muodostunut N,N'-disyklohekayyliurea erotetaan imusuodattamalla, liuotin tislataan pois tyhjössä ja jäännöstä käsitellään edelleen esimerkissä 7 kuvatulla tavalla. Amorfinen raakatuote puhdistetaan sitten patsaskromatografi-sesti piigeelipatsaassa toluoli-etikkaesteri-seoksella <5:1). Vastaavien koottujen fraktioiden haihduttamisen ja uudel-leenkiteyttämiaen jälkeen etikkaesteri-petrolieetteriatä 1:1 saadaan 3,0 g <45,7 X) 3-/Jf-< furyyli-< 2' >-metoksikarbonyy- 39 7 7 2 2 9 _ o li)-L-alanyylioksi/-indolia, värittöminä kiteinä, ap. 129 C.

20 o — et D: -51,9 , e = 1 X (matanoli).

Analogisella tavalla saadaan vastaavien substituoitujen aminohappojen tai peptidien reagoidessa kulloistenkin indoksyyli-yhdisteiden kanssa seuraavat yhdisteet: 9.1. 3-ZF-<toluoli-4'-eulf onyyli-L-valyylioksi/-indo1i, o värittömiä kiteitä, ep. 125-127 C, 20 o a jj : -24,5 , c = 1 * (metanoli).

9.2. 3-/.H- ( 4' -dimetyy1iamino-bentsolieulf onyyli) -L-alanyy-lioksi/-indoli, amorfinen hieman punertava jauhe, DC: valmiit piigeelilevyt, (eluoimisaine: toluoli-dioksaani 3:1, todettu: UV, NH3 (kaasu), R^-arvo 0,25).

9.3. 3-/JI-< 4 ' -asetyyli-bentsolisulf onyy 1 i )-L-alanyylioksi7-indoli 9.4. 3-/N-(4'-metoksikarbonyyli-benteolieulfonyyli>-L-ala-nyylioksij-indoli, o värittömiä kiteitä, sp. 140-141 C, 20 o a p -40,3 , c = 1 X (metanoli).

9.5. 3-ZJi-(4'-karboksimetyyli-bentsolisulf onyy li >-L-alanyy- liokei/-indoli, amorfinen väritön vaahto.

20 o a d : -82,1 , c β 1 x (metanoli), DC: valmiit piigeelilevyt, (eluoimisaine: isopropano-1i-etikkahappo-n-butyyliseteri-vesi 5:3:2, todettu: UV, NH3 (kaasu), Rf-arvo: 0,68).

40 77229 9.6. 3-£k-< 4'-karboksimetoksi-bentsolisulf onyyli)-L-alanyy- liokei7-indoli, amorfinen väritön vaahto, 20 o a p : -47,7 , c = 1 X (metanoli).

DC: valmis piigeelilevy (eluoimisaine: toluoli-diok-aaani-etikkaeateri 6:2:1, todettu: UV, NHg (kaasu), Rf-arvo: 0,27).

9.7. 3-£jN-(4'-karboke imetyyliamino-bentsoiisulfonyyli)-L-alanyylioksi7-indoli, o värittömiä kiteitä, sp. 151-153 C (hajoaa), 20 o ctjj -71,5 , c = 1 X (metanoli).

9.Θ. 3-/S-(4'-<bentsyyliokeikarbonyyli-metyyliamino>- benteol iaul f onyyli ) -L-alanyy 1 i oka i_7- indo 1 i , o värittömiä kiteitä, sp. 110-113 C, 20 o a p : -60,0 , c = 1 X (metanoli).

9.9. 3-/N-(4'-fluori-benteolisulf onyyli)-L-alanyylioksi/-indoli, o värittömiä kiteitä, sp. 94-95 C, 20 o a jj -46,5 , c = 1 X (metanoli).

9.10. 3-5i-(4'-fluorisulfonyyli-bentsoiisulf onyyli)-L-ala-nyylioksi7-indoli, 9.11. -sulf amoyy li-bent soi isul f onyyli ) -L-alanyy Il oksi/ -indo1i 9.12. 3-£R-asetyyli-N-(toluoli-4'-sulf onyyli)-L-alanyyli- oksi_/-indoli, väritön amorfinen jauhe, 20 o a D : -10,6 , c = 1 X (metanoli), DC: valmis piigeelilevy (eluoimisaine: toluoli-dioksaani 9:1, todettu: UV, NHg (kaasu), Rf-arvo: 0,17).

41 77229 9.13. 3-^-(pyridiini-3'-eulfonyyli>-L-alanyyliokei7-indoli, värittömiä kiteitä, βρ. 155-157 C, 20 o aD : "55*1 * c s 1 * <metanoli).

9.14. 3-/N-< 5 ,5 -dimetyyli-3'-okeo-eyklohekaen-1'-yyli)-L- alanyyliokei/-indoli , o värittömiä kiteitä, βρ. 154 c, 20 o otjj : -272,2 , c = 1 % (metanoli) .

9.15. 3-£fi- (di-^4' -nit robenteyy ii> - f oeforyyli) -L-alanyyli-oksi/-indoli 9.16. 3-/H-(di-4'-bromibenteyyli-f oeforyyli)-L-alanyyli- okei_/-indoli 9.17. 3-/N-(toluoli-4'-sulfonyyli)-L-alanyylioksi7-5-metok-ei-indoli, väritön viekoottinen öljy, 20 o

Op : -46,8 , c = 1 X (metanoli), DC: valmis piigeelilevy (eluoimieaine: toluoli- etikkahappoetyylieeteri 2:1, todettu: UV, NH3 (kaasu), Rf-arvo: 0,45).

Esimerkki 10 3-^Jf- <3', 6 ' -dioksa-n-heptyylioks i-karbonyy li ) -L-alanyyli- oksff-indoli___________

Reaktion suorittamiseksi aeosanhydridimenetelmää käyttäen liuotetaan 3,52 g (0,015 moolia) N-(3,6-dioksa-n-heptyylioksi- karbonyyli)-L-alaniinia 35 ml:aan abs. tetrahydrofuraania (THP). Kun on lisätty 2,1 ml (0,015 moolia) trietyyliamiinia, o jäähdytetään seos lämpötilaan -15 C ja tämän jälkeen lisätään anhydridiaeoksen muodostamiseksi 1,43 ml (0,015 moolia) kloo- rimuurahaishappoetyyliesteriä. 1 tunnin pituisen sekoittami- o sen jälkeen lämpötilassa -15 C lisätään samalla hapelta ja o vedeltä suojaten lämpötilaan -15 C jäähdytetty liuos, jossa on 2,00 g (0,015 moolia) indoksyyliä 20 ml:saa abs. THF.

42 77229

Seosta sekoitetaan edelleen 2 h lämpötilassa välillä -15 ja o -20 C ja sen annetaan sitten seistä yli yön jäähdytyskaapissa. Muodostunut trietyyliamiinihydrokloridi erotetaan imusuodat-tamalla, liuotin haihdutetaan tyhjössä ja jäännöstä käsitellään edelleen esimerkissä 7 kuvatulla tavalla. Amorfinen raa-katuote puhdistetaan sitten pateaskromatografisesti piigeelin avulla käyttäen ensin metyleenikloridi-metanoliseoata (95:5) ja sitten toluoli-metyylietyyliketoni-seosta (1:2). Koottujen fraktioiden käsittelemisen jälkeen aktiivihiilellä ja liuottimen poistamisen jälkeen saadaan 0,51 g (9,5 X) 3-/Tf-(3',~ 6'-dioksa-n-heptyylioksi-karbonyyli)-L-alanyy1iokai7-indolia värittömänä viskoottisena öljynä, 20 o a g : -40,4 , c = 1 X (metanoli), DC: valmis piigeelilevy, (eluoimisaine: toluoli-metyyli-etyyliketoni 1:2, todettu: UV, NHg (kaasu), R^-arvo: 0,54).

Analogisella tavalla saadaan vastaavien substituoitujen aminohappojen reagoidessa kulloistenkin indoksyy1i-yhdisteiden kanssa seuraavat yhdisteet: 10.1. 3-/}i-< 2'-nitro-bentsolisulf enyyli)-L-alanyylioksiT"-indoli, o keltaisia kiteitä, ap. 133-134 C, 20 o a D : -116,0 , c * 1 X (metanoli).

10.2. 3-ZS-C1'-metyy1i-2'-bentsoyyli-vinyyli)-L-alanyyli-oksi7-indoli, “ o hieman punertavia kiteitä, sp. 130-133 C, DC: valmis piigeelilevy, (eluoimisaine: toluoli- dioksaani 4:1, todettu: UV, NHg (kaasu), Rf-arvo 0,45).

Claims

43 7 7 2 2 9 Patentti vaatimukset

1. Indoksyyli-aminohappoesteri ja -peptidiesteri, jol]a on yleinen kaava I R , 1 R0 f /0-A-B (I) R 4 jossa kaavassa R , R0, R,, R., jotka voivat olla samanlaisia tai erilaisia, ovat kukin vety tai halogeeni, C^-C^-alkyy1i-tai C^-C^-alkoksi ryhmä, X on mahdollisesti C^-C^-alkyyl1 - , bentsyyli- tai bent-soyylijäännöksenä substituoitu iminoryhmä, A on luonnollinen α-aminohappojäännös tai di- tai trialanyy-lijäännös ja B on peptidikemiassa tavanomainen tai tästä johdettu typpi" suojaryhmä.

2. Menetelmä indoksyyli-aminohappoestereiden ja -peptidi" estereiden valmistamiseksi, jolla on yleinen kaava I R ,1 Rg ^0-A-B (I) % jossa kaavassa Rj, R^, R^, R^, jotka voivat olla samanlaisia tai 44 77229 erilaisia, ovat kukin vety tai halogeeni, C^-C^-alkyy 1i-tai C -C -.Ikoksiryhmä, X on mahdollisesti C^-C3~alkyyli-, bentsyyli- tai bent-soyy1ijäännöksel1ä substituoitu iminoryhmä, A on luonnollinen a-aminohappojäännös tai di- tai trialanyy-lijäännös ja B on peptidikemiassa tavanomainen tai tästä johdettu typpi-suojaryhmä, tunnettu siitä, että yhdisteitä, joilla on yleinen kaava II R ''°'H {in I i rr " R 4 jossa kaavassa R , R R R4 ja X tarkoittavat samaa kuin edellä, saatetaan reagoimaan aminohappojen ja peptidien kanssa, joil. la on yleinen kaava III H-O-A-B (III) jossa kaavassa A ja B tarkoittavat samaa kuin edellä tai vastaavasti niiden reaktiokykyisten johdannaisten kanssa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukaisten indoksyy 1i-aminohap- poestereiden ja -peptidiestereiden, joiden yleinen kaava on r 4 > käyttö kromogeenisina aineina proteolyyttisten enstyymien osoittamiseksi. 45 77229