DK155318B - Indoxyl- og thioindoxyl-aminosyreestere og -peptidestere, diagnostisk middel indeholdende dem, og deres anvendelse i diagnostiske midler - Google Patents
Indoxyl- og thioindoxyl-aminosyreestere og -peptidestere, diagnostisk middel indeholdende dem, og deres anvendelse i diagnostiske midler Download PDFInfo
- Publication number
- DK155318B DK155318B DK535679AA DK535679A DK155318B DK 155318 B DK155318 B DK 155318B DK 535679A A DK535679A A DK 535679AA DK 535679 A DK535679 A DK 535679A DK 155318 B DK155318 B DK 155318B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- indole
- alanyloxy
- sulfonyl
- methanol
- indoxyl
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
- C12Q2334/50—Indoles
Description
i
DK 15531 8 B
Den foreliggende opfindelse angår indoxyl- og thioindoxyl-aminosyreestere og -peptidestere med den almene formel I
R1
5 n . OA'-B
ΕΎπ—Γ (I) R3 10 hvor Ri, R2, r3 0g r4# der |<an være ens eller forskellige, er hydrogen eller halogen, en (C1-C5)-alkyl -, (C1-C5)-alkoxy-, (c6“c10)-aryl-f (C6~Cio)‘aryl-(Ci-C5)-alkyl-, (C6“Cio)-aryl-(Ci-C5)-alkoxy-, en hydroxy-, en carboxy-, en carboxy-(Ci-Cs)-alkoxy-, (C6-Cjq)-ary1(Cj-C5)-alkoxycarbony1-, en {Cg-Cjo)· 15 aryl-(Ci-C5)-a.lkoxycarbonyl-(Ci-C5)-alkoxy-, en nitro- eller en (C1"C5)-acylaminogruppe, eller to nabosubstituenter er en eventuelt med halogen substitueret benzoannelleret rest, X er et svovlatom eller en eventuelt med en (Ci-C5)-alkyl-, en (C6-Ci0)-aryl-, en (C6-Cio)~aryl-(Ci-C5)-alkyl- eller en (0^-20 C5)-acylrest substitueret iminogruppe, A er en aminosyrerest eller en di-, tri-, tetra- eller penta-peptidrest, B er en i peptidkemien sædvanlig nitrogenbeskyttelsesgruppe.
25 Disse estere er egnede til anvendelse i diagnostiske midler til påvisning af proteolytiske enzymer, således som de f.eks. forekommer i leukocyter. De egner sig endvidere til påvisning af f.eks. elastase, chymotrypsin eller trypsin i rene vandige opløsninger eller i legemsvæsker som f.eks. plasma i serum, li-30 quor, pankreassekret eller vandige afføringsekstrakter.
Påvisning af leukocyter i legemsvæsker, især i urin, indtager en fremskudt plads i diagnostikken af sygdomme i nyrerne og urogeni talområdet.
Hidtil udføres denne påvisning ved møjsommelig tælling af leu-kocyterne i ikke-centrifugeret urin eller i urinsediment.
35 2
DK 155318 B
Fælles for de to metoder er ifølge naturen, at kun intakte leukocyter konstateres. På den anden side er det kendt, at hastigheden af leukocytlysen alt efter urinmiljøet er underkastet enorme svingninger; således må man f.eks. i stærkt alka-5 lisk urin regne med en leukocythalveringstid på kun 60 minutter. Følgen heraf er for lave leukocyttal henholdsvis ved længere urinhenstand, endog falsk-negative resultater.
Bortset fra lysefejl giver kvantitativ mikroskopisk bestemmel-10 se af leukocyterne i ikke-centri fugeret, homogeniseret urin i tællekammer ret pålidelige værdier. I praksis anvendes denne metode dog kun sjældent, da den er møjsommelig, trættende og tidsrøvende og kræver anvendelse af skolet personale.
15 Det overvejende flertal af leukocytbestemmelser i urin udføres i medicinsk praksis efter den såkaldte synsfeltmetode i urinsediment. Til dette formål må undersøgelsesmaterialet (sediment) først udvindes ved centrifugering. Herved opkoncentreres imidlertid også andre bestanddele af urinen, der som f.eks.
20 salte og epitelceller kan vanskeliggøre den mikroskopiske tælling af leukocyterne betydeligt. Svingende sedimentindhold, inhomogeniteter af sedimentet samt muligvis forskellige mikroskopiske forstørrelser og forskelligt optisk udstyr af mikroskopet fører til, at den her sædvanlige angivelse af antal af 25 leukocyter pr. mikroskopisk synsfelt kan være behæftet med fejl på flere hundrede procent.
Det var derfor den foreliggende opfindelses opgave at tilvejebringe et diagnostisk middel, hvormed leukocyterne i legemsvæ-30 sker kan påvises hurtigt og fuldstændigt på enkel og let håndterbar måde.
Som påvisningsprincip for en sådan leukocyt-prøve tilbyder sig en enzymatisk reaktion, da leukocyterne har et bredviftet en-35 zymspektrum. 1 amerikansk patent nr. 30 87 794 er beskrevet en leukocytpå-visning, som styres over den i de granulocytære leukocyter
DK 155318 B
3 tilstedeværende peroxydatiske aktivitet. En sugedygtig bærer, der er imprægneret med hydrogenperoxid, og en organisk indikator, f.eks. o-tolidin, viser tilstedeværelsen af leukocyter ved dannelse af et farvet oxidationsprodukt. En sådan prøve 5 har dog afgørende ulemper. For det første har peroxydati ske reaktioner under anvendelse af o-tolidin ganske alment en betydelig tilbøjelighed til forstyrrelse over for reducerende stoffer i urinen, som f.eks. over for ascorbinsyre. Desuden findes i flere litteratursteder (se f.eks. L. Mettler, Med.
10 Welt 23, 399 (1972)) henvisninger til instabiliteten af leuko-cytperoxidase i urinmiljø, som giver anledning til falsk-negative konstateringer. Endnu mere graverende er den mangelfulde selektivitet, som man skulle forvente af denne prøve over for erytrocyter.
15 I nogle år har påvisningsmetoder, som beror på den esterolyti-ske aktivitet af de enzymer, som findes i de systemer, der skal bestemmes, haft deres faste plads i den histokemiske og cytokemiske enzymologi (se f.eks. A.G.E. Pearse, Histochemi-20 stryl, Theoretical and Applied). I princippet anvendes farveløse eller svagt farvede estere, som gennem den enzymatiske spaltning for det meste henfalder i en farveløs syrekomponent og en ligeledes farveløs alkohol-(phenol)-komponent. Sidst nævnte bliver så ved en reaktion, som følger på den enzymati-25 ske forsæbning, omsat til farvede produkter (f.eks. kobling med diazoniumsalte eller oxidative reaktioner).
Således beskriver f.eks. F. Schmalzl og H. Braunsteiner i Klin.Wschr. 46, 642 (1968) en specifik cytokemisk leukocyt- 30 esterase-påvisning med naphtol-AS-D-chloracetat som substrat og et diazoniumsalt til dannelse af den farvede azoforbindel-se.
Til et diagnostisk middel til hurtig og simpel påvisning af 35 leukocyter i legemsvæsker, som f.eks. i urin, viser to-kompo- nentsystemer af denne art sig uegnede, da som bekendt mange i urin forekommende forbindelser, såsom urobilinogen, stercobi-1 i nogen, bilirubin og andre, reagerer med diazoniumsalte. Des- 4
DK 1 55318 B
uden er denne påvisning alt for ufølsom. F.eks. viser prøver med 5.000 leukocyter pr. μ liter ingen reaktion.
I britisk patent nr. 11 28 371 beskrives et diagnostisk middel 5 til påvisning af hydrolytiske enzymer i legemsvæsker. Hertil bliver en sugedygtig bærer vædet med farveløse indoxyl- eller thioindoxylestere og eventuelt en stødpude og et oxidations-middel. Ved tilstedeværelse af hydrolytiske enzymer opstår af esterne frit indoxyl eller thioindoxyl og heraf ved indvirk-10 ning af luftens oxygen eller oxidationsmidler dybt farvet indigo eller thioindigo. De i dette patent beskrevne forbindelser er ikke brugbare til en leukocytprøve, da de selv med 10.000 leukocyter pr. μ liter ikke viser nogen reaktion.
15 Således findes der i dag i handelen ikke nogen prøvestrimmel, som gør det muligt simpelt og hurtigt at påvise leukocyter, selv om leukocyt-påvisning i urin hører til de hyppigst udførte kliniske undersøgelser.
20 Sammen!igninqsføring
Ved hjælp af forbindelserne ifølge opfindelsen med den almene formel I fremstilles på den i de følgende eksempler beskrevne måde diagnostiske midler ifølge opfindelsen. Disse sammenlig-25 nes med diagnostiske midler, som er fremstillet på helt analog måde med; forbindelser, der har været, anvendt til leukocytpåvisning efter andre tidligere beskrevne metoder.
Fremstilling af det diagnostiske middel 30
Filtrerpapir (Schleicher & Schiill 23 SL) imprægneres i rækkefølge med følgende opløsninger og tørres ved 60°C.
Opløsning 1 (Stødpudeopløsning) (Dinatriumtetraboratdecahydrat 7,63 g (2 x 10-2 md.)
Destilleret vand ca. 30 ml
Opløsningen indstilles med IN salt- 35 5
DK 155318 B
syre til pH 8
Destilleret vand til 100 ml
Opløsning 2 (Substratopløsning) 5
Hertil bliver følgende substrater i en koncentration på 10~3 mol/1 opløst i acetone.
A) Naphthol-AS-D-chloracetat og ægte granatsalt GBC (beskrevet 10 i F. Schmalzl, H. Braunstei ner, Klin. Wschr. 46 642 (1968)) B) Indoxylacetat (Eks. 1 i britisk patent 11 28 371) C) Indoxylbutyrat (Eks. 2 i britisk patent 11 28 371) D) 3-[N-(benzy1oxycarbony1)-L-alany1oxy]-6-methy1 indol (Eks.
1.3 i den foreliggende ansøgning) 15 E) 3-[N-toluol-41-sulfonyl)-L-alanyloxy1]-indol (Eks. 1.31 i den foreliggende ansøgning) F) 3-[N-totuol-4'-sulfony1)-L-tyrosy1oxy]-indol (Eks. 1.43 i den foreliggende ansøgning) 20 De på ovenfor beskrevne måde fremkomne prøvepapir blev dyppet i isotoniske kogsaltopløsninger, der indeholder 5.000 eller 10.000 leukocyter/μΐ (L/μ1).
I følgende tabel er anført de reaktionstider, som var nødven-25 dige til påvisning af leukocyter i disse prøveopløsninger. Der er anført tiden indtil der optræder en tydeligt synlig farveændring af prøvefeltet.
Tabel 30
Reaktionstid (T) til påvisning af leukocyter i isotonisk kogsaltopløsning med henholdsvis 5.000 og 10.000 leukocyter pr. μΐ.
35 6
DK 155318 B
T (sek.)
Prøvestrimmel 5.000 L/μΙ 10.000 L/μΙ
5 A --X --X
B --X --X
C —x --X
D 160 70 E 50 20 F 140 60 1 o x Ingen synlig reaktion selv efter 30 minutter.
Forsøgsresultaterne viser, at diagnostiske midler, der er fremstillet med forbindelserne ifølge opfindelsen, er egnede til påvisning af leukocyter i legemsvæsker, medens diagnostiske 15 midler med forbindelser, der hidtil har været kendt til påvisning af leukocyter efter andre metoder, ikke engang viser leukocyt-koncentrationer, som liger langt over de patologisk faktisk forekommende koncentrationer. Af angivelserne i de følgende eksempler kan ses, at der med .forbindelserne ifølge opfindelsen 2 0 også kan påvises tydeligt lavere urinleukocytkoncentrationer end de, der blev anvendt i de ovenstående sammenligningsforsøg. Der kræves her blot noget længere reaktionstider. Med forbindelserne ifølge. opfindelsen kan der følgelig fremstilles diagnostiske midler, som er fremragende egnet til at se for- 2 5 skel på normale og patalogiske urinleukocytkoncentrationer.
Opfindelsen angår derfor endvidere et diagnostisk middel til påvisning af proteolyt i ske enzymer bestående af en sugedygtig bærer, et filmlag, en pulverblanding et lyofilisat, en opløs- 3 0 ning eller en reagenstablet indeholdende en eller flere chro-mogener og et egnet stødpudestof og eventuelt yderligere hjælpemidler, hvilket middel er ejendommeligt ved, at der som chromogener anvendes indoxyl- og/eller thioindoxy1-aminosyre- estere og/eller -peptidestere med den almene formel I.
3 5
Opfindelsen angår endvidere anvendelsen af indoxyl- og/eller thioindoxyl-aminosyreestere og/eller -peptidestere af den al-
DK 155318B
7 mene formel I til fremstilling af diagnostiske midler til påvisning af proteolytiske enzymer, især de i leukocyter værende proteaser i legemsvæsker.
5 Samtlige indoxyl- og thioindoxyl-aminosyreestere og -peptid-estere med den almene formel I er hidtil ukendte forbindelser.
Fremstillingen af de hidtil ukendte indoxyl- og thioindoxyl-aminosyreestere og -peptidestere af den almene formel I kan 10 ske på måder, der er i og for sig kendt fra peptidkemien.
Fortrinsvis omsættes på i og for sig kendt måde de tilsvarende indoxyl- eller thioindoxyl-forbindelser af den almene formel II
T i » ,r ™ R T4
R
20
hvor Ri, R2, r3, r4 0g X har den ovennævnte betydning, med aminosyrer og peptider af den almene formel III
HO-A-B (III) 25 hvor A og B har den ovennævnte betydning, eller med egnede reaktionsdygtige derivater deraf.
Som reaktionsdygtige derivater anvendes f.eks. syrech1 or iderne 30 henholdsvis de ved peptidsyntese sædvanligt anvendte blan-dingsanhydrider, f.eks. med chlormyresyreethylester eller akti vester.
Indoxyl- og thioindoxyl-forbindelserne med den almene formel 35 II samt aminosyrerne og peptiderne méd den almene formel III er kendte forbindelser (se f.eks. P. Friedlaender, Fortschritte der Teefarbenfabrikation und verwandter Industriezweige, bind 3-20 og Houben-Weyl, Metoden der organischen Chemie, bind 15/1) eller kan fremstilles i analogi med kendte forbindelser.
8
DK 155318 B
Ved halogen i definitionen af Ri, R2, r3 0g R4 skal forstås fluor, chlor, brom og jod, fortrinsvis chlor og brom.
Alkoxygruppen i definitionen af Ri, R2, R3 og R4 samt alkyl-5 gruppen i Ri, R2, R3, R4 og X indeholder 1 til 5, fortrinsvis 1 til 3 carbonatomer, idet methoxygruppen og methylgruppen foretrækkes særligt.
Ved en aralkoxygruppe i definitionen af Ri, R2, R3 og R4 samt 10 en aralkylgruppe i definitionen af Ri, R2, R3, R4 og X skal f.eks. forstås phenyl- og naphthylgrupper substitueret med oxy-lavere alkyl- eller lavere alkylrester, idet alkylresten indeholder 1 til 5, fortrinsvis 1-3 carbonatomer. Særligt foretrukne er benzyloxy- og benzyl resten.
15
Som acylaminogrupper af Ri, R2, R3 og R4 kan der være tale om amidgrupperingerne af de lavere alifatiske carbonsyrer med 1 til 5, fortrinsvis 1 til 3 carbonatomer. Særligt fortrukket er acetyl am i noresten.
20
Som acylrest i definitionen af X kan der være tale om resterne af alifatiske carbonsyrer med 1 til 5, fortrinsvis 1 til 3 carbonatomer eller aromatiske carbonsyrer, som f.eks. benzoe-syrer eller naphthoesyrer. Særligt foretrukket er acetyl- og 25 benzoyl resterne.
Ved en arylrest i definitionen af R1, R2, R3, R4 og X skal fortrinsvis forstås phenyl- eller napthylgruppen.
30 Som aminosyrerest i definitionen af A kan der fortrinsvis være tale om resterne af de naturlige α-aminosyrer i deres L- eller D-form eller i deres racemiske form. Særligt foretrukket er resterne af glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, phenyl-alamin og tyrosin. Eventuelt tilstedeværende hydroxygrupper 35 kan være acyleret, fortrinsvis acetylenet.
Ved en peptidrest i definitionen A skal forstås di-, tri-, te-tra- og pentapeptider, fortrinsvis di- og tripeptider, idet 9
DK 15531S B
der som aminosyrekomponenter fortrinsvis anvendes de ovennævnte aminosyrer.
Som en i peptidkemien sædvanlig nitrogenbeskyttelsesgruppe i 5 definitionen af B skal f.eks. forstås acyl-, oxycarbony1-, thiocarbonyl-, sulfonyl-, sulfenyl-, vinyl-, cyklohexenyl-phosphoryl- eller carbamoyl grupperne.
De ifølge opfindelsen som chromogener anvendte indoxy- eller 10 thi o indoxy1-aminosyreestere og -peptidestere med den almene formel I anvendes i koncentrationer på 10-4 til 1 mol pr. liter, fortrinsvis 10“3 til 10“1 mol pr. liter imprægneringsopløsning, overtræksmasse eller væske, der skal undersøges.
15 En yderligere bestanddel af det diagnostiske middel til påvisning af proteolytiske enzymer og især leukocytproteaserne er et egnet stødpudesystem. Til dette formål kan anvendes f.eks. phosphat-, borat-, barbiturat-, tris-(hydroxymethylJ-aminome-than-, 2-amino-2-methyl-propandiol-1,3-(=amediol)- eller ami-20 nosyre-stødpuder, idet pH-værdien og kapaciteten må vælges således, at der i måleopløsningen henholdsvis på prøvestrimmelen indstiller sig en pH-værdi på 6-10, fortrinsvis 7-9.
Endvidere kan man ved fremstillingen af det diagnostiske mid-25 del ifølge opfindelsen til påvisning af proteolytiske enzymer, især leukocytproteaserne i legemsvæsker, yderligere anvende oxidationsmidler for at omsætte de ved den enzymatiske reaktion primært opståede indoxyl- eller thioindoxyl-forbindelser til de farvede indigo- eller thioindigostoffer. Disse oxida-30 tionsmidler som f.eks. kaliumhexacyanoferrat-III, kaliumbro-mat, kaliumchromat, phenazinmethosulfat eller tetrazoliumsalte anvendes i koncentrationer på 10-4 til 1 mol pr. liter, fortrinsvis 10"3 til 10“1 mol pr. liter imprægneringsopløsning, overtrækningsmasse eller væske, som skal undersøges.
En yderligere bestanddel af et diagnostisk middel til påvisning af proteolytiske enzymer, især leukocytproteaser, kan være et befugtningsmiddel, da der herved opnås noget forkortede 35
. DK 155318 B
10 reaktionstider og undertiden mere brillante farver. Fortrinsvis anvendes ikke-ionogene, men også amfotere kationaktive eller anionaktive befugtningsmidler i koncentrationer på 0,05-2%, fortrinsvis 0,1-1¾.
5
Til fremstilling af midlet ifølge opfindelsen imprægneres f.eks. sugedygtige bærere, fortrinsvis filtrerpapir, cellulose eller kunsttavef1 is med opløsninger af de nødvendige sædvanligt til fremstilling af prøvestrimler anvendte reagenser 10 (substrat, stødpude, eventuelt befugtningsmiddel, oxidationsmiddel o.s.v.) i let-flygtige opløsningsmidler som f.eks. vand, methanol, ethanol eller acetone. Dette sker hensigtsmæssigt i to adskilte trin: først imprægneres med en vandig opløsning, som indeholder stødpuden og andre vandopløselige ti 1 — 15 sætningsstoffer. Derefter imprægneres med en opløsning af pro-teasesubstratet med den almene formel I. I specielle tilfælde kan også anvendes den omvendte imprægneringsrækkefølge.
De færdige prøvepapirer kan anvendes som sådanne eller på i og 20 sig kendt måde klæbet til gribestykker eller fortrinsvis forseglet mellem kunststoffer og finmasket netværk ifølge DE-fremlæggelsesskrift nr. 21 18 455.
Til fremstilling af filmbelagte prøvestrimler indføres samtli-25 ge reagenser i opløsningen eller dispersionen af et filmdannende stof som f.eks. polyvinylester eller polyamid og blandes homogent. Blandingen stryges så i et tyndt lag på en kunststofbærer og tørres. De filmbelagte prøvestrimler ifølge opfindelsen udskæres efter tørring og kan anvendes som sådanne 30 eller på i og for sig kendt måde klæbet til gribestykker eller f.eks. forseglet mellem kunststoffer og finmasket netværk ifølge DE-fremlæggelsesskrift nr. 21 18 455.
Det diagnostiske middel ifølge opfindelsen til påvisning af 35 proteolytiske enzymer, især leukocytproteaser, i form af pulverblandinger eller reagenstabletter kan fremstilles ved, at der til prøvens ovenfor anførte bestanddele sættes sædvanlige galeniske tilsætningsstoffer og det hele derefter granuleres.
DK 155313 B
π
Tilsætningsstoffer af denne art f.eks. carbonhydrater såsom mono-, eller oligo- eller polysaccharider, eller sukkeralkoholer, såsom mannit, sorbit eller xylit, eller andre opløselige indifferente forbindelser, såsom polyethylenglycoler eller po-5 lyvinylpyrrolidon. Pulverblandingerne eller reagenstabletterne har i almindelighed en slutvægt på ca. 50-200 mg, fortrinsvis 50-80 mg.
Til fremstilling af lyofilisater i en samlet vægt på ca. 5-20 10 mg, fortrinsvis 10 mg, frysetørres en opløsning, som foruden samtlige til prøven nødvendige reagenser indeholder sædvanlige skeletdannere, såsom polyvinylpyrrolidon, og eventuelt andre fyldstoffer, såsom mannit, sorbit eller zylit.
15 Det diagnostiske middel ifølge opfindelsen i form af en opløsning indeholder fortrinsvis samtlige til prøven nødvendige reagenser. Som opløsningsmiddel kan der anvendes vand eller blandinger af vand med et vandopløseligt, organisk opløsningsmiddel, såsom methanol, ethanol, acetone eller dimethylfor-20 mamid. Af holdbarhedsgrunde kan det være fordelagtigt at fordele de til prøven nødvendige reagenser på to eller flere opløsninger, som først føres sammen ved den egentlige undersøgelse.
25 De således fremstillede diagnostiske midler gør det muligt efter neddypning i de legemsvæsker, som skal undersøges, eller som skal undersøges efter en tilsætning, hurtigt og enkelt via en farvedanne1 se at påvise tilstedeværelsen af proteolytiske enzymer, især leukocytproteaser, hvilken farvedannelse kan be-30 dømmes visuelt eller fotometrisk, f.eks. remissionsfotometrisk eller i cuvette. Da aktiviteten af 1eukocytproteaserne pr. celle kan anses for en i det væsentlige konstant størrelse, kan leukocytkoncentrationen i den undersøgte legemsvæske konstateres af intensiteten af farvedannelsen. Derved omfattes af 35 det diagnostiske middel ifølge opfindelsen både intakte og lyserede leukocyter, da aktiviteten af leukocytproteaserne bevares fuldt ud, også efter lyse af leukocyterne. Der optræder følgelige ikke nogen lysefejl.
DK 155318 B
12
Eksempel 1
Filtrerpapir (f.eks. Schleicher + SchUll 23 SL) imprægneres efter hinanden med følgende opløsninger og tørres så ved 60°C.
5
Opløsning 1
Dinatriumtetraboratdecahydrat 1,91 g
Destilleret vand ca. 30 ml 10 Indstilles med 0,1 N saltsyre til pH-værdi 8.0
Destilleret vand til 100 ml
Opløsning 2 15 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-indol 33,8 mg
Acetone til 100,0 ml
Man får et farveløst prøvepapir, som ved neddypning i leuko-cytholdig urin alt efter leukocytkoncentrationen farves lys 20 turkis til blåt. Der kan påvises: 5.000 leukocyter/μ 1 urin på ca. 2 minutter 1.000 leukocyter/μ 1 urin på ca. 6 minutter 500 leukocyter/μ 1 urin på ca. 10 minutter 25 200 leukocyter/μ 1 urin på ca. 15 minutter prøvens følsomhed ligger ved ca. 200 leukocyter pr. μ liter. Bedømmelsen kan også foretages remissionsfotometrisk ved 620 nannometer.
30
Prøvepapir med lignende egenskaber (følsomhed: 200-2.000 leukocyter pr. μ liter) får man, når man i stedet for 3-[N-(ben-zyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-indol anvender følgende substrater, idet der - når andet ikke er anført - ligeledes kan iagt- 35 tages lys-turkise til blå farvninger af de i øvrigt farveløse farvepapirer ved neddypning i leukocytholdig urin: 1.1 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-4-methyl indo! 1.2 3-[N-(benzyloxycarbony1)-L-alanyloxy]-5-methyl indo!
DK 155318 B
13 1.3 3-[N-(benzyloxycarbony 1)-L-alanyloxy]-6-methyl indo! 1.4 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-7-methylindol 1.5 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-4,7-dimethyl indo! 1.6 3 - [N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-4-chl or i ndol 5 1.7 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-5-bromindol 1.8 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-6-chlorindol. Farvning: Farveløs efter purpur.
1.9 3-[N-(toluol-4'-sulfony1)-L-alanyloxy]-4-chlor-5-bromi n-dol 10 1.11 3-[N-(toluol-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-4-chlor-5-brom-7- methy1 i ndol 1.22 1-methyl-3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-i ndol Farvning: Farveløs efter grøn.
1.23 1-benzy1-3-[N-(toluol-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-i ndol 15 Farvning: Farveløs efter grøn.
1.26 l-benzoyl-3-[N-(toluo1-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-i ndol Farvning: Farveløs efter violet.
1.27 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-glycyloxy]-indol 1.28 3-[N-(toluol-4'-sulfonyl)-glycyloxy]-indol 20 1.29 3-[N-(toluol-3'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-indol 1.30 3-[N-(toluol-3'-sulfony 1)-L-alany1oxy]- i ndol 1.31 3-[N-(toluol-4'-sulfonyl)-L-a1 anyloxy]- i ndol 1.32 3-[N-(toluol-4'-sulfonyl)-D-alany 1oxy]- indol 1.33 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-D,L-alanyloxy]-i ndol 25 1.34 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-valyloxy]-indol 1.35 3-[N-(toloul-4'-sulfonyl)-L-valyloxy]- indol 1.36 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-leucyloxy]-indol 1.37 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-isoleucyloxy]-indol 1.38 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-phenylalanyloxy]-i ndol 30 1.39 3-[N-(toloul-4'-sulfonyl)-L-phenylalanyloxy]-indol 1.42 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-tyrosyloxy]-indo! 1.43 3-[N-(toluol-4'-sulfonyl)-L-tyrosyloxy]- i ndol 1.44 3-[N-(toluol-4'-sulfony1)-0-acety1-L-tyrosyloxy]- indol 1.45 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alany1-L-alanyloxy]-indol 35 1.46 3-[N-(toluol-4'-sulfonyl)-D-alanyloxy-L-alanyloxy]-i ndol 1.47 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyl-L-alany1-L-alanyloxy]-i ndol 1.48 3-[N-(toluol-4'-sulfonyl)-D-alany1-D-alany1-L-alany1oxy]-
DK 155318 B
14 j i ] indo! 1.49 3-[N-formyl-L-alanyloxy]-indol 1.50 3-[N-acetyl-L-alanyloxy]-indol 1.51 3-[N-succinyl-L-alanyloxy]-indol 5 1.52 3-[N-benzoyl-D,L-alanyloxy]-indol 1.53 3-[N-phthaloyl-L-alanyloxy]-indol 1.54 3-[N-(ethoxycarbony1)-L-a1any 1oxy]- i ndol 1.55 3-[N-(tert.-buty1oxycarbony1)-L-alanyloxy]- i ndol 1.56 3-[N-(3',61-dioxa-n-heptyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-indo! 10 1.57 3-[N-(cyklohexyloxycarbonyl-L-alanyloxy]-indol 1.58 3-[N-(phenyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-indo! 1.59 3-[N-(41-methy1-benzyloxycarbonyl)-L-alany1oxy]-i ndol 1.60 3-(N-(4 *-methoxybenzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-indol 1.61 3-[N-(41-nitrobenzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]- indol 15 1.62 3-[N-(N'-(piperidino)-oxycarbonyl)-L-alanyloxy]-indol 1.63 3-[N-(furyl-(2*)-methoxycarbony1)-L-alanyloxy]-indol 1.64 3-[N-(thienyl -(2')-methoxycarbony1)-L-alanyloxy]-indo 1 1.65 3-[N-(benzylthiocarbony1)-L-alanyloxy]-indol 1.66 3-[N-(methansulfonyl)-L-alany1oxy]-i ndol 20 1.67 3-[N-(benzyl sulfonyl)-L-alanyloxy]-indol 1.68 3-[N-(benzol sulfonyl)-L-alany 1oxy]- i ndol 1.69 3-[N-(41-brombenzol sulfonyl)-L-alanyloxy]-i ndol 1.70 3-[N-(4,-nitrobenzolsulfonyl)-L-alanyloxy]- i ndol 1.71 3-[N-(41-dimethylaminobenzolsulfonyl)-L-alanyloxy]-i ndol 25 1.72 3 —[N —(41-acetylaminobenzolsulfony1)-L-alany 1oxy]- i ndol 1.73 3-[N-(4'-n-butylbenzolsulfonyl)-L-alanyloxy]-indol 1.74 3-[N-(4'-tert.-butylbenzolsulfonyl)-L-a1anyloxy]- i ndol 1.75 3-[N-(4'-n-octylbenzolsulfonyl)-L-alanyloxy]-indol 1.76 3 -[N-(4'-hydroxybenzol sulfony1)-L-alany1oxy]- i ndol 30 1.77 3-[N-(41-methoxybenzolsulfony1)-L-alany1oxy]-indol 1.78 3-[N-(4'-benzyloxybenzolsulfonyl)-L-alanyloxy]- i ndo 1 1.80 3-[N-(4' - (3"-oxa-5,,-hydroxy-n-pentyloxy)- benzolsulfonyl) -L-alanyloxy]- i ndol 1.81 3-(N-(4’-(3",6"-dioxa-n-heptyloxy)-benzol sulfonyl)-L-ala- 35 nyloxy]-indol 1.82 3-[N-{41-(2"-hydroxyethyl)-benzol sulfonyl)-L-alanoxy]-indol 1.84 3-[N-{4'-(2"-chlorethyl)-benzol sulfonyl)-L-alanyloxy]-
DK 155318 B
15 i ndol 1.86 3-[N-(4'-cyanobenzolsulfonyl)-L-alanyloxy]-i ndol 1.87 3 —[N —{4'-carboxybenzol sulfonyl)-L-alanyloxy]-1ndol 1.88 3-[N-(41-methoxycarbonylbenzol sulfonyl)-L-alany1oxy]- 5 indol 1.89 3-[N-(41-benzyloxycarbony1 benzol sulfonyl)-L-alanyloxy]-i ndol 1.90 3-[N-(41-carbamoyl benzol sulfonyl)-L-alanyloxy]-i ndol 1.91 3-[N-(4'-di methyl carbamoyl)-benzol sulfony 1)-L-alanyloxy]- 10 indol 1.92 3-[N-(41-carboxymethyl benzol sulfonyl)-L-alanyloxy]-i ndol 1.93 3 - [N- (4 1 - car boxy tne thoxy benzol sul f onyl) - L-al anyloxy ] - indol 1.94 3- £ N-{4 *-carboxymethyl am i nobenzolsulfonyl)-L-alany1oxy]-i ndo 1 15 1.95 3-[N-(4'-(benzy1oxycarbony1 methy1 am i no)-benzolsu1fony1)- L-alanyloxy]-indol 1.96 3-[N-(4'-fluorbenzolsulfonyl)-L-alany1oxy]-indol 1.99 3-[N-methyl-N-(toluol-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-indol 1.100 3-[N-acetyl-N-{tolool-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-indol 20 1.101 3-[N-(241,6'-trimethyIbenzolsulfonyl)-L-alanyloxy]- indol 1.102 3-[N-(biphenyl-4’-sulfonyl)-L-alanyloxy]-indol 1.103 3-[N-(naphthalin-2'-sulfonyl)-L-alany1oxy]-indol 1.104 3-[N-(4'-acetylaminonaphthalin-l'-sulfonyl)-L-alanyl- 25 oxy]-indol 1.105 3-[N- (5'-di methyl ami nonaphthalin-1'-sulfonyl)-L-alany1-oxy]- i ndol 1.106 3-[N-(chinolin-8'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-indol 1.107 3-[N-(pyridin-3'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-indol 30 1.108 3-[N-(2'-ni trobenzol sulfonyl)-L-alanyloxy]-indol
Farvning: Gul efter grøn.
1.109 3-[N-(l,-methyl-2'-benzoylvinyl)-L-alanyloxy]-indol 1.110 3-[N-(5',5'-dimethy1-3'-oxocyklohexen-1'-yl)-L-alanyl-oxy]-indol 35 1.111 3-[N-(diphenylcarbamoyl)-L-alanyloxy]-indol 1.116 3-[N-(toloul-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-5-methoxyindol I i
DK 155313B
16
Eksempel 2
Filtrerpapir (f.eks. Schleicher + Schiill 23 SL) imprægneres efter hinanden med følgende opløsninger og tørres så ved 60*0.
5
Opløsning 1
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan 0,61 g
Kaliumhexacyanoferrat-III 32,9 mg 10 Destilleret vand ca. 30 ml
Indstilles med 0,1 N saltsyre til en pH-værdi på 8,0
Destilleret vand til 100,0 ml 15 Opløsning 2 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-benzo[b]-thiophen 35,5 mg
Acetone til 100,0 ml 20
Man får et gulfarvet prøvepapir, som ved neddypning i leuko-cytholdig urin farves rødt.
Prøvens følsomhed ligger ved ca. l.ooo leukocyter pr. μ liter 25 urin.
Bedømmelsen kan også udføres remissionsfotometrisk ved 576 nannometer.
30 Med substraterne i eksempel 1 fås med oxidationsmidler, som f.eks. det ovennævnte kaliumhexacyanoferrat-III, eller f.eks. med kaliumbromat, kaliumchromat, phenazinmethosulfat eller te-trazoliumsalte, prøvepapir, der sammenlignet med analoge prøvepapirer uden oxidationsmiddel undertiden viser lidt for kor-35 te reaktionstider.
DK 155318 B
17
Eksempel 3
Filtrerpapir (f.eks. Schleicher + SchUll 23 SL) imprægneres efter hinanden med følgende opløsninger og tørres så ved 60°C.
5
Opløsning 1
Di natriumtetraboratdecahydrat 1,91 g
Destilleret vand ca. 30 ml 10 Nonylphenolpolyglycolether 0,2 g
Opløsningen indstilles med 0,1 N saltsyre til en pH-værdi på 8,0
Destilleret vand til 100,0 ml 15 Opløsning 2 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-indol 33,8 mg
Acetone til 100,0 ml 20 Man får et farveløst prøvepapir, som ved neddypning i leuko-cytholdig urin farves lys turkis til blåt, alt efter 1eukocyt-koncentrationen. Sammenlignet med recepten i eksempel 1 fås noget forkortede reaktionstider og lidt mere brillante farver.
25 Også med andre substrater i eksempel 1 og 2 fås der med be-fugtningsmidler som f.eks. ovennævnte nonylphenolpolyglycolether (ikke-ionogen), men også f.eks. med kokosiroidazoli nfor-bindelser (amfoter) eller benzyltrimethylammoniumchlorid (kat-ionaktiv) eller natriumsulfonatododecylbenzol (anionaktiv), 30 prøvepapir, der sammenlignet med analoge prøvepapirer uden be-fugtningsmiddel undertiden udviser lidt for korte reaktioner og noget mere brillante farver.
Eksempel 4 35
Opløsning 1 3-[N-benzoy1-D,L-alanyloxy]-indol 154,2 mg
Methanol til 100,0 ml
DK 155318 B
18
Opløsning 2
Di natriumtetraboratdecahydrat 7,63 g
Destilleret vand ca. 50 ml 5 Indstilles med N saltsyre til en pH-værdi på 8,0
Destilleret vand til 100,0 ml
Der blandes i et reagensglas: 10 1 ml opløsning 1 1 ml opløsning 2 2 ml leukocytholdig urin
Blandingen farves gradvis lysegrøn til dybblå, alt efter leu-15 kocytkoncentrationen.
Efter ca. 10 minutters henstand ved stuetemperatur bestemmes leukocytkoncentrationen visuelt ved hjælp af sammenligningsfarver eller bestemmes fotometrisk, f.eks. i 1 cm cuvetter ved 20 620 nannometer.
Prøvens følsomhed ligger ved ca. 200 leukocyter pr. μ liter urin.
25 Også med de andre substrater i eksemplerne 1 og 2 kan udføres reagensglasprøver eller cuvetteprøver med lignende følsomheder (200-1.000 leukocyter pr. μ liter urin).
Eksempel 5 30
En tablet indeholdende 3-[N-(41-carboxymethy1 ami nobenzolsulfonyl)-L-alanyloxy]-indol 2,0 mg
Kai iumdihydrogenphosphat 0,8 mg 35 Dinatriumhydrogenphosphatdihydrat 16,8 mg
Mannit til 70,0 mg sættes til 2 ml af en leukocytholdig urin i et reagensglas. Urinen farves gradvis lysegrøn til dybblå, alt efter leukocyt-
DK 155318B
19 koncentrationen .
Efter 10 minutters henstand ved stuetemperatur bestemmes leu-kocytkoncentrationen visuelt ved hjælp af sammenligningsfarver 5 eller fotometrisk f.eks. i 1 cm mikrocuvetter ved 620 nannome-ter.
Prøvens følsomhed ligger ved ca. 200 leukocyter pr. μ liter urin. Reaktionstiden kan forkortes tydeligt, hvis inkubationen 10 udføres ved 37°C.
Med de andre substrater i eksempel 1 og 2 kan opnås lignende følsomheder (200-1.000 leukocyter pr. μ liter) idet tilsætning såsom methanol eller dimethyl formamid anbefales, hvor det dre-15 jer sig om tungtopløselige substrater.
Eksempel 6
Filtrerpapir (f.eks. Schleicher + Schlill 23 SL) imprægneres 20 efter hinanden med følgende opløsninger og tørres så ved 60°C.
Opløsning 1
Dinatriumtetraboratdecahydrat 1,91 g 25 Destilleret vand ca. 30 ml
Opløsningen indstilles med 0,1 N saltsyre til en pH-værdi på 8,0
Destilleret vand til 100,0 ml 30 Opløsning 2 3-[N-(toluol-4'-sulfonyl)-L-tyrosyloxy]-indol 45,1 mg
Acetone til 100,0 ml 35 Man får et farveløst prøvepapir, som ved neddypning i vandige opløsninger, der indeholder det proteolyti ske enzym chymotryp-sin, farves blåt. Der kan på denne måde påvises koncentrationer på 0,02 U chymotrypsin pr. ml på ca. 6-7 minutter.
DK 155318 B
20
Den anførte enzymaktivitet blev bestemt med N-acety1-L-tyro-sinethylester som substrat ved 25eC, pH 7,0 og λ = 237 nanno-meter.
5 Også med de andre substrater i eksempel 1 og 2 kan - alt efter aminosyre henholdsvis peptidrest - påvises chymotrypsin eller andre proteolytiske enzymer som f.eks. elastase eller trypsin i rene vandige opløsninger eller f.eks. i legemsvæsker, såsom fuldblod, serum, liquor, pankreassekret eller vandige affø-10 ringsekstrakter.
Eksempel 7 3-CN-(toluol-4l-sulfonvl)-L-alanyloxvl-indol 15
Opløsning 1
Til fremstilling af syrechloridet opløses 5,35 g (0,022 mol)-N-(toluol-4-sulfonyl)-L-alanin i 20 ml absolut dimethylform-20 amid (DMF) og afkøles til -30°C. Derefter tilpipetteres under omrøring og afkøling 1,76 ml (0,024 mol) thionylchlorid, og reaktionsblandingen henstilles i 30 minutter i kølebad ved -300 C.
25 Opløsning 2 I en 250 ml trehalset kolbe, der er forsynet med omrører, termometer og rør for tilførsel og fraføring af gas, anbringer man efter fuldstændig fjernelse af luften med en svag nitro-30 genstrøm en opløsning af 2,90 g (0,022 mol) indoxyl (3-hydro-xyindol) i 40 ml absolut OMF, tilføjer 9,74 ml absolut pyridin og afkøler til -15°C.
Omsætning 35
Man hælder opløsning 1 til opløsning 2 og omrører under udelukkelse af oxygen og vand i ca. 5 timer ved -15°C, indtil der ikke mere kan konstateres indoxyl ved DC.
DK 155318 B
21
Med henblik på oparbejdning inddampes reaktionsblandingen i vakuum ved maksimalt 40-50°C badtemperatur. Remanensen optages i 100 ml eddikeester og vaskes efter hinanden to gange med hver 30 ml IN citronsyre, 20 ml vand, 50 ml 5% natriumbicarbo-5 natopløsning og 25 ml vand. Efter tørring med natriumsulfat inddampes eddikeesterfasen i vakuum.
Det således fremkomne råprodukt renses søjlekromatografisk på kiselgel med en blanding af toluol og dioxan (9:1). Efter af- 10 destillation af opløsningsmidlet fra de samlede fraktioner i vakuum får man ved udrøring af remanensen i ether 1,45 g (18,4%) 3-[N-(toluol-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-indol som far- 20 veløse krystaller, smeltepunkt 103°C, α - 56,6°, c = 1% (me-
D
thanol).
15
Som biprodukt kan der af andre fraktioner fra ovennævnte søj- lekromatograf iske adskillelse endvidere isoleres 0,89 g (11,3%) 1-[N-(toluol-41-sulfonyl)-L-alanyloxy]-3-hydroxyindo 1 = 1-[N(toluol-4'-su1fony 1)-L-alany1oxy]-2-oxoindo 1 in af eddi- 20 20 keester*. Farveløse krystaller, smeltepunkt 187-188°C, a -41,7° , c = l(DMF) . ° På analog måde får man ved omsætning af de tilsvarende substituerede indoxylforbi ndel ser med de pågældende aminosyrer føl-25 gende substrater, idet der i alle tilfælde (med undtagelse af 7.23-7.27) som biprodukter dannes ovennævnte 1-substituerede 3-hydroxy i ndo 1 er: 7.1. 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-indol, 30 farveløse krystaller, smp. 123°C, a^° --49,0°, c = 1% (methanol) 7.2. 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-4-methylindol, farveløse krystaller, smp. 113°C, -44,6°, c = 1% (methanol) 35 7.3. 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-5-methylindol, farveløse krystaller, smp. 143-144°C, -48,2°, c = 1% (methanol)
DK 15 5 318 B
22 7.4. 3- [N- (benzyloxycarbonyl) -L-alanyloxy }-6-methylindol, farveløse krystaller, smp. 148°C, -49,0°, c = 1% (methanol) 5 7.5. 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-7-methylindo1, farveløse krystaller, smp. 146°C, -51,2°, c = 1% (methanol 1 7.6. 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-4,7-dimethylindo1, farveløse krystaller, smp. 121°C, dp0 -46,3°, c = 1% (methanoll 7.7. 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-4-chlorindol, farveløse krystaller, smp. 142-143°C, -61,4°, c = 1% (methanoll I5 7.8. 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-5-bromindol, farveløse krystaller, smp. 138°C, a^° -28,0°, c = 1% (methanoll 7.9. 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-6-chlorindol, farveløse krystaller, smp. 170°C, 20 o -41,3°, c = 1% (methanol) 7.10 3-[N-(toluol-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-4-chlor-5-bromindol farveløse krystaller, smp. 150-152°C, aj^ -31,0°, c = 1% (methanol) 25 7.12. 3-[N-(toluol-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-4-chlor-5-brom- 7-methylindol, svagt beigefarvede krystaller, smp. 143-145°C, DC:færdiglavet kiselgelplade (løbemiddel: Toluoldio= xan 2:1, detektion: UV, NH3 (gas), R^-værdi: 0,56} 30 7.23. l-methyl-3-[N-(benzyloxycarbonyl1-L-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 92°C, a^:-49,5°, c = 1% (methanol) 7.24. l-benzyl-3-[N-(toluol-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-indol, 35 farveløse krystaller, smp. 149-152°C, <x^0:-54,9°, c = 1% (DMF).
DK 155318 B
23 7.27. l-benzoyl-3-[N-(toluol-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 155-156°C, dp0 :-54,7°, c = 1% (DMF).
7.28. 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-glycyloxy]-indol,
5 farveløse krystaller, smp. 122-124°C
7.29. 3-[N-(toluol-4'-sulfonyl)-glycyloxy]-indol,
farveløse krystaller, smp. 103-105°C
7.30. 3-[N-(toluol-21-sulfonyl)-L-alanyloxy]-indol, 10 farveløst amorft'pulver, a^°:-62,5°, c = 1% (methanol), DC: Færdiglavet kiselgelplade (løbemiddel: Toluol= dioxan 9:1. Detektion: UV, NH^ (gas), Rp-værdi:0,20).
7.31. 3-[N-(toluol-3'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 94°C, a^: -54,9°, c = 1% (methanol) 7.32. 3-[N-(toluol-4'-sulfonyl)-D-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 98°C, :+53,1°, c = 1% (methanol) 7.33. 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-D,L-alanyloxy]-indol,
farveløse krystaller, smp. 11Q-111°C
7.34. 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-valyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 64-65°C, aj^:41,l°, c = IS (methanol) 25 7.35. 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-leucyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 73-75°C, a^:-42,2°, c = 1% (methanol) 7.36. 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-isoleucyloxy]-indol, farveløst amorft pulver, 30 20 o <Xp :-30,6 , c = 1% (methanol),DC; Eferdiglavet kiselgelplade. (Løbemiddel:Toluoldioxan 2:1.
Detektion:UV, NH3 (gas).
Rp-værdi: 0,57).
35
DK 155318 B
24 7.37. 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-phenylalanyloxy]-indol, gullige krystaller, smp. 125°C, DC:Færdiglavet kiselgelplade.
(Løbemiddel:Toluoldioxan 9:1.
5 Detektion:UV, NH3 (gas).
Rp-værdi:0,56) .
7.38. 3-[N-(toluol-4'-sulfonyl)-L-phenylalanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 167-169°C, σ^0:-34,4°, c = 1% (methanol) 10 7.41. 3- [N- (benzyloxy carbonyl) -L-tyrosyloxy ] -indol, farveløst amorft skum, a^Q:-22,6°f c = 1% (methanol).
DC: Færdiglavet kiselgelplade.
(Løbemiddel: Toluoldioxan 4:11.
15
Detektion: UV, NH^ (gasl.
Rp-værdi: 0,27).
7.42. 3-[N-(toluol-4’-sulfonyl)-L-tyrosyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 171°C, 20 a^:-28,3°, c = 1% (methanol) 7.43. 3-[N-(toluol-4’-sulfonyl)-O-acetyl-L-tyrosyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 168-17Q°C, a^°:-24,l°, c = 1% (dimethylformamidi 7.44 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyl-L-alanyloxy]-indol, 25 farveløse krystaller, smp. 144°C, a^:-17,3°, c = 1% (methanol) 7.45. 3-[N-(toluol-41-sulfonyl)-D-alanyl-L-alanyloxy]-indol, gulligt amorft skum, 30 dp0:+5,8°, c =% (methanol).
DC: Færdiglavet kiselgelplade.
(Løbemiddel: Toluoldioxan 4:1.
Detektion: Uv, NH^ (gas).
Rp-værdi: 0,19).
35 7.46. 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyl-L-alany1-L-alanyloxy]- indol, farveløse krystaller, smp. 156°C, aj^:-39,5°, c = 1% (methanol) 25
DK 15531 δ B
7,47. 3-[N-(toluol-4'-sulfonyl)-D-alanyl-D-alany!-L-alanyloxy]- indol, farveløse krystaller, snip. 216°Cf a^:+53,8°, c = 1% (methanol) 5 7.48. 3-[N-acetyl-L-alanyloxy]-indol, farveløst amorft skum, a^:-12,5°, c = 1% (methanol).
DC: Færdiglavet kiselgelplade.
(Løbemiddel: eddikeesterdichlormethan 10:1.
10 Detektion: UV, NH^ (gas).
Rp-værdi: 0,33).
7.49. 3-[N-succinyl-L-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 142°C, a^°:-63,9°, c = 1% (methanol) 15 7.50. 3-[N-benzoyl-D,L-alanyloxy]-indol,
farveløse krystaller, smp. 171°C
7.51. 3-[N-phthaloyl-L-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 58°C, o λ 20 aD :-26,3°, c = 1% (methanol) 7.52. 3-[N-(ethoxycarbonyl)-L-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 96°C, ap°:-68,9°, c = 1% (methanol) 7.53. 3-[N-(cyklohexyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-indol, 25 _ farveløse krystaller, smp. 149 C, a^:-60,4°, c = 1% (methanol) 7.54. 3-[N-(phenyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 161°C, 30 (Xpj-96,0°, c = 1% (methanol) 7.55. 3-[N - (41-methylbenzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 135°C, a^:-45,9°, c = 1% (methanol) 7.56. 3- [JS— (4 ' -nitrobenzyloxycarbonyl) -L-alanyloxy] -indol, 3 5 q gullige krystaller, smp. 160 C, αρ0:-29,4°, c = 1% (methanol)
DK 155318 B
26 7.57. 3-[N-(benzylthiocarbonyl)-L-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 122°C, a^:-77,8°, c = 1% (methanol) 7.58. 3-[N-(methansulfonyl)-L-alanyloxy]-indol, 5 farveløse krystaller, smp. 164-166°C, α^°:-54,0Ο, c = 1% (methanol) 7.59. 3-[N-(benzylsulfonyl)-L-alanyloxy]-indol, farveløs viskos olie, ctp0:-54,8o, c = 1% (methanol).
10 DC: Færdiglavet kiselgelplade.
(Løbemiddel: Toluoleddikeester 2:1.
Detektion: UV, NHg (gas).
Rp-værdi: Q,40).
j5 7.60. 3-[N-(benzolsulfonyl)-L-alanyloxy]-indol, farveløs viskos olie, a^:-59,8°, c = 1% (methanol 1.
DC: Færdiglavet kiselgelplade.
(Løbemiddel: Toluoleddikeester 2:1.
2o Detektion: UV, NH^ (gas).
Rp-værdi: 0,48).
7.61. 3-[N-(4'-brombenzolsulfonyl1-L-alanyloxy]-indol, gulligt amorft pulver.
DC: Færdiglavet kiselgelplade.
25 (Løbemiddel: Toluoldioxan 4:1.
Detektion: UV, NH^ (gas).
Rp-værdi: Q,39).
7.62. 3-[N-(41-nitrobenzolsulfonyl)-L-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 136-137°C, 30 a^°:-35,9°, c = 1% (methanol).
7.63. 3-[N-(4'-acetylaminobenzolsulfonyll-L-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 162-163°C, a£Q:-57,2°, c = 1% (methanol) 35 7.64, 3-[N-(4'-n-butylbenzolsulfonyl)-L-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 105°C, a^°:-46,l°, c = 1% (methanol)
DK 155318 B
27 7.65. 3-[N-(41-tert.-butylbenzolsulfonyl)-L-alanyloxy]—indol, farveløse krystaller, smp. 140°C, α^0:-43,3°/ c = 1% (methanol) 7.66. 3-[N-(4'-n-octylbenzolsulfonyl)-L-alanyloxy]-indol, 5 farveløse krystaller, smp. 57°C, cip0:-34,2O, c = 1% (methanol) 7.67« 3-[N-(41-hydroxybenzolsulfonyl)-L-alanyloxy]-indol, viskos svagt rødlig olie.
DC: Færdiglavet kiselgelplade.
1 o (Løbemiddel: Toluoldioxan 1:1.
Detektion: UV, NH^ (gas)..
Rp-værdi: 0,62).
7.68. 3-[N-(41-methoxybenzolsulfonyl)-L-alanyloxy]-indol, 15 farveløse krystaller, smp. 126-128°C, a^:-54,3°, c = 1% (methanol) 7.69. 3—[N—(4'-benzyloxybenzolsulfonyl)-L-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 112°C, -40,3°, c = 1% (methanol) 20 7.71. 3-[N-(41-(3"-oxa-5"-hydroxy-n-pentyloxy)-benzolsulfonyl)- L-alanyloxy]-indol, farveløs viskos olie, 0,^:-36,4°C, c = 1% (methanol). DC: Færdiglavet kiselgelplade.
(Løbemiddel: Toluoleddikesyreethylester 1:10.
Detektion: UV, NH^ (gas).
Rp-værdi: Q, 3 7) .
7.72. 3-[N-(41-(3 ", 6"-dioxa-n-heptyloxy)-benzolsulfonyl)-L-alanyloxy]-indol, svagt rødlig viskos olie.
30 DC: Færdiglavet kiselgelplade.
(Løbemiddel: Toluoldioxan 4:1.
Detektion: UV, NH^ (gas).
Rp-værdi: 0,21).
7.73. 3-[N-(4'-(2"-hydroxyethyl)-benzolsulfonyl)-L-alanyloxy]- 35 indol, gulligt amorft pulver, 20
DK 155318B
28 ccD :-54,5, c = 1% (methanol).
DC: Færdiglavet kiselgelplade.
(Løbemiddel: Toluoleddikesyreethylester 1:2.
Detektion: UV, NH^ (gas).
5 R^-værdi: 0,26).
7.75. 3-[N-(4'-(2"-chlorethyl)-benzolsulfonyl)- L-alanyloxy]-indol, svagt rødligt amorft skum, 20 aD:-48-,.3 , C = 1% (methanol).
DC: Færdiglavet kiselgelplade.
(Løbemiddel: Toluoleddikeester 5:1.
Detektion: UV, NH^ (gas).
Rp-værdi: 0,20).
15 7.76 3-[N - (4'-cyanobenzolsulfony1)-L-alanyloxy]-indol,
_ Λ A
farveløse krystaller, smp. 131 c, :-47,Q°, c = IS (dimethylformamid) .
7.77. 3-[N-(4'-carboxybenzolsulfonyl)-L-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 143°C, ^ a^:-51,0°, c = 1% (methanol).
7.78. 3-[N-(4'-benzyloxycarbonylbenzolsulfonylj-L-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller,smp. 178°C, a^:-42,8°, c = 1% (acetone)
25 D
7.79. 3-[N-(4'-carbamoylbenzolsulfonyl)-L-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 2Q6°C, a^9-58,0°, c = 1% (acetone) 7.80. 3-[N-(4 -(dimethylcarbamoyl)-benzolsulfonyl)-L-alanyl= 30 oxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 170-172°C, a^°:-46,4°, c = IS (dimethylformamid) 7.81. 3-[N-methyl-N-(toluol-41-sulfony1)-L-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 82°C, 35 ap°:-42,2°, c = 1% (methanol)
DK 155318 B
29 7.82, 3-[N-(21,4’,6 * - trimethylbenzolsulfonyl)-L-alanyloxy]- indol, farveløse krystaller, smp. 192-194°C α^:-63,80, c =· 1% (methanol)., 5 7.83. 3-[N-(biphenyl-4'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 159°C, a^:-42,0°, c = IS (methanol) 7.84. 3-[N-(naphthalin-2'-sulfonyl)-L-alanyloxy]-indol, svagt rødlige krystaller, smp. 103-1Q5°C, DC: Færdiglavet kiselgelplade.
(Løbemiddel: Toluoldioxan 4:1.
Detektion: UV, NH^ (gas).
Rp-værdi: 0,41).
15 7.85. 3- [N- (41 -acetylaminonaphthalin-1' -sulfonyl)-L-alanyl= oxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 129-132°C, a^:-63,2°, c = 1% (methanol).
7.86. 3-[N-(51-dimethylaminonaphthalin-1'-sulfonyl)-L-alanyl= 2Q oxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 170°C, a^:-30,7°, c = IS (methanol) 7.87. 3-[N-(benzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-benzoIb]-thiophen, farveløs viskos olie, 25 a^:-42,2°, c = 1% (methanol).
DC: Færdiglavet kiselgelplade.
(Løbemiddel: Dichlormethan.
Detektion: UV, NaOH/K3Fe(CN),g.
Rp-værdi: 0,13).
30 ,
Eksempel 8 3-[N-(tert.-butyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-indol 35
Til omsætning efter carbodiimidmetoden opløses 3,23 g (0,0.17 mol) N-tert.-butyloxycarbonyl-L-alanin og 2,27 g (0,017 mol) 30 DK 1553188 indoxyl i 100 ml absolut dioxan.dichlormeth.an 1:1. Efter tilsætning af en opløsning af 3,87 g (0,019 mol). dicyklohexyl= carbodiimid (DCC) i 20 ml absolut dioxan omrører man. under udelukkelse af vand og oxygen i 68 timer ved stuetemperatur.
5
Det udskilte N,N'-dicyklohexylurinstof frasuges, opløsningsmidlet afdestilleres i vakuum, og remanensen optages i ca.
100 ml eddikesyreethylester. Efter frasugning af yderligere udfældet N,N'-dicyklohexylurinstof vaskes den klare eddike-10 esteropløsning efter hinanden hver to gange med 30 ml IN ci tronsyre, 20 ml vand, 50 ml 5-10% natriumbicarbonatopløsning og 25 ml vand. Efter tørring over natriumsulfat inddampes eddikeesterfasen i vakuum. Den amorfe remanens renses søjlekromatografisk på kiselgel med en toluoldioxanblanding 15 (9:1).
Efter inddampning af de samlede fraktioner i vakuum og omkrystallisation af eddikeesterether(1:10) får man 1,Q4 g (20%) 3-[N-(tert.-butyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-indol som 20 farveløse krystaller, smp. 158°C, a^: -65,0°, c = 1% (me= thanol).
Som biprodukt opstår der også ved denne omsætning den i 1-stil-ling substituerede 3-hydroxyindol (se eksempel 7).
25 På analog måde får man ved omsætning af de tilsvarende substituerede indoxylforbindelser med de pågældende aminosyrer følgende substrater, idet der også her i alle tilfælde som biprodukt opstår de tilsvarende i 1-stilling substituerede 30 3-hydroxyindoler: 8.1. 3-[N-formyl-L-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 121-122°C, a^:-2,5°, c = 1% (methanol) 35 8.2. 3-[N-(41-methoxybenzyloxycarbonyl)-L-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 92°C, a^°:-42,9°, c = 1% (methanol)
DK 155318 B
31 8.3. 3- [N- (Ν' - (piperidino 1 -oxycarbonyl). -L-alanyloxy] -indol, farveløse krystaller, smp. 104°C, O Λ <xD :-24,7°, c = 1% (methanol 1 8.4. 3- [N- (thienyl -(21} -methoxycarbonyl) -L-alanyloxy] -indol, 5 farveløse krystaller, smp. 134°C.
a£Q:-55,7°, c = 1% (methanolI
8.5. 3-[N-(chinolin-8'-sulfonyl)-L-alanyloxy]—indol, amorft svagt rødligt pulver, DC: Færdiglavet kiselgelplade.
(Løbemiddel: Toluoldioxan 4:11.
Detektion: UV, NH3 (gas],
Rp-værdi: 0,23].
8.6. 3- (N-(diphenylcarb amoyl] -L-alanyloxy] -indol, 15 farveløse krystaller, smp. 188-19Q°C, a^:+22,2°, c = 1% (pyridin]
Eksempel 9 20 3 - [N-(furyl-(21)-methoxycarbonyl1-L-alanyloxy]-indol
Til omsætning ved aktiv-estermetoden opløses 4,26 g (Q,Q2 mol] N- (fury 1- (2*1 -methoxycarbonyl ] -L-alanin og 5,4 g (G., Q 4 mol) N-hydroxybenzotriazol i 50 ml absolut tetrahydrofuran (THF), 25 afkøles til Q°C, og derefter tilsættes en opløsning af 4,4 g (0,022 mol ] dicyklohexylcarbodiimid (DCC) i 10 ml absolut THF. Til dannelse af den aktive ester omrører man reaktionsblandingen 1 1/2 time ved Q°C og derpå to timer ved stuetemperatur. Derefter tilsætter man under udelukkelse 3^ af oxygen og vand 2,66 g (Q,Q2 mol] indoxyl og 2,77 ml (0,0.4 mol) absolut triethylamin. Blandingen omrøres i 18 timer ved stuetemperatur. Det dannede N,N,-dicyklohexylurinstof fra-suges, opløsningsmidlet afdestilleres i vakuum, og remanensen oparbejdes, som beskrevet i eksempel 7. Det amorfe rå— 35 produkt renses så søjlekromatografisk på en kiselgelsøjle med en blanding af toluol og eddikeester (5:1). Efter ind-dampning af de ønskede samlede fraktioner og omkrystallisation af eddxkeesterpetroleumsether 1;1 fås 3,Q g (45,7%).
DK 155318 B
32 3-[N-(furyl-(21)-methoxycarbonyl)-L-alanyloxy]-indol som farveløse krystaller, smeltepunkt 129°C, αρ0ί~51,9°, c = 1% (methanol).
5 På analog måde får man ved reaktion af de tilsvarende sub stituerede aminosyrer eller peptider med de pågældende in= doxylforbindeIser følgende stoffer: 9.1. 3-[N-(toluol-4'-sulfonyll-L-valyloxy]-indol, 10 farveløse krystaller, smp. 125-127°C, a^:-24,5°, c = 1% (methanol) 9.2. 3-[N-(4'-dimethylaminobenzolsulfonyl)-L-alanyloxy]-indol, amorft svagt rødligt pulver, DC: Færdiglavet kiselgelplade.
*5 (Løbemiddel: Toluoldioxan 3:1.
Detektion: UV, NH^ (gas).
R -værdi: 0,251.
i? 9.4. 3-[N-(4’ -methoxycarbonylbenzolsulfonyli-L-alanyloxy]-indol,
farveløse krystaller, smp. 14Q.-141°C, a^°:-4Q,3°, c = 1% (methanolI
9.5. 3-[N-(41-carboxymethylbenzolsulfonyl1-L-alanyloxy]-indol, amorft farveløst skum, :-82,1°, c = 1% (methanoll,
25 D
DC: Færdiglavet kiselgelplade.
(Løbemiddel: Isopropanoleddikesyre-n-butylester- vand 5:3:2.
Detektion: UV, NH^ (gas).
R_-værdi: 0,68).
30 F
9.6. 3-[N-(4'-carboxymethoxybenzolsulfonyl]-L-alanyloxy]-indol, amorft farveløst skum, <Xp°:-47,7°, c = 1% (methanoll, DC: Færdiglavet kiselgelplade.
35 (Løbemiddel: Toluoldioxaniseddike 6:2:1.
Detektion; UV, NHg (gas).
Rp-værdi: 0,27).
DK 155318 B
33 9.7. 3-[N-(4'-carboxymethylaminobenzolsulfonylI-L-alany1oxy]- indol, farveløse krystaller, smp. 151-153°C (Zers.!, :-71,5°, c = 1 (methanol! 5 9.8. 3- [N1 - (4 ' - (benzyloxycarbonyimethylaminol -benzolsulfonyl) - L-alanyloxy]-indol, farveløse krystaller, smp. 11Q-113°C, a^:-6Q,Q°, c = 1% (methanol! 9.9. 3-[N- (41-fluorbenzolsulfonyl[-L-alanyloxy]-indol, 10 farveløse krystaller, smp. 94-95°C, a^:-48,5°, c - 1% (methanol 1 9.12. 3-[N-acetyl-N-(toluol-4'-sulfonyl]-L-alanyloxy]-indol, farveløst amorft pulver, a^:-10,6°, c = 1% (methanol)., 15 u DC: Færdiglavet kiselgelplade.
(Løbemiddel: Toluoldioxan 9:1.
Detektion: UV, NH^ (gas). .
Rp-værdi: 0,171.
2o 9.13., 3-[N-(pyridin-3 1-sulfonyl)-L-alanyloxy ]-indol, farveløse krystaller, smp, 155-157°C, a^:-55,l°, c = 1% (methanol! 9.14. 3-[N-(51,5'-dimethyl-3'-oxocyklohexen-1'-yl)-L-alanyloxy]-indol, 25 farveløse krystaller, smp. 154°C, <XpQ :-272,2°, c = 1% (methanol! 9.17. 3-[N-(toluol-41-sulfonyl 1-L-alanyloxy]-5-methoxyindol,
2 Q Q
farveløs viskos olie, aD :-46,8 , c = 1% (methanol), DC: Færdiglavet kiselgelplade.
30 Løbemiddel: Toluoleddikesyreethylester 2:1.
Detektion: UV, NH3 (gas).
Rp-værdi: 0,45[.
Eksempel 10 35 3-[N- (31,6 '-dioxa-n-heptyloxycarbonyl). -L-alanyloxy] -indol Til omsætning efter blandingsanhydridmetoden opløses 3,52 g
/ Λ Λ 1 r- -. \ » / -> /- n_r____ — T___J___T ________T_____i \ T__1--4 ~ 4 O C
DK 155318 B
34 ml absolut tetrahydrofuran (THF)_. Efter tilsætning af 2,1 ml (0,015 moll triethylamin afkøles blandingen til -15°C, og med henblik på dannelse af blandingsanhydridet tilsættes 1,43 ml (0,015 mol) chlormyresyreethylester. Efter 1 times omrøring 5 ved -15°C tilsætter man under udelukkelse af oxygen og vand en til -15°C afkølet opløsning af 2,0Q g (Q,Q15 mol) indoxyl i 20 ml absolut THF. Blandingen omrøres videre i to timer ved -15°C og indstilles så i køleskab natten over. Det dannede triethylaminhydrochlorid frasuges, opløsningmidlet af-10 trækkes i vakuum, og remanensen oparbejdes, som beskrevet i eksempel 7. Det amorfe råprodukt renses så søjlekromatografisk på kiselgel, først med en methylenchlorid-methanol-blanding (95:5) og derefter med en toluo1-methylethylketon-blandirig (1:2). Efter behandling af de samlede fraktioner 15 med aktivt carbon og aftrækning af opløsningsmidlet fås Q,51 g (9,5%) 3-[N-(3',61-dioxa-n-heptyloxycarbonyi)-L-alanyloxyJ- 2q ø indol som en fairveløs viskos olie, : ^4Q,4 , c = 1% (me= thanol), DC: Færdiglavet kiselgelplade.
20 (Løbemiddel: Toluolmethylethylketon 1:2.
Detektion: UV, NH3 (gas!· R„-værdi: 0,54).
£ På analog måde får man ved reaktion af de tilsvarende sub-25 stituerede aminosyrer med de pågældende indoxylforbindelser følgende stoffer: 10.1. 3-[N-(2'-nitrobenzolsulfenyl)-L-alanyloxy]-indol, gule krystaller, smp. 133-134°C, 30 ct^0:-116,0°, c = 1% (methanol) 10.2. 3-[N-d'-methy 1-2' -benzoyl vinyl) -L-alanyloxy] -indol, svagt rødlige krystaller, smp. 130-133°C, DC: Færdiglavet kiselgelplade.
(Løbemiddel:Toluoldioxan 4:1.
35 Detektion: UV, NH^ (gas).
Rp-værdi: 0,45).
Claims (2)
1. Indoxyl- og thioindoxyl-aminosyreestere og -peptidestere 5 med den almene formel I R1 -/0^15 R Å4 hvor Ri, R1, R2 og R3, der kan være ens eller forskellige, er hydrogen eller halogen, en (Cj-C5)-al kyl-, (Cj-C5)-alkoxy-, 15 (Cg-Cio)-aryl-, (C6-Cio)-aryl-(Ci“C5)-alkyl-f (C6-Cjo)-aryl- (Cl'CsJ-al^oxy-, en hydroxy-, en carboxy-, en carboxy-(C1-C5)-alkoxy-, (Cg-Cio)”aryl(Ci-CsJ-alkoxycarbonyl-, en (Cg-Cio)-aryl-(Ci-C5)-alkoxycarbonyl-(Ci-C5)-alkoxy-, en nitro- eller en (cl~C5)-acylaminogruppe, eller to nabosubstituenter er en 20 eventuelt med halogen substitueret benzoannel1eret rest, X er et svovlatom eller en eventuelt med en (C^-Cg)-alkyl-, en (C6-Ci0)-aryl-, en (C6-Cio)_ary1"(cl"c5)"a,,ky1·· eller en {Cj-C5)-acylrest substitueret iminogruppe, A er en am inosyrerest eller en di-, tri-, tetra- eller penta-25 peptidrest, B er en i peptidkemien sædvanlig nitrogenbeskyttelsesgruppe. Diagnostisk middel til påvisning af proteolytiske enzymer bestående af en sugedygtig bærer, et filmlag, en pulverblan- 30 ding, et lyofilisat, en opløsning eller en reagenstablet indeholdende en eller flere chromogener og et egnet stødpudestof og eventuelt yderligere hjælpemidler, kendetegnet ved, at der som chromogener anvendes indoxyl- og/eller thio-indoxyl-aminosyreestere og/eller peptidestere ifølge krav 1, 2 Diagnostisk middel ifølge krav 2, kendetegnet ved, at der som yderligere hjælpemidler anvendes befugtnings-midler, oxidationsmidler, filmdannere, galeniske tilsætnings- 3 stofpr nn/eller skpletdannpnrlia sf-offer. DK 155318 B
4. Anvendelse af indoxyl- og/eller thioindoxyl-aminosyreeste-re og/eller peptidestere ifølge krav 1 i diagnostiske midler til påvisning af proteolytiske enzymer. 5 10 15 20 25 30 35
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2854987A DE2854987A1 (de) | 1978-12-20 | 1978-12-20 | Diagnostische mittel zum nachweis proteolytischer enzyme und dafuer geeignete chromogene |
| DE2854987 | 1978-12-20 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK535679A DK535679A (da) | 1980-06-21 |
| DK155318B true DK155318B (da) | 1989-03-28 |
| DK155318C DK155318C (da) | 1989-08-28 |
Family
ID=6057730
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK535679A DK155318C (da) | 1978-12-20 | 1979-12-17 | Indoxyl- og thioindoxyl-aminosyreestere og -peptidestere, diagnostisk middel indeholdende dem, og deres anvendelse i diagnostiske midler |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4278763A (da) |
| EP (1) | EP0012957B1 (da) |
| JP (1) | JPS593475B2 (da) |
| AR (1) | AR223505A1 (da) |
| AT (1) | ATE230T1 (da) |
| AU (1) | AU515190B2 (da) |
| BR (1) | BR7908306A (da) |
| CA (1) | CA1130801A (da) |
| CS (1) | CS245763B2 (da) |
| DD (1) | DD147845A5 (da) |
| DE (2) | DE2854987A1 (da) |
| DK (1) | DK155318C (da) |
| ES (1) | ES486932A1 (da) |
| FI (1) | FI77229C (da) |
| HU (1) | HU180431B (da) |
| PL (1) | PL127198B1 (da) |
| PT (1) | PT70608A (da) |
| SU (2) | SU1184444A3 (da) |
| YU (1) | YU311579A (da) |
| ZA (1) | ZA796880B (da) |
Families Citing this family (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3005845A1 (de) * | 1980-02-16 | 1981-09-03 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Aminosaeure- und peptidester von leuko-indoanilinen, verfahren zu deren herstellung sowie diese verbindungen enthaltende mittel zum nachweis proteolytischer enzyme |
| DE3017721A1 (de) * | 1980-05-09 | 1981-11-26 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme und dafuer geeignete substrate |
| EP0046742B1 (en) * | 1980-08-25 | 1984-06-27 | KabiVitrum AB | Peptide substrates for determination of protease activity |
| US4499185A (en) * | 1982-05-17 | 1985-02-12 | Miles Laboratories, Inc. | Test for esterase activity in a liquid sample |
| US4676950A (en) * | 1984-02-03 | 1987-06-30 | Foster Research Corporation | Indicator and test device for detecting occult blood |
| IL73998A (en) * | 1984-04-06 | 1988-08-31 | Miles Lab | Preparation of 3-(n-tosyl-l-alaninyloxy)-pyrrole compounds |
| US4657855A (en) * | 1984-04-06 | 1987-04-14 | Miles Laboratories, Inc. | Composition and test device for determining the presence of leukocytes, esterase and protease in a test sample |
| DE3413078A1 (de) * | 1984-04-06 | 1985-10-24 | Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. | Chromogene aminosaeure- und peptidester, verfahren zu deren herstellung, verwendung dieser verbindungen in analysenverfahren sowie mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme |
| US4637979A (en) * | 1984-04-06 | 1987-01-20 | Miles Laboratories, Inc. | Composition and test device for determining the presence of leukocytes containing a zwitterion coupling agent |
| US4645842A (en) * | 1984-04-06 | 1987-02-24 | Miles Laboratories, Inc. | Pyrrole compounds for detecting the presence of hydrolytic analytes |
| DE3412939A1 (de) * | 1984-04-06 | 1985-10-17 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Substrate fuer hydrolasen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| DE3413077A1 (de) * | 1984-04-06 | 1985-10-17 | Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Ind. | Chromogene aminosaeure- und peptidester, verfahren zu deren herstellung, verwendung dieser verbindungen in analysenverfahren sowie mittel zum nachweis esterolytischer und/oder proteolytischer enzyme |
| US4716236A (en) * | 1984-04-06 | 1987-12-29 | Miles Laboratories, Inc. | Method for synthesizing esters |
| DE3446714A1 (de) * | 1984-12-21 | 1986-06-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis des vorliegens einer allergie und zum spezifischen nachweis des fuer die allergie verantwortlichen allergens |
| GB8607294D0 (en) * | 1985-04-17 | 1986-04-30 | Ici America Inc | Heterocyclic amide derivatives |
| US5179112A (en) * | 1985-04-17 | 1993-01-12 | Ici Americas Inc. | Heterocyclic amide derivatives and pharmaceutical use |
| PT83559B (pt) * | 1985-10-17 | 1989-05-31 | Ici America Inc | Processo para a preparacao de novos derivados de indol e indazol-ceto-sulfona e de composicoes farmaceuticas que os contem |
| GB8623429D0 (en) * | 1985-10-17 | 1986-11-05 | Ici America Inc | Carboximide derivatives |
| GB8609175D0 (en) * | 1986-04-15 | 1986-05-21 | Ici America Inc | Heterocyclic carboxamides |
| WO1990012888A1 (en) * | 1989-04-27 | 1990-11-01 | Biocontrol Systems, Incorporated | Precipitate test for microorganisms |
| US5589328A (en) * | 1994-08-04 | 1996-12-31 | Mahant; Vijay K. | Chemiluminescence assays based on indoxyl substrates, thioindoxyl substrates and other substrates |
| US5464739A (en) | 1994-08-22 | 1995-11-07 | Bayer Corporation | Composition method for determining the presence of leukocyte cells, esterase or protease in a test sample |
| CA2161574A1 (en) | 1994-11-15 | 1996-05-16 | James Noffsinger | Methodology for colorimetrically determining the concentration of white blood cells in a biological fluid |
| FR2751663B1 (fr) * | 1996-07-29 | 1998-10-02 | Bio Merieux | Procede de mise en evidence d'une activite enzymatique de microorganismes |
| DE19651886A1 (de) * | 1996-12-13 | 1998-06-18 | Merck Patent Gmbh | Mittel und Verfahren zur Bestimmung von hydrolytischen Enzymen |
| GB2326712B (en) * | 1997-06-25 | 2001-09-26 | Fujirebio Kk | Colour devoloping method,enzyme immunoassay using the colour developing method,and immunochromatography incorporating the enzyme immunoassay |
| DE19735614A1 (de) * | 1997-08-16 | 1999-02-18 | Lothar Dr Seik | Verfahren zum Nachweis der Aktivität von Insulin-like Growth Factor Binding Protein-Proteasen (IGFBP-Proteasen). |
| DE19829707C2 (de) * | 1998-07-03 | 2002-07-18 | Macherey Nagel Gmbh & Co Hg | Diagnostisches Mittel zum Nachweis von Leukozyten, Elastasen, Esterasen und Proteasen |
| US6348324B1 (en) | 1999-01-21 | 2002-02-19 | Hypoguard America Limited | Composition and device for detecting leukocytes in urine |
| US6528652B1 (en) * | 1999-01-21 | 2003-03-04 | Chronimed | Composition and device for detecting leukocytes in urine |
| US6709868B2 (en) * | 2002-05-20 | 2004-03-23 | Portascience Inc. | Method and apparatus for measuring white blood cell count |
| WO2006065899A1 (en) * | 2004-12-13 | 2006-06-22 | Bayer Healthcare Llc | A method of differentiating between blood and control solutions containing a common analyte |
| GB2426334A (en) * | 2005-05-20 | 2006-11-22 | Orion Diagnostica Oy | Application of a reagent to a matrix material |
| US7504235B2 (en) * | 2005-08-31 | 2009-03-17 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Enzyme detection technique |
| US7727206B2 (en) * | 2005-12-27 | 2010-06-01 | Gorres Geoffrey H | Device for monitoring a patient for a urinary tract infection |
| US9103796B2 (en) * | 2007-12-14 | 2015-08-11 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Multi-layered devices for analyte detection |
| US11104933B1 (en) * | 2016-03-22 | 2021-08-31 | Cleu Diagnostics, Llc | Compositions and methods for determining the presence of active leukocyte cells using an electrochemical assay |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3087794A (en) | 1960-05-23 | 1963-04-30 | Miles Lab | Chemical test for differentiating leucocytes from erythrocytes |
| BE615395A (da) * | 1962-03-21 | |||
| GB1128371A (en) | 1965-10-04 | 1968-09-25 | Miles Lab | Diagnostic composition |
| DE2118455B1 (de) | 1971-04-16 | 1972-09-21 | Boehringer Mannheim Gmbh | Teststreifen |
| US4061625A (en) * | 1975-07-11 | 1977-12-06 | Ab Kabi | Novel chromogenic thrombin substrates |
| JPS5263794A (en) * | 1975-11-21 | 1977-05-26 | Shionogi Seiyaku Kk | Test piece for latent blood |
| JPS53132539A (en) * | 1977-04-22 | 1978-11-18 | Takeda Chem Ind Ltd | Protected amino acid or peptide having said protected amino acid residue |
| JPS53147034A (en) * | 1977-05-30 | 1978-12-21 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Gamma-glutamyl-p-aminoanilide derivatives and process for their preparation |
| US4216142A (en) * | 1978-12-18 | 1980-08-05 | Abbott Laboratories | Chromogenic substrates for the proteolytic enzymes |
-
1978
- 1978-12-20 DE DE2854987A patent/DE2854987A1/de not_active Withdrawn
-
1979
- 1979-11-30 US US06/099,180 patent/US4278763A/en not_active Expired - Lifetime
- 1979-12-05 CA CA341,299A patent/CA1130801A/en not_active Expired
- 1979-12-13 AR AR279277A patent/AR223505A1/es active
- 1979-12-13 CS CS798763A patent/CS245763B2/cs unknown
- 1979-12-14 AU AU53838/79A patent/AU515190B2/en not_active Expired
- 1979-12-14 AT AT79105184T patent/ATE230T1/de not_active IP Right Cessation
- 1979-12-14 DE DE7979105184T patent/DE2960857D1/de not_active Expired
- 1979-12-14 DD DD79217706A patent/DD147845A5/de not_active IP Right Cessation
- 1979-12-14 EP EP79105184A patent/EP0012957B1/de not_active Expired
- 1979-12-14 ES ES486932A patent/ES486932A1/es not_active Expired
- 1979-12-17 DK DK535679A patent/DK155318C/da not_active IP Right Cessation
- 1979-12-18 PT PT70608A patent/PT70608A/pt unknown
- 1979-12-18 BR BR7908306A patent/BR7908306A/pt unknown
- 1979-12-19 FI FI793986A patent/FI77229C/fi not_active IP Right Cessation
- 1979-12-19 PL PL1979220526A patent/PL127198B1/pl unknown
- 1979-12-19 HU HU79BO1813A patent/HU180431B/hu unknown
- 1979-12-19 SU SU792853140A patent/SU1184444A3/ru active
- 1979-12-19 ZA ZA00796880A patent/ZA796880B/xx unknown
- 1979-12-19 YU YU03115/79A patent/YU311579A/xx unknown
- 1979-12-20 JP JP54164895A patent/JPS593475B2/ja not_active Expired
-
1981
- 1981-10-16 SU SU813346097A patent/SU1156595A3/ru active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS245763B2 (en) | 1986-10-16 |
| CA1130801A (en) | 1982-08-31 |
| SU1184444A3 (ru) | 1985-10-07 |
| AR223505A1 (es) | 1981-08-31 |
| DK535679A (da) | 1980-06-21 |
| JPS593475B2 (ja) | 1984-01-24 |
| DE2960857D1 (en) | 1981-12-03 |
| AU5383879A (en) | 1980-06-26 |
| BR7908306A (pt) | 1980-09-09 |
| YU311579A (en) | 1984-04-30 |
| AU515190B2 (en) | 1981-03-19 |
| PL127198B1 (en) | 1983-10-31 |
| ATE230T1 (de) | 1981-10-15 |
| HU180431B (en) | 1983-03-28 |
| US4278763A (en) | 1981-07-14 |
| PL220526A1 (da) | 1980-12-01 |
| DE2854987A1 (de) | 1980-06-26 |
| FI77229C (fi) | 1989-02-10 |
| DD147845A5 (de) | 1981-04-22 |
| EP0012957B1 (de) | 1981-09-16 |
| SU1156595A3 (ru) | 1985-05-15 |
| FI793986A (fi) | 1980-06-21 |
| PT70608A (de) | 1980-01-01 |
| JPS5585561A (en) | 1980-06-27 |
| EP0012957A1 (de) | 1980-07-09 |
| DK155318C (da) | 1989-08-28 |
| ES486932A1 (es) | 1980-05-16 |
| FI77229B (fi) | 1988-10-31 |
| ZA796880B (en) | 1980-12-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK155318B (da) | Indoxyl- og thioindoxyl-aminosyreestere og -peptidestere, diagnostisk middel indeholdende dem, og deres anvendelse i diagnostiske midler | |
| DK169974B1 (da) | Anvendelse af midler til påvisning af esterolytiske og/eller proteolytiske enzymer i leukocytter samt midler til en sådan anvendelse | |
| US9487520B2 (en) | Coelenterazine derivatives and methods of using same | |
| US4717658A (en) | Gram negative bacteria screening method with horseshoe crab amebocyte lysate (LAL) | |
| EP0034586B1 (en) | 4-trifluoromethylcoumarin peptide derivatives and their use in proteinase assays | |
| US20130102014A1 (en) | Fluorinated resorufin compounds and their application | |
| US4645842A (en) | Pyrrole compounds for detecting the presence of hydrolytic analytes | |
| NO164201B (no) | Reagens for spektrofotometrisk bestemmelse av tilstedevaerelsen av leukocytter, esterase eller protease i en proeve, forsoeksinnretning omfattende denne og fremgangsmaate til bestemmelse av tilstedevaerelsen av de nevnte stoffene. | |
| NO164866B (no) | Reagens og forsoeksinnretning til bestemmelse av tilstedevaerelsen av leukocytter, esterase og protease i en proeve. | |
| FI81359C (fi) | Glykosider av resorufin-derivat, foerfarande foer framstaellning daerav samt deras anvaendning foer bestaemning av aktiviteten av glykosidaser. | |
| US8216800B2 (en) | Substrates for detecting peptidase activity and methods using the substrates | |
| US4704460A (en) | Novel compounds for detecting the presence of hydrolytic analytes in a test sample | |
| CS220789B2 (en) | Diagnostic means for evidence of the leucosyte in the body liquids | |
| HU179936B (en) | Diagnostic means for the detection of leucocythes in body fluids and process for preparing the proper chromogens | |
| US4469789A (en) | Amino acid and peptide esters of leuko-indoaniline compounds and compositions for the detection of proteolytic enzymes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PUP | Patent expired |