CS245763B2

CS245763B2 - Agent for demonstration of proteolytical ferments

Info

Publication number: CS245763B2
Application number: CS798763A
Authority: CS
Inventors: Dieter Berger; Franz Braun; Werner Guethlein; Manfred Kuhr; Wolfgang Werner
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1978-12-20
Filing date: 1979-12-13
Publication date: 1986-10-16
Also published as: DE2960857D1; DE2854987A1; FI793986A; AU515190B2; ATE230T1; PL220526A1; PT70608A; FI77229B; AR223505A1; JPS593475B2; ZA796880B; HU180431B; DK155318C; EP0012957B1; YU311579A; AU5383879A; ES486932A1; FI77229C; US4278763A; BR7908306A

Description

mentu moče tak zvanou metodou zorného pole. K tomu musí být nejprve pomocí odstředění získán zkoumaný vzorek (sediment). Přitom však jsou obohaceny i jiné součásti moči, které, jako například seli a epitelové buňky, mohou podstatně ztěžovat mikroskopické hodnocení leukocytů. Kolísavý obsah sedimentu, nehomogenita sedimentu, jakož i pokud možno· rozdílné mikroskopické zvětšení nebo rozdílné optické vybavení mikroskopů vedou k tomu, že zde obvyklé údaje o- počtu leukocytů v mikroskopickém zorném poli jsou zatíženy chybami několika set procent.

Úkolem tohoto vynálezu bylo tudíž zajistit prostředek, kterým lze stanovit le-uo?clcyty v tělních tekutinách jednoduchým a snadno proveditelným způsobem, pokud možno rychle a dokonale.

Jako· princip důkazu pro takový leukocytový test se nabízí enzymatická reakce, protože leukocyty vykazují rozšířené enzymové spektrum.

V americkém patentovém spise číslo 30 87 794 je popsán a chráněn průkaz leukocytů, který je prováděn pomocí peroxidické aktivity v granulocytárních leukocytech. Savý nosič, který je impregnován peroxidem vodíku a organickým indikátorem, například. o-tolidlnem, prokazuje přítom-

nost leukocytů tvorbou barevného oxidačního produktu. Takový test má však značné nevýhody: peroxidické reakce využívající o-tolidinu jsou obvykle rušeny redukčními látkami v moči, například kyselinou askioťbovou. Kromě toho lze nalézt ve více údajích literatury (například B. L. Mettler, Med. Welt 23, 399 [1972]) odkazy na nestabilitu leukocytové peroxidázy v moči, ktterá vede к nesprávným negativním nálezům. Ještě závažnější je očekávaná nedostatečná selektivita tohoto testu proti erythrocytům.

Po několik let mají v histochemické a cytočhemické enzymologii své pevné místo průkazné metody, které spočívají v esterolytické aktivitě enzymů přítomných v hodnocených systémech (srovnej například A. G. E. Pearse, Histochemistry, Theoretical and Applied). V principu se přitom používá bezbarvých nebo* slabě zbarvených esterů, které se enzymatickým štěpením štěpí většinou v bezbarvou kyselinovou a rovněž bezbarvou alkoholickou (fenolickou) složku. Ta se potom převádí reakcí následující po enzymatickém zmýdelnění v barevné produkty (například kopulací s diazoniovými solemi nebo oxidačními reakcemi). Tak například popisují F. Schmalzl a H. Braunsteiner v Kliň. Wschr. 46, 642 (1968) specifický cytochemický leukoicytoesterázový průkaz s naftol-AS-D-chloracetátem jako substrátem a diazoniiovou solí pro tvorbu barevné azosloučeniny.

Pro diagnostický prostředek к rychlému a jednoduchému průkazu leukocytů v tělních tekutinách, jako například v mtoči. se ukázaly dvousložkové systémy tohoto druhu jako nevhodné, protože, jak je známo, četné v moči se vyskytující sloučeniny, jako urobilinogen, sterkobilinogen, bilirubin a jiné, reagují s diazoniovými solemi. Kromě toho· je tento důkaz velice necitlivý. Například vzorky s 5 000 leukocyty/μΐ nevykazují žádnou reakci.

V britském patentu č. 11 28 371 je popisován a chráněn diagnostický prostředek к průkazu hydrblytických enzymů v tělních tekutinách. Přitom se napojí savý nosič bezbarvými indoxyliovými nebo thiioindoxylovými estery a případně pufrem a oxidačním činidlem. Při přítomnosti hydrolytických enzymů vzniká z esterů volný indioxyl nebo· thioindoxyl a z toho působením vzdušného kyslíku nebo oxidačního činidla tmavě zbarvené indigo nebo thioindigo. Sloučeniny chráněné v tomto britském patentu jsou pro leukocytový test nepoužitelné, protože ani s 10 000 leutoocytů/μΐ nedávají žádnou reakci.

Tak dodnes není na trhu zkušební proužek, který umožňuje jednoduchý a rychlý průkaz leukocytů, ačkoliv průkaz leukocytů v moči náleží к nejčastěji prováděným klinickým vyšetřením.

S překvapením bylo nyní nalezeno, že lze získat stabilní a rychle ukazující diagnos tické prostředky, kterými lze dobře dokázat leukOcyty v tělních tekutinách, když jako substrátů к průkazu esteráz (proteáz), přítomných v neutrofilních leukocytových granulocytech, se použije esterů indoxylových nebo thioindoxyliových esterů aminokyselin nebo peptidických esterů. Kromě toho se ukázalo, že tyto substráty se výborně hodí к obecnému průkazu proteolytických enzymů, jako například elastázy, chymotrypsinu nebo trypsinu v čistě vodných roztocích nebo rovněž v tělních tekutinách jako například v plazmě, séru, likvoru, sekretu pankreatu nebo ve vodných extraktech stolice.

Předmětem tohoto vynálezu je tedy prostředek к průkazu proteolytických enzymů, sestávající ze savého nosiče, práškovité směsi, roztoku nebo reagenční tablety, které obsahují reagenční směs, která sestává z 0,2 až 9,0 mlol. % chromogenu, 62,4 až

99,8 mol. °/o pufru, 0 až 28,4 mol. % simáčedla a 0 až 78,5 mol. % galenické přísady. Podstata tohoto prostředku spočívá podle vynálezu v tom, že jako chrOmogen obsahuje estery indoxyl- a/nebo thioindioxylaminokyselin a/nebo -peptidů obecného vzOrce I

fy (I) ve kterém

Ri, Rz, R3, Rí miohou být stejné nebo různé, znamenají vždy vodík nebo halogen, Cl až Сз-alkylovOu, Ci—Сз-alkoxyloviou, benzylovou, benzyloxylovou, hydroxylovou, karboxylovou, karboxy-Ci—Сз-alkoxylovoiU, benzyloxykarbonytavou, benzyboxykarbonyl-Ci—Сз-alkaxylovou skupinu, nitriskupinu nebo acetylaminoskupinu nebo vždy dva sousední substituenty tvoří benzoanelovaný zbytek,

X značí atom síry a případně Ci—Сз-alkylem, fenylem, benzylem, acetylem nebo benzioylem substituovanlou iminoskupinu,

A zbytek přírodních α-aminokyselin nebo z těchto α-aminokyselin sestávající dinebo tri-peptidický zbytek,

В značí v peptidové chemii obvyklou nebo od ní odvozenou skupinu chránící dusík, jako je například skupina acylová, oxykarbonylová, thiokarbonylová, sulfonylová, sulfenylová, vinylová, cyklohexenylová, fosforylová nebo karbamoylová.

Prostředky podle vynálezu jsou určeny к důkazu proteolytických enzymů, zejména

243763 prioteáz přítomných v leukiocytech tělních tekutin.

Všechny estery odvozené od indoxylových aminokyselin a thioindoxylových aminokyselin a/nebo peptidů uvedeného obecného vzorce I jsou novými sloučeninami.

Způsob výroby esterů odvozených od indoxylových a thioindoxylových aminokyselin nebo/a peptidů, které jsou účinnými složkami prostředku podle tohoto vynálezu obecného vzorce I uvedeného výše, se zakládá na metodách obvyklých v chemii peptidů. Spočívá v tom, že sloučeniny obecného vzorce II

Ri, R2, Из, Rj а X mají· výše uvedené významy, se uvádění do reakce s aminokyselinami a peptidy obecného vzorce III

H—О—А—В (Ш), ve kterém

А а В mají výše uvedené významy, případně s jejich reaktivními derivátyt; reakce se provádí v inertním rozpouštědle při teplotách od —30 °C až do běžné teploty místnosti.

Jako reaktivních derivátů se používá například chloridů kyselin, případně směsných anhydridů, které se obvykle používají při syntéze peptidů, odvozených například od ethylesteru kyseliny chlormravěnčí nebo aktivních esterů.

Indoixylové a thioindoxylové sloučeniny obecného vzorce II, jakož aminokyseliny a peptidy obecného vzorce III, jsou známé látky (srovnej například P. Friedlender, Forteo ritte der Teerfarbenfabrikation und resp. Houben-Weyl, Methoden der organischen Chemie, sv. 15(1), nebo je lze připravovat jako analogické známé sloučeniny.

Halogenem v definici Ri, Rž, R3 a R4 se rozumí fluor, chlor, brom a jod, s výhodou chlor a brom.

Jako zbytek aminokyseliny v defhrci zbytku A přicházejí v úvahu zbytky přirozených α-amiinokyselin v L- nebo D-formě nebo· rovněž ve své racemické formě. Zejména výhodné jsou zbytky glycinu, alaninu, valinu, leucinu, isoleucinu, fenylalamnu a tyrosinu. Případné volné hydroxylové skupiny mohou být acylovány, s výhodou acetylovány.

Jakto peptldický zbytek v definici zbytku A se rozumí di- a tripeptidy, přičemž jako aminokyselinové složky se používají s výhodou výše uvedené aminokyseliny.

Podle vynálezu se chromogeny používané estery odvozené Od indoxylových aminokyselin nebo thioindoxylových anrnokyselin nebo/a peptidů obecného vzorce I poiužívají v koncentracích 10⁴ až 1 mol/litr, s výhodou 10³ až 10“¹ mol/litr impregnačního roztoku, potahovací hmoty nebo vyšetřované tekutiny.

Další složkou prostředku podle vynálezu к průkazu proteolytických enzymů a zejména proteáz leukocytů je vhodný systém pufrů. V úvahu přicházejí například fosfátový, bo-rátový, tris-(hydroxymethyl)ammo·· ethanový, (tris-), 2-amino-2-methylpropan-1,3-diiolový (amediolový) pufr nebo aminokyselinový pufr, přičemž hodnota pH a kapacita musí být voleny tak, aby v měřeném roztoku a na testovacím proužku se nastavila hodnota pH 6 až 10, s výhodou 7 až 9.

Při výrobě prostředku podle vynálezu к průkazu proteolytických enzymů, zejména leukocytových prioteáz v tělních tekutinách, lze používat přídavně také oxidační činidla, aby se převedly indoxylové a thioindoxylové sloučeniny primárně vzniklé při enzymatické reakci na zbarvené indigové, případně thioindigové substance. Tato -oxidační činidla, jako například ferrikyanid draselný, bromičnan draselný, chroman draselný, fenazinmethOsulfát nebo tetrazoliové soli, se používají v koncentracích 10~⁴ až 1 mol na litr, s výhodou 10 ~³ až 10mol na litr impregnačního roztoku, potahové hmoty nebo zkoušené tekutiny.

Další složkou prostředku pr<o důkaz proteolytických enzymů, zejména na leukocytových prioteáz, může být smáčedlo, poněvadž se tím dosahuje poněkud zkrácených reakčních dob a zčásti brilantnějších barev. S výhodou se používá neionogenních, ale i amfoterních, kationtově nebo aniontově aktivních smáčedel v koncentracích od 0,05 až 2 %. s výhodou 0,1 až 1 °/o.

Při výrobě prostředku podle vynálezu se impregnují například savé nosiče, s výhodou filtrační papír, celulóza nebo rouna z umělých vláken roztoky potřebných, obvykle к výrobě testovacích proužků používaných reagencií (substrát, pufr, případně smáčedlo, oxidační činidlo atd.) v lehce těkavých rozpouštědlech, jak například ve vodě, methanolu, ethanolu nebo acetonu. Toto se děje účelně ve dvou samostatných stupních: nejdříve se provede impregnace vodným roztokem, který -obsahuje pufr a ostatní přídavné látky rozpustné ve vodě. Potem se provádí impregnace roztokem substrátu proteáz obecného vzorce I. Ve speciálních případech lze též používat opačnéhoi sledu impregnace. Hotové testovací papírky mohou být používány jako tako7

245783 vé nebo mohou být nalepeny o sobě známým způsobem na držadlo· nebo zataveny mezi umělými hmotami a jemnou mřížovinou podle německého· patentového, spisu č. 21 18 455.

Při výrobě filmem potažených testovacích proužků se vnášejí veškeré reagencie do roztoku nebo disperze látky tvořící film, jako například polyvinylesteru nebo polyamidu a homogenně smíchají. Směs se natírá v tenké vrstvě na nosič z umělé hmoty a suší. Testovací proužky podle vynálezu potažené filmem se po sušení stříhají a lze jich používat jako takových nebo mohou být nalepeny o sobě známým způsobem na držadle nebo zataveny například mezi umělými hmotami a jemnou mřížovinou podle německého patentového spisu č. 21 18 455.

Diagnostické prostředky podle vynálezu k průkazu proteolytických enzymů, zejména proteáz leukocytů, ve formě práškovitých směsí nebo reagenčních tablet, lze připravit tak, že výše uvedené složky testu se smíchají s obvyklými galenickými přísadami a granulují. Přísadami tohoto druhu jsou například uhtohydráty, jako například mono-, oligo- nebo· polysacharidy nebo cukerné alkoholy, jako· například manit, sorbit, nebo xylit nebo· jiné rozpustné netečné sloučeniny, jako· polyethylenglykoly nebo polyvinylpyrrolidon. Práškovité směsi nebo reagenční tablety mají obvykle konečnou hmotnost přibližně 50 až 200 mg, s výhodou 50 až 80 mg.

Pro· výrobu lyofillzátu o celkové hmotnosti vždy asi 5 až 20 mg, s výhodou asi 10 mg, se lyofilizuje roztok, který obsahuje vedle reagencií nezbytných pro test, obvyklé látky tvořící skelet, jako například polyvinylpyrrolidon ·a případně další plnidla, jako například manit, sorbit nebo xylit.

Diagnostický prostředek podle vynálezu ve formě roztoku obsahuje s výhodou všechny reagencie potřebné k testům. Jako rozpouštědla přicházejí v úvahu voda nebo směsi viody s organickými rozpouštědly rozpustnými ve vodě, jako je například methanol, ethanol, 'aceton nebo· dimethylformamid. Z hlediska trvanlivosti může být výhodným rozdělit reagencie potřebné pro test do dvou nebo více roztoků, které se spojují teprve při vlastním vyšetřování.

Takto vyrobené diagnostické prostředky umožňují po ponoření do vyšetřované tělní tekutiny nebo po přidání příslušné tělní tekutiny průkaz přítomnosti proteolytických enzymů, zejména proteáz leukocytů, rychle a jednoduše pomocí vzniku zabarvení, které lze hodnotit vizuálně nebo fotometricky, například remisně fotometricky nebo v kyvetě. Protože aktivitu proteáz leukocytů v buňce lze považovat za v podstatě konstantní veličinu, lze z intenzity vzniklého zbarvení určit koncentraci leukocytů ve vyšetřované tělní tekutině. Diagnostickým činidlem podle vynálezu se určí jak mtaktní tak i lyžované leukocyty, protože aktivita proteáz leukocytů i po lýzy leukocytů zůstává zachována. K chybě způsobené lýzí v důsledku toho· nedochází.

Příklady provedení

Příklad 1

Filtrační papír (například Schleicher a Schull 23 Sl) se impregnuje následujícími roztoky a potom suší při 60 °C.

Roztok 1

Dekahy-drát tetraboritanu sodného · 1,91 g destilovaná voda asi 30 ml

Roztok se nastaví 0,1 N kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu 8,0 destilovaná voda ad 100,0 ml

Roztok 2

3- [ N- (benzyloxykarbonyl ] -L-alanytoxy ] indol 33,8 mg aceton ad 100,0 ml

Získá se bezbarvý testovací papírek, který se po· ponoření do moči obsahujícího leukocyty barví podle koncentrace leukocytů světle tyrkysové až modře. Lze dokázat:

000 leukocytů/μΐ moči asi po 2 minutách 1 000 leukocytů/μΐ moči asi po· 6 minutách 500 ieukocytů/μΐ moči asi po 10 minutách 200 leukbcytů/μΐ moči asi po 15 minutách

Citlivost testu je asi· 200 leukocytů/μΐ. Stanovení lze · provádět rovněž remisně fotometricky při 620 nm.

Testovací papírky s podobnými vlastnosmi (citlivosti: 200 až 2 000 leukocytů/μΐ) se získají, jestliže se místo 3-[N-(benzyloxykarbonylj-L-alanylOxy] indolu použije následujících substrátů, přičemž, není-li to zvláště zmíněno, lze pozorovat rovněž světle tyrkysové až modré zbarvení jinak bezbarvých testovacích papírků při ponoření do moči obsahující leukocyty:

1.1.

3- [ N- (benzyloi^y^l^k^i^lx^i^;^l) -L-alanyloxy]-4-methylrrdol

1.2.

3- [ N- (benzyloxykarbonyl j -L-alanyloxy ]-5-methylindol

1.3.

3- [ N- (benzyloxykarbonyl j -L-alanyloxy ] -6-methylindol

1.4.

3- [ N- (berzylorykkabo'nyl) -L-alanyloxy ] -7-methylindoJ

1.5.

3- [ Ν- (benzylOKyk^bonyl) -L-alanyloyy]-4,7-dimethylindol

1.6.

3- [ Ν- (benzyloxykarbtonyl) -L-alanyloyy ]-4-chlorindol

1.7.

3- [ N- ( benzylob^x^l^í^i^^bo^yl)-L-alanyloxy ] -5-briomindol

1.8.

3- [ N- ( benzylolxykarbonyl ) -L-alanyloyy ] -6-chlorindol, zbarvení: bezbarvé do purpurová.

1.9.

3- [ N- (1oluen-4‘-sulf onyl) -L-alanyloyy ] -4-chlor-5-bromindol

1.10.

3- [ N- (toluen-4*-sulfonyl )-L-alanyloyy ] -4,5,7--richl'orindol

1.11.

3- [ N- (toluen-4‘-sulfonyl )-L-alanyloyy ] -4-chlor-5-brom-7-meíhylindol

1.12.

3- [ N- (1oluen-4‘-sulf onyl) -L-alanyloiyy ] ^-hydroyy-indol

1.13.

3- [ N- (benzyloxykar b-onyl) -L-alanyloyy ] -5-metiioyyindol

1.14.

3- [ N- (tioouen-4‘-sulfonyl) -L-alanyldyy ] -5-benzyl<oyylndol

1.15.

3- [ N- {1oluén-4‘-sulfonyl) -L-alanyloyy ] -4-karboyyindol

1.16.

3- [ N- (1oluen-4‘-sulfonyl) -^^-^lí^iny]^'^:^y]-4-benzyloy^l^i^.rbonylindol

1.17.

3-[ N- (toluen-4‘-sulfonyl )-L-alanyloyy ] - 5 - (kar boxymelhoyy ] indol

1.18.

3- [ N- (lo.luen-4‘-sulf Onyl) -L-alanyloxy]-5- (benzyloxykarbonylmethoxy) indlol

1.19.

3- [ N- (loluen-4‘-sulfonyl) -L-alanyloyy ] -6-nltn^indol

1.20.

3- [ N- (toluen^-sultany!) -L-alanyloyy ] -6-acetyluiiinomdol

1.21.

3- [ N- (loluen-4‘-sulfoii^’^l) -L-alanyloyy ]benzo[ g ] indol Zbarvení: bezbarvé do- zelena.

1.22.

1-010^-3-3- [ N- (lenzylox'ykarbon.yl) -L-alanylOyy ] indol

Zbarvení: bezbarvé do zelena.

1.23.

l-benzy3-3- [ N- (loluen-4‘-sulf onyl) -L-alanyloyy ] indol

Zbarvení: bezbairvé do zelena.

1.24.

14ппу3-3 [ N- (toluen-4‘-sulf onyl) -L-alanylo-yy ] Indol

Zbarvení: bezbarvé do modrozelená.

1.25.

l-acel-3-3- [ N- {loluen-4‘-sulf onyl) -L-alanyloyy ] indol Zbarvení: bezbarvé do červena.

1.26.

^βυζον!-- [ N-toluen-4‘-sulf onyl ] -L-alanyloyy ] indol

Zbarvení: bezbarvé do fíalova.

1.27.

3- [ N- (lenzyloxykarbonyl ] glyceloxy] indol

1.28.

3- [ N- (toluen-4‘-sulfonyl ] glycyloyy] indol

1.29.

3- [ N- (loluen-2‘-súlfonyl ] -L-alanyloyy ]indbl

1.30.

3- [ N- (1oluen-3‘-sulfonyl ] -L-alányloyy] indol

1.31.

3- [ N- (toluen-4‘-sulfonyl ] -L-alanyloyy ] indol

1.32.

3- [ N- ( tolueo-4‘-sulflonyl ]-D-alanyloyy] indol

1.33.

3- [ N- ( benzyloxy-karbonyl) -D,L-alanyloyy ] indol

1.34.

3- [ N- (benzyloxy-karbonyl) -L-^j^'lyloyy ] indol

1.35.

3- [ N- (toluen-4‘-sulfonyl) -L-valyloxy] indol

1.36.

3- [ N- (benzylo)xykarboiny1) -L-leucyloxy ] indol

1.37.

3- [ N- (benzyloxy karbonyy) -L--soIeucyloxy ] indol

1.38.

3- [ N- (b&nzyloxykai^b^ol^^^l) -L-fenylalanyloxy ] indol

1.39.

3- [ N- (toluer-4‘-su.lforyl) -L-f enylalanyloxy ] indol

1.40.

3- [ N-acetyl-L-tynosyloxy ] indol

1.41.

3- [ N-benzoyl-L-tyi^íosyloxy ] indol

1.42.

3- [ N- (berzyl·oxykarbonyl) -L-tyrosyloxy] indol

1.43.

3- [ N- (toluen-4‘-sulf onyl) -L-tynosyloxy ] indol

1.44.

3- [N- (toluen-4‘-sulf.onyl )-O-acetyl-L-tynosyloxy] indol

1.45.

3-[ N- (benzyloxykarbonyl) -L-alanyl-L-alanyloxy ] indol

1.46.

3- [ N- (toluen-4‘-sulfonyl) -D-alanyl-L-alanylaxy ] indol

1.47.

3- [ N- (benzoyloxykarbonyl) -L-alanyl-L-alanyl-L-alanyloxy Jindol

1.48.

3- [ N- (toluen-4‘-sulf onyl )-D-ala:nyl-D-alanyl-L-alanyloxy ] indol

1.49.

3- [ N-fiormy bL-alanyloxy ] indol

1.50.

3- [ N-acetyl-L-alanyloxy ] indol

1.51.

3- [ N-sukcinyl-L-alanyloixy ] indol

1.52.

3- [ N-be.nzoyl-D,L-alaryIoxy ] indol

1.53.

3- [ N-f taloyl-L-alanyloxy ] indol

1.54.

3- [ N- (ethoxy^:^.rbonyl) -L-alanyloxy ] indol

1.55.

3- [ N- (terc.butyloxyl^i^rboi^^^l) -L-alanyloxy (indol

1.56.

3- [ (3‘,6‘-dioxa-n-heptyloxykarbonyl) -L-alanyloxy ] indol

1.57.

3- [ N- (cyktohexyloxykar bony 1) -L-alanyloxy Jindol

1.58.

3- [ N- (f enyloxykarbonyl) -L-alanyloxy ] indol

1.59.

3- [ N- (4*-methylbenzylox^^i^^b^ny^) -L-alanyloxy (indol

1.60.

3- [ N- (4‘-metboxybenzyloxykarb(lnyl) -L-alanyloixy] indol

1.61.

3- [ N- (4‘-nitroberzyIoxykaгbonyl) -L-alanyloxy ] indol

1.62.

3- [ N- (N‘-/pl^r idino/oxykarbonyl) -L-alanyloxy ] indol

1.63.

3-[ N- (f uryl-/27-methoxykarblonyl) -L-alanyloxy ] indol

1.64.

3- [ N- (thienyl-/27-methoxykarbonyl) -L-alanyloxy ] indol

1.65.

3- [N- (berzylthrαkarboryI )-L-alanyloxy ] indol

1.66.

3-[ N- (methansulfoňyl) -L-alanyloxy ] indol

1.67.

3-[ N-(benzylsulfonyl)-L-alanyloxy ] indol

1.68.

3- [ N- (benzensulfonyl)-L-alanyloxy ] indol

1.69.

3- [ N- (4‘-brombenzensulfonyl) -L-alanyloxy ] indol

1.70.

3- [ N- (4‘-mtrobenzensulfO'nyl) -L-alanyloxy ] indol

1.71.

3-{N-{4‘-dimethylamlnobenzensulf onyl) -L-alanyloxy ] indol

1.72.

3- [ N- (4‘-acetylaminobenzensulfonyl) -L-alanyloxy] indol

1.73.

3- [ N- (4^<-n-butylberzersulfonyl) -L-alanyloxy] indol

1.74.

3- [ N- (4‘-terc.butylbθnzersulf onyl ] -L-alanyloxy ] indol

1.75.

3- [ N- (4'-n-okty lberzersulforyl ] -L-alanyloxy ] indol

1.76.

3-( N- (^-hydroxy-benzensulfonyl ]-L-alanyloxy ] indol

1.77.

3- [ N- (4^<-methoxybenzersu.lfonyl ] -L-alanyloxy ] indol

1.78.

3- [ N- (4‘-benzyloxybenzensulfonyl -L-alanyloxy ] indol

1.79.

3- [N- (4‘ -/2“-hydroxyethioxy/benzensulf onyt ] -L-alanyloxy ] indol

1.80.

3- [ N- (4‘-/3“-oxa-5“-hydroxy-n-pen.tylΌιxy/benzersulforyl j -L-alanyloxy] indol

1.81.

3- [ N- (4‘-/3“,6“-di-oxa-n-heptyioxy/berzensulfΌ'nyl) -L-alanyloxy ] indol

1.82.

3- [ N- (4‘-/2“-hydroxyethyl/benzensulf onyl) -L-alanyloxy J indol

1.83.

3-{N- [ 4‘- (2“-/4“-nitrobenzyloxy/ethyl) benzensulfiony 1 ] -L-alanyloxy}indol

1.84.

3-[N- (4‘-/2“-chlorethyl/benzensulf ony 1 ] -L-alanyloxy ] indol

1.85.

3? [ N- (4‘-acetylbenzensulfonyl ] -L-alanyloxy ] indol

1.86.

3- [N- (4‘-ky<^^obenzensulfonyl] -L-alanyloxy ] indol

1.87.

3- [ N- (4‘-karboxybenzefisulfonyl ]-L-alanyloxy] indol

1.88.

3- [ N- (4'-meth^loxykarborLylberzersultol^^l ] -L-alanyloxy ] indol

1.89.

3- [ N-( 4*-benzylcxykar tonyl-benzensulfony 1 ] -L-alanyloxy] indol

1.90.

3- [ N- (4‘-karbamαylbenzersultoιryl )-L-alanyloxy] indol

1.91.

3- [ (4‘-/ⁱdimethyl'karbamoyl/benzens-uHon.yl) -L-alanyloxy ] indol

1.92.

3- [ N- (4‘-karboxymetliylbenzensulf ony 1 ] -L-alanyloxy ] indol

1.93.

3- [ N- (4‘-karboxymethα)|xybenzersulfony 1) -L-alanyloxy ] indol

1.94.

3- [ N- (4‘-karboxχmetlthlamiirobenzcnsulfonyl ] -L-alanyloxy ] indol

1.95.

3- [ N- (4‘-/ber;zyloxykιar'bcinylmethylammo/benzens-ultony 1 ) -L-alanyloxy ] indol

1.96.

3- [ N- (4^<-fluoгberzensulf·ony 1 ] -L-alanyloxy] indol

1.97.

3- [ N- (4‘-f luorsulfonylbenzerκulα□nyl ] -L-alanyloxy ] indol

1.98.

3- [ N- (4‘-sulfamoylbenzensulfonyl ]-L-alanyloxy ] indol

1.99.

3- [ N-methyl-N-{toluen-4‘-sulfonyl ]-L-alanyloxy ] indol

1.100.

3- [ N-acetyl-N- (tolu-en^-sulfonyl) -L-alanyloxy Jindol

1.101.

3- [ N-^^^-trimethylbenzensulfonyl ] -L-alanyloxy ] indol

1.102.

3- [ N- (dif enyl-4‘-sulf onyl) -L-alanyloxy ] indol

1.103.

3- [ N- (naftalen-2‘-sulfonyl) -L-alanyloxy] indol

1.104.

3- [ N- (4‘-acetylaminonaf talen-Γ-sulf onyl) -L-alanyloxy ] indol

1.105.

3- [ N- (S^dimethylaminoinaftalen-l*-sulf onyl) -L-alanyloxy ] indol

1.106.

3- [ N- (chintolin-8‘-sulfonyl) -L-alanyloxy] indol

1.107.

3-[N-(pyridin-3*-sulfonyl)-L-alanyloxy] indol

1.108.

3- [ N- (2‘-nltr obenzensulf enyl) -L-alanyloxy ] indol

Zbarvení: žluté do zelena

1.109.

3- [ N- (l‘-methyl-2‘-benzoylvinyl) -L-alanyloxy ] indol

1.110.

3-[N-(5‘,5‘“-dimethyl-3‘-oxiocyklohexen-l‘-yl) -L-alanyloxy ] indol

1.111.

3- [ N- ( dif enylkarbamioyl) -L-alanyloxy ] indol

1.112.

3- [ N- (di-/4‘-nitnobenzyl/f osf oryl) -L-alanyloxy ] indol

1.113.

3- [ N- (dl-/4‘-br ombenzyl/f osforyl) -L-alanyloxy ] indol

1.114.

3- [ N- (toluen-4‘-sulfonyl) -L-alanyloxy ]-5-benzylindol

1.115.

3- [ N- (toiluen-4‘-sulfonyl) L-alanyloxy ] -5-f enylindol

1.116.

3- [ N- (toluen-4‘-sulf onyl) -L-alanyloxy ] -5-methoxyindol

Příklad 2

Filtrační papír (například Schleicher + + Schiill 23 SL) se impregnuje postupně těmito roztoky a potom se suší při teplotě 60 °C.

Roztok 1

Tris- (hydroxymethyl) aminomethan 0,61 g ferrikyanid draselný 32,9 mg destilovaná voda asi 30 ml

Hodnota pH roztoku se nastaví 0,1 N kyselinou chlorovodíkovou na 8,0 destilovaná voda ad 100,0 ml

Roztok 2

3- [ N- (benzyloxykarbonyl) -L-alanyloxy]benzo[b]thiofen 35,5 mg aceton ad 100,0 ml

Získá se žlutě zbarvený testovací papírek, který se při namočení do mioči obsahující leukocyty zbarví červeně.

Citlivost testu je asi 1000 leukocytů//^ moče.

Vyhodnocení lze provádět rovněž remlsně fotometricky při 576 nm.

Ze substrátů podle příkladu 1 se pomocí oxidačních činidel, například výše uvedených ferrikyanidem draselným nebo například bromičnanem draselným, chromanem draselným, methosulfátem fenazinu nebo tetrazoliovými solemi, získávají testovací papírky, se kterými se docilují ve srovnání s analogickými testovacími papírky bez oxidačních činidel nepatrně zkrácené reakční doby.

Příklad 3

Filtrační papír (například Schleicher + + Schull 23 SL) se postupně impregnuje těmito roztoky a potom suší při 60 °C.

Roztok 1

Dekahydrát tetraboritanu sodného 1,91 g destilovaná voda asi 30 ml nonylfenolpolyglykolether 0,2 g

Hodnota pH roztoku se upraví 0,1 N kyselinou chlorovodíkovou na 8,0 destilovaná voda ad 100,0 ml

Roztok 2

3- [ N- (benzyloxykarbonyl) -L-alanyloixy]indol 33,8 mg aceton ad 100,0 ml

Získá se bezbarvý testovací papírek, který se zbarví při ponoření do moči obsahující leukocyty světle tyrkysové až modře, podle koncentrace leukocytů. Ve srovnání s recepturou z příkladu 1 se poněkud zkracují reakční doby a docilují se nepatrně brilantnější barvy.

Rovněž s jinými substráty z příkladů 1 a 2 se získávají se smáčedly, jato například s výše uvedeným nonylfenolpolyglykoletherem (neionogenní), ale rovněž například s kokosimidazoliniovými sloučeninami (amfoterními) nebo benzyltrimethylamoniumchloridem (kationaktivní) nebo doidecylbenzensulfonátem sodným (anionaktivní) testovací papírky, které vykazují ve srovnání s analogickými testovacími papírky bez smáčedel nepatrně zkrácené reakční doby a o něco brilantnější barvy.

Příklad 4

Roztok 1

3- [ N-benzoyl-D,L-alanyloxy} indol 154,2 mg methanol ad 100,0 ml

Roztok 2 dekahydrát tetraboritanu sodného· 7,63 g destilovaná voda asi 50 ml

Hodnota pH roztoku se upraví přidáním

N kyseliny chlorovodíkové na 8,0 voda destilovaná ad

100,0 ml ti se stanoví vizuálně koncentrace leukocytů pomocí srovnávacího zbarvení nebo fotometricky, například v 1 cm mikrokyvetě při 620 nm.

Citlivost testu je přibližně asi při 200 leukocytech/μΐ moči. Reakční dobu lze význameně zkrátit, jestliže se inkubace provede při teplotě 37 °C.

S dalšími substráty z příkladu 1 a 2 lze dosáhnout podobných citlivostí (200 až 1 000 leukocytů/μΙ), přičemž při těžce rozpustných látkách se doporučuje přidání organických rozpouštědel, jako například methanolu nebo dimethylformamidu.

Příklad 6

Filtrační papír (například Schleicher + + Schůll 23 SL) se postupně impregnuje následujícími roztoky a potom se suší při teplotě 60 °C.

Roztok 1

Dekahydrát tetraboritanu sodného destilovaná voda asi

Hodnota pH roztoku se nastaví 0,1 selinou chlorovodíkovou na 8,0

N kyVe zkumavce se smíchají:

destilovaná voda ad

100,0 ml ml roztoku 1 ml roztoku 2 ml moče obsahující leukocyty

Směs se pomalu zbarvuje podle koncem trace leukocytů — světle zeleně až tmavě modře.

Asi po 10 minutách stání při teplotě místnosti se stanoví koncentrace leukocytů vizuálně piomocí srovnávacího zbarvení nebo fotometricky, například v lem kývete při 620 nm.

Citlivost testu je asi při 200 letukocytech na moči.

Rovněž s ostatními substráty příkladů 1 a 2 lze provádět testy ve zkumavce, případně testy s kyvětou s podobnými citlivostmi (200 až 1 000 leukocytů/^l moči).

Příklad 5

Jedna tableta obsahující

3- [ N- (4‘-karboxymethylaminobenzensulfonyl) -L-alanyloxy ] indol 2,0mg dihydrogenfosfát draselný 0,8mg dihydrát hydrogenfosfátu dvojsodiného 16,8mg manit ad 70,0mg se přidá ve zkumavce ke 2 ml moči obsahující leukocyty. Moč se zbarví zvolna — podle koncentrace leukocytů — světle zeleně až tmavomodře.

Po. 10 minutách stání při teplotě místnosRoztok 2

3- [ N- (toluein-4‘-sulf onyl) -L-tyrosyloxy ] indol aceton ad

45,1 mg

100,0 ml

Získá se bezbarvý testovací papírek, který se zbarví tmavě modře při ponoření db vodných roztoků, které obsahují prioteolytický enzym chymotrypsin. Během 6 až 7 minut lze stanovit koncentrace ještě 0,02 U/ml chymotrypsinu.

(Uvedená enzymová aktivita byla stanovena s ethylesterem N-acetyl-L-tyrosinu jato substrátem při teplotě 25 ^CC, při hodnotě pH 7,0 а Λ = 237 nm).

Rovněž s jinými substráty příkladů 1 a 2 lze — podle aminokyselinového nebo· peptidlckého zbytku — stanovit chymotrypsin nebo jiné proteolytické enzymy, jako například elastázu nebo trypsin v čistě vodných roztocích nebo rovněž například v tělních tekutinách, jako například v celé krvi, séru, likvoru, sekretu slinivky břišní netto vodných extraktech stolice.

Příklad 7

3-(N-(toluen-4‘-sulfonyl)-L-alanyloxy ] indol

Roztok 1

Pro přípravu chloridu kyseliny jednostup245763

20 ňovým způsobem se 5,35 g (0,022 mol) N- (toiluen-4‘-sulfonyl) -L-alaninu rozpustí ve 20 ml dlmethylformamidu (DMF) a ochladí na teplotu —30 °C. Potom se za chlazení a míchání přidá pipetou 1,76 ml (0,024 mol) thionylchloridu a reakční směs se ponechá po, dobu třicet minut v chladicí lázni při teplotě — 30 °C.

Roztok 2

Do 250 ml tříhrdlé baňky, opatřené míchadlem, teploměrem a přívodem s odvodem plynu, se po dokonalém odstranění vzduchu slabým proudem dusíku dá roztok

2,90 g (0,022 mol) indoxylu (3-hydno|xyindolu) ve 40 ml absolutního dimethylformamidu, к tomu se přidá 9,74 ml absolutního pyridinu a reakční směs se ochladí na teplotu —15 °C.

Reakce

Roztok 1 se přilije к roztoku 2 a míchá se za vyloučení kyslíku a vlhkosti po dobu asi 5 hodin při teplotě —15 °C, až pomocí chromatografie na tenké vrstvě nelze rozeznat žádný indoxyl.

Při zpracování se reakční směs zahustí ve vakuu maximálně při teplotě lázně 40 až 50 °C. Zbytek se vyjme do ethylacetátu a promyje se postupně 2X po 30 ml 1 N kyseliny citrónové, 20 ml vody, 50 ml 5% roztoku kyselého uhličitanu sodného a 25 ml vody. Ethylacetátová fáze se odpaří, po předchozím vysušení síranem sodným, ve vakuu. Takto· získaný surový produkt se čistí pomocí sloupcové chromatografie na silikagelu ve směsi toluen-dloxan (9 : 1). Po oddestilování rozpouštědla ze spojených frakcí ve vakuu se po rozmíchání zbytku s etherem získá 1,45 g (18,4%) 3-[N-(toluen-4‘-sulfonyl)-L-alanyloxy] indolu, ve formě bezbarvých krystalků, teplota tání 103 stupně Celsia, [a]_D ²⁰: —56,6°, c = 1 % (methanol).

Jako vedlejší produkt lze z dalších frakcí výše uvedeného sloupcově chromatografického· dělení izolovat ještě 0,89 g (11,3 %)

1- [ N- (toluen-4‘-sulfonyl) -L-alanyloxy) -3-hydroxyindolu = l-[N-(toluen-4‘-sulfonyl)-L-alanyloxy]-3-oxoindolinu, po krystalizaci z ethylacetátu bezbarvé krystaly, teplota tání 187 až 188 °C, [a]_D ²⁰: —41,7°, c = = 1 % (DMF).

Analogicky se získají po reakci příslušně substituovaných indoxylových sloučenin s příslušnými aminokyselinami následující substráty, přičemž ve všech případech (mimo 7.23 až 7.27) jako meziprodukty vznikají právě výše uvedené 1-substituované 3-hydroxyindoly:

7.1.

3- [ N- (benzyloxykarbonyl) -L-alanyloxy,] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 123 °C, [a]_D ²⁰: —49,0°, с = 1 % (methanol).

7.2.

3- [ N- (benzyloxykarbonyl) -L-alanyloxy ] -4-methylindol bezbarvé krystaly, teplota tání 113 °C, [«Id²⁰: —44,6°, с = 1 % (methanol).

7.3.

3- [ N- (benzyloxykarbonyl) -L-alanyloxy ] -5-methy lindol, bezbarvé krystaly, teplota tání 143 až 144 stupňů Celsia, [a)o²⁰: —48,2°, c — 1 % (methanol).

7.4.

3- [ N- (benzyloxykarbonyl) -L-alanyloxy ] -6-methylindol, bezbarvé krystaly, teplota tání 148 °C, [a]_D ²⁰: —49,0°, c = 1% (methanol).

7.5.

3- [ N- (benzyloxykarbonyl) -L-alanyloxy ]-7-methy lindol, bezbarvé krystaly, teplota tání 146 °C, [a]o²⁰: —51,2°, c — 1 % (methanol).

7.6.

3- [ N- (benzyloxykarbonyl) -L-alanyloxy ] -4,7-dimethylindol, bezbarvé krystaly, teplota tání 121 °C, '[a]_D ²⁰: —46,3°, c — 1% (methanol).

7.7.

3- [ N- (benzyloxykarbonyl) -L-alanyloxy ] -4-chlorindol, bezbarvé krystaly, teplota tání 142 až 143 stupňů Celsia, [·α]ο²⁰: —61,4°, с = 1 % (methanol).

7.8.

3-[N-(benzyloxykarbonyl )-L-alanyloxy ] -5-bromindol, bezbarvé krystaly, teplota tání 138 °C, [«]_D ²⁰: —28,0°, c = 1 % (methanol).

7.9.

3- [ N- (benzyloxykarbonyl) -L-alanyloxy)-6-chlor indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 170 °C, [a]_D ²⁰: —41,3°. c = 1% (methanol).

7.10.

3- [ N- (toluen-4‘-sulfonyl) -L-alanyloxy ] -4-chlor-5-bromindol, bezbarvé krystaly, teplota tání 150 až 152 stupňů Celsia, [a]_D ²⁰: —31,0°, с = 1 °/o (methanol).

7.11.

3-[ N-(toluen-4‘-sulf ony 1)-L-alanyloxy )-4,5,7-trichlor indol

7.12.

3- [ Ν- (toluen-4‘-sulf onyl) -L-alanyloxy ] -4-chlor-5-brom-7-methylindol slabě béžové zbarvené krystaly, teplota tání 143 až 145 °C. Chromatografie na tenké vrstvě: hotové desky se silikagelem, systém: toluen-dioxan 2 : 1, Detekce: UF, NH3 (plynný),

Hodnota R₍: 0,56

7.13.

3- [ N- (t oluem-4‘-sulf onyl) -L-alanyloxy ] -5-hydroxyindol

7.14.

3- [ N- (toluen-4‘-sulf onyl) -L-alanyloxy ]-5-methoxy indol

7.15.

3- [ N- (toluen-4‘-sulf onyl) -L-alanyloxy ] -5-benzyloxyindol

7.16.

3- [ N- (toluen-4‘-sulf onyl) -L-alanyloxy ] -4-karboxyindol

7.17.

3- [ N- (toluen-4‘-sulf onyl) -L-alanyloxy ] -4-benzyloxy karbony lindiol

7.18.

3- [ N- (toluen-4‘-sulf onyl) -L-alanyloxy )-5-( karboxymethoxy) indol

7.19.

3-[N-(toluen-4‘-sulfonyl)-L-alanyloxy]-5- (benzy loxykarbonylmethoxy) indol

7.20.

3- [ N- (toluen-4‘-sulf onyl) -L-alanyloxy ]-6-nitroindol

7.21.

3- [ N- (toluem-4‘-sulfonyl) -L-alanyloxy]-6-acetylaminoindiol

7.22.

3- [ N- (toluen-4‘-sulf onyl) -L-alanyboIxy Jbenzo [ g ] indol

7.23.

l-methyl-3- [ N- (benzyloxykarbonyl) -L-alanyloxy] indol bezbarvé krystaly, teplota tání 92 °C, [a]_D ²⁰: —49,5°, c = 1 % (methanol).

7.24.

l-benzyl-3- [ N- (toluen-4 ‘-sulf onyl) -L-alanyloxy] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 149 až 152 stupňů Celsia, [a]_D ²⁰: — 54,9°, c = 1 % (DMF).

7.25.

l-fenyl-3-[N- (toluen-d^sulfcnyl)-L-alanyloxy] indol

7.26.

l-ace-tyl-3- [ N- (toluen-4^ť-sulf onyl) -L-alanyloxy ] indol

7.27.

l-benzoyl-3- [ N- (toluen-4‘-sulf onyl) -L-alanyloxy] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 155 až 156 stupňů Celsia, [α]_π ²⁰: —54.7°, c 1 % (DMF).

7.28.

3- [ N- (benzyloxykarbonyl) glycyloxy] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 122 až 124 stupňů Celsia.

7.29.

3- [ N- (toluen-4‘-sulfonyl) glycyloxy] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 103 až 105 stupňů Celsia.

7.30.

3- [ N- (toluen-2‘-sulf onyl) -L-alanyloixy ] indol, bezbarvý ambrfní prášek, [a]_D ²⁰: —62,5°, c = 1 % (methanol).

Chromatografie na tenké vrstvě: hotová deska se silikagelem, systém: toluen—dioxan 9:1).

Detekce: UF, NH3 (plynný), hodnota R₍: 0,20.

7.31.

3- [ N- (toluen-3‘-sulfonyl) -L-alanyloxy] indol bezbarvé krystaly, teplota tání 94 °C, [a]_D ²⁰: —54,9°, c = 1% (methanol).

7.32.

3- [ N- (toluen-4‘-sulf ony 1 ] -D-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 98 °C, [α]ο²⁰: +53,Г, c = l°/o (methanol).

7.33.

3- [ N- (benzyloxykarbonyl) -D,L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 110 až 111 stupňů Celsia.

7.34.

3- [ N- (benzyloxykarbonyl) -L-valyloxy] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 64 až 65 stupňů Celsia, [a]_D ²⁰: —41,1°, c = 1 % (methanol).

243763

7.35.

3- [ N- (benzyloxykarbonyl) -L-leucyloxy] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 73 až 75 stupňů Celsia, [a]_D ²⁰: —42,2°, c = 1 % (methanol).

7.36.

3- [ N- (benzyloxykarbonyl) -L-isoleucyloxy ] indol, bezbarvý amorfní prášek, [a] o²⁰: —30,6°, c — 1 % (methanol).

Chromatografie na tenké vrstvě, hotové desky se silikagelem, systém: toluen—dioxan 2 : 1, detekce: UF, NH3 (plynný), hodnota R_f: 0,57.

7.37.

3- [ N- (benzy loxykarbionyl) -L-f enylalanyloxy ] indol, nažloutlé krystaly, teplota tání 125 °C, chromatografie na tenké vrstvě: hotové desky se silikagelem, systém: toluen—dioxan 9 : 1, detekce: UF, NH3 (plynný), hodnota R_f: 0,56.

7.38.

3- [ N-(toluen-4‘-sulfonyl)-L-fenylalanyhoixy] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 167 až 169 stupňů Celsia, [ cd _D ²⁰: —34,4°, c = 1 % (methanol).

7.39.

3- [ N-acetyl-L-tyrosyloxy ] indol,

7.40.

3- [ N-benzioyl-L-tyrosyloxy ] indol

7.41.

3- [ N- (benzyloxykarbonyl )-L-tyrosyloxy ] indol, bezbarvá, amorfní pěna, [a]_D ²⁰: —22,6°, с = 1 % (methanol), chromatografie na tenké vrstvě: hotová deska se silikagelem, systém: toluen—dioxan 4 : 1, detekce: UF, NH3 (plyn), hodnota R_f: 0,27.

7.42.

3- [ N- (toluen-4‘Sulfonyl) -L-tyrosyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 171 °C, [;a]n²⁰: —28,3°, c = 1% (methantol).

7.43.

3- [ N- (toluen-4‘-sulf onyl) -O-acetyl-L-tyrosyloxy] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 168 až 170 stupňů Celsia, [«Jo²⁰: —24,1°, c — 1 % (dimethylformamid).

7.44.

3- [ N- (benzyloxykarbonyl) -L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 144 ^CC, Wd²⁰: —17,3°, c = 1% (methanol).

7.45.

3- [ N- (toluen-4‘-sulf onyl) -D-alanyl-L-alanyloxy ] indol, nažloutlá amorfní pěna, [«Jd²⁰: +5,8°, c = 1% (methanol), chromatografie na tenké vrstvě: hotová deska se silikagelem, systém: toluen—dioxan 4 : 1, detekce: UF, NH3 (plynný), hodnota R_f: 0,19.

7.46.

3- [ N- (benzyloxykarbonyl) -L-alanyl-L-alanyloxy] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 156 °C, [a]o²⁰: —39,5°, c = 1% (methanol).

7.47.

3- [ N- (toluein-4‘~sulf onyl) -D-alanyl-D-alany 1-L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 216 °C, [a]_D ²⁰: +53,8°, c = 1 % (methanol).

7.48.

3- [ N-acetyl-L-alanyloxy ] indol, bezbarvá, amorfní pěna, [a]_D ²⁰: —12,5°, c = 1 0/0 (methanol), chromatografie na tenké vrstvě: hotová deska se silikagelem, systém: ethylacetát—methylenchlorid : 1, detekce: UF, NH3 (plynný), hodnota: R_{: 0,33.

7.49.

3- [ N- (sukcinyl-L-alanyloxy ] indlol, bezbarvé krystaly, teplota tání 142 °C, ЫЛ -63,9°, c = 1% (methanol).

7.50.

3- [ N-benzoyl-D, L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 171 °C.

7.51.

3-[N-ftak>y 1-L-alanyloxy] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 58 °C, [^]o²⁰: —26,3‘, c = 1 % (methanol).

7.52.

- [ N - (ethoXykarbohy 1) -L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 96 °C, (a]_D ²⁰: —68,9°, c = 1 % (methanol).

7.53.

3- [ N- (cyklohexyloxykarbonyl) -L-alanyloxy] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 149 °C, [a]_D ²⁰: —60,4°, c = 1% (methanol).

7.54.

3- [ N- (f enyloxykarbonyl) -L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 161 °C, [a]_D ²⁰: —96,0°, c = 1% (methanol).

7.55.

3- [ N- (4‘-methylbenzyloxykarbonyl) -L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 135 °C, [a]_D ²0: —45,9°, c = 1% (methanol).

7.56.

3- [ N- (4‘-nitrobenzyloxykarbonyl) -L-alanyloxy ] indol, nažloutlé krystaly, teplota tání 160 °C, >[α]ο²0: —29,4°, c = 1% (methanol).

7.57.

3- [ N- (benzylthiokarbonyl) -L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 122 °C, [α]υ2°: —77,8°, c — 1% (methanol).

7.58.

3- [ N- (methansulfonyl) -L-alanyloxy] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 164 až 166 stupňů Celsia, [..Id²⁰: — 54,0°, c — 1 % (methanol).

7.59.

3- [ N- (benzylsulf ony 1) -L-alanyloxy ] indol, bezbarvý, viskózní olej, '[•«Jd²⁰: —54,8°, c = 1 % (methanol) chromatografie na tenké vrstvě: hotová deska se silikagelem, systém: toluen—ethylacetát 2 : 1, detekce: UF, NH3 (plynný), hodnota R_f: 0,40.

7.60.

3- [ N- (benzensulfony 1) -L-alanyloxy ] indol, bezbarvý, viskózní olej, [«)d2°: —59,8°, c — 1% (methanol), chromatografie na tenké vrstvě: hotová deska se silikagelem, systém: toluen—ethylacetát 2 : 1, detekce: UF, NH3 (plynný), hodnota R_f: 0,48.

7.61.

3- [ N- (4‘-brómbenzz ns ullonyll) -L-alanyloxy ] indol, nažloutlý, amorfní prášek, chromatografie na tenké vrstvě: hotová deska se silikagelem, systém: toluen—dioxan 4 : 1, detekce: UF, NH3 (plynný), hodnota R_f: 0,39.

7.62.

3- [ N- (4^t-zitzoíbezzezsulf onyl) -L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 136 až 137 stupňů Celsia, [a]?⁰: —35,9°, c ~ 1 % (methanol).

7.63.

3- [ N- (4‘-acetylamino¹eenzezsulfozyl )-L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 162 až 163 stupňů Celsia, [a]?⁰: —57,2°, c = 1 % (methanol).

7.64.

3- [ N- (4^<-n-butylee!nzznsulf-onyl) -L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 105 °C [•a^: —46,7°, c = 1 % (methanol).

7.65.

3- [ N- (4‘-tnrc.butylennzensulfo;nyl) -L-alanyloxy] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 140 '^cC, [«]d20: —43,3°, c = 1% (methanol).

7.66.

3- [ N- (4‘-n-oktylennznz.sulfozy 1) -L-alanyloxy ] indol, [alo20: —34,2°, c — 1 % (methanol). bezbarvé krystaly, teplota tání 57 °C,

7.67.

3- (N- (4‘-hydroxybznzensulfonyl) -L-alanyloxy ] indol, viskózní, slabě načervenalý olej, chromatografie na tenké vrstvě: hotová deska se silikagelem, systém: toluen—-dioxan 1:1, detekce: UF, NH3 (plynný), hodnota R{ 0,62.

7.68.

3- [ N- (4‘-methoxyennze.nsulf onyl) -L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 126 až 128 . stupňů Celsia, [a^⁰: —54,3°, c — 1 % (methanol).

7.69.

3- [ N- (4‘-benzyloxχlbenzz·nzultonyl) -L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 112 ^eC, (a^²⁰: —40,3°, c = 1 % (methanol).

7.70.

[N- (4‘-/2“-hydroxyetho-xy/enzzezsulfoιnyl) -L-alanyloixy] indol

7.71.

S^N-^-^-oxa-S^-hydroxy-n-pnzylΌxy/-bezz ensulf^onyl )-L-alanyloxy ] indol, bezbarvý viskózní olej, bab²⁰: —36,4°, c = 1% (methanol], chromatografie na tenké vrstvě: hotová deska se silikagelem, systém: tolunz—nthylacntát 1 : 10 detekce: UF, NH3 (plynný), hodnota R_f: 0,37.

4 3 7 6 3

7.72.

3- [ N- (4‘-/3“,6“-di-oxa-.n-hep·tyloxy/benzensulfony 1) -L-alanyloxy ] indol, slabě načervenalý, viskózní olej, chromatogralie na tenké vrstvě: hotová deska se silikagelem, systém: toluen—dioxan 4 : 1, detekce: UF, NH3 (plynný), hodnota: R_f: 0,21.

7.73.

3-[N-(4‘-/2“-hydroxyethyl/-benzensull o:nyl ] -L-alanyloxy ] indol nažloutlý amorfní prášek, [a,]_D20: —54,5°, c = 1 % (methanol), chromatografie · na tenké vrstvě: hotová deska se silikagelem, systém: toluen—ethylacetát 1 : 2, detekce: UF, NH3 (plynný), hodnoita Ri: 0,26.

7.74.

3-{N-[ 4‘-(2“-/4“’-nitrobenzyloxy)ethyl) benzensull onyl ] -L-ala.nyloxyjindol,

7.75.

3-[N-(4‘-/2“-chlorethyl/benzensull onyl) -L-alanyloxy ] indol, slabě načervenalá, amorfní pěna, [;α·]₀2°: —48,3°, c — 1 % (methanol), chromatografie na tenké vrstvě: hotová deska se silikagelem, systém: toluen—ethylacetát 5 : 1, detekce: UF, NH3 (plynný), hodnota Ri: 0,20.

7.76. ‘

3- [ N- (4‘-kyanobeinzensull onyl) L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 131 °C, [a]_D2°: —47,0°, c — 1 % (dimethyllormamid).

7.77.

3- [ N- (4‘-karboxybenzensullonyl) -L-alanyloxy] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 143 °C, [a]_o20: —51,0°, c = 1% (methanol),

7.78.

3-[N-(4‘-benzyloxykarbO'nylbeDzensullonyl) -L-alanyloxy ] indol bezbarvé krystaly, teplota tání 178 °C, [«]d20: —42,8°, ,c = 1% (aceton).

7.79.

3- [ N- (4‘-karbamoylbenzensulloinyl) -L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 206 °C, [«]d2°: —58,0°, c = 1% (aceton).

7.80.

3-[N-(4‘-/dimethylkarbamoyl/benzensull o;nyl) -L-alanyloxy ] indol, bezbarvé -krystaly, teplota tání 170 až 172 stupňů Celsia, [a^O —46,4°, c = 1 % (dimethylliormamid).

7.81.

3- [ N-methyl-N- (toluen-4‘-sullonyl) -L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 82 °C, [z«]o2°: —42,2°, c = 1 % (methanol).

7.82.

3- [ N- ^‘^^‘-trimethylbenzensullonyl) -L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 192 až 194 stupňů Celsia, [«]ι?°: —63,8°, c = 1 % (methanol).

7.83.

3- [ N- (dil enylyl^-sullcinyl) -L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 159 °C, [w]d2°: —42,0°, c = 1 % (methanol).

7.84.

3- [ N- (DaltaleD-2‘-sullonyl )-L-alanyloxy] indol, slabě načervenalé krystaly, teplo-ta tání 103 až 105 °C, chromatogralie na tenké vrstvě: hotová deska se silikagelem, systém: toluen—dioxan 4 : 1, detekce: UF, NH3 (plynný), hodnota Ri: 0,41.

7.85.

3- [ N- (4‘-acetylamino.naftalen-rsulíony 1) -L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 129 až 132 stupňů Celsia, [ι][?°: —63,2°, c = 1 % (methanol).

7.86.

3- [ N- (5^<-dimethylaminonaflalen-11-sull onyl) -L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 170 °C, [α]_ο20: —30,7°, c = 1% (methanol),

7.87.

3- [ N- (benzyloxykarbonyl ] -L-alanyloxy j indol, bezbarvý viskózní o.lej, [i]d2°: —42,2°, c = 1 % (methanol), chromatogralie na tenké vrstvě: hotová deska se silikagelem, systém: dichlormethan, detekce: UF, NaOH/K3Fe(CN)6, hodnota R(: 0,13.

7.88. “

3- [ N- (toluen-4^<-3ulí onyl) -L-alanyloxy ] -5-be.nzylindol

7.89.

3- [ N- (toluen-4‘-sullonyl) -L-alanyloxy ] -5-l enylindol

Příklady 7a až 7f

Filtrační papír (například Schleicher & Schull 23 SL) se postupně impregnuje následujícími roztoky a potom se suší při teplotě 60 °C.

Roztok 1

Diinatrium-telraborát (jako dekahydrát), hodnota pH 8,0 ve vodě, v koncentracích udaných v následující „tabulce složení recepturních příkladů“.

Roztok 2

3- [ N- (benzyloxykarbonyl) -L-alanyloxy ] indo-l v acetonu, v koncentracích uvedených v následující „Tabulce složení recepturních příkladů“.

Popřípadě se do roztoků přidávají oxidační činidla a/nebo smáčedla tak, aby bylo dosaženo· finálních koncentrací udaných v následující' „Tabulce složení recepturních příkladů“.

Složení recepturních příkladů 7a až 7f

bs CD CD CD~	1 °° 1 oj
cxi \| \|	CM
o o	o
t—1 r-1	гЧ
X X	1 x
ю Ю	OJ

СО ’Ф CO CD со счГ o irT

	CO		OJ
co 1	O] 1	co I	CM I	O o
CD гЧ	O гЧ	O r4	O r4	т-4

X X X X in imn n

OJ co 1 1
	о
i 7	о
o O	гЧ
гЧ гЧ
XX 1	1

Ю OJ

OJ o 0° ⁰⁴¹ 00

CD O

CD гЧ I

CD I

CO <N I I

XX I I

Ю Ю

Ф o Ή X) CU

I

Získají se bezbarvé nebo žlutě zbarvené zkušební papírky, které se při ponoření do vzorků moči s obsahem leukocytů zabarvují, a to — od bezbarvá do modra (příklady 7a, c + f), popřípadě — od žlutá do zelena (příklad 7b, d +

4- e).

Dá se prokázat vždy 5 000 leukocytů/₍ul moči při příklad č. reakční době (v sekundách)

7a 7b 7c

7d

7e

7f

100

250

160

270

240

I s jinými substráty (příklady 1 až 6), jakož i s jinými oxidačními činidly a/nebo smáčedly se dosahuje při srovnatelných molárních koncentracích podobných výsledků.

Příklad 8

3- [ N-terc.butyloxykarbonyl) -L-alanyloxy] indol

К provedení reakce karboimidovým způsobem se rozpustí 3,23 g (0,017 mol) N-terc.butyloxykarbonyl-L-alaninu a 2,27 g (0,017 mol) indioxylu ve 100 ml směsi dioxan—dichlormethan — 1:1. Po přidání roztoku 3,87 g (0,019 mol) dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) ve 20 ml absolutního dioxainu se reakční směs za vyloučení vlhkosti a kyslíku míchá po doňu 69 hodin při teplotě místmosti. Vyloučená N,N‘-dicyklohexylmočovina se odsaje, rozpouštědlo odddestiluje ve vakuu a zbytek se vyjme asi do 100 ml ethylacetátu. Po odsátí další vyloučené N,N‘-dicyklohexylmočoviny se čirý ethylacetátový roztok promyje postupně dvakrát po 30 ml 1 N kyseliny citrónové, ml vody, 50 ml 5 až 10% roztokem kyselého uhličitanu sodného a 25 ml vody. Po vysušení nad bezvodým síranem sodným se ethylacetátová fáze zahustí ve vakuu. Amorfní zbytek se čistí sloupcovou chromatografií na silikagelu ve směsi toluen—dioxan 9 : 1.

Po zahuštění spojených frakcí ve vakuu a překrystalování zbytku ze směsi ethylacetát—ether (1 : 10) se získá 1,04 g (20%) 3- [ N- (terc.butyloxykarbonyl) -L-alanyloxy] indolu ve formě bezbarvých krystalů, teplota tání 158°C, [a]_D ²⁰: —65,0°, c = 1% (methanol).

I v tomto případě vzniká při této reakci jako vedlejší produkt v poloze 1 substituovaný 3-hydroxyindol (viz příklad 7).

Analogicky se získají reakcí příslušně substituoivaných indioixylových sloučenin, s příslušnými aminokyselinami následující substráty, přičemž i zde ve všech případech vznikají jato vedlejší produkty v poloze 1 substituované 3-hydroxyindoly:

8.1.

3- [ N-f ormyl-L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 121 až 122 °C, [:a]_D ^{* 20}: —2,5°, c = 1% (methanol).

8.2.

3- [ N- (4‘-methoxybenzyloxykarbcnyl) -L-alanyloxy] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 92 °C, [kzjo²⁰: —42,9°, c ~ 1% (methanol).

8.3.

3- [ N- (N‘-/pi.peridino/oxykarbonyl) -L-alanyloxy] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 104 °C, [i+²⁰: —24,7°, c — 1% (methanol),

8.4.

3- [ N- (4‘-thienyl-/27-methoxykarbonyl) -L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 134 °C, [<се]о²⁰: —55,7°, c — 1% (methanol).

8.5.

3- [ N- (chinolin-8^£-sulf onyl) -L-alanyloxy ] Indol, amorfní, slabě načervenalý prášek, chromatografie na tenké vrstvě: hotová deska na silikagelu, systém: toluen—dioxan 4 : 1, detekce: UF, NH3 (plynný), hodnota R_f: 0,23.

8.6.

3- [ N- (dif enylkarbamoyl) -L-alanyloxy] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 188 až 190 °C, [ia]_D ²⁰: +22,2°, c = 1% (pyridin).

Příklad 9

3- [ N- (furyl-/27-methoxykarbonyl )-L-alanyloxy ] indol

К reakci metodou aktivovaného esteru se rozpustí 4,26 g (0,02 mol) N-[furyl-(2‘)-methoxykarbonyl]-L-alaninu a 5,4 g (0,04 mol) N-hydroxybenzotriazolu v 50 ml bezvOdého tetrahydrofuranu (THF), ochladí se na teplotu 0°C a přidá se roztok 4,4 g (0,022 mol) dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) v 10 mililitrech bezvodého tetrahydrofuranu. Pro tvorbu aktivního esteru se míchá reakční směs po dobu 1.5 hodiny při teplotě 0°C, potom 2 hodiny při teplotě místnosti. Potom se přidá za vyloučení kyslíku a vlhkosti 2,66 g (0,02 mol) indoxylu a 2,77 ml (0,04 mol) bezvodého triethylaminu. Směs se míchá po dobu 18 hodin při teplotě místnosti. Vzniklá Ν,Ν-OicyklohexylmЮĎoviιna se odsaje, rozpouštědlo se oddestiluje ve vakuu a zbytek se zpracuje jako· v příkladu 7. Amorfní surový produkt se potom čistí sloupcovou chromatografií na sloupci silikagelu směsí toluen—ethylacetát 5 : 1. Po zahuštění příslušných odebraných frakcí a překrystalování ze směsi ethylacetát—petrolether 1 : 1 se získají 3,0 g (45,,7%) 3- [ N- (f uryl-/27-methoixykarbonyl) -L-alanyloxy] indolu, bezbarvé krystaly, teplota tání 129°C, [XiJd²⁰: —51,9°, c = 1% (methanol].

Analogicky se získají reakcí příslušně substituovaných aminokyselin nebo peptidů s příslušnými indolxylovými sloučeninami následující látky:

9.1.

3- [ N- (toluen-4‘-sulfonyl-L-valyloxy] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 125 až 127 stupňů Celsia, [a]_D20: —24,5°, c = 1 % (methanol).

9.2.

3- [ N- (4‘-dimethylaminobenzensulfonyl) -L-alainyloxy ] indol, amorfní, slabě načervenalý prášek, chromatografie na tenké vrstvě: hotová deska se silikagelem, systém: toluen—dioxan 3 : 1, detekce: UF, NH3· (plynný), hodnota R_ř: 0,25.

9.3.

3- [ N- (4‘-acety lbenzensulfonyl) -L-ala.nyloxy] indol

9.4.

3- [ N- (4‘-methoxykarbonylbe.nzensulf onyl) -L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, teplota tání 140 až · 141 stupňů Celsia, [nL^: —40,4°, c = 1% (methanol).

9.5.

3- [ N- (4‘-karboxymethylbenzensulfonyl) -L-alanyloxy ] indol, amorfní, bezbarvá pěna, [a?Jo2°: —82,1°, c = 1 % (methanol), chromatografie na tenké vrstvě: hotová deska se silikagelem, systém: isopropylalkchiol—-budylacetá— —voda 5:3:2, detekce: · UF, NH3 (plynný), hodnota R_f: 0,68.

9.6.

3- [ N- (4‘-karboixxmethoxybenzensulfonyl) -L-alanyloxy ] indol, amorfní, bezbarvá pěna, [.ΐαίο²^ —47,7°, c = 1 % (methanol), chromatografie na tenké vrstvě: hotová deska se silikagelem.

systém: to-luen—dioxan—ethylacetát 6:2:1, detekce: UF, NH3 (plynný), hodnota Rf: 0,27.

9.7. _t

3- [ N- (4‘-karboxymethylaminobenzensulfonyl) -L-alanyloxy ] indol, bezbarvé krystaly, tepllota· tání 151 až 153 stupňů Celsia (rozklad), [h]d²°: —71,5°, c = 1 % (methanol).

9.8.

3- [ N‘- (4‘-/benzyloxy-karbionylmethylamino/benzensulfonyl) -L-alanyloxy ]indol, bezbarvé krystaly, teplota tání [+]d²0: —60,0°, c = 1 % (methanol).

9.9.

3- [ N- (4‘-f luorbenzensulfony!) -L-alanyloxy j indol bezbarvé krystaly, teplota tání 94 až 95 stupňů Celsia, [al^: —48,5°, c = 1% (methanol).

9.10.

3- [N- (4‘-fluoosulfo.ny lbenzensulfonyl )-L-alanyloxy ] indol

9.11.

3- [ N- (4‘-sulfamoy lbenzensulfonyl) -L-alanyloxy] indol

9.12.

3- [ N-acetyl-N- (toluen-4‘-sulf onyl )-L-alanyloxyl indol bezbarvý, amorfní prášek, [a)D²⁰: —10,6°, c = 1 % (methanol), chromatografie na tenké vrstvě: hotová deska se silikagelem, systém: toluen—dioxan 9 : 1, detekce: UF, NH3 (plynný), hodnota Rf: 0,17.

9.13.

3- [ N- (pyridi.n-3‘-sulf onyl) -L-alanyloxy ] indol bezbarvé krystaly, teplota tání 155 až 157 stupňů Celsia, [«Jd²^ —55,1°, o = 1 % (methanol).

9.14.

3- [ N- (5‘,5‘-dimethyl-3‘-oxocyk:^^ihexan-l‘-y 1) L-alanyloxy ] i ndol, bezbarvé krystaly, teplota tání 154 °C, [a^: —272,2°, c = 1% (methanol).

9.15.

3- [ N- (di-/4‘-nitrobenzyl/f osf oryl) -L-alanyloxy ] indol

9.16.

3- [ N- (di-/4‘-brombenzyl/fosf· oryl) -L-alanyloxy ] indol

9.17.

3- [ N ~ (tolue.n-4‘-sulf oinyl) -L-alanyloxy] indol bezbarvý, viskózní olej, [a]_D ²⁰: —46,8°, с = 1 % (methanol), chromatografie na tenké vrstvě: hotová deska se silikagelem, systém: toluen—ethylacetát 2 : 1, detekce: UF, NH3 (plynný), hodnota R_ř: 0,45.

Příklad 10

3- [ N- (B^^dioxa-n-heptyloxykarbonyl) -L-alanyloxy ] indol

К reakci metodou směsných anhydridů se rozpustí 3,52 g (0,015 mol) N-(3,6-dioxa-n-heptyloxykairbonylj-L-alaninu ve 35 ml bezvodého tetrahydrofuranu (THF). P10 přidání 2,1 ml (0,015 mol) triethylaminu se reakční směs ochladí na teplotu —15 °C a potom pro vznik směsného anhydridů se přidá 1,43 ml (0,015 mol) ethylesteru kyseliny chlormravenčí. Po 1 hodině míchání při teplotě —15°C se přidá za vyloučení kyslíku a vlhkosti na —15 °C ochlazení roztok 2,0 g (0,015 mol) indbxylu ve 20 ml bezvodého tetrahydrofuranu. Směs se míchá po dobu dalších 2 hodin při teplotě —15 °C až — 20 °C a potom se ponechá stát pres noc v lednici. Vzniklý hydrochlorid triethylaminu se odsaje, rozpouštědlo se odstraní ve vakuu a zbytek se zpracuje jak je popsáno v příkladu 7. Amorfní surový produkt se potom čistí sloupcovou chromatografií na silikagelu, nejprve směsí methylenchlorid—methanol 95 : 5 a potom směsí toluen—methylethylketon 1:2. Pio¹ zpracování shromážděných frakcí aktivním uhlím a odstraněním rozpouštědla se získá 0,51 g (9,5 %) 3-[N-(3‘,6‘-dioxa-n-heptyloxykarbonyl) -L-alanyloxy ] indolu, bezbarvý viskózní olej, [alo²⁰: —40,4°, c = 1% (methanol), chromatografie na tenké vrstvě, hotová deska se silikagelem, systém: toluen—methylethylketon 1 : 2, detekce: UF, NH3 (plynný), hodnota R_f: 0,54.

Analogicky se získají reakcí příslušně substituovaných aminokyselin s příslušnými indoxylovými sloučeninami následující látky:

10.1.

3- [ N- (2‘-nitrobenzensulfony 1) -L-alanyloxy] indol žluté krystaly, teplota tání 133 až 134 °C, [a]_D ²⁰: —116°, c = 1 % (methanol).

10.2.

3- [ N- (r-methyl-2‘-benzoylvinyl) -L-alanyloxy] indol slabě načervenalé krystaly, teplota tání 130 až 133 °C, chromatografie na tenké vrstvě: hotová deska se silikagelem, systém: toluen—dioxan 4 : 1, detekce: UF, NH3 (plynný) hodnota R_f: 0,45.

Příklad 11

Hmota následujícího složení, určená к potahování filmu, dobře zhomiogenizova-ná, se nanáší v tloušťce 100 na polykarbonátovou fólii:

roztok alginátu sodného

[3 %, vodný)	15	g
polyvinyl-propionát	16	g
křemelina	24	g
dihydrogenfcsforečnan draselný	0,2	g
hydrlogenfosforečnan sodný,
dihydrát	4,2	g
destilovaná vioda	35	g

3- [ N- (toluen-4‘-sulf ony 1) -L-alanyloxy] indol, rozpuštěný v 10 ml ethanolu 7,2 g

Po usušení takto potáhnuté fólie při teplotě 50 °C a rozřezání se získají bezbarvé testovací proužky, které se při ponoření do vzorků moči s obsahem leukocytů zbarvují, podle koncentrace leukocytů, světle tyrkysové až modře.

Dá se prokázat:

000 leukocytů v μ\ moči během asi 8 minut,

000 leukocytů v μΐ moči během asi 15 minut.

Citlivost zkoušky je asi 5 000 leukocytů na μΐ moči.

S jinými substráty (z příkladů 1 a 2) lze dosáhnout podobných hodnot citlivosti (5 000 až 20 000 leukocytů na μΐ moči).

Příklad 12

Následující roztok se lyofilizuje (suší mrazovou sublimací) v dávkách po 1 ml:

3- [ N- (4‘-karboxy-benzensulf onyl) -

-L-alany lo(xy ] indol	155,4	mg
polyvinylpyrrlolidon	300	mg
kyselina boritá	618	mg
destilovaná voda	asi 50	ml

Roztok se nastaví na hodnotu pH 8,0 pomocí 1 N roztoku hydroxidu sodného, doplní se pak destilováními vodou do 100 ml.

Ke stanovení koncentrace leukocytů se к lyofilizátu přidává po 2 ml moči obsahující leukocyty. Moč se pozvolna zbarvuje, podle koncentrace leukocytů, světle zeleně až temně modře. Po 10 minutách, se stanoví koncentrace leukocytů vizuálně pomocí srovnávacích barev nebo fotometricky, ha příklad v centimetrových kyvetách při 620 nm.

Citlivost zkoušky je asi 500 leukocytů na μΐ moči. Doba reakce se zřetelně zkrátí, jestliže se provede inkubování při teplotě 37 °C.

S jinými substráty (podle příkladů 1 a

2) lze dosáhnout podobných hloídnot citlivosti (500· až 2 000 leukocytů na μΐ), přičemž u substrátů obtížně rozpustných se doporučuje přídavek organických rozpouštědel, jako' například methanolu nebo dimethylformamidu.

Claims

1. Prostředek k průkazu proteolytických enzymů, sestávající ze savého· nosiče, práškovité směsi, roztoku nebo reagenční tablety,· které obsahují reagenční směs, která sestává z 0,2 až 9,0 mol. % chromogenu,

62,4 až 99,8 mol. % pufru, 0 až 28,4 mol. % smáčedla a 0 až 78,5 mol. % galenické přísady, vyznačující se tím, že jako chromogen obsahuje estery indioxyl- a/nebo thiioindoxylaminokyselin a/nebo· -peptidů obecného vzorce I

Rif (I) ve kterém

Ri, Rx, R3, R4 mohou být stejné nebo různé, znamenají vždy vodík nebo· halogen, Ci až C3-alkylov)ou, C-t—Сз-alkoxyHovou, benzylbvou, benzyloxylovou, hydroxylovou, karboxylovou, karboxy-Ci—Cs-alkoнylovou, beinzyloxykarbtoinylovou, benzyloxykarbonyl-Ci—C3-alkoxylovou skupinu, nitroskupinu nebo acetylaminoskupinu nebo vždy dva sousední substituenty tvoří benzoanelovaný zbytek,

X značí atom síry, a případně Ci—C3-alkylem, fenylem, benzylem, acetylem nebo benzoylem substituovanou iminoskupinu,

A zbytek přírodních a-aminokyselin nebo z těchto· a-aminokyselin sestávající di- nebo· tri-peptidický zbytek,

B značí v peptidové chemii obvyklou nebo od ní odvozenou skupinu, chránící dusík, například acylovou, oxykarbonylovou, thokarbonyliovou, sulfonylovou, sulfenylovou, vinylovou, cyklohěxenylovou, fosřorylovou nebo k-arbamioylovou skupinu.

2. Způsob výroby esterů indoxyl- a/nebo thtoindoxyl-aminokyselin a/nebo -peptidů, tvlořících účinnou složku prostředku podle bodu 1, obecného vzorce I uvedeného v bodě 1, vyznačující se tím, že se uvádějí do reakce sloučeniny obecného vzorce II ve kterém

Ri, Rx, R3, Ri a X mají výše uvedené významy, s aminokyselinami a peptidy obecného· vzorce III

H—O—A—B (ΙΠ) ve kterém

A a B mají výše uvedené významy, případně s jejich reaktivními deriváty, v inertním rozpouštědle při teplotách iod —30 stupňů Csl-sia až do teploty místnosti.