FI86204B - Analysfoerfarande och medel foer att paovisa esterolytiska och/eller proteolytiska enzym. - Google Patents

Description

1 86204

Analyysimenetelmä ja väline esterolyyttisten ja/tai pro-teolyyttisten entsyymien toteamiseksi

Esillä oleva keksintö koskee välinettä esterolyyttisten 5 ja/tai proteolyyttisten entsyymien analyyttistä toteamista varten, esim.kehon nesteissä, jolloin esterit ovat sopivalla tavalla sisällytettyinä koestusvälineisiin, erityisesti koestus-suikaleihin. Keksinnön mukaiset välineet sisältävät kromogee-nisten entsyymisubstraattien (sopivien fenolien aminohappo-10 tai peptidiesterien) samoin kuin mahdollisesti fenolien kanssa väriä muodostaen kytkeytyvien diatsoniumsuolojen ohella vielä suolojen aminohappo- vast, peptidiesterien entsymaat-tisten hajoamisen nopeuttajina. Välineitä käytetään edullisesti leukosyyttien toteamiseen, erityisesti virtsassa.

15 Munuaisten sekä virtsa- ja sukuelinten sairauksien diagnos tiikassa on suuri merkitys leukosyyttien toteamisella kehon nesteissä, erityisesti virtsassa. Alkuaan suoritettiin tämä toteaminen laskemalla leukosyytit ei-sentrifugoiduissa virtsassa tai virtsan sakassa. Kummallakin menetelmällä voitiin saa-20 da huomioiduksi ainoastaan eheät leukosyytit. On kuitenkin tunnettua, että leukosyytti-lyysin nopeus on aina virtsan . ; ympäristön mukaan voimakkaiden vaihtelujen alainen;niinpä esimerkiksi voimakkaasti aikalisissä virtsoissa on leukosyyt-tien puoliintumisaika vain 60 minuuttia. Tämä johtaa siihen, * 25 että todetaan liian alhaisia leukosyyttilukuja. Kiinnittämättä huomiota tähän lyysi-virheeseen antaa leukosyyttien kvantita-·· tiivinen mikroskooppinen määrittäminen laskentakammiossa ei- sentrifugoidussa, homogenoidussa virtsassa hyvin tarkkoja arvoja. Tästä huolimatta käytetään tätä menetelmää käytännössä : ·. 30 vain harvoin,koska se on vaivalloinen ja aikaa vievä ja edel lyttää koulutettua henkilökuntaa.

. Lääketieteellisessä käytännössä suosittu menetelmä leu- kosyyttien määrittämiseksi virtsassa oli sen vuoksi niin sa-·;·’ nottu näkökenttämenetelmä virtsasakassa. Tätä varten täytyi ’ ·-. 35 ensiksi saada näyte (sakka) sentrifugoimalla. Tällöin rikas- / tuivat kuitenkin myös muut virtsan aineosat, jotka - kuten 2 86204 esim. suolet ja epiteelisolut - vaikeuttavat huomattavasti leukosyyttien laskemista mikroskoopin avulla. Vaihteleva sakka-pitoisuus, sakan epähomggeenisuus samoin kuin mikroskoopin erilaiset optiset varusteet aiheuttivat suhteellisen suuria vir-5 heitä (jopa useita satoja %:teja) leukosyyttilukutuloksissa.

Näiden vaikeuksien välttämiseksi yritettiin jo monesti käyttää leukosyyttien toteamisperiaatteena erilaisissa kehon nesteisessä entsymaattisia reaktioita, koska leukosyytillä on laajaviuhkainen entsyymispektri.

10 Niinpä esim. saksalaisista hakemusjulkaisuista 2 826 965 ja 2 836 644 tunnetaan välineitä leukosyyttien toteamiseksi kehon nesteissä, joissa välineissä käytetään analyyttisiä tarkoituksia varten hyväksi leukosyyteissä olevaa esterolyyttistä ja/tai proteolyyttistä aktiviteettia. Substraatteina leukosyyt-15 tiesteraaseja ja/tai -proteaaseja varten käytetään tällöin sulfoniftaleiiniesteriä vast, atso-väriaine-esteriä. Entsy-maattisen reaktion yhteydessä vapautuneet väriaineet määritetään sen jälkeen tunnettujen menetelmien mukaan* Näissä julkaisuissa kuvatut välineet ovat kuitenkin käytännöllisiä tarkoi-20 tuksia varten vielä liian epäherkät, koska leukosyytti-konsent-raatioiden ollessa alhaiset ne vaativat liian pitkiä reaktio-aikoj a.

Erilaisia menetelmiä proteaasien ja esteraasien toteami-· seksi tunnetaan myös histo- ja sytokemiallisesta entsymologi- /25 asta (katso esimerkiksi A.G.E.- Pearse, Histochemistry,

Theoterical and Applied, 3 painos, Churchill Livingstone, Edinburg-London-New York 1968) . Toteamista varten käytetään tällöin yleensä värittömiä tai heikosti värillisiä estereitä, jotka entsyymien vaikutuksesta hajoavat värittömäksi hapoksi . -30 ja samoin värittömäksi alkoholi-(fenoli)-komponentiksi. Fenoli-komponentti reagoitetaan sen jälkeen seurausreaktiossa vä-·’ rillisiksi tuotteiksi, esim. kytkemällä diatsoniumsuolojen : ·.: kanssa tai hapettamalla. F. Schmalzl ja H. Braunsteiner esit- tävät esimerkiksi julkaisussa Klin. Wschr. 46, 642 (1968) 35 spesifiseni, sytokemialliscn leukosyytti-esteraasin toteamista-van käyttämällä naftoli-AS-D-klooriasetaattia substraattina 3 86204 ja diatsoniumsuolaa, joka muodostaa vapautuvan naftolin kanssa värillisen atso-yhdisteen.

Leukosyyttien nopeaan ja yksinkertaiseen toteamiseen kehon nesteissä, kuten esim. virtsassa, eivät tämän laatuiset 5 kaksikomponentti-järjestelmät osoittautuneet kuitenkaan sopi viksi, koska ne ovat liian epäherkkiä: näytteet, jotka sisälsivät 5000 leukosyyttiä^ul, eivät osoittaneet vielä mitään reaktiota.

Julkaisuissa GB-A 1 128 371 ja EP-A 12 957 selostetaan 10 indoksyyli-ja tioindoksyyliesterien käyttämistä kromogeenisi- nä substraatteina hydrolyyttisten entsyymien toteamiseksi kehon nesteissä. Substraatin enLsymaattisessa hajoamisessa syntyy vapaata indoksyyliä, joka sen jälkeen hapetetaan helposti todettavaksi siniseksi väriksi, indigoksi. Julkaisuun 15 EP-A 12 957 perustuva , kaupasta saatava koestusväline käsittää suodatinpaperisuikaleen,joka on kyllästetty N-tosyyli-L-alaniini-indoksyyliesterillä. Leukosyyttejä sisältävään virtsanäytteeseen upotettuna värjäytyy koestussuikale siniseksi. Tämän tuotteen eräs oleellinen haitta on kuitenkin pitkä 20 odotusaika (noin 15 minuuttia), kunnes lopullinen värjäyty minen saavutetaan ja koetulos voidaan arvioida.

- ' Julkaisussa EP-A 14 929 selostetaan erilaisia nopeutta- : ,·. via aineita (pyridiinijohdannaisia; imidatsolijohdannaisia; alkoholeja; metallikomplekseja) entsymaattista pilkkoamis-25 reaktiota varten. Epäkohdiksi jäävät kuitenkin indoksyylin . . täydelliseen hapettumiseen kuluva suhteellisen pitkä aika ja kokeen vähäinen herkkyys (toteamisraja: muutamia tuhansia leu- kosyyttejä^ul). Samaa koskee myös leuko-indoaniliinien esterien käyttämistä substraatteina leukosyytti-entsyymeille 30 julkaisun EP-A 34 323 mukaan.

Julkaisu EP-A 39 880 esittää julkaisun EP-A 12 957 : vast. 14 929 mukaisten substraattien yhdistelmän samoin edellä tarkastellun, diatsoniumsuolojen kanssa tapahtuvaan kytkentään perustuvan toteamisperiaatteen kanssa. Tällä ta-: ' - 35 valla tosin onnistutaan alentamaan selvästi leukosyyttien : toteamisrajoja, mutta vielä ei kuitenkaan saavuteta käytän- 4 86204 nön toteutusta silmällä pitäen toivottua toteamisherkkyyttä joka on 15-20 leukosyyttiä^ul.

Esillä olevan keksinnön tehtävänä oli sen vuoksi löytää esteriä hajottavia entsyymejä varten uusia aktivaattoreita, 5 jotka seurauksena leukosyyttientsyymien aiheuttamaa substraat tien entsvmaattisen hajoamisen nopeuttamisesta tekevät mahdolliseksi leukosyyttien herkän ja nopean toteamisen. Tämä tehtävä ratkaistaan lisäämällä suoloja reagenssijärjestelmään.

Kuten yllättäen havaittiin, nopeutuu leukosyyttientsyy-10 mien avulla tapahtuva kromogeenisten substraattien hajoami nen huomattavasti suolalisäyksen ansiosta vast, testausjär-jestelmässä jo läsnäolevien aktivaattorien vaikutus vahvistuu.

Keksinnön kohteena ovat välineet esterolyyttisten ja/tai 15 proteolyyttisten entsyymien toteamiseksi ja ne sisältävät (a) fenolin aminohappo- tai peptidiesteriä kromogeenisenä entsyymisubstraattina, (b) komponentin (a) aminohappo- vast, peptidiesterisidok-sen entsymaattista hajoamista nopeuttavaa ainetta, mahdolli- 20 sesti (c) diatsoniumsuolaa, mahdollisesti . (d) kantaja-ainetta ja/tai tavallisia lisäaineita, .* ja näille välineille on tunnusomaista se, että nopeuttavana aineena käytetään suolaa mahdollisesti yhdessä muiden akti-: ·' 25 vaattorien kanssa.

Keksinnön kohteena on lopuksi myös menetelmä esterolyyt-: tisten ja/tai proteolyyttisten entsyymien toteamiseksi neste- : - - mäisissä näytteissä, erityisesti kehon nesteissä, ja menetel mälle on tunnusomaista se, että näyte saatetaan kosketukseen 30 keksinnön mukaisen välineen kanssa ja tapahtuva värireaktio määritetään.

Nopeuttavasti vaikuttavia suoloja ovat keksinnön mukaan erityisesti alkali- ja maa-alkalimetallien 1- ja 2-arvoisten • · + + + , + + ...· kationien, kuten esimerkiksi kationien Li , Na , K ja Mg <*·,. 35 suolat. Aktivoivien suolojen edullisia anioneja ovat 1-, 2- .·_ : tai 3-arvoiset orgaaniset tai epäorgaaniset anionit. Erityi- 5 862C4 sesti mainittakoon halogenit ja pseudohalogenidit, sulfaatit ja fosfaatit samoin khin orgaanisten happojen, kuten etikka-hapon, trifluorietikkahapon, tolueenisulfonihapon ja meripih-kahapon ionit.

5 Keksinnön mukaan ovat suolojen konsentraatiot koestusliuok- sissa edullisesti välillä 0,05 mol. - 2 mol., erityisesti edullisesti välillä 0,1 - 1 mol.

Kantaja-aineiden kyllästämiseen (koestusvälineiden jälem-pänä selostetun valmistuksen yhteydessä) käytettyihin valmis-10 teisiin liuotetaan suoloja edullisesti määrissä, jotka ovat välillä 0,01 mol. - 2 mol., erityisen edullisesti välillä 0,1- 1 mo1.

Keksinnön mukaan käytettävät suolat nopeuttavat julkaisuissa EP-A 7 407, 8428, 12 557, 14929, 34 323 ja 39 880 15 esitettyjen substraattien entsymaattista hajottamista leuko- syyttientsyymien avulla samoin kuin jo aikaisemmin esitettyjen substraattien hajoamista /G. Gomori, J. Histochem. Cy-tochem. 6 469 (1953); H. Löffler, Klin. Wochenschr. 39, 1120 (1961); L. Visser ja E. Blout, Fed. Proc. 28, 407 (1969) 20 samoin kuin Biochim. Biophys. Acta 268, 257 (1972) ja R. Sweerman ja L. Ornstein, J. Histochem. Cytochem. 23, . : 327 (1974)J.

• Keksinnön mukaisissa välineissä oleviin edullisiin kromo- .IV geenisiin substraatteihin kuuluvat myös rinnakkaisessa pa- *. 25 tenttihakemuksessa kuvatut yhdisteet, joilla on yleinen kaava *2 j1! 6 86204 jossa ja ovat samanlaisia tai erilaisia ja tarkoittavat typpeä tai rikkiä, sillä ehdolla,että ja X2 eivät samanaikaisesti tarkoita rikkiä; 5 R-^ tarkoittaa vetyä tai mahdollisesti haarautunutta alkyyliryhmää, jossa on 1-6 C-atomia,ja joka mahdollisesti voi olla substituoitu halogeenilla tai hydroksilla.

R2 ja R3 ovat samalaisia tai erilaisia ja tarkoittavat vetyä, C^-Cg-alkyyliryhmiä, C^-Cg-alkoksiryhmiä, C^-Cg-10 asyyliryhmiä, halogeenia, trifluorimetyyliä, nitroa, SOgH, syanoa, C^-Cg-asyyliaminoryhmiä, C^-Cg-dialkyyliaminoryhmiä tai Cg-C^g-aryyliryhmiä, jotka vuorostaan voivat edelleen olla substituoidut C^-Cg-alkyyliryhmillä, C^-Cg-alkoksiryh-millä, halogeenilla, syanolla, nitrolla, trifluorimetyylil-15 lä, S03H:lla, C^-Cg-asyyliryhmillä tai C-^-Cg-dialkyyliamino- ryhmillä tai R2 ja Rg muodostavat yhdessä lisärenkaaksi aromaattisen renkaan, edullisesti bentseenirenkaan, joka vuorostaan voi olla substituoitu yhdellä tai kahdella R2-tähteellä; A tarkoittaa aminohappo- tai peptiditähdettä ja 20 G tarkoittaa vetyä tai edullisesti peptidikemiassa ta vallista tai siitä johdettua typensuojaryhmää.

Yleisen laavan (II) mukaisia edullisia yhdisteitä ovat sellaiset, joissa X^ tarkoittaa rikkiä ja X2 tarkoittaa typpeä. Edullisia ovat lisäksi ne kaavan (II) mukaiset yhdisteet, • 25 joissa R^ tarkoittaa vetyä, ja sellaiset, joissa R2 ja Rg, : jotka ovat samanlaisia tai erilaisia, tarkoittavat vetyä, j'-'; C^-Cg-alkyyliä, C-^-C2-alkoksia, halogeenia, C-^-C^-dialkyyli- aminoryhmiä tai bentseenitähteitä.

: Kaavan (II) mukaisissa yhdisteissä on esteritähde eri- 30 tyisen edullisesti 5-asemassa.

Muita keksinnön mukaan edullisia kromogeenisiä substraatteja ovat samoin rinnakkaisessa patenttihakemuksessa kuvatut ** " yhdisteet, joilla on yleinen kaava « « » 1 • « · • · · 7 86204

*4 I -0 - A - G

R6 ,4 11111 X3 jossa

X

3 ja tarkoittavat N tai CH, sillä ehdolla, että kulloinkin joko X^ tai X^j tarkoittaa N, 10 R4, Rg ja Rg ovat samanlaisia tai erilaisia ja tarkoitta vat vetyä, C^-Cg-alkyyliryhmiä, C^-Cg-alkoksiryhmiä, C-^-Cg-asyyliryhmiä, halogeenia, trifluorimetyyliä, nitroa, SO^H, syanoa, C^-Cg-asyyliaminoryhmiä, C^-Cg-dialkyyliaminoryhmiä tai Cg-C^Q-aryyliryhmiä, jotka vuorostaan voivat edelleen 15 olla substituoidut C]_-Cg-alkyyliryhmi llä, Cy-Cg-alkoksiryhmi 1- lä, halogeenilla, syanolla, nitrolla, trifluorimetyvlillä, SOgH.-lla, Cj^-Cg-asyyliryhmillä tai Ci-Cg-dialkyyliaminoryh-millä, tai Rg ja Rg muodostavat yhdessä lisärenkaaksi aromaattisen renkaan, edullisesti bentseenirenkaan, joka vuo-20 rostaan voi olla substituoitu yhdellä tai kahdella R^-täh- teellä. ja A ja G tarkoittavat samaa kuin edellä kaavan (II) yhteydessä on esitetty.

/·· Yleisen kaavan (III) mukaisissa yhdisteissä X3 tarkoit- • :: 25 taa edullisesti CH ja X4 typpeä. R^ , Rg ja Rg, jotka voivat olla samanlaisia tai erilaisia, tarkoittavat edullisesti vetyä, C^-C4~alkyyliä, C^-C4~alkoksia, asyyliaminoa (jol- • loin happotähde voi olla alifaattinen tai aromaattinen ja - . sisältää 1-6 C-atomia) , C^-C4-dialkyyliaminoa, nitroa, 30 syanoa, halogeenia samoin kuin aryyliä, joka mahdollisesti on substituoitu C1-C4-alkyylillä, C1-C4~alkoksilla tai halo-geenillä, R4, Rg ja Rg tarkoittavat erityisen edullisesti '.· ‘ vetyä, C^-C4~alkyyliä, fenyyliä tai halogeenia tai Rg ja Rg ;’-J muodostavat yhdessä lisärenkaaksi bentseenirenkaan.

.··*. 35 Kromogeenisiksi substraateiksi keksinnön mukaisia väli neitä varten soveltuvat lisäksi myös yhdisteet, joilla on • · • “ yleinen kaava 8 86204 R4

/ O-A-G

- jolloin , Rg , Rg, A ja G tarkoittavat samaa kuin edellä kaavan (III) yhteydessä on mainittu.

Yleisissä kaavoissa (II), (III) ja (IV) tarkoittaa G - A - edullisesti tähdettä, jolla on yleinen kaava

O

II

R7 - CH - C -

' I

15 NH-Rg jossa R-, tarkoittaa vetyä tai mahdollisesti haarautunutta, alkyyli-, sykloalkyyli- tai aryylitähdettä, joissa on 20 1-15 C-atomia, edullisesti 1-9 C-atomia ja jotka on mahdolli sesti substituoitu hydroksi-, merkapto- tai karboksyyli-ryhmällä, ja

Rg tarkoittaa vetyä tai edullisesti -CO-alkyyliä, -CO-aralkyyliä, -CO-aryyliä, -SC^-alkyyliä tai -S02-aryyliä, ·.*·· 25 jolloin alkyylitähteet ovat suoraketjuisia tai haarautuneita l.j | ja niissä on 1-9 C-atomia, edullisesti 1-6 C-atomia, ja aryy- :’· : litähteet tarkoittavat edullisesti bentseenirenkaita jotka ·;·*: on mahdollisesti substituoitu C^-C^-alkyyliryhmillä, C-^-C^- • alkoksiryhmillä tai haloleegilla.

30 G-A- tarkoittaa erityisen edullisesti tavanomaisella typensuojaryhmällä varustettua luonnon aminohapon tai 2-8 . . tällaisesta aminohaposta koostuvan peptidin tähdettä.

Aminohappotähteet voivat tällöin esiintyä niiden L- tai ’·' ' D-muodossa tai myös niiden raseemisessa muodossa. Erityisen 35 edullisia ovat glysiinin, alaniinin, valiinin, leusiinin, • · · • » • t • · « · · • · 9 86204 isoleusiinin,fenyylialaniinin ja tyrosiinin tähteet, jolloin kulloinkin L-muoto on erityisen edullinen.Mahdollisesti läsnä olevat vapaat hydroksiryhmät voivat olla asyloituja, edullisesti asetyloituja.

5 Peptiditähteellä tarkoitetaan A:n määrittelyssä esim.

di-, tri-, tetra- ja pentapeptidejä, edullisesti di- ja tri-peptidejä, jolloin aminohappokomponentteina tulevat kysymykseen edellä mainitut aminohapot.

Yleisten kaavojen (II), (III) ja (IV) mukaisia substraat-10 teja saadaan reagoittamalla vastaavia fenoleja aminohappojen vast, peptidien kanssa, joilla on yleinen kaava

G - A - OH

15 jossa G ja A tarkoittavat samaa kuin edellä on mainittu, vast, niiden sopivien reaktiivisten johdannaisten kanssa peptidikcmiassa tavallisten menetelmien mukaan.

Sopivia reaktiivisia johdannaisia ovat esim. happoklori-dit ja peptidisynteesissä tavanomaisesti käytetyt seka-anhyd-20 ridit, esim. kloorimuurahaishappoetyyliesterin, tai aktiivi- esterin kuten esim. pentakloorifenyyliesterin tai N-hydroksi-bentsotriatsoliesterin kanssa.

Keksinnön mukaiset välineet sisältävät edullisesti (entsy-maattisessa hajoamisessa vapautuvien) fenolien kanssa reagoi-25 vina värinmuodostajina diatsoniumsuolo ja, joilla on yleinen : kaava ---- oi 30 V-/ <♦> - (-, R',_(/ Λ_ N = N XJ 1 (V) K"

Dl D* «4 « e .*. : 35 * 3 10 8 6204 jossa R'^ tarkoittaa alempaa alkyyli-, alempaa alkoksi-, alempi-alkyylimerkapto-, hydroksi-, nitro-, syanoa-, trifluo-rimetyyli-, C^-C3~alkyylisulfoniamido-, aryylisulfoniamido-, 5 Ci~Cg-alkyylisulfoni-, aryylisulfoni-, sulfonihappo-, karbok- syylihappo-, N-morfolino-, N-tiomorfolino-, N-pyrrolidino-, mahdollisesti N'-alkyloitua N-piperatsino-, N-piperidino-ryhmää, halogeenia tai vetyä.

R'2 tarkoittaa alempaa alkyyli-, alempaa alkoksi-, aryy-10 lioksi-, alempi alkyylimerkapto-, alkyyliamino-, dialkyyli- amino-, hydroksi-, nitro-, syano-1, Ci~Cg-alkyylisulfoniami-do-, aryylisulfoniamidio- , C]_-Cg-alkyylisulfoni-, aryylisulfoni-, sulfonihappo-, karboksyylihappo-, N-morfolino-, N-tio-morfolino-, N-pyrrolidino-, mahdollisesti N'-alkyloi-15 tua N-piperatsino-, N-piperidino-, fenyyliamino-, mahdollises ti alemmalla alkyyli- tai alemmalla alkoksitähteellä substitu-oitua fenyy1i-ryhmää, halogeenia tai vetyä, R'2» R'4, r'5' j°tka voivat olla samanlaisia tai erilaisia, tarkoittavat kulloinkin alempaa alkyyli-, alempaa alkok-20 si-, nitro-, C^-Cg-alkyylisulfoniamido-, aryylisulfoniamido-, C^-Cg-alkyylisulfoni-, aryylisulfoni-, sulfonihappo-, karboksyylihappo-, alempi alkyylimerkaptoryhmää, halogeenia tai vetyä ja X tarkoittaa stabilisoivaa anionia, 25 jolloin kulloinkin kaksi vierekkäistä tähdettä R'^ - R',.

: voi olla sulkeutunut mahdollisesti halogeenilla, C^-Cg- alkyyli-, C^-Cg-alkoksi-, nitro-, sulfonihappo- tai karbok-" syylihapporyhmällä substituoiduksi bentseenirenkaaksi, joten syntyy naftaleenisarjän diatsoniumsuola.

30 Yleisessä kaavassa (V) ovat symbolien merkitykset edulli- sesti seuraavat: R1 tarkoittaa C1-C4~alkyyliä, C^-C^-alkoksia, hydroksia, .*·· nitroa, halogeenia tai vetyä, _ · R'g tarkoittaa C-^-C^-alkyyli-, C^-C4~alkoksi-, aryyli- . ’ ; 35 oksi-, C1-C4-alkyyliamino-, C1-C4-dialkyy]iamino-, nitro-, C^-C4-alkyyli-sulfoniamidio-, aryylisulfoniamido-, C^-C4~ 11 86204 alkyylisulfoni-, aryylisulfoni-, N-morfolino-, N-pyrrolidino-, fenyyliamino- tai sulfonihapporyhmää tai vetyä ja R'2( R'^, r,5' jot^a voivat olla samanlaisia tai erilaisia, tarkoittavat C-^-C^-alkyyli-, C-^-C^-alkoksi-, C-^-C^-al-5 kyyliamino-, C-^-C^-dialkyyliamino-, nitro-, C-^-C^-alkyyli- sulfoniamido-, aryylisulfoniamido- tai sulfonihapporyhmää, halogeenia tai vetyä.

Kulloinkin voi 2 vierekkäistä tähdettä R’^-R'^ olla tällöin mahdollisesti sulkeutunut mahdollisesti halogeenilla, 10 C^-C^-alkyyli-, C^-C^-alkoksi-, nitro- tai sulfonihappotäh- teellä substituoiduksi bentseenirenkaaksi.

Kaavan (V) puitteissa tarkoittaa aryyli kulloinkin mahdollisesti halogeenilla, C^-C^-alkyyli- tai C^-C^-alkoksi-ryhmällä substituoitua aromaattista tähdettä, jossa on 6-12 15 C-atomia, edullisesti 6 C-atomia.

Yleisen kaavan (V) mukaiset diatsoniumsuolat ovat sinänsä tunnettuja tai niitä voidaan syntetisoida sinänsä tunnettujen menetelmien mukaan (Houben-Weyl, (Methoden der organischen Chemie, nide X/3).

20 Keksinnön mukaiset välineet sisältävät edullisesti pro- teolyyttisten entsyymien ja erityisesti leukosyytti-entsyymien toteamiseksi sopivan puskurijärjestelmän. Tähän tarkoitukseen tulevat kysymykseen esim. fosfaatti-, boraatti-, karbo-naatti/vetykarbonaatti-, karbonaatti-, barbituraatti-, tris-25 (hydroksimetyyli) -aminometaani- (=tris), 2-amino-2-metyyli- ::: propaanidioli-1,3- (=amedioli)- tai aminohappo-puskurit, jolloin yleensä pH-arvo ja kapasiteetti valitaan siten, että mittausliuoksessa vast, koestussuikaleessa asettuu pH-arvo : .·. välille 6-10, edullisesti välille 7-9.

30 Keksinnön mukaiset välineet sisältävät edullisesti nopeut- tavasti vaikuttavien suolojen ohella vielä muita aktivaatto-. . reita, jotka osaksi ovat sinänsä tunnettuja. Sopivia aktivaat- ; * toreita ovat esimerkiksi julkaisussa EP-A 14 929 esitetyt pyridiini johdannaiset, imidatsoliyhdisteet, metallikompleksit 35 ja erityisesti alkoholit, jolloin n-dekanoli ja ennenkaikkea n-undekanoli ovat erityisen edullisia. Tähän asti ei-tunnet- i2 86204 tuina entsymaattisten pilkkomisreaktioiden nopeuttajina mainittakoon lisäksi emäksisiä aminohappoja sisältävät homoja ko-polyaminohapot /E.Katchalski ja M. Sela julkaisussa: Advances of Protein Chemistry 13, 243-492 (1958); C.B. Anfin-5 sen, M.L. Anson, J.T. Edsall und K. Bailey (Hrsg.); Academic

Press Inc. Publishers, New York, N.Y._7 samoin kuin sekven-tiaaliset polyaminohapot, jollaisia on selostettu rinnakkaisessa patenttihakemuksessa. Emäksisinä aminohappoina tulevat kysymykseen sellaiset aminohapot, joiden sivuketjuissa on 10 amino- tai guanidinoryhmiä. Näitä ovat erityisesti lysiini ja ornitiini samoin kuin arginiini mutta myös luonnon proteiineissa ei-esiintyvät emäksiset aminohapot, kuten esimerkiksi diaminovoihappo, diaminopropionihappo tai diaminopimeliini-happo. Polyaminohappoihin sisältyvät aminohapot voivat olla 15 raseemisessa tai optisesti aktiivisessa D- tai L-muodossa.

Polyaminohappojen molekyylipainot ovat välillä 1000- 2 000 000 , edullisesti kuitenkin välillä 5000 - 500 000. Emäksisten aminohappojen pitoisuudet ovat välillä 5-100 mooli-%, edullisesti 20-100 mooli-%, laskettuna polyaminohaposta.

20 Keksinnön mukaiset välineet voivat sisältää myös sinänsä tunnettuja detergenttejä, koska tämän johdosta voidaan saavuttaa homogeenisempi värin jakautuminen ja voimakkaampi värjäytyminen. Kysymykseen tulevat sekä kationiaktiiviset että myös anioniaktiiviset detergentit, mutta myös amfotee-25 riset ei-ionogeeniset detergentit. Esimerkkeinä näistä mainit- : takoon bentsyyli-dimetyyli-tetradesyyli-ammoniumkloridi, nat- : '.· riumdodekyylisulf aatti , sefiroli, polyvinyylipyrrolidoni , heparinoidi samoin kuin jo aktivaattoreina mainitut poly-• aminohapot ja sekvenssipolymeerit. Mahdollisesti voidaan : ; ; 30 käyttää myös kahden tai useamman edellä mainitun detergentin seoksia.

; Keksinnön mukaisissa välineissä ovat erilaiset edellä mainitut reagenssit sisällytetyt inerttiin kantajamateri-aaliin edullisesti sinänsä tunnetulla tavalla, jolloin kan-:.i 35 tajamatriisina tulevat kysymykseen erityisen edullisesti : : huokoiset materiaalit, kuten erityisesti suodatinpaperi

II

13 86204 mutta myös tekoainekalvot, lasikuitumatot (US-PS 3 846 247), huokoiset keraamiset suikaleet, tekoainekuituharsot, sieni-mäiset materiaalit (US-PS 3 552 928), huopa, tekstiilit, puu, selluloosa tai myös piihappogeeli.

Mainitut kantajamateriaalit kyllästetään tässä tarkoi-5 tuksessa edellä mainittujen reagenttien liuoksella sopivassa helposti poistettavassa liuottimessa, joita ovat esim. vesi, metanoli, etanoli, asetoni, DMF tai DMSO. Tämä tapahtuu edullisesti kahdessa erillisessä vaiheessa: ensiksi kyllästetään vesiliuoksella, joka sisältää puskuria ja muita vesiliukoisia 10 lisäaineita. Tämän jälkeen kyllästetään yleisen kaavan (V) mukaisten kromogeenisten entsyymisubstraattien ja aktivaatto-rien liuoksella. Kyllästäminen voidaan suorittaa kuitenkin myös toisessa järjestyksessä vast, molempien kyllästysliuosten toisenlaisella koostumuksella. Kyllästysliuos tai tukittava 15 neste sisältää edullisesti kromogeenistä substraattia ja diatsoniumsuolaa edellisen konsentraation ollessa kulloinkin -4 -1 -3 -2 10 - 10 moolia/1, erityisesti 10 - 10 moolia/1, ja suolan konsentraation ollessa 0,01 M - 2 M, erityisesti 0,1 M - 1 M.

20 Käytettäessä suodatinpaperia matriisina voidaan valmiita koestuspapereita käyttää sellaisenaan tai ne voidaan liimata kiinni tunnetulla tavalla kädensijoihin tai edullisesti sul-.·. ; kea tekoaineiden ja hienosilmäisten verkkokudosten väliin - - esim. julkaisun DE-OS 2 118 455 mukaan.

25 Kalvopäällysteisten koestussuikaleitten valmistamiseksi ' * lisätään edullisesti kaikki reagenssit kalvonmuodostavan aineen, kuten esim. polyvinyyliesterin tai polyamidin liuokseen tai dispersioon ja sekoitetaan homogeeniseksi. Seosta sivellään ohueksi kerrokseksi tekoainetta olevalle kanta-30 jalle ja kuivataan. Näin valmistetut kalvopäällysteiset koes- : ·.: tussuikaleet leikataan kuivauksen jälkeen ja niitä voidaan käyttää sellaisenaan tai ne voidaan liimata kiinni tunnetul-.* . la tavalla kädensijoihin tai sulkea esim. tekoaineiden ja 1./ hienosilmäisten verkkorakenteiden väliin julkaisun 35 DE-OS 2 118 455 mukaan.

i4 86204

Keksinnön mukainen diagostinen väline esterolyyttisten ja/tai proteolyyttisten entsyymien, erityisesti leukosyytti-entsyymien toteamiseksi on valmistettavissa jauheseosten tai reagenssitablettien muotoon siten, että koestusvälineen edel-5 lä mainittuihin aineksiin lisätään tavallisia galeenisia lisä aineita ja rakeistetaan. Tämän laatuisia lisäaineita ovat esim. hiilihydraatit, kuten esim. mono-, oligo- tai polysakkaridit, tai sokerialkoholit, kuten esim. mannitoli, sorbitoli tai ksylitoli, tai muut liukoiset inerttiset yhdisteet, kuten 10 polyetyleeniglykolit tai polyvinyylipyrrolidoni. Jauheseosten tai reagenssitablettien lopulliset painot ovat esim. noin 50-200 mg, edullisesti 50-80 mg.

Lyofilisaattien valmistamiseksi, joiden kokonaispaino kulloinkin on noin 5-20 mg, edullisesti noin 10 mg, kuiva-15 taan jäähdyttämällä liuos, joka kaikkien koestukseen tarvit tavien reagenssien ohella sisältää tavallisia rungonmuodos-tusaineita, kuten esim. polyvinyylipyrrolidonia, ja mahdollisesti muita täyteaineita, kuten esim. mannitolia, sorbitolia tai ksylitolia.

20 Liuoksen muodossa oleva keksinnön mukainen diagnostinen väline sisältää edullisesti kaikki koestukseen tarvittavat reagenssit. Liuottimena tulevat kysymykseen vesi tai veden seokset vesiliukoisen orgaanisen liuottimen, kuten esim. metanolin, etanolin, asetonin tai dimetyyliformamidin kanssa.

• /·; 25 Kestävyyttä silmälläpitäen voi olla edullista jakaa kokeeseen : : tarvittavat reagenssit kahdeksi tai useammaksi liuokseksi, jotka yhdistetään vasta varsinaisen tutkimuksen yhteydessä.

—: Näin valmistetut diagnostiset välineet tekevät mahdolli- ; seksi tutkittavaan, kysymykseen olevaan kehon nesteeseen - 30 upottamisen tai siihen lisäämisen jälkeen todeta esterolyyt tisten ja/tai proteolyyttisten entsyymien, erityisesti leu-kosyyttientsyymien läsnäolo nopeasti ja yksinkertaisesti "· värinmuodostuksen avulla, joka voidaan mitata visuaalisesti tai fotometrisesti, esim. remissio-fotometrisesti tai mal-35 jassa. Koska leukosyyttientsyymien aktiviteetti solua kohti . voidaan katsoa oleellisesti vakioiseksi suuruudeksi, saa- is 86204 daan värinmuodostuksen voimakkuudesta selville tutkitun kehon-nesteen leukosyyttikonsentraatio. Tällöin saadaan todetuksi keksinnön mukaisen diagnostisen välineen avulla sekä vahingoittumattomat että myös hajonneet leukosyytit, koska leuko-5 syytti-entsyymien aktiviteetti säilyy täysin ennallaan leukosyyttien hajoamisen jälkeen. Hajoamisen aiheuttamaa virhettä ei niinmuodoin esiinny.

Seuraavien esimerkkien tarkoituksena on valaista esillä olevaa keksintöä. Ellei toisin ole mainittu, tarkoitetaan 10 määriä koskevilla tiedoilla paino-osia tai painoprosentteja.

2,25 ml:aan kysymyksessä olevaa, suolaa sisältävää puskuria lisättiin kulloinkin käytetyn substraatin mukaan 50-250^ul N-metyylipyrrolidonia liukenemista helpottavaksi aineeksi ja liuoksen tilavuus täydennettiin puskurin avulla 15 2,5 ml:ksi. Tämän jälkeen lisättiin reaktioseokseen mahdol lisesti 5^,ul liuosta, joka sisälsi 5-100 mg lisänä käytettyjä aktivaattoreita 1 ml:saa N-metyylipyrrolidonia, samoin kuin 5^ul liuosta, joka sisälsi 2 mg natriumdodesyylisul-faattia (SDS) vast. 4 mg muita detergenttejä 1 ml:ssa vettä 20 tai N-metyylipyrrolidonia. Hyvän sekoittamisen jälkeen lisättiin reaktioliuokseen 5^ul 10 ^-molaarista substraattiliuos-ta N-metyylipyrrolidonissa, dimetyyliformamidissa tai dime-tyylisulfoksidissa ja leukosyyttisuspension lisäämisen jälkeen seurattiin jatkuvasti ekstinktion nousua ilmoitetulla ·*.: 25 aaltopituudella. Substraatin spontaanihydrolyysi määrite- : tään rinnakkaiserässä siihen leukosyyttejä lisäämättä ekstink- tion nousun avulla.

____: Reaktionopeuden määrittämiseksi vähennetään entsyymireak- tossa saatua ekstinktion nousua spontaanihydrolyysille il-30 moitetun määrän verran.Absoluuttiset arvot substraatin ha- · jottamiselle (mol. min. voidaan laskea ekstinktioeroista molaaristen ekstinktiokertoimien avulla.

Esimerkki 1 : Suodatinpaperi (esim. Eaton und Dikeman 205) kyllästetään : 35 peräkkäisesti seuraavilla liuoksilla ja sen jälkeen kuivataan 60°C:ssa.

ie 862C4

Liuos 1: 0/1 M tris-(hydroksimetyyli)-aminometaani-suolahappopuskuria (pH 8,8), joka sisältää 0,25 M natrium-kloridia ja 3 % polyvinyylipyrrolidonia.

_ 3

Liuos 2: 7,5 10 mol/1 N-tosyyli-L-alaniini-5-hydroksi- -2 t- 1,2-bcntsoisotiatsolyyliesteriä, 10 mol/1 2,4-dimetoksi- bentseenidiatsonium-tetrafluoriboraattia ja 3,5 g n-undekano-lia/1 vedettömässä asetonissa.

Tällöin saadaan heikosti keltaiseksi värjäytynyttä koes-tuspaperia, joka leukosyyttipitoiseen virtsaan upotettaessa värjäytyy punaisenruskeaksi.

Esimerkki 2

Suodatinpaperi (esim. Eaton und Dikeman 205) kyllästetään peräkkäisesti seuraavilla liuoksilla ja sen jälkeen kuivataan 60°C:ssa.

Liuos 1: 0,1- boraatti-puskuria (pH=9,0), joka sisältää 3 % polyvinyylipyrrolidonia ja 0,25 moolia natriumkloridia/1.

-3

Liuos 2: 5*10 moolia/1 N-tosyyli-L-alaniini-3-hydrok- si-5-fenyyli-pyrroliesteriä.

_2

Liuos 3: 10 moolia/1 2-hydroksi-4-sulfo-naftyylidiatso-2Q niumstetrafluoriboraattia ja 3,5 g dekanolia/1 vedettömässä asetonissa.

Tällöin saadaan heikosti keltaiseksi värjäytynyttä koes-tuspaperia, joka leukosyyttipitoiseen virtsaan upotettaessa värjäytyy punaiseksi tai violetiksi.

25 Esimerkki 3 : Suolakonsentraation vaikutus N-tosyyli —L-alaniini-indok- syyliesterin hajoamiseen 0,1-m boraattipuskurissa (pH 8,8) vast. 0,1-m tris-(hydroksimetyyli)-aminometaani-puskurissa : .·. (pH 8,8) ,jotka puskurit sisältävät leukosyyttejä, lisättäes- - 20 sä 10/Ug SDS ja 125^ug n-dekanolia/koe-erä.

* · • · • · · • · • · > · · m m 17 862C4

Taulukko 1

Puskuri Suola Mooli- Suhteellinen suus hajoamisno- -----peus_ 5 boraatti LiCl 0,25 lf25

NaBr " 1,15

NaCl " 1,3

NaOCN " 1,38 ^ Na-fosfaatti 0,2 3,2

NaSCN 0,25 1,42 tris _ ^

Na- boraatti 0,1 3,15 15 NaCl 0,1 1,0 " 0,25 1,5 " 0,5 2,3 " 1,0 1,75

Na-fosfaatti 0,2 3,25 20 natrium-tolueenisulfo- 0,1 1,45 „ naatti o, 25 1,6 " 0,5 1,8 . . natrium-trifluoriase- 0,1 1,1 X;: " 0,25 2,6 25 " 0,5 2,3 : V magnesiumkloridi 0^25 1,9 ie 86204

Esimerkki 4

Suolakonsentraation vaikutus N-tosyyli-L-alaniini-indoksyyliesterin hajoamiseen 0,1-m tris(hydroksimetyyli)-aminometaani-suolahappo-puskurissa (pH 8,8), joka sisältää 5 leukosyyttejä, samalla kun läsnä on lO^ug SDS ja 125^ug n-deksanolia/koe. (Hajoamisen määritys arvolla 360 nm).

Taulukko 2

Suola Moolisuhde Suhteellinen hajoa- _misnopeus_ natriumasetaatti 0,25 2,5 " 0,5 2,8 1,0 4,2 ^ natriumsukkinaatti 0,1 3,9 " 0,25 4,0 " 0,5 3,7 " 1,0 1,95 20 Esimerkki 5

Suolakonsentraation vaikutus N-tosyyli-L-alaniini-3-hydroksi-5-fenyyli-pyrroliesterin hajoamiseen leukosyyttien vaikutuksesta 0,1-m trispuskurissa (pH 8,4) aktivaattorien ja detergenttien läsnä ollessa.

| 25 (Reaktionopeuden määritys arvolla 330 nm) .

• » • ψ 1 • m 1 • · • · 1

II

« 1 19 86204

Taulukko 3

Mcolisuus Aktivaattori Detergentti ,ug/koe Suhteellinen 5 (NaCl) (125 ug/koe / hajoamisno- / peus n-dekanoli SDS ~1 TÖ Ϊ Ö,1 " " " 6,35 0,2 - ·· " 13,0 10 °t25 " " " 17,4 0,3 " " " 14,6 0,4 " " " 7,7 0,5 " " " 7,2 0,25 - - 3,2 15 " n- dekanoli - - 4,6 " " SDS 10 16,6 " n-undekandi - _ 10,3 " " SDS 10 22,8 " " BDTA 20 5,1 20 " " heparinoidi " 5,2 " " Poly-DL-lyy- " 8,4 " n- SDS S1 10 18,2 " " BDTA 20 4,2 " " heparinoidi " 3,9 25 " n-tridekanoli SDS 10 15,0 0,5 - - . 4,3 ΙΓ. " - 10 4 " " SDS 10 16,4 " heparinoidi 20 7,8 -jo " n-dodekanoli " "6,0 " n_tridekanoli ·. 2q 54 . . SDS = natriumdodekyylisulfaatti *· BDTA = bentsyyli-dimetyyli-tetradesyyliamiini-hydrokloridi 20 8 6 2 0 4

Taulukko 3a

Suola Moolisuus Aktivaattori Detergentti Suhteellinen (10,ug/koe) hajoamisnope-' us ----- g - - n-dekanoli SDS 1

Na-fosfaatti 0,25 n-undekanoli " 9,0

Na-fos- " " ” 8,6 fiitti N^lSO, " " " 9,5 in z ‘t 1U KC1 " " " 15,1

MgS04 " " " 9,8

Esimerkki 6

Natriumkloridikonsentraation vaikutus N-tosyyli-L-ala-15 niini-3-hydroksi-5-fenyyli-pyrroliesterin hajoamiseen karbo- naattipuskurissa pH-arvossa 8,4 leukosyyttien vaikutuksesta erilaisten aktivaattorien ja detergenttien läsnä ollessa. (Hajoamisnopeuden määritys arvolla 330 nm.).

20 Taulukko 4 , Nad Aktivaatto- Detergent- Suhteelli-

Puskun (moL) ti ti nen hajoa- misnopeus • · · ___ • · * ___________ m 1 —| 1 I·"— : 25 ”... 0,1-m tTis - n· dekanoli SDS 1 - ·' Q ^-m karbonaatti _ n_ undekanoli SDS 5,8 ' - " Hep. 6,2 : - " BDTA/SDS 8,4 - " BDTA/Hep. 6,8 30 0,25 " SDS 24,5 " " BDTA 6,5 " " Hep. 16,8 '· 0,25 " BDTA/SDS 19,5 V*: " " BDTA/Hep. 20,1 35 *···* SDS = natriurrdodekyyl.isulfaatti . - BDTA = bentsyyli-dimetyyli-tetradesyyli amiini-hydrokloridi ... ; (20yug/koe)

Hep = heparinoidi (20^,ug/koe)

II

2i 86204

Esimerkki 8

Suolapitoisuuden vaikutus N-tosyyli-L-alaniini-3-hydrok-si-5-fenyyli-pyrroliesterin hajoamiseen 0,1-M boraattipusku-rissa,ρΗ-arvo 8,4, leukosyyttien vaikutuksesta samalla kun 5 läsnä on undekanolia nopeuttajana ja SDS detergenttinä.

(Hajoamisnopeuden määritys arvolla 320 nm).

22 8 6 2 0 4

Taulukko 5

Suola Moolisuus Suhteellinen hajoa- misnopeus

LiBr M 1^5

NaBr " if8 KBr - lfl

LiCTl 0,25 1,55

NaCl " 1,85 KCl " 2,05 NH4C1 0,1 1|4

NaF " 1,15 KF -- lf5 natriumglysero- „ , __ fosfaatti 1,35 natriumfos- fiitti " 2,05

Na2S04 0,05 1,9 " 0,1 2,3 " 0,15 2,4 " 0,2 2,8 " 0, 25 2,6 0,3 2,1 K2S04 0,1 2,05 " 0,15 2,35 " 0,2 2,05 " 0,25 1,1

Na2S2°3 M2 1,9 : " 0,05 2,35 " 0,075 2,5 " Of1 2,9 : " 0,125 2,35 natriunsukkinaatti 0,1 1^15 ' - ·' magnesiumgalaktaatti 0,1 1,15 natriymgalaktouro- 0,05 1,2 raat£l 0,1 1,4 0,2 1,45 kaliumglukonaatti 0,05 1,2 0,1 1,6 0,2 1,5 • · *.··* natriunglucDuronaatti 0,1 1,3 « ·*·.. natriumtartraatti 0,0 5 1,2 : 0,1 1,4 0,2 1,4 • · 11 23 862C4

Yleinen työskentelyohje N-tosyyli-L-alanyyliesterin valmistamiseksi_

Esteriä valmistettiin kulloinkin reagoittamalla N-to-syyli-L-alanyylikloridia fenolien kanssa absoluuttisessa 5 metyylietyyliketonissa tai absoluuttisessa tolueenissa jauhemaisen kaliumkarbonaatin läsnä ollessa. 6-12-tuntisen noin 55°C:ssa suoritetun hämmentämisen jälkeen 40-70 % fenolista reagoinut. Moolisuhde fenoli: P^CO^: happokloridi oli enimmäkseen 1:1,5:1,5. pH-arvo oli koko reaktion ajan noin 7. Jatko-10 käsittelyä varten erotettiin kaliumkarbonaatti suodattamalla 50°C:ssa ja sen jälkeen liuotin tislattiin pois tyhjössä. Puhdistaminen suoritettiin pylväskromatografian avulla käyttäen piihappogeeliä (eluenttina petroolieetteri:asetoni = noin 9:1) ja sen jälkeen kiteyttämällä uudelleen.

15 L-p-tosyylialaniini

Kirjallisuutta: E. Fischer ja W. Lipschitz, B. 48, 363 (1915).

83,7 g (0,93 mmoolia) L-alaniinia liuotetaan 465 ml:aan noin 2-n natronlipeää. Liuokseen lisätään välillä 70-72°C annoksittain.186 g (0,976 moolia) p-tolueenisulfokloridia 20 20 minuutin kuluessa. Sulfokloridilisäyksen aikana pidetään reaktioseos automaattisen titrauslaitteen avulla ja käyttäen noin 2-n natronlipeää pH-arvossa 10; tällöin kuluu 560 ml 2-n natronlipeää. Sen jälkeen kun reaktioseoksen pH ei enää muu-. . tu, jäähdytetään seos välille 15-5°C ja pH säädetään 37 %:sella 25 suolahapolla arvoon 3. Saostunut tuote erotetaan imusuodat- : timen avulla ja märkä suodatuskakku kiteytetään uudelleen - 2350 ml:sta vettä.

Saanto: 185,5 g (82 % teoreettisesta arvosta) L-p-tosyyli-alaniinia, jonka sp. on 132-135°C.

' ' ^ P~tosyyli-L-alanyylikloridi 158,1 g (0,65 moolia) L-p-tosyylianaliinia hämmenne- tään 350 ml:ssa tionyylikloridia 40°C:ssa siksi, kunnes : : : syntyy kirkas liuos. Sen jälkeen tislataan ylimääräinen tio- ·] ; nyylikloridi pois vesisuihkutyhjön alaisena. Kolviin jäl- ·.**: 35 jelle jäänyt aine otetaan 300 ml:aan tislattua toluaenia.

24 86204 Tällöin saadaan kirkas, heikosti kellertävä liuos, joka kaadetaan 900 ml:aan hämmenettyä pesubensiiniä. Happokloridi saostuu. Se suodatetaan suodattimena seuraavana päivänä, pestään kevytbensiinillä ja kuivataan tyhjöeksikaattorissa 5 kalsiumkloridi/kaliumhydroksidin avulla.

Saanto: 155 g (91 % teoreettisesta arvosta) miltei värittömiä kiteitä, joiden sp. on 81-83°C.

Claims (5)

1. 25 86204 Patentt ivaat imukset
2. 1. Väline esterolyyttisten ja/tai proteolyyttisten entsyymien toteamiseksi, joka väline sisältää 5 (a) fenolin aminohappo- tai peptidiesteriä kromo- geenisenä entsyymisubstraattina ja (b) 0,05M - 2M komponentin (a) aminohappo- vast, peptidiesterisidoksen entsymaattista hajoamista nopeuttavaa ainetta, tunnettu siitä, että hajoamista 10 nopeuttava aine on suola, jossa on ryhmästä Li+, Na*, K* ja Mg++ valittu kationi ja ryhmästä halogenidi, pseudo-halogenidi, sulfaatti, fosfaatti, asetaatti, trifluori-asetaatti, sulfonaatti ja sukkinaatti valittu anioni.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, t u n -15 n e t t u siitä, että välineen komponentit on sisällytetty inerttiin kantajamateriaaliin.
4. 3. Menetelmä esterolyyttisten ja/tai proteolyyttisten entsyymien toteamiseksi nestemäisessä näytteessä, tunnettu siitä, että nestemäinen näyte saatetaan 20 kosketukseen jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukaisen välineen kanssa ja tapahtuva värireaktio määritetään.
5. 26 S62G4